KR102037108B1 - 케피어 유래 유산균 또는 효모의 사균체를 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
케피어 유래 유산균 또는 효모의 사균체를 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상의 사균체를 유효성분으로 함유하는 비만의 개선, 예방 또는 치료용 기능성 식품 및 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 췌장 라이페이스 활성을 억제하고 지방세포의 분화를 억제함으로써 비만을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 효능을 발휘한다. 또한, 사균체의 형태이기 때문에 내열성이 우수하고, 외부 환경에 대한 안정성이 높아 기존 유산균 제품보다 보관이 용이하고 유통기간을 늘일 수 있다.
Description
본 발명은 케피어 유래 유산균 또는 효모의 열처리 사균체를 함유하는 비만의 개선, 예방 또는 치료용 기능성 식품 및 약학 조성물에 관한 것이다.
음식 섭취와 에너지 소비의 불균형에 의한 대사 장애인 비만(obesity)은 가장 일반적이고 심각한 전세계적인 건강 문제 중 하나이다. 비만은 선진국과 개발도상국 모두에게 막대한 의료비용을 발생시킬 수 있는 고혈압, 심혈관계 질환, 제2형 당뇨병, 호흡기 질환, 암 등을 포함하는 다양한 만성 질병의 중요한 위험 요소로 여겨지고 있다.
비만을 치료하기 위한 다양한 접근법이 개발되고 있지만, 이러한 치료법들은 혈압을 증가시키거나, 간부전, 췌장염, 두통, 구강건조증, 월경과다증 등의 부작용들을 갖는 것으로 보고되고 있다. 이러한 이유로 비만을 치료할 수 있는 천연 제품들이 더 안전하고 더 효과적인 항-비만 치료제로서 기대되고 있다.
최근, 많은 연구들이 프로바이오틱스(probiotics)의 천연 항-비만 치료제로서의 잠재력을 강조하고 있다. 프로바이오틱스(probiotics)는 건강에 도움이 되는 장내 세균총 즉, 숙주의 건강에 이로움을 제공하는 살아있는 미생물 즉 생균류를 의미한다. 일반적으로 프로바이오틱스는 요거트 등의 발효식품의 일부 또는 식이보충제로서 소비된다. 프로바이오틱스로 알려진 미생물에는 유산균(lactic acid bacteria; LAB), 비피도박테리아(bifidobacteria), 바실러스 등이 있다. 상기 프로바이오틱스 중 일부는 비만, 인슐린 저항, 비알코올성 지방간 등에 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
케피어(Kefir)는 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 티벳지방 승려들이 건강을 위해 음용하던 것이 대중화된 음료이다. 케피어의 구성영양소로는 단백질 및 다당체가 포함되어 있고, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민B2, 비타민B6, 비타민D, 비타민K2, 엽산, 니코틴산 및 칼슘, 철분, 요오드 등을 고루 포함하고 있다. 이러한 케피어는 유산균과 효모 복합체인 케피어 그레인으로 불리우는 균종(케피어 과립균이라고도 한다)을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료이다.
케피어는 유산균(Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Acetobacter, 및 Streptococcus 종), 초산균 및 효모(Saccharomyces, Kluyveromyces, Torula 및 Candida 종)를 포함하는 다양한 미생물을 함유하고 있다. 케피어는 항돌연변이성, 콜레스테롤 저하, 항균성, 면역 조절 및 항염증 효과를 갖는 것이 증명되었지만, 아직까지 열처리에 의해 불활성화 된 케피어 및 불활성화된 사균체 유산균 및 효모의 항비만에 대해서는 구체적으로 알려진 바가 없다.
일반적으로, 프로바이오틱스 함유 기능성 식품의 경우, 생균 또는 사균의 제품군으로 나눌 수 있는데, 생균으로 섭취할 경우 보통 생균을 냉동 건조시킨 가루 형태나 생균을 함유한 발효유 형태 등으로 시중에 판매되고 있다. 사균의 경우 생균에 비해 생리활성이 밝혀진 것이 거의 없고 장내 유산균의 먹이가 되어 생장을 촉진시켜주는 프리바이오틱스(prebiotics)의 개념으로 섭취되고 있다.
