KR102121826B1 - 간 기능 개선용 유산균 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 간 기능 개선용 유산균 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 간 기능 개선용 유산균은 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성이 높아 숙취해소 활성이 뛰어나며, 내산성 및 내담즙성이 우수하기 때문에, 알코올성 간질환의 예방 등 간 기능 개선용도 또는 숙취 해소 용도로 사용하기 위한 식품 등에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 간 기능 개선용 유산균 및 이의 용도에 관한 것이다.
알코올성 간질환은 과다한 음주로 인해 발생하는 간질환을 의미하며, 무증상 단순 지방간에서부터 알코올성 간염과 간경변 및 이에 의한 말기 간부전에 이르기까지의 다양한 질환군을 일컫는다. 알코올성 간질환은 과도한 음주에 의해 주로 발생하며, 섭취한 알코올을 분해하는 과정에서 생성되는 아세트알데하이드에 의한 간세포의 손상에 기인한다.
한편, 알코올 대사 결과 지방산이 생성되어 간에 지방이 축적됨에 따라 알코올성 지방간이 발생할 수 있으며, 알코올성 지방간은 만성 간질환으로 진행되는 경우가 많아 문제가 된다.
알코올의 과량 섭취나 만성적인 섭취는 소화관 점막을 손상시키고, 많은 장기와 조직에 유해한 손상을 미친다. 또한 알코올 분해과정의 중간생성물인 아세트알데하이드는 알코올 그 자체보다 더 큰 독성을 지니는데, 그 독성에 의해 간세포의 장애가 초래되어 알코올성 간염이나 간경화증이 유발될 수 있다.
알코올의 과량 섭취나 만성적인 섭취는 소화관 점막을 손상시켜 영양소 흡수장애와 영양결핍을 야기하며, 많은 장기와 조직에 유해한 손상을 미친다. 또한 아세트알데하이드 독성에 의해 장 상피 세포 내 미세소관(microtubule)의 손상이 일어나 세포골격이 파괴되고, 이는 곧 장 투과성을 증가시킨다.
장 투과성이 높아지면서 혈류 내로 내독소의 유입이 많아지게 되는데, 이 또한 간 손상에 큰 문제가 된다. 혈 중에 내독소의 농도가 높아지면 Kupffer cell의 toll like receptor의 발현증가로 인하여 Kuffer cell의 활성화가 이뤄진다. 결국 간세포에서 TNF-α, IL-1, IL-6와 같은 염증 유발 사이토카인 분비가 촉진되어 간세포 손상이 유발된다. 그 독성에 의해 간세포의 장애가 초래되어 알코올성 간염이나 간경화증이 유발될 수 있다.
최근 장내 유익균으로 각광을 받고 있는 프로바이오틱스(Probiotics)는 장내 부패균과 병원균에 대한 증식 및 부패활동을 억제하는 효과를 나타내므로 질병의 예방 및 치료에 다양하게 적용되고 있다. 그러나, 간 기능 개선에 적용할 정도로 충분한 알코올 및/또는 아세트알데하이드 분해 활성을 나타내는 균주에 대한 연구는 아직 부족한 단계이며, 알코올 탈수소효소 활성 또는 아세트알데하이드 탈수소효소 활성을 나타내는 것으로 알려진 균주는 대부분 충분한 활성을 나타내지 않아 적용에 한계가 있었다.
간독성을 측정하기 위한 in vitro 시험법에는 배양이 편리하고 재현성 있는 결과를 얻을 수 있는 immortalized human hepatic tumor derived cell line이 널리 사용되고 있는데, 그 중에서도 가장 일반적으로 사용되고 있는 세포 중의 하나가 HepG2 세포이다. HepG2 세포에는 일부 cytochrome(CYP) enzyme이 부족하지만, phase II enzyme과 transporter가 in vivo 수준으로 있어 간독성을 예측하고 기전을 연구하기에 적합한 모델이다.
또한 대한민국 특허출원 제 2004-98717호, 제 2003-77488호, 제 2012-13754호, 제 2012-13753호에 기재된 바와 같이 에탈올과 아세트알데하이드 분해 활성이 포함된 유산균 및 식품조성물이 있지만, 위장관에 존재하는 미생물에 의해 대사되지 않고 소화 기관에서 흡수된 알코올 또는 아세트알데하이드에 의한 간 손상으로부터 보호할 필요가 있다. 따라서 소화 기관에 흡수된 알코올 또는 아세트알데하이드에 의한 간 손상으로부터 보호할 필요성 때문에, 본 발명에서는 알코올 간손상에 의한 염증성 사이토카인 발현을 감소시킴으로써 간 기능 개선하는 기작이 필요하다.
