KR102037898B1 - 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 포함하는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 포함하는 조성물은 포도씨 분말이 프리바이오틱스로 작용하고 케피어에서 분리한 유산균 복합균체가 프로바이오틱스로 작용하여 고지방식이로 인한 비알코올성 지방간을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기능성 식품 또는 약학 조성물의 형태로 섭취되어 간 무게 감소, 인슐린 수치 감소, AST 및 ALT 수치 감소, 콜레스테롤 수치 감소, 간 내 지방 조직 감소 등의 효과를 발휘할 수 있다.

Description

케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Hepatic Steatosis Comprising Lactic Acid Bacteria from Kefir and Grape Seed Flour}
본 발명은 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 포함하는 지방간의 개선, 예방 또는 치료용 기능성 식품 및 약학 조성물에 관한 것이다.
지방간(hepatic steatosis)은 간 세포 속에 지방이 축적된 상태를 의미하며, 의학적으로 지방이 전체 간 무게의 5% 이상을 초과하는 병적 상태를 의미하는데, 이를 포함하는 간질환은 선진국 40-50대 성인 인구의 사망 원인에서 암 다음으로 심각한 질환으로 인정되고 있다.
지방간은 크게 과음으로 인한 알코올성 지방간 질환(alcoholic fatty liver disease)과 비만, 당뇨병, 고지혈증, 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease; NAFLD)으로 나눌 수 있다. 비알코올성 지방간 질환은 과량의 알코올을 섭취하지 않은 환자에게서 나타나는 염증 반응을 동반하지 않는 단순 지방간, 및 이에 의해 진전되며, 간세포의 염증반응, 간섬유화 및 간경화를 포함하는 넓은 범위의 질환을 의미한다.
현재까지 비알코올성 지방간 질환에 대한 확립된 치료법은 없는데 이는 비알코올성 지방간 질환이 당뇨병, 비만, 관상동맥 질환, 생활 습관 등의 다양한 요소와 연관되어 나타나기 때문이다. 따라서, 지방간 치료를 위하여 운동과 식이요법만이 권장되고 있기 때문에 신규한 지방간 치료제의 개발이 요구된다.
케피어(Kefir)는 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 티벳지방 승려들이 건강을 위해 음용하던 것이 대중화된 음료이다. 케피어의 구성영양소로는 단백질 및 다당류가 포함되어 있고 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 비타민 D, 비타민 K2, 엽산, 니코틴산, 칼슘, 철분, 요오드 등을 고루 포함하고 있다. 이러한 케피어는 유산균과 효모 복합체인 케피어 그레인으로 불리우는 균종(케피어 과립균이라고도 한다)을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료이다.
케피어 그레인에 의하여 발효된 음료인 케피어는 인체에 유익한 유산균을 포함하고 있어 장 활동을 원활히 하여 변비를 억제하고 위장 장애를 개선하는데 도움이 되며 면역체계의 강화에 효능이 있다고 알려져 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0115820호에서는 케피어를 유효성분으로 포함하는 식중독 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1426399호에서는 변비 개선용 케피어 및 이의 제조방법을 제공하고 있다. 그러나, 케피어의 장 건강 외에 다른 대사장애의 예방 또는 치료에 미치는 영향에 대해서는 아직 제대로 밝혀진 바가 없다.
프로바이오틱스(probiotics)는 건강에 도움이 되는 장내 세균총 즉, 숙주의 건강에 이로움을 제공하는 살아있는 미생물 즉 생균류를 의미한다. 일반적으로 프로바이오틱스는 요거트 등의 발효식품의 일부 또는 식이보충제로서 소비된다. 프로바이오틱스로 알려진 미생물에는 유산균, 비피도박테리아(bifidobacteria), 바실러스 등이 있다.
프로바이오틱스와 유사한 개념으로, 프리바이오틱스(prebiotics)는 장내 유익한 균의 생장을 돕는 난소화성 성분으로서 프로바이오틱스(probiotics)의 영양원이 되어 장내 환경을 개선하는 데 도움을 주는 물질을 말한다. 어떠한 식품 성분이, 대장 내 유용 미생물에 의해 이용되어 미생물의 생육이나 활성을 촉진함으로써 숙주 건강에 좋은 효과를 나타내게 하는 프리바이오틱스로 활용되기 위해서는, 위장관의 상부에서 소화 또는 흡수되지 않아야 하고 대장 내 미생물 중 유용 세균을 선택적으로 활성화시키고 병원균 등의 유해균은 억제할 수 있어야 한다.