이러한 종래의 프로바이오틱스 소재의 경우, 생리활성을 유지하기 위해 생균 상태로 가공식품에 함유시키려면 살균 등의 가공 과정에서 사멸할 수 있어 가루나 발효유 외의 다양한 가공 형태로 응용하기에 어려움이 있고, 한편으로 사균으로 함유시키기에는 사균의 생리활성이 밝혀진 바가 없고 생균에 비해 활성이 떨어지는 것으로 알려져 아직 식품 또는 의약 분야에 적용되기 어려움이 있다.
사균체를 활용한 식품 또는 의약 분야 특허로는, 대한민국 등록특허공보 제10-1472190호에서 식물성 유산균 락토바실러스 플란타룸 피엠오08 사균체를 유효성분으로 포함하는 변비 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1369219호에서는 항균용 유산균 사균체 및 이의 제조방법에 대해서 개시한 바 있다.
본 발명자들은 케피어 유래 유산균 또는 효모균의 사균체가 비만을 개선, 예방 또는 치료하는 데에 효과적이라는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 케피어 유래 유산균 또는 효모의 열처리 사균체를 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 기능성 식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 케피어 유래 유산균 또는 효모의 열처리 사균체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 케피어(Kefir) 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상의 사균체를 포함하는 비만 개선용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 케피어리(Lactobacillus kefiri), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. Lactis) 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효모는 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 사균체는 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상을 80℃ 이상에서 열처리 사멸시킨 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 사균체는 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상을 열처리 사멸 후 파쇄한 현탁액의 형태일 수 있다.
본 발명에서, 상기 사균체는 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상을 열처리 사멸 후 파쇄한 현탁액의 수용성 분획일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기능성 식품은 췌장 라이페이스(lipase)의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기능성 식품은 지방 세포의 분화를 저해할 수 있다.
본 발명은 또한, 케피어(Kefir) 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상의 사균체를 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 케피어 유래 유산균 또는 효모의 사균체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 기능성 식품 또는 약학 조성물로서 적용되어, 췌장 라이페이스 활성을 억제하고 지방세포의 분화를 억제함으로써 비만을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 효능을 발휘한다. 또한, 사균체의 형태이기 때문에 내열성이 우수하고, 외부 환경에 대한 안정성이 높아 기존 유산균 제품보다 보관이 용이하고 유통기간을 늘일 수 있다.
도 1은 케피어 유래 효모(a) 및 유산균(b)의 열처리 사멸 파쇄 현탁액(HSS)의 췌장 라이페이스 억제 활성을 나타낸다.
도 2는 케피어 유래 균의 HSS(a) 및 HSF(b) 107CFU/mL 및 2×107CFU/mL로 처리된 지방세포(3T3-L1)의 생존율을 나타낸다.
도 3은 케피어 유래 균의 HSS(a) 및 HSF(b)로 처리된 지방세포(3T3-L1)의 지방 분화 후의 촬영 이미지를 나타낸다.
도 4는 케피어 유래 균의 HSS(a) 및 HSF(b)로 처리된 지방세포(3T3-L1)의 지방 축적량을 나타낸다.
도 2는 케피어 유래 균의 HSS(a) 및 HSF(b) 107CFU/mL 및 2×107CFU/mL로 처리된 지방세포(3T3-L1)의 생존율을 나타낸다.
도 3은 케피어 유래 균의 HSS(a) 및 HSF(b)로 처리된 지방세포(3T3-L1)의 지방 분화 후의 촬영 이미지를 나타낸다.
도 4는 케피어 유래 균의 HSS(a) 및 HSF(b)로 처리된 지방세포(3T3-L1)의 지방 축적량을 나타낸다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 케피어(kefir) 유래 유산균 또는 효모의 사균체를 함유하는 비만의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 케피어(kefir)는 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 케피어는 유산균과 효모 복합체인 케피어 그레인으로 불리우는 균종을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료를 의미한다.