이에 본 발명자들은 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성이 높고 알코올성 간세포 손상에 의한 염증성 사이토카인 발현 감소가 우수한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 락토바실러스 브레비스 균주를 통하여 간 기능을 개선할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성이 높은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) DSR J266(미생물 수탁번호: KFCC11765P)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성이 높은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) DSR J301(미생물 수탁번호: KFCC11766P)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주를 포함하는 간 기능 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주를 포함하는 간 기능 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주를 포함하는 숙취 해소용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성이 높은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) DSR J266(미생물 수탁번호: KFCC11765P)을 제공한다.
상기 락토바실러스 플란타룸 균주는 김치에서 분리한 것으로, 상기 락토바실러스 플란타룸 DSR J266을 한국미생물보존센터에 2018년 1월 23일자로 수탁하였다(미생물 수탁번호: KFCC11765P). 본 발명에서, 락토바실러스 플란타룸 DSR J266과 락토바실러스 플란타룸 LP266은 동일한 균주(수탁번호: KFCC11765P)를 의미하고, 서로 혼용되어 사용되며, 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 양상은 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성이 높은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) DSR J301(미생물 수탁번호: KFCC11766P)를 제공한다.
상기 락토바실러스 브레비스 균주는 김치에서 분리한 것으로, 상기 락토바실러스 브레비스 DSR J301을 한국미생물보존센터에 2018년 1월 23일자로 수탁하였다(미생물 수탁번호: KFCC11766P). 본 발명에서, 락토바실러스 브레비스 DSR J301과 락토바실러스 브레비스 LB301은 동일한 균주(수탁번호: KFCC11766P)를 의미하고, 서로 혼용되어 사용되며, 서열번호 2의 16S rRNA 서열을 갖는다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주 및/또는 락토바실러스 브레비스 균주는 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성이 높고, 내산성 및 내담즙성이 우수하며, 알코올 손상에 의해 간세포에서 발현되는 염증성 사이토카인의 수준을 감소시키므로, 간 기능 개선에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 간 기능 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, '간 기능 개선'은 간의 탄수화물 대사, 아미노산 및 단백질 대사, 지방 대사, 담즙산 및 빌리루빈 대사, 비타민 및 무기질 대사, 호르몬 대사, 해독 작용 및/또는 살균 작용 등의 대사작용 효율을 유지 또는 향상시키는 것을 의미하며, 상기의 대사작용 효율이 저하되는 정도를 감소시키는 것을 포함한다. 상기의 대사작용 효율을 저하시키는 주요 요인은 간염, 지방간, 알코올성 간 질환, 간암, 간경변증, 간농양 및 간혈관종 등의 간 질환이며, 그 밖에, 스트레스, 불규칙적인 취침시간, 과도한 음주 및 흡연 등 건강에 좋지 않은 생활습관을 포함한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주 및 락토바실러스 브레비스 균주를 배양하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있으나, 상기 균주를 탈지유에 배양했을 때 유산균의 증식이 활발하고, 산도에 영향을 주지 않기 때문에, 유제품, 특히 발효유에 첨가될 경우, 제품의 물성 또는 유통기한에 영향을 주지 않으면서도, 아세트알데하이드 제거에 따른 간 기능 개선 및 숙취 해소 효과와 같은 기능성을 부여할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 트레할로스, 히알루론산, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 공지된 간 기능 개선에 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 간 기능 개선을 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001~1000㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물의 제형은 분말, 과립, 정제 및 캅셀로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 등의 고형제제 형태로 투여될 수 있으며, 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물을 분말, 과립, 정제 또는 캅셀 형태로 제형화 할 경우, 이의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 제제화에 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함하여 조제될 수 있으며, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 또는 탈크 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 간 기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주 및 락토바실러스 브레비스 균주를 포함하는 식품 조성물은 유제품, 건강기능식품 및 식품첨가제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 유제품은 우유, 발효유, 요구르트, 버터, 치즈, 분유 및 콩 유제품(soy dairy-like product)일 수 있고, 건강기능식품은 락토바실러스 플란타룸 균주 및 락토바실러스 브레비스 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 분말제품, 과립제품, 정제제품 또는 캅셀제품일 수 있으며, 식품첨가제는 김치, 된장 등의 발효식품, 음료류, 과자류, 캔디류, 초콜렛, 소스 및 드레싱, 냉동식품, 빵류, 효모 제품, 케이크, 쿠키, 크래커, 아이스크림 및 냉동용 디저트 등에 첨가되는 것일 수 있다.