한편, 포도에는 식물에서 발견되는 항산화물질인 폴리페놀(polyphenol) 계열의 레스베라트롤(resveratrol)이 많이 함유되어 있으며, 레스베라트롤은 항균, 항암, 항바이러스, 항알레르기, 및 항염증 감소효과를 지니며 강력한 항산화 활성의 기능이 있는 물질로 포도부산물인 과피, 씨, 송이 가지에 다량 함유되어 있으므로 포도부산물을 그대로 폐기할 경우 농산물에 함유된 유용한 성분을 손실하게 되는 것은 물론이고, 환경오염의 문제가 되므로 포도부산물의 효용가치를 높이는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
본 발명자들은 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말이 각각 프로바이오틱스 및 프리바이오틱스로 작용하여 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료에 효과적이라는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 목적은 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 포함하는 비알코올성 지방간 개선용 식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 포함하는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 케피어(kefir) 유래 유산균 및 포도씨 분말을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 개선용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 케피어 유래 유산균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) 또는 이들의 복합 균체일 수 있으며, 바람직하게는 류 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4(leuconostoc mesenteroides LCM4, 기탁번호: KCCM12117P) 및 락토바실러스 케피리 DH5(Lactobacillus kefiri DH5, 기탁번호: KCCM11837P)의 복합 균체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복합 균체는 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4 및 락토바실러스 케피리 DH5를 1:5 내지 1:20의 농도비로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 케피어 유래 유산균은 포도씨 분말의 질량에 대하여 0.1 내지 10중량%로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포도씨 분말은 와인 제조 부산물일 수 있으며, 샤르도네(Chardonnay) 품종의 포도로 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은 장내 단쇄지방산을 증가시킴으로써 비알코올성 지방간을 개선할 수 있다.
본 발명에서, 상기 기능성 식품은 발효식품일 수 있다.
본 발명은 또한, 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 포함하는 조성물은 포도씨 분말이 프리바이오틱스로 작용하고 케피어에서 분리한 유산균 복합균체가 프로바이오틱스로 작용하여 고지방식이로 인한 비알코올성 지방간을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기능성 식품 또는 약학 조성물의 형태로 섭취되어 간 무게 감소, 인슐린 수치 감소, AST 및 ALT 수치 감소, 콜레스테롤 수치 감소, 간 내 지방 조직 감소 등의 효과를 발휘할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 및 비교예의 식이를 섭취한 실험쥐의 생화학적 수치 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 및 비교예의 식이를 섭취한 실험쥐의 지방 세포 이미지를 나타낸다.
도 3은 포도씨 분말을 섭취한 실험쥐의 간 지방 조직에서 포도씨 분말을 섭취하지 않은 실험쥐에 대하여 1.8배 이상의 비율로 발현된 대표적 유전자 목록을 나타낸다.
도 4는 케피어 유래 유산균 복합 균체를 섭취한 실험쥐의 간 지방 조직에서 케피어 유래 유산균 복합 균체를 섭취하지 않은 실험쥐에 대해 8배 이상의 비율로 발현된 대표적 유전자 목록을 나타낸다.
도 5는 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균 복합 균체를 섭취한 실험쥐의 간 지방 조직에서 이를 섭취하지 않은 실험쥐에 대하여 1.8배 이상의 비율로 발현된 유전자 목록을 나타낸다.
도 6은 포도씨 분말을 섭취한 실험쥐의 지방 조직에 대한 ingenuity pathway analysis(IPA) 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 케피어 유래 유산균을 섭취한 실험쥐의 지방 조직에 대한 IPA 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 섭취한 실험쥐의 지방 조직에 대한 IPA 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 포도씨 분말을 섭취한 실험쥐의 유전자 변화를 종합하여 나타낸 것이다.
도 10은 케피어 유래 유산균을 섭취한 실험쥐의 유전자 변화를 종합하여 나타낸 것이다.
도 11은 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 섭취한 실험쥐의 유전자 변화를 종합하여 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 유효성분으로 함유하는 지방간의 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 “프로바이오틱스(probiotics)”란, 섭취되어 장에 도달하였을 때에 장내 환경에 유익한 작용을 하는 균주를 의미한다.