본 발명에 있어서, "사균체"란 생균의 반대되는 개념으로서 발효를 통해 얻어진 생균과 대사산물들을 열처리 등에 의해 균의 성장이 일어나지 못하도록 한 형태를 의미한다. 사균체는 세포질(cytoplasm), 세포벽(cell wall), 박테리오신(bacteriocin) 등의 항균활성 물질, 다당류(polysaccharide), 유기산 등을 포함할 수 있다.
사균체 제품은 생균 제품과 비교하여 높은 안정성을 가지고 있다. 특히 내열성이 우수하며, 외부 환경에 대한 안정성이 높아 기존 생균 제품보다 보관이 용이하고 유통기간을 늘일 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한, 항생제 사용에 대한 규제가 강화되고 있기 때문에 대체제로서의 활용성과 아직 사균체 제품 생산에 본격적으로 뛰어든 업체가 손에 꼽을 정도이기 때문에 시장성과 성장가능성이 매우 크다.
본 발명에서는, 케피어로부터 분리된 유산균 및 효모가 열처리(heat-killed)에 의해 불활성화된 사균체의 형태로 섭취되는 경우에도 항-비만 활성을 발휘한다는 것을 발견하였다. 따라서, 가공 식품의 살균 가공 과정에서도 항-비만 활성을 잃지 않고 다양한 가공 형태로 응용될 수 있는 가능성이 있다.
본 발명에서, 항-비만 활성을 갖는 사균체로서 적용될 수 있는 케피어 유래 유산균은 락토바실러스 케피어리(Lactobacillus kefiri), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. Lactis) 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 적용 가능한 케피어 유래 유산균은 락토바실러스 케피어리 DH1, 락토바실러스 케피어리 DH3, 락토바실러스 케피어리 DH5, 코커스 락티스 DH1601, 락토코커스 락티스 DH1602, 락토코커스 락티스 DH1603, 락토코커스 락티스 DH1605, 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1606, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1607 및 류코노스톡 메센테로이데스 DH1609로부터 선택된 1종 이상이다. 이들은 모두 건국대학교 수의학대학 식품안전연구센터에서 입수할 수 있으며, 이 중 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4는 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM12117P(수탁일자: 2017년 9월 21일)로 기탁되어 있고, 락토바실러스 케피리 DH5는 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM11837P(수탁일자: 2016년 4월 29일)로 기탁되어 있다.
본 발명에 있어서, 항-비만 활성을 갖는 사균체로서 적용될 수 있는 케피어 유래 효모는 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)일 수 있다.
보다 바람직하게는, 클루이베로마이세스 막시아누스 KU140723-01, 클루이베로마이세스 막시아누스 KU140723-02, 클루이베로마이세스 막시아누스 KU140723-04 및 클루이베로마이세스 막시아누스 KU140723-05로부터 선택된 1종 이상이다. 이들은 모두 건국대학교 수의학대학 식품안전연구센터에서 입수할 수 있다.
지금까지의 연구에서, 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로 알려져 있지만, 최근에는 효모가 프로바이오틱스로 사용될 수 있다는 증거들이 발견되고 있다. 효모는 진핵세포이기 때문에 원핵세포인 유산균과는 상이하다. 많은 효모가 낮은 산성 pH에서의 생존, 담즙산염에의 저항력, 상피세포에의 접착력 등의 특성을 갖기 때문에 유산균과는 구별되는 활성을 가질 것으로 기대되고 있다. 본 발명에서는 케피어 유래 효모인 클루이베로마이세스 막시아누스가 생균 또는 사균의 형태로 섭취되었을 때 비만을 개선, 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.
가장 바람직하게는, 상기 케피어 유래 유산균 및 효모는, 락토바실러스 커피어리 DH1(Lactobacillus kefiri DH1), 락토바실러스 커피어리 DH5(Lactobacillus kefiri DH5), 락토코커스 락티스 DH1601(Lactococcus lactic subsp. Lactis DH1601), 락토코커스 락티스 DH1602(Lactococcus lactis subsp. Lactis DH1602), 류코노스톡 메센테로이데스 LCM4(Leuconostoc mesenteroides LCM4), 류코노스톡 메센테로이데스 DH1609(Leuconostoc mesenteroides DH1609) 및 클루이베로마이세스 막시아누스 KU140723-01(Kluyveromyces marxianus KU140723-01)로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 케피어 유래 유산균 및 효모의 사균체는 케피어 유래 유산균 또는 효모를 80℃ 이상에서 열처리 사멸시킨 것일 수 있다. 또는, 상기 사균체는 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상을 열처리 사멸시킨 후 파쇄한 현탁액의 형태일 수 있다. 또는, 상기 사균체는 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상을 열처리 사멸 후 파쇄한 현탁액의 수용성 분획의 형태일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 케피어 유래 유산균 및 효모의 사균체가 췌장 라이페이스(lipase)의 활성을 저해한다는 것을 확인하였다.
