KR100646938B1 - 헬리코박터 필로리의 정착과 생육 활성을 저해하는락토바실루스 람노서스 아이디씨씨 3201 - Google Patents

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    • A23V2400/11—Lactobacillus

Abstract

본 발명은 헬리코박터 필로리의 활성을 저해하는 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201에 관한 것으로 보다 상세하게는 위궤양, 십이지장궤양, 위암등의 원인균인 헬리코박터 필로리의 위점막 부착과 증식을 효과적으로 저해할 수 있는 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201을 제공하는데 있다. 본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201은 헬리코박터 필로리의 활성 저해능 뿐만 아니라 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성이 우수하여 발효유, 건강기능성식품 및 다양한 유산균제품에 사용될 수 있다.
헬리코박터, 락토바실루스, 위궤양, 유산균, 위점막

Description

헬리코박터 필로리의 정착과 생육 활성을 저해하는 락토바실루스 람노서스 아이디씨씨 3201 {Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 having inhibitory activity on adhesion and growth of Helicobacter pylori}
도 1은 본 발명의 부착능 측정법에서 헬리코박터 필로리가 in vitro에서 KATO III 세포주에 부착되는 정도를 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201이 in vitro에서 헬리코박터 필로리의 부착을 저해하는 효과를 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명의 사균화된 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201이 헬리코박터 필로리의 부착을 저해하는 효과를 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201이 in vivo에서 헬리코박터 필로리의 부착을 저해하는 효과를 나타낸 것이고,
도 5는 본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201의 DNA 핑거프린팅과 종특이 중합연쇄반응 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
만성위염, 위궤양, 십이지궤양, 소화성궤양의 원인균인 헬리코박터 필로리를 박멸 하기 위한 많은 연구가 진행되었음에도 불구하고 헬리코박터 필로리에 만 특이적으로 작용하는 약제개발은 아직까지 성공하지 못한 형편이다. 현재 헬리코박터 필로리 치료제를 개발하기 위해 꾸준히 신약 창출노력이 계속되고 있으나 만족할만한 결과는 아직 보고 되고 있지 않다. 또한 in vitro에서 효과를 보였던 물질 또한 in vivo에서는 효과가 나타나지 않는 경우가 많다. 이는 실제로 약물이 위점막에 서식하는 헬리코박터 필로리와 반응하는 기회가 적기 때문이다. 따라서 본 발명에서는 헬리코박터 필로리의 위점막 부착과 생육을 저해하기 위하여 위점막에 헬리코박터 필로리와 경쟁적으로 정착할 수 있고, 헬리코박터 필로리의 생육을 저해할 수 있는 유산균주를 개발하는데 있다.
1982년, 헬리코박터 필로리는 마샬(Marshall)과 와렌(Warren)에 의해 처음 분리된 이후 위궤양과 십이지장궤양 등 소화성 궤양 질환의 주요 원인인자로 밝혀졌으며 근래에는 위암과의 상관성까지 추정되고 있다. 주로 위점막에서 서식하고 있는 헬리코박터 필로리균은 그람음성, 미호기성의 나선균으로 유레아제(urease)에 의해 유레아(urea)를 가수분해하여 암모니아를 발생시켜서 균 주위를 중화하여 산성조건인 위내환경에서 생존한다(Gastroenterology 1990, 99:697~702). 헬리코박터 필로리의 병원성 기작은 아직 완전히 밝혀지지 않았지만 위점막에 존재하는 헬리코박터 필로리가 유레아제를 이용해 위점막내 유레아를 분해하여 생기는 암모니아가 위표피세포를 손상시키며, VacA와 같은 세포독성물질을 생성하여 위표피세포를 괴사시키고, 헬리코박터필로리의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)가 위점막세포의 글라이코실레이션(glycosylation)과 설파션(sulfation)을 저해하여 뮤신(mucin) 의 구조변화를 일으켜 위표피세포가 위산에 쉽게 노출되도록 하는 작용을 하는 것으로 알려졌다(Infect . Agent . Dis . 1996, 5:191~202). 또한 헬리코박터 필로리 감염에 의해 일어나는 염증반응과 대식세포작용에 의해 생성되는 반응성이 높은 유리산소에 의해 표피세포의 DNA를 손상시키는 결과를 보여 위암발생의 원인이 될 수 있음을 보여주고 있다(Cancer . Res . 1996, 56:1279~1282).