본 발명에서 "프리바이오틱스(Prebiotics)"란, 장내 유익한 박테리아의 생장을 돕는 난소화성 성분으로서 프로바이오틱스(probiotics)의 영양원이 되어 장내 환경을 개선하는 데 도움을 주는 물질을 말한다.
본 발명에서, 케피어(kefir)는 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 케피어는 유산균과 효모 복합체인 케피어 그레인으로 불리우는 균종을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료를 의미한다.
본 발명에서 사용가능한 케피어 유래 유산균은 류코노스톡 메센테로이데스(leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 또는 이들의 복합 균체일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 사용가능한 케피어 유래 유산균은 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4(leuconostoc mesenteroides LCM4, 기탁기관: 한국미생물보존센터, 수탁번호: KCCM12117P, 수탁일자: 2017년 9월 21일), 락토바실러스 케피리 DH5(Lactobacillus kefiri DH5, 기탁기관: 한국미생물보존센터, 수탁번호: KCCM11837P, 수탁일자: 2016년 4월 29일), 또는 이들의 복합 균체일 수 있다. 가장 바람직하게는, 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4 및 락토바실러스 케피리 DH5의 복합 균체를 사용하는 것이 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료에 적합하다. 상기 복합 균체는 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4 및 락토바실러스 케피리 DH5를 1:1 내지 1:100의 농도로 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 1:5 내지 1:20의 농도로 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명자들은 포도씨 분말이 케피어 유래 유산균의 프로바이오틱스 활성에 유익한 영향을 미치는 프리바이오틱스(prebiotics)로서 작용한다는 것을 확인하였다.
본 발명에 이용되는 포도의 품종, 산지 또는 수확시기 등에는 특별한 제한은 없으나, 샤르도네(Chardonnay) 포도를 이용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 포도씨 분말은 포도를 재료로 하는 음료나 주류의 제조과정에서 발생되는 부산물로부터 생성될 수 있다. 바람직하게는, 상기 포도씨 분말은 포도주 또는 와인(wine)의 제조과정에서 발생되는 부산물로부터 생성될 수 있다.
여기서, "부산물"은 포도를 원료로 하여 파쇄 및 발효 공정을 거친 후 증류 공정에서 생성되는 와인 또는 포도주 증류액을 제외한 나머지 생성물을 총칭한다.
통상적으로, 와인 또는 포도주 제조시 발생되는 부산물들은 폐기되고 있다. 그러나 이러한 폐기물은 원료 포도의 40% 정도에 이르러 경제적으로 큰 손실이 아닐 수 없다. 본 발명에 따르면, 와인 제조시 발생되는 부산물을 프리바이오틱스로 활용할 수 있기 때문에, 환경적, 경제적으로도 큰 이점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 "포도씨 분말"(Grape seed flour, GSF)은 와인을 생산하고 남은 부산물로부터 포도씨를 분리, 건조한 뒤, "냉각프레스", "열프레스" 기법 등을 이용하여 포도씨로부터 오일을 추출한 다음, 가루로 분쇄함으로써 생성될 수 있다. 포도씨 분말의 분리, 건조, 압축, 분쇄 방법은 종래 알려진 기술들에 의해 다양한 형태로 수행될 수 있다.
포도씨 분말의 입자 크기는 분쇄 환경에 따라 다양하게 조절할 수 있으며, 더 작은 입자를 가진 분말을 생성하기 위해 체로 거르는 작업을 추가할 수 있다. 포도씨 분말의 입자 크기는 식품, 의약품 등 활용 용도와 목적에 맞게 조절 가능하다.
본 발명에서는 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 섭취하는 경우 고지방식이로 인한 비알코올성 지방간 개선에 우수한 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다. 특히, 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균은 함께 섭취되었을 때 시너지 효과를 발휘하여 이들을 각각 섭취하였을 경우로부터 예측하기 어려운 현저한 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
구체적으로, 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 함께 섭취하는 경우 고지방식이로 인한 간 무게 증가와 인슐린 수치를 억제할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 고지방식이로 유도된 지방간 실험쥐에게 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 고지방식이와 함께 9주간 섭취시킨 경우 간 무게와 인슐린 수치가 감소한다는 것을 확인하였다.
또한, 간 손상의 지표인 AST(asparate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase)가 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 함께 섭취한 경우 이들을 각각 섭취한 경우에 비하여 크게 감소한다는 것을 확인하였다. 간세포는 transaminase 라 불리우는 AST 효소를 가지고 있는데, 지방간과 같은 간 질환으로 인하여 간세포가 파괴되면 이들 효소를 혈중으로 방출하게 된다.
