JP2017171616A

JP2017171616A - Ｍｋｐ−１誘導剤

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Publication number: JP2017171616A
Application number: JP2016060089A
Authority: JP
Inventors: 忠昭宮崎; Tadaaki Miyazaki; 一信馬場; Kazunobu Baba; 史彦酒井; Fumihiko Sakai
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 2016-03-24
Filing date: 2016-03-24
Publication date: 2017-09-28
Anticipated expiration: 2036-03-24
Also published as: JP6761268B2

Abstract

【課題】日常摂取しても安全であるものの中から、ＭＫＰ−１の遺伝子発現量を増加させる医薬品や飲食品及び飼料を提供することを課題とする。
【解決手段】ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）に属する乳酸菌又はその培養物を有効成分とすることにより、がん細胞内にてＭＫＰ−１の遺伝子発現量を増加させる薬剤、飲食品及び飼料を提供することが可能となった。
【選択図】図１

Description

本発明は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌を有効成分とする、ＭＫＰ−１誘導剤、及び、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌を有効成分とする、ＭＫＰ−１誘導剤を含有する栄養組成物、飲食品又は飼料に関する。

生物にとって細胞増殖は個体の発生と細胞分化を展開する上で必須の事象であり、生体恒常性を維持するためにもその増殖の過程は厳密な制御の下で行われなければならない。しかし、一度その制御機構に狂いが生じると、生体恒常性が破綻し、ガンを始めとする様々な疾病が引き起こされる。
細胞は、細胞外部の環境の変化や細胞外からの増殖因子などによる刺激に応答して細胞分裂を開始するが、その際に外界からの情報を認識・処理し、適切に細胞内部に伝える細胞内情報伝達システムが重要な役割を果たす。細胞内情報伝達システムにはタンパク質、脂質、糖質、核酸成分、活性酸素など様々な分子種が関与し、それぞれの活性や量を厳密に制御することで生体の恒常性が維持されている。ガンを始めとする多くの疾病では、この細胞内情報伝達システムに関わる分子に異常をきたすことで、細胞増殖がコントロールできなくなり疾病に至る事例が多い。

細胞増殖に重要な細胞内情報伝達経路として、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路が挙げられる。ＭＡＰＫは構造的に類似した複数のタンパク質から成るスーパーファミリーを形成しており、とくにＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、及びＥｒｋタンパク質が知られている。細胞が増殖因子やストレスなど外部からの様々な刺激を受けることでＭＡＰＫが活性化されるが、それと同時にＭＡＰＫの負の制御因子であるＭＫＰ−１（ＭＡＰＫ脱リン酸化酵素）も活性化されることで、ＭＡＰＫの異常な活性化が制御される。一方、このような制御機構に異常を呈しＭＡＰＫが異常に活性化された状態が続くようになると、ガン（非特許文献１）、リウマチ（非特許文献２）などの疾病が進行していくことが知られている。さらに最近では、高脂肪食を負荷したマウスの脂肪組織においてＭＫＰ−１の発現量が減少し、そのためＭＡＰＫであるＥｒｋタンパク質の持続的な活性化が生じ、糖尿病や心血管疾患の前駆段階であるメタボリックシンドロームに向かうことが報告されている（非特許文献３）。また、ＭＫＰ−１遺伝子を欠損したマウスに急性感染症モデルとしてリポポリサッカライドを投与すると、過剰な急性炎症が惹起されエンドトキシンショックを引き起こす（非特許文献４）ことや、ＭＫＰ−１遺伝子欠損マウスでは、骨量の減少が生じて骨粗しょう症様の症状を呈することが報告されている（非特許文献５）。また、神経変性疾患や多発神経障害では、神経細胞のＭＫＰ−１が低下することでＭＡＰＫの異常活性化が生じていることが示されている（非特許文献６）。したがって、これら疾患の予防・治療を目指す上で、ＭＫＰ−１の活性を亢進させることでＭＡＰＫの異常な活性化を防ぐ戦略が検討されてきた（非特許文献７）。