상기 유제품, 건강기능식품 또는 식품첨가제는 유효성분으로 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주 및 락토바실러스 브레비스 균주뿐만 아니라, 유제품, 건강기능식품 또는 식품첨가제의 제조 시에 통상적으로 사용되는 성분을 포함하여 제조될 수 있으며, 상기 성분은 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 유제품, 건강기능식품 또는 식품첨가제 제조에 통상적으로 사용되는 탄수화물은 예를 들어, 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스, 올리고당 등의 디사카라이드; 및 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드일 수 있다. 또한, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올을 사용할 수 있으며, 타우마틴 또는 레바우디오시드 A, 글리시르히진과 같은 스테비아 추출물 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 더 포함할 수 있다.
상기 유제품, 건강기능식품 또는 식품첨가제에 있어서, 락토바실러스 플란타룸 균주 및 락토바실러스 브레비스 균주는 유제품, 건강기능식품 또는 식품첨가제에 대하여 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 20 중량로 포함될 수 있고, 최종 소비되는 제형을 기준으로 1×105 내지 1×109CFU/g, 바람직하게는 1×105 내지 1×108CFU/g으로 포함될 수 있다. 상기 유제품, 건강기능식품 또는 식품첨가제를 통한 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주 및 락토바실러스 브레비스 균주의 1일 섭취량은 1×105 내지 1×108CFU/kg, 바람직하게는 1×105 내지 1×107CFU/kg이고, 하루에 일 회 또는 수 회로 나누어 섭취할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주 및 락토바실러스 브레비스 균주 또는 이의 배양물은 유제품, 건강기능식품 및 식품첨가제 등의 식품을 제조하기 위한 스타터(starter)로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 숙취 해소용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "숙취"는 술에 취한 뒤의 특이한 불쾌감이나 두통, 구토, 또는 심신의 작업능력 감퇴 등의 증상이 1 내지 2일간 지속되는 상태를 의미하며, 이는 음주 후 체내에 남아있는 알코올 및/또는 아세트알데하이드에 의해 기인하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주 및 락토바실러스 브레비스 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 조성물은 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성을 증가시키므로 알코올 및 아세트알데하이드에 의한 숙취를 해소하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 발효식품, 우유, 발효유, 요구르트, 버터, 치즈, 분유, 콩 유제품(soy dairy-like), 분말제품, 과립제품, 정제제품, 캅셀제품, 음료류, 과자류, 캔디류, 초콜렛, 소스 및 드레싱, 냉동식품, 빵류, 효모제품, 제과류, 아이스크림 및 냉동용 디저트로 이루어진 군에서 선택되는 제품에 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주 및 락토바실러스 브레비스 균주를 종균으로 이용하여 제조한 발효식품의 종류는 장류로써 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 또는 혼합간장 일 수 있고, 김치류 사용하는 주원료의 종류나 형태, 담그는 방법, 시기, 지방 등에 따라 그 종류가 다양하여 통배추, 김치, 깍뚜기, 동치미, 총각김치, 무우짠지, 보쌈김치, 석박지, 오이소배기, 오이지 등일 수 있으며, 젓갈류로는 멸치, 까나리, 조기, 황석어, 갈치, 밴댕이, 고등어, 꽁치, 가오리, 가자미, 넙치, 농어, 대구, 돔, 명태, 방어, 병어, 전어, 삼치, 임연수어, 쥐치, 민어, 숭어, 조개, 바지락, 홍합, 소라, 전복, 굴, 대합, 꼬막 또는 성게를 원료로 한 젓갈일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양상은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.