헬리코박터 필로리에 대한 효과적인 제균과 감염 예방에 관한 연구가 다양하게 진행되고 있다. 헬리코박터 필로리 감염치료는 항생제와 proton pump inhibitor(PPI)를 주축으로 하는 제균요법이 가장 많이 사용되고 있으나 항생제가 위점액층 및 점막에 도달하지 못하여 효과적이지 못하고 다른 병원성균과 마찬가지로 항생제에 대한 내성균주 출현으로 항생제 사용시 더욱 신중하게 되었으며, 치료 후에도 재발율이 높아 효과적인 치료법으로 사용되지 못하고 있다. 또한 백신을 이용해 헬리코박터 필로리 제균을 시도하고 있으나 헬리코박터 필로리의 대량배양이 어려워 세균 자체를 이용한 백신 개발은 아직까지 상품화되지 않았으며, 헬리코박터 필로리의 유레아제를 이용한 백신은 개발되었으나 효과가 미미하여 상용화되지 않은 실정이다. 최근에는 면역반응에 의한 헬리코박터 필로리 제균 가능성 자체가 의문시 되고 있다.
유산균은 헬리코박터 필로리가 서식하는 위점막내에서 일시적으로 생존이 가능하여 헬리코박터 필로리의 위점막상피세포로의 부착을 저지하고 유산(lactic acid), 박테리오신(bacteriocin), 과산화수소와 같은 항균물질을 생성하여 헬리코박터 필로리의 증식을 저해할 수 있어 헬리코박터 필로리의 제균과 감염예방에 효 과적인 대안이 될 수 있다. 일본 와까모또 제약회사가 유산균을 이용해 헬리코박터 필로리 제균을 시도하여 무균동물에서 유의성 있는 결과를 얻었다는 보고가 있었고, 그외 다른 문헌에서도 일부 유산균이 헬리코박터 필로리의 부착 및 증식억제에 효과적이었다는 보고가 있었으며, 지원자를 대상으로 한 임상실험 결과에서도 락토바실루스 아시도필루스등의 유산균주가 헬리코박터 필로리에 대해 제균효과를 나타내었다고 보고하였다(Digestion 1999, 60:203~209). 그러나 일반적인 유산균 모두가 동일한 효과를 나타내지는 않는 균주 특이성이 있으므로 위점막 정착성이 우수한 균주를 선별하여 개발할 필요성이 있다. 따라서 부작용이 없으면서도 한국인 체질에 맞는 헬리코박터 필로리 활성 저해 기능을 갖는 균주를 개발하여 의약품 또는 건강기능성식품 개발에 활용하고자 한다.
위점막상피세포에서 정착이 가능하여 헬리코박터 필로리와 경쟁적으로 위점막에 부착하고, 항균활성이 높아 헬리코박터 필로리의 생육을 억제하고, 인체에 부작용이 없어 일상적인 섭취가 가능한 유산균주를 개발하고 이 균주를 유효성분으로 한 의약품 또는 건강기능성식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 위점막 정착성이 우수하여 헬리코박터 필로리와 경쟁적으로 위점막에 부착하고, 항균물질을 생성하여 헬리코박터 필로리의 증식을 저해함으로써 위장관에서 헬리코박터 필로리의 활성과 감염을 억제하는 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 위점막 정착성이 우수하고 헬리코박터 필로리의 생육저해 효과를갖는 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201을 제공하는 것이다.
본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201은 그램 양성, 카탈라제 음성의 간균으로, 당을 분해하여 유산을 생산하며 생리 생화학적 특성은 하기 [표 5, 6]과 같은 특징을 갖는다. 또한 본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201은 서열번호 9로 기재되는 1,528 bp의 염기서열을 포함하는 16S rRNA 유전자를 갖고 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 분리한 유산균 중 헬리코박터 필로리의 부착 저해능과 생육저해 활성이 우수한 균주를 ‘락토바실루스 람노서스 IDCC 3201’로 명명하고, 이를 2005년 8월 16일자로 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC-10833BP).