これまでに、ＭＫＰ−１の活性を亢進させるために、ＭＫＰ−１遺伝子の発現量を上げるような物質が探索され、グルココルチコイド（非特許文献８）、Ａｕｒｏｔｈｉｏｍａｌａｔｅ（非特許文献９）、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ４阻害剤（Ｒｏｌｉｐｒａｍ）（非特許文献１０）、などが報告されてきた。
非特許文献１１では、ラクトバチルス・ジェンセニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｅｎｓｅｎｉｉ）ＴＬ２９３７株が、ブタの腸管上皮細胞のＭＫＰ−１の遺伝子発現量を増加させることを示しているが、当該乳酸菌をヒトが経口摂取した際の安全性については何ら保証されていない。また、本特許が示すラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）に属する乳酸菌については何ら示していない。

Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄＮｅｂｒｅｄａ，Ａ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｃａｎｃｅｒ，２００９；９：５３７−５４９Ｓａｌｏｇｉｎ，ＫＶ，ｅｔ．ａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２００６；１７６：１８９９−９０７Ｉｔｏ，Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００７；２８２：２５４４５−２５４５２Ｚｈａｏ，Ｑ．，ｅｔ．ａｌ．，ＪＥｘｐＭｅｄ，２００６；２０３：１３１−４０Ｓａｒｔｏｒｉ，Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，ＪＤｅｎｔＲｅｓ，２００９；８８：１１２５−３０Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，ＦＡ．，ｅｔ．ａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００６；９７：１５１−６０Ｋｏｒｈｏｎｅｎ，Ｒ．，ａｎｄＭｏｉｌａｎｅｎ，Ｅ．，ＢａｓｉｃＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ，２０１４；１１４：２４−３６Ｍａｎｅｔｓｃｈ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，ＢｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１２；１６６：２０４９−５９Ｎｉｅｍｉｎｅｎ，Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ，２０１０；６２：１６５０−９Ｋｏｒｈｏｎｅｎ，Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，ＢｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１３；１６９：１５２５−３６Ｓｈｉｍａｚｕ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ，２０１２；８０：２７６−８８

非特許文献８〜１０に記載されている物質等の薬剤は、投与したときの副作用に対する懸念が大きく、健常人が予防的観点から服用することは困難であった。とくにステロイド製剤であるグルココルチコイドは、その用法の加減による副作用発現のリスクが高いことが知られている。
そこで、本発明者らは、日常摂取しても安全であるものの中から、ＭＫＰ−１の遺伝子発現量を増加させる因子を鋭意探索した結果、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌を見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち本発明は以下の構成を有する
（１）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌及び／又はその培養物を有効成分とするＭＫＰ−１（Ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−１）誘導剤。
（２）ラクトバチルス属に属する乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）に属する乳酸菌であることを特徴とする（１）に記載のＭＫＰ−１誘導剤。
（３）乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株（ＦＥＲＭＢＰ−５４４５）又はＳＢＴ２１６１株（ＮＩＴＥＢＰ−０１７０７）であることを特徴とする、（２）に記載のＭＫＰ−１誘導剤。
（４）ガン細胞のＭＫＰ−１を誘導することを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤。
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、抗がん剤。
（６）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、ウイルス感染予防または治療剤。
（７）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、抗糖尿病剤。
（８）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、抗心血管疾患剤。
（９）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、抗感染症予防剤。
（１０）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、骨粗しょう症予防剤。
（１１）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、神経疾患予防剤。
（１２）（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の剤を含有する栄養組成物、飲食品又は飼料。

ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌を摂取することで、Ｂリンパ腫細胞のＭＫＰ−１遺伝子の発現が誘導されることにより、ガンの増殖を抑制するとともに、過剰な免疫応答を予防、改善することができる。