췌장 라이페이스는 췌장에 의해 분비되는 필수 효소이며, 트리아실글리세롤 및 인지질의 소화와 흡수에 중요한 역할을 수행한다. 이 효소는 섭취된 지방 가수분해의 약 50 내지 70%를 책임진다. 지방 소화에 있어서의 췌장 라이페이스의 높은 중요성으로 인하여 이 효소의 억제능 분석은 천연 물질의 항-비만 가능성을 결정하기 위하여 가장 널리 사용되는 방법이다. 췌장 라이페이스의 활성 억제가 비만의 개선에 중요한 이유는 이들이 어떠한 핵심 마카니즘을 변경하지 않으면서도 장 내의 소화를 수정하여 안전하게 에너지 흡수를 억제할 수 있다는 점이다.
본 발명에서, 케피어 유래 균주의 사균체의 파쇄 현택액(heat-killed and sonicated suspension; HSS)은 췌장 라이페이스 활성을 억제하였으나, 이 현탁액을 원심분리한 상등액인 수용성 분획(heat-killed soluble fraction; HSF)은 그렇지 않았다. 이는 사균체의 친수성 성분 보다는 소수성 성분이 췌장 라이페이스를 억제할 수 있다는 것을 의미한다. 케피어 유래 균주의 HSF는 열처리 사균의 파쇄 후 원심분리에 의해 제조되기 때문에 소수성 성분을 함유하지 않아 라이페이스의 활성을 억제할 수 없었다. 결국, 케피어 유래 균주의 S-층 단백질 및 리포테이코산과 같은 소수성 성분이 프로바이오틱 균의 라이페이스 억제 활성에 1차적인 역할을 한다는 것을 알 수 있다.
본 발명에서, 케피어 유래 균주의 사균체는 세포 내의 지질 생성을 억제한다. 본 발명의 일 실시예에서는 세포내 지질 축적을 3T3-L1 세포를 오일 레드 O로 염색하여 확인하였다. 케피어 유래 균주 중 어느 것도 지질 측정 시험 전에 독성을 나타내지 않는 것으로 조사되었기 때문에 케피어 균들의 지질 축적 저해 효과는 세포 생존의 감소에 의한 것이 아니라 지질생성의 억제에 기인한다는 것을 알 수 있다.
비만은 섬유아세포 지방전구세포의 과도한 분화로 인한 지방세포의 수적 및/또는 크기적 증가 상태이다. 3T3-L1 지방전구세포는 지방전구세포의 분화를 생체 외 실험으로 조사할 수 있는 모델이며, 생체 내 분화 메커니즘을 신뢰가능하게 모방하는 것으로 알려졌고 지방세포의 모폴로지 및 생화학적 특성을 거의 대부분 갖고 있다. 이러한 이유로 3T3-L1 지방세포 모델은 열처리 케피어 사균체의 항-비만 효과를 신빙성있게 설명할 수 있다.
기존의 유산균에 대한 항-지질 생성 특성에 대한 연구는 오직 수용성 세포 분획에 대해서만 수행되었으며 파쇄 이후 셀 현탁액에 대해서는 수행된 바가 없었다. 그러나, 본 발명에서는 케피어 유래 균주의 파쇄 현탁액(HSS) 및 이의 수용성 분획(HSF)이 모두 3T3-L1 세포 내의 트리글리세라이드 축적을 저해할 수 있다는 것을 확인하였다. 더욱이, 수용성 분획은 파쇄 현탁액(약 30%)에 비하여 더욱 우수한 저해 효과(약 45%)를 나타내었다. 즉, 케피어 유래 사균체의 수용성 분획은 췌장 라이페이스 활성을 억제할 수는 없지만, 지방 세포의 분화는 더 효과적으로 억제한다는 것을 알 수 있다.