본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201은 헬리코박터 필로리의 생육을 저해하는 활성과 위점막 부착을 저해하는 활성이 있다. 생육저해 작용은 유산과 박테리오신 같은 항균물질 생성과 관련이 있다. 실제로 헬리코박터 필로리의 활성 저해 정도는 유산의 농도에 따른 영향을 많이 받는다. 유산을 상대적으로 많이 분비하는 유산균이 헬리코박터 필로리의 생육저해 활성이 높으므로 1차적으로 유산생성이 높은 유산균주를 선별하는 것이 바람직하다(J. Appl . Bacteriol . 1995, 79:475~479). 또한 헬리코박터 필로리의 위점막 부착능은 헬리코박터 필로리의 군집화와 감염에 중요한 요소가 된다. 따라서 헬리코박터 필로리의 위점막 부착을 경쟁적으로 저해할 수 있는 유산균의 선별이 또한 중요하다. in vitro에서 유산균 응집반응 (agglutination)과 위점막세포를 이용한 부착능 실험을 기본으로 부착능이 우수한 유산균주를 선별하였다. 응집반응은 단백질이나 다당류등의 성분이 세포표면에 위치한 특정성분과 결합하여 불용성의 덩어리를 이루어 침전되는 현상으로 부착능이 우수한 유산균에서 많이 볼 수 있다. 또한 헬리코박터 필로리는 위점막세포의 갱글리오테트로실세라마이드(gangliotetraosylceramide)와 설파티드(sulfatide)를 포함한 글라이코리피드(glycolipid)에 결합하여 부착하는 것으로 알려져 있다. 유산균은 이러한 위점막의 갱글리오테트로실세라마이드와 설파티드에 먼저 결합하여 부착함으로써 헬리코박터 필로리가 부착되는 것을 억제할 수 있다(FEMS Immunol . Med. Microbiol. 2002, 32:105~110). 부착능 정도를 확인하기 위하여 위점막세포인 KATO III에 헬리코박터 필로리와 유산균을 일정조건에서 반응시킨 후 KATO III에 부착된 헬리코박터 필로리의 양을 측정함으로써 부착능을 평가할 수 있다. 부착능 측정 방법은 헬리코박터 필로리를 염색하여 현미경하에서 계측하는 방법이 주로 사용되었으나 본 발명에서는 헬리코박터 필로리의 유레아제 활성 측정법을 사용하여 대량시료를 효과적으로 검색할 수 있게 하였다. 위와 같은 과정을 통하여 헬리코박터 필로리의 위점막 부착저해능이 가장 우수한 균주를 최종 선정하였다. 이와 같이 선정된 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201의 in vivo 효능을 알아보기 위하여 헬리코박터 필로리 감염 동물모델에 이 균주를 투여하고 일정기간 경과 후 위점막에 부착되어 있는 헬리코박터 필로리 균수를 측정하여 평가하였다(Am . J. Gastroenterol . 1998, 93: 2097~2101). 이러한 효능이 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201의 항균물질에 의한 것인지 또는 헬리코박터 필로리의 부착을 저해한 결과인지는 확실치 않 으나 위점막의 내부 환경에서 유산균의 증식이 어렵고 헬리코박터 필로리의 균수가 많이 감소되지 않는 것으로 보아 항균물질에 의한 항균작용보다는 헬리코박터 필로리의 부착 저해능이 더 효과적으로 작용한 것으로 보인다.
또한, 본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201은 위장의 산과 소장의 담즙산에 대한 높은 내성을 나타내기 때문에 경구투여시 위장을 비롯한 장내에서 높은 생존율을 나타내어 효과적으로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 위와 같은 특징을 갖는 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201을 유효성분으로 함유하는 식품 또는 건강기능성식품을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 필로리 활성 저해제를 제공한다.
본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201은 임상투여시에 경구투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201은 실제 임상투여시에 여러가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 전분, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시 럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201은 독성이 없는 안전한 균주이며, 유효용량은 1 ~ 40 x 108 균수(cfu)/kg 이고, 바람직하기로는 10 ~ 20 x 108 cfu/kg 이며, 하루 1~3 회 투여될 수 있다.
본 발명의 헬리코박터 필로리 활성 저하용 식품은 헬리코박터 필로리 감염 관련 질병, 특히 위염, 위궤양, 십이지장 궤양 등 소화성 질환의 예방 또는 완화에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201을 식품으로 사용할 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 균주를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 발효유, 요구르트, 치즈, 우유, 이유식, 식품첨가물, 또는 건강기능성식품인 것이 바람직하다.