본 발명의 균주 배양액에는 상기 균주가 생산해 낸 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성 물질 등이 포함되어 있어 생균제 조성물의 유효성분으로 포함되었을 때, 균주를 포함한 조성물과 동등한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 생균제 조성물은 알코올 탈수소효소 및/또는 아세트알데하이드 탈수소효소 활성을 타나내는 공지된 미생물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 생균제 조성물은 상기 유효 성분 외에 통상적인 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 조성물은 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 동결건조 또는 열건조될 수 있고, 캡슐화된 형태 또는 배양 현탁액이나 건조 분말 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 생균제 조성물은 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성이 우수한 균주 또는 그 배양액을 포함함으로써, 숙취해소 활성이 우수하며, 내산성 및 내담즙성이 우수하므로, 알코올성 간질환의 예방 등 간 기능 개선용도 또는 숙취 해소 용도로 사용하기 위한 식품 또는 의약품 등에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 간 기능 개선용 유산균은 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성이 높아 숙취해소 활성이 뛰어나며, 내산성 및 내담즙성이 우수하기 때문에, 알코올성 간질환의 예방 등 간 기능 개선용도 또는 숙취 해소 용도로 사용하기 위한 식품 등에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 선별한 유산균의 알코올 탈수소효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에서 선별한 유산균의 아세트알데하이드 탈수소효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에서 선별한 유산균의 TNF-α 분비 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 선별한 유산균의 IL-8 분비 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에서 선별한 유산균의 아세트알데하이드 탈수소효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에서 선별한 유산균의 TNF-α 분비 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 선별한 유산균의 IL-8 분비 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 김치 유산균 분리
국내에서 시판되는 25종류의 김치로부터 유산균을 분리하였다.
구체적으로, 생리식염수에 현탁시킨 각 김치의 현탁액을 MRS 아가(agar) 배지에 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. MRS 아가 배지상에 형성된 유산균 중에서, 형태학(morphology)적으로 상이한 것을 위주로 선별하여 37℃의 MRS broth에서 24시간 동안 계대배양하였다. 분리된 균주들 중에서, 배양 중 가스가 형성된 균주 18종을 선별하였다.
선별한 균주들을 BCP(bromocresol purple) 아가 배지에 배양하여 확인한 결과, 선별한 균주들 모두 유산(lactic acid)을 생성하는 유산균임을 확인하다. 또한, 상기 균주들을 동정한 결과, 각각 하기 표 1과 같은 균주임을 확인하였다.
균주 번호 | 균주 명칭 | 균주 종류 |
1 | LM066 | Leuconostoc mesenteroides |
2 | LP067 | Lactobacillus plantarum |
3 | LP068 | Lactobacillus plantarum |
4 | LP072 | Lactobacillus plantarum |
5 | LP089 | Lactobacillus plantarum |
6 | LP094 | Lactobacillus plantarum |
7 | LP188 | Lactobacillus plantarum |
8 | LM189 | Leuconostoc mesenteroides |
9 | LM190 | Leuconostoc mesenteroides |
10 | LP192 | Lactobacillus plantarum |
11 | LP254 | Lactobacillus plantarum |
12 | LP262 | Lactobacillus plantarum |
13 | LP266 | Lactobacillus plantarum |
14 | LB301 | Lactobacillus brevis |
15 | LB304 | Lactobacillus brevis |
16 | LM512 | Leuconostoc mesenteroides |
17 | PP515 | Pediococcus pentosaceus |
18 | PP516 | Pediococcus pentosaceus |
실시예
2. 유산균의 알코올 및
아세트알데하이드
분해능 확인
<2-1> 유산균의
조효소액
제조
균주를 MRS broth 배지에 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 균체를 회수하여 멸균된 pH 7.4의 인산칼륨완충용액(potassium phosphate buffer; PBS) 100mM 로 워싱(washing)하였다. 회수된 균체는 인산칼륨완충용액 100mM에 현탁하여 맥팔랜드(McFarland) No. 3 정도의 수준으로 적정하였다. 준비된 현탁액을 과열되지 않도록 얼음에 천천히 냉각시키면서 30초씩 5회 초음파파쇄(sonification)하여 획득한 세포파쇄액을 13,000rpm에서 1시간 동안 원심 분리한 후, 상등액을 취하여 조효소액을 분리하였다. 분리한 조효소액은 -80℃의 초저온 냉동고에 저장하여 사용하였다.
<2-2> 알코올 탈수소효소 활성 확인
상기 실시예 1에서 선별한 18종의 유산균의 알코올 분해능을 측정하기 위하여, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 조효소액을 이용하여 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase; ADH) 활성을 측정하였다.