ヒトＢ細胞リンパ腫株（ＢＪＡＢ細胞）にラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株を添加・培養し、培養後のＭＰＫ−１遺伝子の発現量を比較した図である（試験例１）。マウス大腸ガン由来ＭＣ３８細胞株にラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株を添加・培養し、培養後のＭＰＫ−１遺伝子の発現量を比較した図である（試験例２）。ヒトＢ細胞リンパ腫株（ＢＪＡＢ細胞）にラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株の培養物を添加・培養し、培養後のＭＰＫ−１遺伝子の発現量を比較した図である（試験例３）。マウス大腸ガン由来ＭＣ３８細胞株にラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株の培養物を添加・培養し、培養後のＭＰＫ−１遺伝子の発現量を比較した図である（試験例４）。ヒトＢ細胞リンパ腫株（ＢＪＡＢ細胞）にラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株、ＳＢＴ２１６１株、ＪＣＭ１１２０Ｔ株、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ＳＢＴ２０５５株、ＪＣＭ１１３１Ｔ株、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＢＴ２０６２株を添加・培養し、培養後のＭＰＫ−１遺伝子の発現量を比較した図である（試験例５）。

本発明における乳酸菌としては、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌を用いることができる。ラクトバチルス属に属する乳酸菌としては、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）に属する乳酸菌等を用いることができる。特に、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株（ＦＥＲＭＢＰ−５４４５として寄託）、ＳＢＴ２１６１株（ＮＩＴＥＢＰ−０１７０７として寄託）、ＳＢＴ２１９５株（ＦＥＲＭＰ−１１５３８として寄託）、ＳＢＴ２１９６株（ＦＥＲＭＰ−１１６７６として寄託）、ＳＢＴ００６４株（ＦＥＲＭＰ−２１０７９として寄託）、ＳＢＴ０４０２株（ＦＥＲＭＰ−２１５５９として寄託）等が好ましいが、これらに限定されるものではない。

ラクトバチルス属に属する乳酸菌は、乳酸菌培養の常法に従って培養することができる。培養培地には、乳培地又は乳成分を含む培地、これを含まない半合成培地など種々の培地を用いることができる。このような培地としては、還元脱脂乳培地などを例示することができる。
得られた培養物から遠心分離などの集菌手段によって分離された菌体をそのまま本発明の有効成分として用いることができる。濃縮、乾燥、凍結乾燥などした菌体を用いることもできるし、加熱乾燥などにより死菌体にしてもよい。
菌体として純粋に分離されたものだけでなく、培養物、懸濁物、その他の菌体含有物や、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分も用いることができる。
培養物などの形態としては、合成培地であるＭＲＳ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、還元脱脂乳培地など一般的に乳酸菌の培養に用いられる培地を用いた培養物だけでなく、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料などの乳製品などを例示することができるが特に限定されるものではない。
さらに、得られた培養物から遠心分離、濾過操作などの方法を用いて、乳タンパク質沈殿や菌体成分を除去することによって調製した培養上清なども用いることができる。固形分が少ない上清であるため、飲食品などへの適用範囲が広くなる。例えば、還元脱脂乳培養物を５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離することにより培養上清を調製することができる。

製剤化に際しては製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して濃縮、凍結乾燥するほか、加熱乾燥して死菌体にしてもよい。これらの乾燥物、濃縮物、ペースト状物も含有される。また、ラクトバチルス属に属する乳酸菌のＭＫＰ−１誘導作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能であり、これらを経口的に投与することが望ましい。

本発明のＭＫＰ−１誘導剤はどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
本発明のＭＫＰ−１誘導剤は、これを有効成分とする抗がん剤、ウイルス感染予防または治療剤、免疫抗糖尿病剤、または抗循環器疾患剤として利用することができる。
さらに、本発明のＭＫＰ−１誘導剤を飼料に配合することができる。前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。