유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201을 식품 또는 음료의 제조시에 상기 특정식품 소재 1g(또는 ㎖) 당 본 발명의 균을 0.1 ~ 10 x 108 cfu 첨가하고, 바람직하게는 1 ~ 5 x 108 cfu의 양으로 첨가한다. 본 발명의 균주의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 고 활성 및 부착능 우수균주 선별
<1-1> 유산균의 분리
헬리코박터 필로리의 활성 저해능을 갖고 내산성을 갖는 균주를 분리하기 위하여 한국인 유아의 분변 및 소, 돼지, 개 등의 소화기관에서 균주를 분리하였다. 구체적으로, 유아분변은 이유식을 하지 않는 유아의 신선한 분변을 사용하였으며 채변 즉시 혐기용액(Mitsuoka수)에 넣고 일정량 희석하여 분석배지에 도말하였다. 포유동물로는 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐, 염소, 토끼 등을 사용하였다. 도살 직후 각 동물의 소화기관(위장, 소장, 대장)을 채취하고 각 장기 내부의 표피를 긁어내고 내용물을 혐기용액으로 희석하여 분석배지에 도말하였다. 그리고 어류, 염장류, 유제품, 유산균제제 등은 내용물을 균질기로 균질화시키고 혐기용액으로 희석하여 분석배지에 도말하였다. 유산균 분리용 분석배지는 0.5% 담즙산을 함유하는 MRS 한천배지(pH 3.0)를 사용하여 내산성과 내담즙산성을 갖는 균주를 분리하였다. 분석배지에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양하여 가급적 집락의 모양과 크기가 다른 집락을 분리하여 총 2,047 균주를 분리하였다.
<1-2> 응집반응 및 고 유산 생성균주 선별
상기 실시예 <1-1>에서 분리한 균주 중 부착능과 항균력이 우수한 유산균을 선별하기 위하여 1차적으로 배양 중에 응집반응이 일어나고 유산생성능이 높은 유산균을 선별하였다. 분리균주를 MRS 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하면서 배양 중에 균이 뭉쳐 침전되어 상등액이 맑은 균주를 선별하고, 이 균주들의 배양여액에서 유산을 측정하여 유산생성량이 0.1M이상인 70균주를 1차로 선별하였다.
< 실시예 2> 헬리코박터 필로리균에 대한 항균력
상기 실시예 1에서 1차 선별한 70 균주를 대상으로 헬리코박터 필로리에 대한 항균력을 갖는 균주를 선별하기 위하여 paper disk 법으로 항균력을 측정하였다.
<2-1> 헬리코박터 필로리 배양
헬리코박터 필로리는 경상대학교 의과대학에서 분양받은 ATCC 700392 균주를 사용하였으며, 배양은 Bovine calf serum(BCS)을 10% 첨가한 Muller Hinton 한천(MHA)배지를 사용하여 37℃, 10% CO2 배양기에서 3일간 배양하였다.
<2-2> 유산균 시료 준비
유산균은 유청배지를 사용하여 37℃배양기에서 24시간 배양하고 배양여액을 감압농축기로 5배, 10배 농축하여 시료액으로 하였다.
<2-3> 항균력 시험
3일 동안 MHA 배지에서 배양한 헬리코박터 필로리 균을 수거하여 Muller Hinton 액상배지에 현탁하고, 현탁액을 MHA 배지(1% agar, 10%BCS)와 충분히 섞은 후에 MHA 배지 위에 도말하였다. Paper disk에 유산균시료를 100㎕ 처리하고 충분히 건조시킨 다음 Paper disk를 헬리코박터 필로리가 도말된 MHA 배지 위에 일정간격으로 놓아둔 후 37℃, 10% CO2 배양기에서 1일 배양 후 paper disk 주위의 투명환 크기로 항균력을 평가하여 항균효과가 높은(투명환 지름 12mm이상) 10주를 2차 선별하였다[표 1]
유산균의 헬리코박터 필로리에 대한 항균력.
유산균 분리원 투명환 크기 ( mm )
5배 농축액 10배 농축액
IDCC 0571 Human 12 30
IDCC 0580 - 30
IDCC 3201 18 30
IDCC 3605 - 20
IDCC 3658 16 30
IDCC 3697 - 30
IDCC 3739 Cat - 18
IDCC 3849 Mouse - 13
IDCC 3872 Fish - 15
IDCC 3884 - 16
GG 유산균 12 25
유청배지 - -
특히 IDCC 3201은 10배, 5배 농축액에서 가장 높은 항균력을 나타냈다.