본 발명은 또한, 케피어 유래 효모가 사균화된 이후에도 우수한 항-비만 활성을 나타낸 다는 것을 확인하였다. 케피어 효모의 저해 활성은 케피어 유산균의 그것과 유사하거나 더 우수한 수준의 췌장 라이페이스 활성 억제와 3T3-L1 세포 지질생성 억제 활성을 나타내었다.
본 발명에 따른 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상의 사균체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 비만을 개선하기 위한 기능성 식품으로 적용될 수 있다.
상기 기능성 식품은 발효식품인 것이 바람직하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어서, 상기 기능성 식품은 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류일 수 있으며, 더욱 자세히는, 유제품, 제과물, 조미료, 음료 및 드링크제, 스낵, 캔디류, 젤리류, 아이스크림 및 냉동용 디저트, 아침 곡물류, 영양바, 스낵 바 초콜렛 제품, 가공 식품, 곡물 제품 및 파스타, 스프, 소스 및 드레싱, 과자 제품, 오일 및 지방 제품, 유제품 음료 (dairy drink) 및 우유 음료, 차, 두유 및 콩 유제품 (soy dairy-like product), 냉동식품, 조리 음식 및 대체 음식, 육류 제품, 치즈, 요구르트, 빵 및 롤빵, 케이크, 쿠키 및 크래커로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품은 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상의 사균체를 포함하는 캡슐, 정제, 분말, 액상 현탁액, 환제 및 과립제 등의 제형으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품은 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상의 사균체 외에도 유효성분으로서 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 과일주스나 야채 음료 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상의 사균체는 또한, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 적용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상의 사균체를 유효성분으로서 함유하며, 통상의 방법에 따른 적절한 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)]에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리 식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 지식을 가진 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
모든 실시예의 실험 결과는 평균(mean)±표준오차(SEM)으로 표시하였고, 각 균주간의 통계적 유의성 검증은 Staticstical Package for Social Sience(SPSS) version 21.0을 이용하여 p<0.05의 수준에서 one-way analysis of variance(ANOVA) 및 Duncan's multiple range test를 통해 검증하였다.
제조예 1: 열처리 사균체의 제조
아래 표 1에 나열한 케피어 유래 유산균 및 효모 균주 15종 및 ATCC에서 구매한 2종의 균을 각각 MRS 액체 배지에서 효모는 37℃, 유산균은 30℃으로 24시간 동안 배양하였다.
ATCC에서 구매한 SC6037과 KM34440의 경우, 기존 효모와 케피어 유래 효모와의 활성을 비교하기 위한 대조군으로 사용하였다.
배양된 각 균을 9,190×g로 5분간 4℃에서 원심분리한 후 멸균생리식염수에 2회, 멸균증류수에 1회 세척하고, 95℃에서 5분간 열처리 사멸(heat-killed)시켰다.
열처리 균을 동결건조한 후 멸균증류수에 재분산시킨 후 초음파균질기(Sonics & Materials Inc.)를 이용하여 4℃에서 50초 파쇄 및 59초 휴식을 반복하여 초음파 파쇄 처리함으로써, 케피어 유래 균주의 열처리 및 파쇄 현탁액(Heat-killed and sonicated suspension; HSS)을 수득하였다.
또한, 상기 HSS를 1,100×g로 15분 간 4℃에서 원심분리한 상등액을 분획하여, 케피어 유래 균주의 열처리 수용성 분획(Heat-killed soluble fraction; HSF)를 수득하였다.
실시예 1: 췌장 라이페이스 억제 활성 분석
제조예 1에서 수득한 HSS 및 HSF의 췌장 라이페이스 활성 억제 효과를 확인하였다.