ラクトバチルス属に属する乳酸菌の菌体又は培養物を配合して、ＭＫＰ−１誘導剤あるいは、ＭＫＰ−１誘導用飲食品、栄養組成物、飼料などの素材又はそれら素材の加工品に配合させて使用する場合、ラクトバチルス属に属する乳酸菌の配合割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量にあわせて適宜調節すればよい。投与対象者の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、通常成人の場合、ラクトバチルス属に属する乳酸菌の培養物などを１０〜２００ｇ、あるいはその菌体自体を０．１〜５，０００ｍｇ摂取できるように配合量などを調整すればよい。このようにして摂取することにより所望の効果を発揮することができる。

以下に、実施例及び試験例を示し、本発明についてより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

［試験例１］
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株によるヒトＢ細胞リンパ腫株のＭＫＰ−１遺伝子発現誘導作用
１−１．試験方法
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株をＭＲＳｂｒｏｔｈで１６時間培養した後、遠心分離により菌体を分離した。菌体は滅菌生理食塩水で２回、超純水で１回洗浄した後、凍結乾燥した。凍結乾燥粉末は１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）に懸濁した後、使用するまで−２０℃で保存した。

ヒトＢ細胞リンパ腫株（ＢＪＡＢ細胞）を１２ｗｅｌｌプレートに播種し２４時間培養した後、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株を最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加し（ＳＢＴ２１７１群）、同時にコントロールとしてラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株を含まないＰＢＳのみを添加した群（コントロール群）を設けた。両群とも一水準につき３ｗｅｌｌ（ｎ＝３）設置し、培養３、６、９時間後に各ｗｅｌｌから以下の手順にてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。培養した細胞にＲＮＡ抽出剤であるＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．５ｍｌ添加し５分間静置した後、ピペッティングにて可溶化させた細胞液を１．５ｍｌ容のチューブに回収した。細胞液に０．１ｍｌのクロロホルムを添加し、十分に攪拌した後、二層に分離した上層（水層）を新たな１．５ｍｌ容のチューブに回収した。回収液に０．２５ｍｌの２−プロピルアルコールを添加し、１０分間静置後、１５，０００ｒｐｍ、４℃の条件にて１５分間遠心分離し、ｔｏｔａｌＲＮＡの沈殿物を得た。得られたｔｏｔａｌＲＮＡからＫＡＰＡＳＹＢＲＦａｓｔｑＰＣＲＫｉｔ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲを行い、ＭＫＰ−１遺伝子の発現量を測定した。内在性コントロール遺伝子としてヒトＨｉｓｔｏｎｅＨ４遺伝子の発現量を測定し、ＭＫＰ−１遺伝子の発現量を標準化した。ヒトＭＫＰ−１遺伝子発現量解析用プライマーとして、表１に示される配列表配列番号１、２を用いた。ヒトＨｉｓｔｏｎｅＨ４遺伝子発現量解析用プライマーとして、表１に示される配列表配列番号３、４を用いた。

１−２．試験結果
図１に培養３、６、９時間後のＭＫＰ−１遺伝子発現量を示した。遺伝子発現量は、０時間の発現量を１とした相対値で表した。ＳＢＴ２１７１群では、培養３時間後からＭＫＰ−１遺伝子発現量が増加し始め、培養９時間後には顕著な発現量の増加が認められた。一方、コントロール群では、ＭＫＰ−１遺伝子の発現量に変化は認められなかった。培養９時間後において、ＳＢＴ２１７１群はコントロール群よりも有意にＭＫＰ−１遺伝子の発現量が高かった。すなわち、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）によって、ＢＪＡＢ細胞のＭＫＰ−１遺伝子の発現が誘導されることが示された。