< 실시예 3> 헬리코박터 필로리 in vitro 부착능 저해시험
<3-1> 세포주 배양
헬리코박터 필로리 부착능 시험에 사용한 세포주는 헬리코박터 필로리가 부착하는 것으로 알려진 위점막세포인 KATO III 세포주를 사용하였다. KATO III를 10% 우태아혈청(FBS)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 배양하여 well 당 2 x 104 cfu 농도로 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 2일간 배양 후 부착능 측정 실험에 사용하였다.
<3-2> 헬리코박터 필로리 현탁액 제조
헬리코박터 필로리의 배양은 BCS 10%가 첨가된 Muller Hinton 액상배지를 사용하여 37℃, 10% CO2 배양기에서 2일간 배양하였다. 배양액을 원심분리(4℃/5000rpm/5분)하여 헬리코박터 필로리 균체를 수거하였다. 수거된 균체는 식염수로 5회 세척하여 혈청성분을 제거하고 최종적으로 균체를 인산염 완충식염수(PBS)로 660nm에서 흡광도 0.5가 되도록 조절하여 현탁하였다.
<3-3> 유산균 현탁액 제조
실시예 2의 2차 선별균주 10주를 MRS 배지에서 24시간 배양하고 원심분리하여 수거된 균체를 PBS로 660nm에서 흡광도 0.5가 되도록 조절하여 현탁하였다.
<3-4> 부착능시험
배양된 KATO III을 96 well plate에 2 x 104 cfu/well 균수로 분주하고 50% TCA를 각 well당 100㎕ 첨가하여 4℃에서 60분간 반응시켜 KATO III를 고정시켰다. 반응 후 식염수로 5회 세척하여 고정되지 않은 KATO III를 제거하였다. 여기에 헬리코박터 필로리의 부착능을 알아보기 위해 헬리코박터 필로리 PBS 현탁액을 1/2 단계희 석한다. 각 희석단계의 희석액 40㎕를 각 well에 첨가하여 37℃, 10% CO2 배양기에서 60분간 반응시켰다. 세포주에 부착하지 않은 헬리코박터 필로리를 제거하기 위해 PBS 150㎕로 3회 세척한 다음 헬리코박터 필로리의 유레아제 기질용액 [Phenol red 0.02%, Urea 0.8% / 10mM PBS (pH 6.5)]을 100㎕ 첨가하고, 10분 간격으로 540nm에서 흡광도를 측정하여 헬리코박터 필로리의 부착정도를 평가하였다[도 1]. 희석단계별로 초기에는 헬리코박터 필로리의 부착능 차이가 있었으나 반응 30분 후부터 8배 희석액까지는 일정한 수준으로 부착되는 정도를 알 수 있었다. 또한 헬리코박터 필로리를 열처리하여 사균화한 것은 유레아제의 불활성화로 활성이 측정되지 않았다. 이와 같이 헬리코박터 필로리의 부착정도에 따라 유레아제 활성 차이가 나타나므로 헬리코박터 필로리의 부착능 평가방법으로 유용하게 사용할 수 있었다. 유산균에 의한 헬리코박터 필로리의 부착 저해능을 알아보기 위해서는 96 well plate에 KATO III를 고정시키고 헬리코박터 필로리 PBS현탁액을 well 당 40㎕ 첨가하고 여기에 유산균 현탁액을 PBS로 1/2 단계희석하여 희석액을 100㎕ 씩 첨가한 후 37℃, 10% CO2 배양기에서 60분간 반응시켰다. 세포주에 부착하지 않은 유산균과 헬리코박터 필로리를 제거하기 위해 PBS로 3회 세척한 다음 헬리코박터 필로리의 유레아제 기질용액을 100㎕ 첨가하고 30분간 실온에서 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하여 헬리코박터 필로리의 부착 저해능을 평가하였다.
유산균에 의한 헬리코박터 필로리 부착 저해율(%)은 다음과 같이 산출한다.