본 발명의 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 섭취한 실험쥐는 실제로 간의 지방 조직의 크기가 뚜렷이 감소한다는 것을 확인하였으며, 총 콜레스테롤, LDL 및 VLDL 수치를 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 케피어 유래 유산균은 포도씨 분말의 질량에 대하여 0.1 내지 10중량%로 사용되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5중량%로 사용될 수 있다.
본 발명의 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 함유하는 조성물은 비알코올성 지방간 개선용 기능성 식품으로서 활용될 수 있다.
상기 기능성 식품은 발효식품인 것이 바람직하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어서, 기능성 식품은 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류일 수 있으며, 더욱 자세히는, 유제품, 제과물, 조미료, 음료 및 드링크제, 스낵, 캔디류, 젤리류, 아이스크림 및 냉동용 디저트, 아침 곡물류, 영양바, 스낵 바 초콜렛 제품, 가공 식품, 곡물 제품 및 파스타, 스프, 소스 및 드레싱, 과자 제품, 오일 및 지방 제품, 유제품 음료 (dairy drink) 및 우유 음료, 차, 두유 및 콩 유제품 (soy dairy-like product), 냉동식품, 조리 음식 및 대체 음식, 육류 제품, 치즈, 요구르트, 빵 및 롤빵, 케이크, 쿠키 및 크래커로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품은 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 포함하는 캡슐, 정제, 분말, 액상 현탁액, 환제 및 과립제 등의 제형으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품은 유효성분으로서 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 과일주스나 야채 음료 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 함유하는 조성물은 또한, 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 유효성분으로서 함유하며, 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)]에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리 식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 지식을 가진 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험 준비
비알코올성 지방간 질환을 가진 실험쥐 준비
C57BL/6J 실험쥐 86마리에게 고지방식이인 "western diet" 사료를 5주 동안 섭취시켜 비알코올성 지방간 질환을 유도하였다.
상기 사료 및 아래의 실험예에서 사용될 고지방식이의 구체적인 성분은 아래의 표 1에 나타낸 바와 같다.
성분(g/kg) 고지방식이 포도씨 분말
함유 식이
Lard fat 225.0 225.0
Soybean Oil 21.1 13.5
Cholesterol 0.8 0.8
MCC
(microcrystalline cellulose)		 57.3 0
Casein 199.2 191.0
Corn Starch 145.6 118.7
Sucrose 300.0 300.0
L Cystein 3.0 3.0
Choline Bitartrate 3.0 3.0
Mineral Mix 35.0 35.0
Vitamin Mix 93G 10.0 10.0
GSF 0 100.0
Total Diet weight 1000.0 1000.0
케피어 유래 유산균 준비
케피어로부터 분리된 유산균 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4 및 락토바실러스 케피리 DH5를 각각 MRS 배지에서 배양한 후, 분말화하여 대량생산 하였다.
MRS 고체 배지에서 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4는 1 x 1010CFU/mg, 락토바실러스 케피리 DH5는 1 x 109CFU/mg가 되도록 각각 배양한 후, 자란 균을 긁어 모아 멸균생리식염수가 들어있는 교반기 위의 플라스크에 조금씩 넣으며 LCM4 균의 경우 탁도 3.9, DH5 균의 경우 탁도 2.0에 맞추었다.
이후, 4℃, 3,000rpm에서 10분간 원심분리를 수행하였다. 상등액을 버리고, 멸균생리식염수를 넣어준 뒤 동결건조시켜 분말화하였다.
분말화된 케피어 유래 유산균은 이를 투여 하기 전 1시간 정도 멸균 증류수 6mL에 넣어 상온에서 재수화시킨 후, 두 균주의 샘플을 1:1의 비율로 잘 섞어 튜브식(gavage) 투여를 통해 최종적으로 실험쥐에게 투여하였다.
포도씨 분말 준비
샤르도네(Chardonnay) 포도씨 가루를 미국 ApresVin Enterprises, Inc.에서 구매하여 사용하였다.
상기 포도씨 가루는 샤르도네(Chardonnay) 포도를 이용하여 와인을 만들고 남은 부산물을 냉압착(cold-pressed)하여, 포도씨에서 기름을 제거하고, 남은 생성물을 열풍 건조하고, air blow를 이용하여 껍질 부분을 제거한 다음, 남은 생성물을 100메쉬(150마이크론) 사이즈를 가진 체를 이용하여 거른 고운 입자의 포도씨 분말(Grape seed flour, GSF)의 형태이다.