［試験例２］
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株によるマウス大腸ガン由来ＭＣ３８細胞のＭＫＰ−１遺伝子発現誘導作用
２−１．試験方法
マウス大腸ガン由来ＭＣ３８細胞株を１２ｗｅｌｌプレートに播種し２４時間培養した後、１−１で示したように調製したラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し（ＳＢＴ２１７１群）、コントロールとして、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株を含まないＰＢＳのみを添加した（コントロール群）。両群ともに３ｗｅｌｌ（ｎ＝３）ずつ設置し、培養６時間後に各ｗｅｌｌから１−１と同様の手法にてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した後、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲを用いてマウスＭＫＰ−１遺伝子の発現量を測定した。内在性コントロール遺伝子としてマウスＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定し、ＭＫＰ−１遺伝子の発現量を標準化した。マウスＭＫＰ−１遺伝子発現量解析用プライマーとして、表２に示される配列表配列番号５、６を用いた。マウスＧＡＰＤＨ遺伝子発現量解析用プライマーとして、表２に示される配列表配列番号７、８を用いた。

２−２．試験結果
ＭＣ３８細胞株のＭＫＰ−１遺伝子発現量を図２に示した。遺伝子発現量は、コントロール群の遺伝子発現量を１とした相対値で表した。ＳＢＴ２１７１群はコントロール群に対して、有意なＭＫＰ−１遺伝子発現量の増加が認められた。
すなわち、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）によって、マウス大腸ガン細胞のＭＫＰ−１遺伝子の発現が誘導されることが示された。
上記の試験例１、２により、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）菌体によって細胞のＭＫＰ−１の発現が誘導されることが明らかとなった。

［実施例１］
ＭＫＰ−１誘導剤（発酵培養物）の製造
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株菌体を各々ＭＲＳ液体培地（Ｄｉｈｃｏ社）にて培養した。対数増殖期にある培養液を、０．３％の酵母エキスを添加した１０％還元脱脂乳（１１５℃、２０分滅菌）に１％接種し、各々マザーカルチャーを作製した。これを１００℃にて１０分間加熱した１０％の還元脱脂乳に２．５％添加した後、３７℃で発酵を行い、ｐＨ４．３に達するまで培養した。得られた発酵乳を凍結乾燥してラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１株発酵乳粉末を得た。

［試験例３］
３−１．試験方法
実施例１で得られたラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株の培養物を用いてＭＫＰ−１遺伝子発現誘導試験を行った。試験方法は試験例１に準じて行った。ＢＪＡＢ細胞に実施例１で調製した培養物を添加して培養し、９時間後のＭＫＰ−１遺伝子発現量を測定した結果を図３に示した。

３−２．試験結果
図３より、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株の培養物を添加した群（ＳＢＴ２１７１群）の方が、添加しない群（コントロール群）よりもＭＫＰ−１遺伝子発現量が高いことが分かった。すなわち、ラクトバチルス・ヘルベティカス培養物によって、ＢＪＡＢ細胞のＭＫＰ−１遺伝子発現が誘導されることが示された。

［試験例４］
４−１．試験方法
実施例１で得られたラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株の培養物を用いて、ＭＣ３８細胞株におけるＭＫＰ−１遺伝子発現誘導試験を行った。試験方法は試験例１に準じて行った。実施例１で調製した培養物を添加してＭＣ３８細胞を培養し、６時間後のＭＫＰ−１遺伝子発現量を測定した結果を図４に示した。

４−２．試験結果
図４より、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株の培養物を添加した群（ＳＢＴ２１７１群）の方が、添加しない群（コントロール群）よりもＭＫＰ−１遺伝子発現量が高いことがわかった。すなわち、ラクトバチルス・ヘルベティカス培養物によって、ＭＣ３８細胞株のＭＫＰ−１遺伝子発現が誘導されることが示された。
上記の試験例３、４により、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）の培養物によって細胞のＭＫＰ−１の発現が誘導されることが明らかとなった。

［試験例５］
各種乳酸菌によるヒトＢ細胞リンパ腫株のＭＫＰ−１遺伝子発現誘導作用
５−１．試験方法
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株、ＳＢＴ２１６１株、ＪＣＭ１１２０Ｔ株、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ＳＢＴ２０５５株、ＪＣＭ１１３１Ｔ株、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＢＴ２０６２株をＭＲＳｂｒｏｔｈで１６時間培養した後、遠心分離により菌体を分離した。菌体は滅菌生理食塩水で２回、超純水で１回洗浄した後、凍結乾燥した。凍結乾燥粉末は１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）に懸濁した後、使用するまで−２０℃で保存した。