부착 저해율(%) = (1 - 시험군 흡광도 / 대조군 흡광도 ) × 100
[대조군 : 헬리코박터 필로리만 처리한 시료
시험군 : 헬리코박터 필로리와 유산균을 동시에 처리한 시료]
in vitro에서 헬리코박터 필로리의 부착 억제능이 가장 우수한 균주는 IDCC 3201이었다. 부착 저해율은 원액에서는 100% 수준이었고 8배 희석액에서는 60% 수준으로 부착능이 우수한 균주로 알려진 GG 유산균보다 우수하였다[도 2]. 또한 사균체에서도 헬리코박터 필로리에 대한 부착 저해능이 있는지 알아보기 위해 부착 저해능이 가장 우수하였던 IDCC 3201을 80℃에서 10분간 반응시켜 사균화 시킨 후 평가하였다. IDCC 3201 사균체도 8배 희석액에서 70% 이상의 저해율을 보여 IDCC 3201 생균체와 거의 동일한 헬리코박터 필로리의 부착 저해능을 나타내었다[도 3].
< 실시예 4> 헬리코박터 필로리 부착 저해능 in vivo 평가
상기 실시예 3과 같이 in vitro에서 헬리코박터 필로리의 부착 저해능을 갖는 균주로 최종 선별된 IDCC 3201에 대해 생체내 효능을 평가하였다. 생체내 효능시험은 헬리코박터 필로리를 마우스에 먼저 감염시킨 다음 IDCC 3201을 투여하고 일정기간 경과 후 위장에서 헬리코박터 필로리의 균수를 직접 측정하는 방법을 사용하였다. 마우스는 5주령된 DS-GF 마우스를 시험군당 5마리씩 사용하였고 실험 기간동안 금식 없이 먹이와 물은 충분히 섭취하도록 하였다.
<4-1> 헬리코박터 필로리의 감염
실시예 2와 같이 배양된 헬리코박터 필로리를 마우스에 감염시키기 전에 NaHCO3 0.25㎖(0.2M)을 먼저 투여하여 위를 중화시켰다. 위장을 중화시킨 마우스에 헬리코박터 필로리 현탁액 0.5㎖(1 x108 cfu/㎖)를 1일 1회, 3일 연속 경구투여하여 감염시켰다.
<4-2> IDCC 3201 투여
실시예 2과 같이 배양된 IDCC 3201을 마우스당 0.5㎖(4 x 109 cfu/㎖)씩 1일 1회 일주일에 두 번 헬리코박터 필로리가 감염된 마우스에 경구투여하였다.
<4-3> 헬리코박터 필로리와 유산균수 측정
헬리코박터 필로리 균수는 실험 종료시 마우스를 해부하여 위를 절제하고 절제된 위를 장축을 기준으로 반으로 나눈 후 PBS 1㎖와 함께 균질기에 첨가하여 완전히 위 조직을 파쇄한 후 PBS로 10, 100배까지 희석하고, 희석액 0.1㎖를 항생물질이 첨가된 헬리코박터 필로리 분리배지(Brain heart infusion agar 52g, Vancomycin 10mg, Amphotericin B 5mg, Cefsulodin 5mg, Trimethroprim lactate 5mg, Polymyxin 1250U, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride 40mg, Horse blood 70㎖/L)에 접종하고 37℃, CO2 배양기에서 3일간 배양하였다. 유산균수는 유산균분리배지인 LBS 한천배지(BBL)에 접종하고 혐기조건으로 37℃에서 4일간 배양하였다. DS-GF 마우스에서의 IDCC 3201은 평균 107 cfu/g 정도의 균수를 실험기간 동안 유지하여 위내에 잘 정착했음을 확인할 수 있었다 [표 2].
DS - GF 마우스 위장관에서의 유산균수
Weeks 유산균수 ( log cfu /g)
* IDCC 3201 처리군 ** 대조군
4 7.29 ± 0.78 7.71 ± 0.49
6 6.61 ± 1.65 5.45 ± 1.01
8 6.77 ± 0.68 7.86 ± 0.21
10 7.04 ± 0.66 8.20 ± 0.57
12 7.09 ± 0.84 7.18 ± 1.11
* IDCC 3201처리군 : 헬리코박터 필로리 + IDCC 3201 투여군
** 대조군 : IDCC 3201 투여군
DS - GF 마우스 위장관에서의 헬리코박터 필로리 균수
Weeks 헬리코박터 필로리 균수 ( log cfu /g)
* IDCC 3201 처리군 ** 대조군
4 4.27 ± 0.69 5.28 ± 0.37
6 4.34 ± 0.56 4.59 ± 0.44
8 4.46 ± 0.33 4.95 ± 0.33
10 4.39 ± 0.81 5.02 ± 0.32
12 4.92 ± 0.48 4.84 ± 0.42
* IDCC 3201처리군 : 헬리코박터 필로리 + IDCC 3201 투여군
** 대조군 : 헬리코박터 필로리 투여군
반면 감염 4주 후부터 IDCC 3201 처리군에서의 헬리코박터 필로리의 균수는 104 ~ 105 cfu/g 정도로 계속 유지되고, 대조군은 105 ~ 106 cfu/g 정도로 유지되어 10% 정도의 부착능 저해효과가 있음을 확인하였다[표 3, 도 4].