구체적으로, NAD+ 2.5mM 및 에탄올을 첨가한 0.1M의 글리신 완충용액(Glycine buffer; pH 9.6) 1ml에 각 유산균의 조효소액을 100㎕를 첨가하고, 25℃의 항온수조(water bath)에서 5분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응시킨 용액 내에 생성된 NADH 함량을 340nm, 25℃에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
한편, 조효소액의 단백질 함량은 단백질 정량 키트(Bio-Rad)를 통해 측정하였다. 측정 결과를 통하여 조효소액의 단백질 mg당 반응시간 동안 생성된 NADH 양을 계산하여 ADH의 활성을 비교하였다.
그 결과, 18종의 유산균 중, LB301 및 LB304 균주의 ADH 활성이 특히 우수함을 확인하였다(표 2 및 도 1).
균주 명칭 | ADH(nmol NADH produced/min/log CFU) |
LM066 | 11 |
LP067 | 4 |
LP068 | 9 |
LP072 | 12 |
LP089 | 22 |
LP094 | 5 |
LP188 | 6 |
LM189 | 30 |
LM190 | 26 |
LP192 | 14 |
LP254 | 12 |
LP262 | 7 |
LP266 | 3 |
LB301 | 225 |
LB304 | 352 |
LM512 | 24 |
PP515 | 12 |
PP516 | 5 |
<2-3>
아세트알데하이드
탈수소효소활성 확인
상기 실시예 1에서 선별한 18종의 유산균의 알코올 분해능을 측정하기 위하여, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 조효소액을 이용하여 아세트알데하이드 탈수소효소(acetaldehyde dehydrogenase; ALDH) 활성을 측정하였다.
구체적으로, NAD+ 1mM를 첨가한 피로인산나트륨 완충용액(sodium pyrophosphate buffer; pH 8.8) 60mM에 최종 농도가 100μM이 되도록 아세트알데하이드(acetaldehyde) 및 ADH의 억제제(inhibitor)인 4-메틸피라졸(methylpyrazole)을 첨가하여 혼합용액을 제조하였다. 제조한 혼합용액 1ml에 각 유산균 조효소액 100㎕를 첨가하고, 25℃의 항온수조(water bath)에서 5분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응시킨 용액 내에 생성된 NADH 함량을 340nm, 25℃에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
한편, 조효소액의 단백질 함량은 단백질 정량 키트(Bio-Rad)를 통해 측정하였다. 측정 결과를 통하여 조효소액의 단백질 mg당 반응시간 동안 생성된 NADH 양을 계산하여 ALDH의 활성을 비교하였다.
그 결과, 18종의 유산균 중, LP089, LB301 및 LB304 균주의 ALDH 활성이 특히 우수함을 확인하였다(표 3 및 도 2).
균주 명칭 | ALDH(nmol NADH produced/min/log CFU) |
LM066 | 0.210 |
LP067 | 0.258 |
LP068 | 0.040 |
LP072 | 0.050 |
LP089 | 0.450 |
LP094 | 0.132 |
LP188 | 0.242 |
LM189 | 0.060 |
LM190 | 0.040 |
LP192 | 0.010 |
LP254 | 0.112 |
LP262 | 0.200 |
LP266 | 0.060 |
LB301 | 0.850 |
LB304 | 0.600 |
LM512 | 0.100 |
PP515 | 0.050 |
PP516 | 0.200 |
실시예
3. 알코올
손상성
염증성 사이토카인 분비 측정
<3-1>
TNF
-α 분비 억제 활성 확인
알코올 손상에 의해 간세포에서 발현되는 염증성 사이토카인 중 하나인 Tumor necrosis factor-α(TNF-α)의 분비가 상기 실시예 1에서 선별한 18종의 유산균에 의해 억제되는지 확인하였다.
구체적으로, HepG2 세포는 KCLB(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받았으며, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)을 첨가한 돌베코수정이글배지(dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 48 웰 플레이트에 분주(1×105 cells/well)하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 유산균 조효소액은 DMEM으로 농도별로 희석하여 세포에 처리(400μL/well)한 후, 배양기에서 반응시켰다. 24시간 후 플레이트를 원심분리(×500g, 15분)하여 획득한 상층액 50μL를 Human TNF-alpha Quantikine ELISA Kit(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)에 반응시킨 후 microplate reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 후, 각 웰의 단백질을 정량하고, TNF-α의 양을 단백질 양으로 나누어 보정하였다.
그 결과, TNF-α 발현 억제 활성은 LP266 균주가 가장 우수함을 확인하였다(도 3).