ヒトＢ細胞リンパ腫株（ＢＪＡＢ細胞）を１２ｗｅｌｌプレートに播種し２４時間培養した後、調整した乳酸菌懸濁液を最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加し、同時にコントロールとして乳酸菌を含まないＰＢＳのみを添加した水準（コントロール群）を設けた。一水準につき３ｗｅｌｌ（ｎ＝３）設置し、培養２４時間後に各ｗｅｌｌから以下の手順にてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。培養した細胞にＲＮＡ抽出剤であるＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．５ｍｌ添加し５分間静置した後、ピペッティングにて可溶化させた細胞液を１．５ｍｌ容のチューブに回収した。細胞液に０．１ｍｌのクロロホルムを添加し、十分に攪拌した後、二層に分離した上層（水層）を新たな１．５ｍｌ容のチューブに回収した。回収液に０．２５ｍｌの２−プロピルアルコールを添加し、１０分間静置後、１５，０００ｒｐｍ、４℃の条件にて１５分間遠心分離し、ｔｏｔａｌＲＮＡの沈殿物を得た。得られたｔｏｔａｌＲＮＡからＫＡＰＡＳＹＢＲＦａｓｔｑＰＣＲＫｉｔ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲを行い、ＭＫＰ−１遺伝子の発現量を測定した。その結果を図５に示した。内在性コントロール遺伝子としてヒトＨｉｓｔｏｎｅＨ４遺伝子の発現量を測定し、ＭＫＰ−１遺伝子の発現量を標準化した。

５−２．試験結果
図５より、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株、ＳＢＴ２１６１株、ＪＣＭ１１２０Ｔ株を添加した水準において、コントロール群よりもＭＫＰ−１遺伝子発現量が統計的に有意に高いことがわかった。他の乳酸菌では、有意な差は認められず、ラクトバチルス・ヘルベティカスによって、ＢＪＡＢ細胞株のＭＫＰ−１遺伝子発現が誘導されることが示された。
上記の結果より、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）によって細胞のＭＫＰ−１の発現が誘導されることが明らかとなった。

［実施例２］
ＭＫＰ−１誘導剤（顆粒）の製造
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１株を食用可能な合成培地（０．５％酵母エキス、０．１％トリプチケースペプトン添加）に５重量％接種し、３８℃で１５時間培養後、遠心分離で菌体を回収した。回収した菌体を凍結乾燥し、前記菌体の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末１ｇを乳糖５ｇと混合し、顆粒状に成形して本発明のＭＫＰ−１誘導剤を得た。

［実施例３］
ＭＫＰ−１誘導剤（顆粒）の製造
ラクトバチルス・ヘルベティカスＪＣＭ−１１２０株を食用可能な合成培地（０．５％酵母エキス、０．１％トリプチケースペプトン添加）に５重量％接種し、３８℃で１５時間培養後、遠心分離で菌体を回収した。回収した菌体を凍結乾燥し、前記菌体の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末１ｇを乳糖５ｇと混合し、顆粒状に成形して本発明のＭＫＰ−１誘導剤を得た。

［実施例４］
ＭＫＰ−１誘導剤（散剤）の製造
第１３改正日本薬局方解説書製剤総則「散剤」の規定に準拠し、上記実施例２で得られたラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１株の凍結乾燥粉末１０ｇに乳糖（日局）４００ｇ、バレイショデンプン（日局）６００ｇを加えて均一に混合し、本発明のＭＫＰ−１誘導剤を製造した。

