JP6761268B2 - Mkp−1誘導剤 - Google Patents
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Description
細胞は、細胞外部の環境の変化や細胞外からの増殖因子などによる刺激に応答して細胞分裂を開始するが、その際に外界からの情報を認識・処理し、適切に細胞内部に伝える細胞内情報伝達システムが重要な役割を果たす。細胞内情報伝達システムにはタンパク質、脂質、糖質、核酸成分、活性酸素など様々な分子種が関与し、それぞれの活性や量を厳密に制御することで生体の恒常性が維持されている。ガンを始めとする多くの疾病では、この細胞内情報伝達システムに関わる分子に異常をきたすことで、細胞増殖がコントロールできなくなり疾病に至る事例が多い。
非特許文献11では、ラクトバチルス・ジェンセニー(Lactobacillus jensenii)TL2937株が、ブタの腸管上皮細胞のMKP−1の遺伝子発現量を増加させることを示しているが、当該乳酸菌をヒトが経口摂取した際の安全性については何ら保証されていない。また、本特許が示すラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)に属する乳酸菌については何ら示していない。
そこで、本発明者らは、日常摂取しても安全であるものの中から、MKP−1の遺伝子発現量を増加させる因子を鋭意探索した結果、ラクトバチルス(Lactobacillus)属に属する乳酸菌を見出し、本発明を完成させるに至った。
(1)ラクトバチルス(Lactobacillus)属に属する乳酸菌及び/又はその培養物を有効成分とするMKP−1(Mitogen activated protein kinase phosphatase−1)誘導剤。
(2)ラクトバチルス属に属する乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)に属する乳酸菌であることを特徴とする(1)に記載のMKP−1誘導剤。
(3)乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) SBT2171株(FERM BP−5445)又はSBT2161株(NITE BP−01707)であることを特徴とする、(2)に記載のMKP−1誘導剤。
(4)ガン細胞のMKP−1を誘導することを特徴とする、(1)〜(3)のいずれか1項に記載のMKP−1誘導剤。
(5)(1)〜(4)のいずれか1項に記載のMKP−1誘導剤を含む、抗がん剤。
(6)(1)〜(4)のいずれか1項に記載のMKP−1誘導剤を含む、ウイルス感染予防または治療剤。
(7)(1)〜(4)のいずれか1項に記載のMKP−1誘導剤を含む、抗糖尿病剤。
(8)(1)〜(4)のいずれか1項に記載のMKP−1誘導剤を含む、抗心血管疾患剤。
(9)(1)〜(4)のいずれか1項に記載のMKP−1誘導剤を含む、抗感染症予防剤。
(10)(1)〜(4)のいずれか1項に記載のMKP−1誘導剤を含む、骨粗しょう症予防剤。
(11)(1)〜(4)のいずれか1項に記載のMKP−1誘導剤を含む、神経疾患予防剤。
(12)(1)〜(11)のいずれか1項に記載の剤を含有する栄養組成物、飲食品又は飼料。
得られた培養物から遠心分離などの集菌手段によって分離された菌体をそのまま本発明の有効成分として用いることができる。濃縮、乾燥、凍結乾燥などした菌体を用いることもできるし、加熱乾燥などにより死菌体にしてもよい。
菌体として純粋に分離されたものだけでなく、培養物、懸濁物、その他の菌体含有物や、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分も用いることができる。
培養物などの形態としては、合成培地であるMRS培地(DIFCO社製)、還元脱脂乳培地など一般的に乳酸菌の培養に用いられる培地を用いた培養物だけでなく、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料などの乳製品などを例示することができるが特に限定されるものではない。
さらに、得られた培養物から遠心分離、濾過操作などの方法を用いて、乳タンパク質沈殿や菌体成分を除去することによって調製した培養上清なども用いることができる。固形分が少ない上清であるため、飲食品などへの適用範囲が広くなる。例えば、還元脱脂乳培養物を5,000rpm、10分間遠心分離することにより培養上清を調製することができる。
本発明のMKP−1誘導剤は、これを有効成分とする抗がん剤、ウイルス感染予防または治療剤、免疫抗糖尿病剤、または抗循環器疾患剤として利用することができる。
さらに、本発明のMKP−1誘導剤を飼料に配合することができる。前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株によるヒトB細胞リンパ腫株のMKP−1遺伝子発現誘導作用
1−1.試験方法
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株をMRS brothで16時間培養した後、遠心分離により菌体を分離した。菌体は滅菌生理食塩水で2回、超純水で1回洗浄した後、凍結乾燥した。凍結乾燥粉末は10mg/mLとなるようにPBS(10mMリン酸緩衝生理食塩水)に懸濁した後、使用するまで−20℃で保存した。