돼지 췌장 라이페이스(porcine pancreatic lipase)를 EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid) 버퍼(1mM morpholinopropane-sulphonic acid(MOPS)와 1mM EDTA의 혼합액)에 25mg/mL로 녹여 원심분리한 상등액을 효소액으로 사용하고, 100mM Tris-HCl과 5mM CaCl2를 혼합한 용액을 에세이 버퍼(assay buffer)로 사용하였으며, p-니트로페닐 부티레이트(p-nitrophenyl butyrate; p-NPB)를 기질로 사용하였다.
169μL의 에세이 버퍼와 6μL의 효소 버퍼를 혼합하여 총 175μL의 효소 에세이 버퍼 용액을 제조한 후 1×108CFU/mL 농도로 4mM Tris-HCl에 녹인 균 샘플 4μL을 혼합한 후 15μL의 기질 용액을 더하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 대조군으로는 균을 함유하지 않은 Tris-HCl을 사용하였다. 효소 반응에 의해 방출된 p-nitrophenol은 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과, 모든 균주의 HSF의 경우 췌장 라이페이스 억제 활성을 나타내지 않았다.
반면, 도 1에서 확인 가능한 바와 같이, HSS의 경우 모든 효모 및 유산균 균주가 통계적으로 유의적인 라이페이스 억제 활성을 나타냈다.
케피어 유래 효모의 경우 KMKU01번 균주가 가장 높은 억제 활성을 보였고, 다음으로 KMKU04가 높은 활성을 보였다.
케피어 유산균의 경우 LMDH04가 가장 높은 저해활성을 보였고, LKDH5 및 LMDH09이 다음으로 높은 활성을 보였다.
실시예 2: 세포 독성 평가
양성 대조군인 SC6037 및 KM34440 균과, 전체 실험군 중 LKDH5, LLDH01, LLDH02, LMDH04, LMDH09 및 LKDH1에 대하여 세포 독성 평가를 수행하였다.
3T3-L1 지방전구세포에 대한 열처리 균주의 독성 평가를 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 이용하여 수행하였다.
ATCC에서 구입한 3T3-L1 세포를 96-well 플레이트에 1×104CFU/mL의 농도로 식종하여 high glucose(Gibco), 10% 소혈청(bovine serum) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(P/S, Gibco)을 함유하는 둘베코수정이글배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium; DMEM)에서 24시간 동안 배양하였다.
상기 배양액에 20μL의 HSS 및 HSF 샘플을 처리하고, 대조군은 PBS(phosphate-buffered saline)을 처리하여 24시간동안 추가로 배양하였다.
이후 MTT(Sigma-Aldrich)를 0.5mg/mL의 농도로 PBS에 녹인 용액 20μL을 처리하여 어두운 곳에서 4시간 배양하고, 반응을 통해 생성된 보라색 포르마잔 결정을 1,500rpm으로 5분간 원심분리하였다. 이후 포르마잔을 디메틸술폭사이드(DMSO)로 15분간 녹이고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 균이 처리되지 않은 세포의 생존율을 100%로 세포 생존율을 계산하여 도 2에 나타내었다.
도 2에서, 8종 균주의 HSS(도 2(a)) 및 HSF(도 2(b)) 모두 독성을 가지지 않는다는 것이 확인되었다.
HSS의 경우, 107와 2×107CFU/mL의 농도의 균주 샘플을 처리한 지방전구세포가 각각 평균 118%와 104%의 생존율을 보였고, HSF의 경우, 107와 2×107 CFU/mL의 농도의 균주 샘플을 처리한 지방전구세포가 각각 평균 188%와 218%의 생존율을 보였다.
실시예 3: 지방세포 분화 억제 활성 분석
열처리 균주 8종의 3T3-L1 지방세포의 분화 억제 활성을 평가하였다.
3T3-L1 지방세포를 6-well 플레이트에 배양 및 분화시키고, 분화 유도기간 4일 및 분화 과정 6일 동안 8종 균주의 HSS 및 HSF을 107 및 2×107CFU/mL의 농도로 처리하였다.