［実施例５］
ＭＫＰ−１誘導剤（散剤）の製造
第１３改正日本薬局方解説書製剤総則「散剤」の規定に準拠し、上記実施例３で得られたラクトバチルス・ヘルベティカスＪＣＭ−１１２０株の凍結乾燥粉末１０ｇに乳糖（日局）４００ｇ、バレイショデンプン（日局）６００ｇを加えて均一に混合し、本発明のＭＫＰ−１誘導剤を製造した。

［実施例６］
スティック状栄養健康食品の製造
ビタミンＣ４０ｇまたはビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇに、上記実施例２で得られたラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１株の凍結乾燥粉末４０ｇを加えて混合した。混合物を袋に詰め、本発明のスティック状栄養健康食品を１５０袋製造した。

［実施例７］
飼料の製造
大豆粕１２ｋｇ、脱脂粉乳１４ｋｇ、大豆油４ｋｇ、コーン油２ｋｇ、パーム油２３．２ｋｇ、トウモロコシ澱粉１４ｋｇ、小麦粉９ｋｇ、ふすま２ｋｇ、ビタミン混合物５ｋｇ、セルロース２．８ｋｇ、ミネラル混合物２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間殺菌して、実施例２で得られたラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１株１０ｋｇを配合して、飼料を製造した。

ラクトバチルス属に属する乳酸菌の菌体、該乳酸菌を含有する発酵乳、チーズまたは乳酸菌飲料を摂取する事で、Ｂリンパ腫細胞のＭＫＰ−１遺伝子の発現を誘導することにより、ガンの増殖を抑制するとともに、過剰な免疫応答を予防、改善することができ、免疫疾患に有効な医薬品となる。

［寄託生物材料への言及］
（１）ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１
イ当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
ロイの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成６年６月２２日（１９９４年６月２２日）（原寄託日）
平成８年３月６日（１９９６年３月６日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハイの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭＢＰ−５４４５
（２）ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１６１
イ当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
ロイの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１３年９月１８日（原寄託日）
ハイの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥＢＰ−０１７０７

ヒトＢ細胞リンパ腫株（ＢＪＡＢ細胞）にラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株を添加・培養し、培養後のＭＫＰ−１遺伝子の発現量を比較した図である（試験例１）。マウス大腸ガン由来ＭＣ３８細胞株にラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株を添加・培養し、培養後のＭＫＰ−１遺伝子の発現量を比較した図である（試験例２）。ヒトＢ細胞リンパ腫株（ＢＪＡＢ細胞）にラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株を添加・培養し、培養後のＭＫＰ−１遺伝子の発現量を比較した図である（試験例３）。マウス大腸ガン由来ＭＣ３８細胞株にラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株を添加・培養し、培養後のＭＫＰ−１遺伝子の発現量を比較した図である（試験例４）。ヒトＢ細胞リンパ腫株（ＢＪＡＢ細胞）にラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株、ＳＢＴ２１６１株、ＪＣＭ１１２０Ｔ株、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ＳＢＴ２０５５株、ＪＣＭ１１３１Ｔ株、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＢＴ２０６２株を添加・培養し、培養後のＭＫＰ−１遺伝子の発現量を比較した図である（試験例５）。

Claims

ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌及び／又はその培養物を有効成分とするＭＫＰ−１（Ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−１）誘導剤。
ラクトバチルス属に属する乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）に属する乳酸菌であることを特徴とする請求項１に記載のＭＫＰ−１誘導剤。
乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株（ＦＥＲＭＢＰ−５４４５）又はＳＢＴ２１６１株（ＮＩＴＥＢＰ−０１７０７）であることを特徴とする、請求項２に記載のＭＫＰ−１誘導剤。
ガン細胞のＭＫＰ−１を誘導することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、抗がん剤。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、ウイルス感染予防または治療剤。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、抗糖尿病剤。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、抗心血管疾患剤。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、抗感染症予防剤。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、骨粗しょう症予防剤。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＫＰ−１誘導剤を含む、神経疾患予防剤。
請求項１〜１１のいずれかに記載の剤を含有する栄養組成物、飲食品又は飼料。