図1に培養3、6、9時間後のMKP−1遺伝子発現量を示した。遺伝子発現量は、0時間の発現量を1とした相対値で表した。SBT2171群では、培養3時間後からMKP−1遺伝子発現量が増加し始め、培養9時間後には顕著な発現量の増加が認められた。一方、コントロール群では、MKP−1遺伝子の発現量に変化は認められなかった。培養9時間後において、SBT2171群はコントロール群よりも有意にMKP−1遺伝子の発現量が高かった。すなわち、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)によって、BJAB細胞のMKP−1遺伝子の発現が誘導されることが示された。
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株によるマウス大腸ガン由来MC38細胞のMKP−1遺伝子発現誘導作用
2−1.試験方法
マウス大腸ガン由来MC38細胞株を12wellプレートに播種し24時間培養した後、1−1で示したように調製したラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株を最終濃度10μg/mlとなるように添加し(SBT2171群)、コントロールとして、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株を含まないPBSのみを添加した(コントロール群)。両群ともに3well(n=3)ずつ設置し、培養6時間後に各wellから1−1と同様の手法にてtotal RNAを抽出した後、real−time PCRを用いてマウスMKP−1遺伝子の発現量を測定した。内在性コントロール遺伝子としてマウスGAPDH遺伝子の発現量を測定し、MKP−1遺伝子の発現量を標準化した。マウスMKP−1遺伝子発現量解析用プライマーとして、表2に示される配列表配列番号5、6を用いた。マウスGAPDH遺伝子発現量解析用プライマーとして、表2に示される配列表配列番号7、8を用いた。
MC38細胞株のMKP−1遺伝子発現量を図2に示した。遺伝子発現量は、コントロール群の遺伝子発現量を1とした相対値で表した。SBT2171群はコントロール群に対して、有意なMKP−1遺伝子発現量の増加が認められた。
すなわち、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)によって、マウス大腸ガン細胞のMKP−1遺伝子の発現が誘導されることが示された。
上記の試験例1、2により、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)菌体によって細胞のMKP−1の発現が誘導されることが明らかとなった。
MKP−1誘導剤(発酵培養物)の製造
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株菌体を各々MRS液体培地(Dihco社)にて培養した。対数増殖期にある培養液を、0.3%の酵母エキスを添加した10%還元脱脂乳(115℃、20分滅菌)に1%接種し、各々マザーカルチャーを作製した。これを100℃にて10分間加熱した10%の還元脱脂乳に2.5%添加した後、37℃で発酵を行い、pH4.3に達するまで培養した。得られた発酵乳を凍結乾燥してラクトバチルス・ヘルベティカスSBT2171株発酵乳粉末を得た。
3−1.試験方法
実施例1で得られたラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株の培養物を用いてMKP−1遺伝子発現誘導試験を行った。試験方法は試験例1に準じて行った。BJAB細胞に実施例1で調製した培養物を添加して培養し、9時間後のMKP−1遺伝子発現量を測定した結果を図3に示した。
図3より、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株の培養物を添加した群(SBT2171群)の方が、添加しない群(コントロール群)よりもMKP−1遺伝子発現量が高いことが分かった。すなわち、ラクトバチルス・ヘルベティカス培養物によって、BJAB細胞のMKP−1遺伝子発現が誘導されることが示された。
4−1.試験方法
実施例1で得られたラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株の培養物を用いて、MC38細胞株におけるMKP−1遺伝子発現誘導試験を行った。試験方法は試験例1に準じて行った。実施例1で調製した培養物を添加してMC38細胞を培養し、6時間後のMKP−1遺伝子発現量を測定した結果を図4に示した。
図4より、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株の培養物を添加した群(SBT2171群)の方が、添加しない群(コントロール群)よりもMKP−1遺伝子発現量が高いことがわかった。すなわち、ラクトバチルス・ヘルベティカス培養物によって、MC38細胞株のMKP−1遺伝子発現が誘導されることが示された。
上記の試験例3、4により、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)の培養物によって細胞のMKP−1の発現が誘導されることが明らかとなった。
各種乳酸菌によるヒトB細胞リンパ腫株のMKP−1遺伝子発現誘導作用
5−1.試験方法