지방세포 3T3-L1를 BS 및 1% P/S를 함유한 DMEM 배지에서 confluence가 100%가 될 때까지 배양한 후, 10% FBS, 1% P/S, 0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), 1μM dexamethasone(DEX) 및 10μg/mL 인슐린을 함유한 MDI 배지에서 2일, 10% FBS, 1% P/S 및 10μg/mL 인슐린을 함유한 분화 성숙 배지에서 2일, 마지막으로 10% FBS 및 1% P/S를 함유한 배지에서 2일간 배양하여 분화시켰다. 지방세포의 배양은 37℃의 5% CO2를 유지하는 CO2 인큐베이터(써모피셔사이언티픽코리아)에서 배양했다.
분화가 완전히 끝난 10일 후 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 0.5% 글루타알데하이드 용액(Junsei Chemical Co.)으로 15분간 고정시킨 후, 고정된 세포를 PBS와 60% 이소프로판올(대정화학)로 세척하였다. 세척한 용액을 오일 레드 O(Oil red O)를 3mg/mL 농도로 이소프로판올에 녹인 오일 레드 O 완충 용액 60% 및 증류수 40%를 혼합한 오일 레드 O 작동 용액으로 15분간 염색하였다.
세포들을 글리세롤 젤라틴(Sigma-Aldrich)에 마운트하고, 분화된 세포 모폴로지를 디지털 카메라(Olympus Camedia C-7070)가 장착된 Olympus CKX41 현미경을 이용하여 캡쳐하여 도 3에 나타내었다.
또한, 염색 후 세포를 PBS와 60% 이소프로판올로 세척한 후, 100% 이소프로판올로 5분간 염색된 지방성분을 추출하고 10,000×g로 2분 간 원심분리한 후 상등액을 480 nm에서 흡광도를 측정하여, 샘플 처리 없이 분화한 세포를 대조군으로 하여 분화저해활성을 계산하였다. 세포 내 지방의 상대적인 양(ODsample / ODcontrol) x 100을 계산하여 도 4에 나타내었다.
도 4에서, 모든 열처리 균주의 HSS(도 4(a)) 및 HSF(도 4(b))가 유의적으로 지방세포 분화를 억제하는 것으로 나타났다.
구체적으로, HSSs와 HSFs는 각각 평균 30%와 45% 지방세포 내 지방 분화를 저해하였다. HSS 중에는 LKDH1과 KMKU01 균주가 가장 효과적으로 지방분화를 억제하였고, 반면에 HSF의 경우 균주별 유의적인 차이가 없었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (10)
- 케피어(Kefir) 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상의 사균체를 포함하는 비만 개선용 기능성 식품으로서,
상기 유산균이 락토바실러스 케피어리(Lactobacillus kefiri), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. Lactis) 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로부터 선택된 1종 이상이고,
상기 효모가 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)이며,
상기 사균체가 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상을 열처리 사멸 후 파쇄한 현탁액의 수용성 분획의 형태인 것을 특징으로 하는, 비만 개선용 기능성 식품.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 사균체가 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상을 80℃ 이상에서 열처리 사멸시킨 것임을 특징으로 하는, 비만 개선용 기능성 식품.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
지방 세포의 분화를 저해하는 것을 특징으로 하는, 비만 개선용 기능성 식품.
- 제 1 항에 있어서,
상기 식품이 발효식품인 것을 특징으로 하는, 비만 개선용 기능성 식품.
- 케피어(Kefir) 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상의 사균체를 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물으로서,
상기 유산균이 락토바실러스 케피어리(Lactobacillus kefiri), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. Lactis) 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로부터 선택된 1종 이상이고,
상기 효모가 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)이며,
상기 사균체가 케피어 유래 유산균 및 효모 중 하나 이상을 열처리 사멸 후 파쇄한 현탁액의 수용성 분획의 형태인 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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| JP2010037225A (ja) * | 2008-08-01 | 2010-02-18 | Nippon Kefia Kk | 乳清ケフィアを有効成分として含んでなる体脂肪減少剤 |
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| Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, vol.81, no.5, pp.958-965, 2017.01.23. |
| BMC Complementary and Alternative medicine, 2002, 2, pp.1-7. |
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| KR20230059929A (ko) | 2021-10-26 | 2023-05-04 | 건국대학교 산학협력단 | 감귤박, 유청 및 유산균 생물전환과 유산균 사균체를 포함한 체중조절 반려견 사료 조성물 |
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