실험예 1: 간 기능 분석
비알코올성 지방간 질환을 가진 실험쥐 60마리를 4개의 그룹으로 나누어 하기 표 2의 식이를 각각 9주간 제공하였다.
표에서, 각 수치는 30g의 실험쥐를 기준으로 1회에 투여된 무게를 의미한다.
비교예 1 비교예 2 비교예 3 실시예 1
고지방식이
(포도씨 분말 함량, %)		 4g
(-)		 4g
(10)		 4g
(-)		 4g
(10)
케피어 유래 유산균 복합 균체 - - 300μg 300μg
9주간 섭취된 식이가 혈액 성분에 미치는 영향을 알아보기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
9주간 식이 섭취 후, 혈액 채취를 위해 각 실험쥐의 혈액을, 혈액응고 방지를 위하여 EDTA에 적신 주사기를 통하여 심장천자법으로 얻었다. 혈액 층분리를 함으로써 혈장은 2,000×g에서 4℃, 30분 동안 원심분리한 후 얻었다. 분리된 혈장은 냉동고(-20℃)에 보관하고, 샘플로부터 간 무게 및 인슐린을 측정하였다. 그 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.
비교예 1 비교예 2 비교예 3 실시예 1
간 무게(mg) 1760±275.8 982.1±96.1 1427.6±178.1 977.1±101.2
인슐린(ng/mL) 2.72±0.29 1.03±0.11 1.05±0.27 0.82±0.07
AST(U/L) 163.6±8.5 131.0±5.3 130.9±5.4 105.5±6.5
ALT(U/L) 76.2±9.6 61.0±8.8 70.8±6.5 54.6±7.3
상기 표 3에서, 포도씨 분말 또는 케피어 유래 유산균을 섭취한 비교예 2 및 3의 실험쥐는 고지방식이만을 섭취한 비교예 1의 실험쥐에 비하여 낮은 간 무게 및 인슐린 수치를 나타내었으며, 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 함께 섭취한 실시예 1의 실험쥐는 이들을 각각 섭취한 실험군으로부터 예측되는 수치에 비하여 더욱 낮은 간 무게 및 인슐린 수치를 나타내었다. 즉, 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균의 시너지 효과로 인하여 개별적인 섭취보다 더 낮은 수치를 얻을 수 있었다.
또한, 간 손상의 지표인 AST 및 ALT 수치에 있어서도, 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균을 함께 섭취한 실시예 1의 실험쥐는 이들을 각각 섭취한 경우로부터 예측되는 수치보다 더욱 낮은 AST 및 ALT 농도를 나타내었다.
즉, 포도씨 분말과 케피어 유래 유산균 복합 균체가 서로 시너지 효과로 작용하여 이들을 각각 섭취할 경우에는 예측하기 어려운 현저한 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
실험예 2: 콜레스테롤 분석
상기 실험예 1에서 9주간 실시예 및 비교예의 식이를 섭취한 실험쥐의 간 조직으로부터 생화학자동분석기(7020, HITACHI)를 이용하여 다음 항목들의 검사를 수행한 결과를 도 1에 나타내었다.
검사 항목:
트리글리세라이드(triglyceride : TG, mg/dL)
총콜레스테롤(total cholesterol : T.C, mg/dL)
LDL(low density lipoprotein, mg/dL)
VLDL(very low density lipoprotein, mg/dL)
HDL(high density lipoprotein, mg/dL)
도 1에서, LDL/HDL 및 트리글리세라이드 수치의 경우 실시예의 실험쥐가 포도씨 분말만 섭취한 비교예 2에 비하여 유의하게 감소하지 않아 특별한 시너지 효과가 관찰되지 않았지만, TC, LDL 및 VLDL 수치에 있어서는 포도씨 분말 및 케피어 유래 유산균 복합 균체를 함께 섭취한 실시예 1의 실험쥐가 이들을 각각 섭취한 비교예 2 또는 3의 실험쥐의 평균값보다 현저히 낮은 값을 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3: 지방 조직 크기 분석
상기 실험예 1에서 9주간 실시예 및 비교예의 식이를 섭취한 실험쥐에 대하여, 간 지방 조직을 적출하고 10% 포르말린에 고정시킨 후 헤마톡실린-에오신 2중 염색(H&E stain)을 수행하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서, 실시예 1의 식이를 섭취한 실험쥐의 세포 크기가 비교예 1 내지 3 중 어느 것과 비교해도 가장 작다는 것을 알 수 있다. 이는 포도씨 분말과 케피어 유래 유산균 복합 균체를 각각 섭취하는 것보다 이들을 함께 섭취하는 것이 간 조직 내의 지방의 함량을 크게 줄일 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
실험예 4: 간 지방 조직에서 microarray 분석에 의한 gene profiling
상기 실험예 1에서 9주간 실시예 및 비교예의 식이를 섭취한 실험쥐의 간 조직에서 RNA를 분리한 후 Agilent microarray chip을 사용하여 microarray 분석을 실시하였다.