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株、SBT2161株、JCM1120T株、ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)SBT2055株、JCM1131T株、ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)SBT2062株をMRS brothで16時間培養した後、遠心分離により菌体を分離した。菌体は滅菌生理食塩水で2回、超純水で1回洗浄した後、凍結乾燥した。凍結乾燥粉末は10mg/mLとなるようにPBS(10mMリン酸緩衝生理食塩水)に懸濁した後、使用するまで−20℃で保存した。
図5より、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株、SBT2161株、JCM1120T株を添加した水準において、コントロール群よりもMKP−1遺伝子発現量が統計的に有意に高いことがわかった。他の乳酸菌では、有意な差は認められず、ラクトバチルス・ヘルベティカスによって、BJAB細胞株のMKP−1遺伝子発現が誘導されることが示された。
上記の結果より、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)によって細胞のMKP−1の発現が誘導されることが明らかとなった。
MKP−1誘導剤(顆粒)の製造
ラクトバチルス・ヘルベティカスSBT2171株を食用可能な合成培地(0.5%酵母エキス、0.1%トリプチケースペプトン添加)に5重量%接種し、38℃で15時間培養後、遠心分離で菌体を回収した。回収した菌体を凍結乾燥し、前記菌体の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末1gを乳糖5gと混合し、顆粒状に成形して本発明のMKP−1誘導剤を得た。
MKP−1誘導剤(顆粒)の製造
ラクトバチルス・ヘルベティカスJCM−1120株を食用可能な合成培地(0.5%酵母エキス、0.1%トリプチケースペプトン添加)に5重量%接種し、38℃で15時間培養後、遠心分離で菌体を回収した。回収した菌体を凍結乾燥し、前記菌体の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末1gを乳糖5gと混合し、顆粒状に成形して本発明のMKP−1誘導剤を得た。
MKP−1誘導剤(散剤)の製造
第13改正日本薬局方解説書製剤総則「散剤」の規定に準拠し、上記実施例2で得られたラクトバチルス・ヘルベティカスSBT2171株の凍結乾燥粉末10gに乳糖(日局)400g、バレイショデンプン(日局)600gを加えて均一に混合し、本発明のMKP−1誘導剤を製造した。
MKP−1誘導剤(散剤)の製造
第13改正日本薬局方解説書製剤総則「散剤」の規定に準拠し、上記実施例3で得られたラクトバチルス・ヘルベティカスJCM−1120株の凍結乾燥粉末10gに乳糖(日局)400g、バレイショデンプン(日局)600gを加えて均一に混合し、本発明のMKP−1誘導剤を製造した。
スティック状栄養健康食品の製造
ビタミンC40gまたはビタミンCとクエン酸の等量混合物40g、グラニュー糖100g、コーンスターチと乳糖の等量混合物60gに、上記実施例2で得られたラクトバチルス・ヘルベティカスSBT2171株の凍結乾燥粉末40gを加えて混合した。混合物を袋に詰め、本発明のスティック状栄養健康食品を150袋製造した。
飼料の製造
大豆粕12kg、脱脂粉乳14kg、大豆油4kg、コーン油2kg、パーム油23.2kg、トウモロコシ澱粉14kg、小麦粉9kg、ふすま2kg、ビタミン混合物5kg、セルロース2.8kg、ミネラル混合物2kgを配合し、120℃、4分間殺菌して、実施例2で得られたラクトバチルス・ヘルベティカスSBT2171株10kgを配合して、飼料を製造した。
(1)ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成6年6月22日(1994年6月22日)(原寄託日)
平成8年3月6日(1996年3月6日)(原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP−5445
(2)ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2161
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
2013年9月18日(原寄託日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
NITE BP−01707
Claims (4)
- ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobac illus helveticus)の菌体及び/又はその培養物を有効成分とするヒト細胞におけるMKP−1(Mitogen activated protein kinase phosphatase−1)誘導剤。
- 乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helvet icus)SBT2171株(FERM BP−5445)又はSBT2161株(NI TE BP−01707)であることを特徴とする、請求項1に記載のMKP−1誘導剤 。
- ガン細胞のMKP−1を誘導することを特徴とする、請求項1又は2に記載のMKP−1誘導剤。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のMKP−1誘導剤を含有するMKP−1誘導用栄養組成物、又はMKP−1誘導用飲食品。
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