<3-2> IL-8 분비 억제 활성 확인
상기 실시예 1에서 선별한 18종의 유산균 중 상기 실시예 2의 결과를 종합적으로 고려하여 효과가 우수한 5종의 균주(LP89, LP254, LP266, LB301 및 LB304)를 선별하였으며, 알코올 손상에 의해 간세포에서 발현되는 염증성 사이토카인 중 하나인 Interleukin 8(IL-8)의 분비가 상기 5종의 균주에 의해 억제되는지 확인하였다.
구체적으로, HepG2 세포는 KCLB(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받았으며, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)을 첨가한 돌베코수정이글배지(dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 48 웰 플레이트에 분주(1×105 cells/well)하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 유산균 조효소액은 DMEM으로 농도별로 희석하여 세포에 처리(400μL/well)하고 배양기에서 반응시켰다. 24시간 후 플레이트를 원심분리(×500g, 15분)하여 획득한 상층액 50μL를 Human IL-8 Quantikine ELISA Kit(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)에 반응시킨 후 microplate reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 후, 각 웰의 단백질을 정량하고, IL-8의 양을 단백질 양으로 나누어 보정하였다.
그 결과, IL-8 발현 억제 활성은 LP266, LB301 및 LB304 균주가 가장 우수함을 확인하였다(도 4).
실시예
4. 유산균의
내산성
및
내담즙성
측정
<4-1> 유산균의
내산성
확인
상기 실시예 2 및 3에서 효과가 우수함을 확인한 LP089, LP266, LB301 및 LB304 균주의 유산균의 내산성을 확인하였다.
구체적으로, 1N HCL 용액으로 pH 3.0으로 적정한 인산완충용액(phosphate buffer) 50mM를 멸균하여 내산용액을 제조하였다. 제조한 내산용액에, MRS broth 배지에서 24시간 배양시킨 18종의 균주를 1% 접종하여, 초기 접종시 생균수 및 접종 후 37℃에서 2시간 동안 배양한 후의 생균수를 측정하고, 생존율을 계산하여 내산성이 있는 균주를 확인하였다.
그 결과, LP089, LP266, LB301 및 LB304 균주 모두 60% 이상의 생존율을 나타내었으며, 특히 LP089, LB301 및 LB304 균주는 70% 이상의 생존율을 보여, 내산성이 우수함을 확인하였다(표 4).
균주 명칭 | 생존율(%) |
LP089 | 84.62 |
LP266 | 66.67 |
LB301 | 77.71 |
LB304 | 78.94 |
<4-2> 유산균의
내담즙성
확인
상기 실시예 2 및 3에서 효과가 우수함을 확인한 LP089, LP266, LB301 및 LB304 균주의 내담즙성을 확인하였다.
구체적으로, pH 7.0의 인산 완충용액(phosphate buffer) 50mM에 Oxgall(Difco)을 1% 첨가하여 내담즙 배지를 제조하였다. 제조한 내담즙 배지에, MRS broth 배지에서 24시간 배양시킨 균을 1% 접종하여, 초기 접종시 생균수 및 접종 후 37℃에서 6시간 동안 배양한 후의 생균수를 측정하고, 생존율을 계산하여 내담즙성이 있는 균주를 확인하였다.
그 결과, LP089, LP266, LB301 및 LB304 균주 모두 60% 이상의 생존율을 나타내었으며, 특히 LP089, LP266 및 LB301 균주는 70% 이상의 생존율을 보여, 내담즙성이 우수함을 확인하였다(표 5).