대조군(비교예 1)과 실시예 1, 및 비교예 1 및 2를 비교하여 통계적으로 유의미하고 변화가 큰 것들을 도 3 내지 5에 나열하였다. 또한, Ingenuity pathway analysis(IPA)를 통해 각각 유의적인 경로를 도 6 내지 8에 나타내었다.
Microarray 분석 및 IPA 분석 결과를 도 9 내지 11에 정리하여 나타내었다.
도 6 내지 8에서, Ingenuity pathway analysis를 사용하여 pathway analysis한 결과 모든 실험군에서 대사성 질환(metabolic disease), 위장 질환(gastrointestinal disease) 및 간 시스템 질환(hepatic system disease) pathway에 관련된 유전자 발현이 통계학적으로 유의하게 영향을 받았으며, 유산균 복합균 섭취에 의해서는 산화 스트레스(oxidatvie stress)에 관련된 유전자 발현이, 포도씨 분말이나 유산균복합균/포도씨 분말 섭취에 의해서는 염증 경로에 관련된 유전자 발현이 더 많이 영향을 받은 것을 알 수 있다.
도 9에서, 포도씨 분말을 섭취한 실험쥐는 대조군에 비해 특이적으로 지질 합성, 산화 스트레스, 염증, NF-kappa B에 관련된 유전자 발현이 대조군에 비해 통계학적으로 유의하게 감소 되었고, 담즙산 및 콜레스테롤 합성과 간기능 마커 유전자 발현은 증가된 것을 확인할 수 있다.
도 10에서, 케피어 유래 유산균을 섭취한 실험쥐는 대조군에 비해 특이적으로 세라미드(ceramide) 합성, 지질합성, 산화 스트레스, 염증, NF-kappa B에 관련된 유전자 발현이 대조군에 의해 통계학적으로 유의하게 감소되었고, 담즙산 합성에 관련된 유전자 발현이 증가된 것을 알 수 있다.
마지막으로, 도 11에서, 포도씨 분말과 케피어 유래 유산균을 함께 섭취한 실험쥐는 대조군에 비해 지질 합성, 산화 스트레스, 염증, NF-kappa B에 관련된 유전자 발현이 대조군에 비해 통계학적으로 유의하게 감소 되었고, 담즙산 및 콜레스테롤 합성과 간기능 마커 유전자 발현은 증가된 것을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 케피어(Kefir) 유래 유산균 및 포도씨 분말을 유효성분으로 포함하되,
    상기 케피어 유래 유산균이 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4(leuconostoc mesenteroides LCM4, 기탁번호: KCCM12117P) 및 락토바실러스 케피리 DH5(Lactobacillus kefiri DH5, 기탁번호: KCCM11837P)를 1:5 내지 1:20의 농도비로 포함하는 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 개선용 기능성 식품.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 포도씨 분말이 와인 제조 부산물인 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 개선용 기능성 식품.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 포도씨 분말이 샤르도네(Chardonnay) 품종의 포도로 제조된 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 개선용 기능성 식품.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 케피어 유래 유산균이 포도씨 분말의 질량에 대하여 0.1 내지 10중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 개선용 기능성 식품.
  8. 제 1 항에 있어서,
    장내 단쇄지방산을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 개선용 기능성 식품.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 기능성 식품이 발효식품인 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 개선용 기능성 식품.
  10. 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 유효성분으로 포함하되,
    상기 케피어 유래 유산균이 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4(leuconostoc mesenteroides LCM4, 기탁번호: KCCM12117P) 및 락토바실러스 케피리 DH5(Lactobacillus kefiri DH5, 기탁번호: KCCM11837P)를 1:5 내지 1:20의 농도비로 포함하는 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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