균주 명칭 | 생존율(%) |
LP089 | 98.13 |
LP266 | 90.91 |
LB301 | 74.19 |
LB304 | 64.19 |
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> DAESANG CORPORATION
<120> Lactic acid bacteria for improving liver function and uses
thereof
<130> PN170391
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1524
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
ttttgagttt tggattcggc tcaggatgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc 60
gaacgcacag cgaaaggtgc ttgcaccttt caagtgagtg gcgaacgggt gagtaacacg 120
tggacaacct gcctcaaggc tggggataac atttggaaac agatgctaat accgaataaa 180
acttagtgtc gcatgacaca aagttaaaag gcgcttcggc gtcacctaga gatggatccg 240
cggtgcatta gttagttggt ggggtaaagg cctaccaaga caatgatgca tagccgagtt 300
gagagactga tcggccacat tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggctgca 360
gtagggaatc ttccacaatg ggcgaaagcc tgatggagca acgccgcgtg tgtgatgaag 420
gctttcgggt cgtaaagcac tgttgtatgg gaagaacagc tagaatagga aatgatttta 480
gtttgacggt accataccag aaagggacgg ctaaatacgt gccagcagcc gcggtaatac 540
gtatgtcccg agcgttatcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcagac ggtttattaa 600
gtctgatgtg aaagcccgga gctcaactcc ggaatggcat tggaaactgg ttaacttgag 660
tgcagtagag gtaagtggaa ctccatgtgt agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa 720
caccagtggc gaaggcggct tactggactg caactgacgt tgaggctcga aagtgtgggt 780
agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acaccgtaaa cgatgaacac taggtgttag 840
gaggtttccg cctcttagtg ccgaagctaa cgcattaagt gttccgcctg gggagtacga 900
ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg agcatgtggt 960
ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctttgaa gcttttagag 1020
atagaagtgt tctcttcgga gacaaagtga caggtggtgc atggtcgtcg tcagctcgtg 1080
tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttattgttag ttgccagcat 1140
tcagatgggc actctagcga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggcgg ggacgacgtc 1200
agatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggcgt atacaacgag 1260
ttgccaaccc gcgagggtga gctaatctct taaagtacgt ctcagttcgg attgtagtct 1320
gcaactcgac tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcacg ccgcggtgaa 1380
tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtttgta atgcccaaag 1440
ccggtggcct aaccttttag gaaggagccg tctaaggcag gacagatgac tggggtgaag 1500
tcgtacaggg gttaccccgt aaaa 1524
<210> 2
<211> 1492
<212> DNA
<213> Lactobacillus brevis
<400> 2
ttttgagttt ggatactgct caggacgaac gctggcggca tgcctaatac atgcaagtcg 60
aacgagcttc cgttgaatga cgtgcttgca ctgatttcaa caatgaagcg agtggcgaac 120
tggtgagtaa cacgtgggaa atctgcccag aagcagggga taacacttgg aaacaggtgc 180
taataccgta taacaacaaa atccgcatgg attttgtttg aaaggtggct tcggctatca 240
cttctggatg atcccgcggc gtattagtta gttggtgagg taaaggccca ccaagacgat 300
gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact 360
cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat ggagcaatgc 420
cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt gttaaagaag aacacctttg 480
agagtaactg ttcaagggtt gacggtattt aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 540
gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc 600
gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctt aaccggagaa gtgcatcgga 660
aactgggaga cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg 720
tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct agtctgtaac tgacgctgag 780
gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat 840
gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca ttaagcactc 900
cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 960
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct 1020
tctgccaatc ttagagataa gacgttccct tcggggacag aatgacaggt ggtgcatggt 1080
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt 1140
atcagttgcc agcattcagt tgggcactct ggtgagactg ccggtgacaa accggaggaa 1200
ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1260
ggacggtaca acgagtcgcg aagtcgtgag gctaagctaa tctcttaaag ccgttctcag 1320
ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagttggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1380
gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt 1440
ttgtaacacc caaagccggt gagataacct cggatcagcc tcaaggcagt gc 1492
Claims (10)
- 삭제
- 삭제
- 간 기능 개선용 약학적 조성물에 있어서,
상기 조성물은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) DSR J266(미생물 수탁번호: KFCC11765P) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) DSR J301(미생물 수탁번호: KFCC11766P), 또는 이들의 배양물을 포함하고,
상기 간 기능 개선은 간 염증의 개선이고,
상기 염증은 TNF-α 및 IL-8의 발현 증가에 의한 것인
간 기능 개선용 약학적 조성물. - 간 기능 개선용 식품 조성물에 있어서,
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) DSR J266(미생물 수탁번호: KFCC11765P) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) DSR J301(미생물 수탁번호: KFCC11766P), 또는 이들의 배양물을 포함하고,
상기 간 기능 개선은 간 염증의 개선이고,
상기 염증은 TNF-α 및 IL-8의 발현 증가에 의한 것인
간 기능 개선용 식품 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 3항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 정제 및 캅셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형인 것인 간 기능 개선용 약학적 조성물.
- 제 4항에 있어서, 상기 조성물은 발효식품, 우유, 발효유, 분유, 콩 유제품(soy dairy-like), 분말제품, 과립제품, 정제제품, 캅셀제품, 음료류, 과자류, 캔디류, 소스 및 드레싱, 냉동식품, 및 효모제품으로 이루어진 군에서 선택되는 제품에 포함되는 것인 간 기능 개선용 식품 조성물.
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