<4-4> 헬리코박터 필로리 항체측정
헬리코박터 필로리에 대한 항체를 측정하기 위해 심장으로부터 혈액을 채취, 상온에 2시간 방치한 후 10000rpm에서 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 항체 측정은 Determiner H. pylori antibody kit(EPI)을 이용하여 ELISA방법으로 역가를 측정하였다. 헬리코박터 필로리에 감염됨 마우스의 혈청에서 헬리코박터 필로리 항체량은
IDCC 3201 처리군이 대조군에 비해 전반적으로 약간 높았으나 유의성을 보이지는 않았다[표 4].
DS - GF 마우스 혈액에서의 헬리코박터 필로리 항체 역가
Weeks 흡광도 (450 nm )
* IDCC 3201처리군 ** 대조군
4 0.91 ± 0.92 1.46 ± 0.53
6 1.93 ± 1.10 0.98 ± 0.38
8 1.41 ± 0.51 1.27 ± 0.19
10 1.36 ± 0.42 1.12 ± 0.46
12 2.00 ± 0.58 1.27 ± 0.44
* IDCC 3201처리군 : 헬리코박터 필로리 + IDCC 3201 투여군
** 대조군 : 헬리코박터 필로리 투여군
< 실시예 5> IDCC 3201의 생리 생화학적 특징
상기 실시예로서 헬리코박터 필로리 활성 저해균주로 최종 선별된 IDCC 3201에 대한 생리 생화학적 특징을 조사하였다. IDCC 3201은 무포자성 간균의 모양을 가지며, 그램 양성, 카탈라제 음성 균주로 당을 분해하여 유산을 생성하는 락토바실루스 속에 속한다.
IDCC 3201의 당 발효능
당 종류 결과 당 종류 결과 당 종류 결과 당 종류 결과 당 종류 결과
Glycerol - D-glucose + Methyl D-glucoside - Saccharose - D-Lyxose -
Erythritol - D-fructose + N-acetyl- glucosamin + Trehalose - D-Tagatose +
D-arabinose - D-Mannose + Amygdaline + Inuline - D-fucose -
L-arabinose - L-sorbose - Arbutine + Melezitose - L-fucose -
Ribose + Rhamnose + Esculine + D-Raffinose - D-arabitol -
D-xylose - Dulcitol - Salicine + Amidon - L-arabitol -
L-xylose - Inositol - Cellobiose + Glycogen - Gluconate +
Adonitol - Mannitol + Maltose + Xylitol - galavctoto -gluconate -
Methyl- xyloside - Sorbitol + Lactose + Gentibiose + ceto- gluconate -
Galactose + Methyl D mannose - Melibiose - D-Turanose -
IDCC 3201의 API 키트(API biomerieux, France)을 이용한 당이용성은 [표 5]와 같고, API 자임 키트(API biomerieux, France)를 이용한 효소특이성은 [표 6]과 같다.
IDCC 3201이 헬리코박터 필로리 활성 저해 효능을 나타내려면 위장관에서 높은 생존율이 요구되며 이를 위해서는 위산의 산과 소장의 담즙산에 대한 내성이 높아야 한다. 내산성과 내담즙산성을 평가하기 위해 in vitro에서 내산성과 내담즙산성 시험을 실시하였다.
IDCC 3201의 효소생성능
효소 종류 IDCC 3201 효소 종류 IDCC 3201
Alkaline phosphatase + Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase +
Esterase - α-galactosidase -
Esterase lipase + β-galactosidase +
Lipase - β-glucuronidase -
Leucine arylamidase + α-glucosidase +
Valine arylamidase + β-glucosidase -
Crystine arylamidase - N-acetyl-β-glucosaminidase _
Trypsin - α-mannosidase _
α-chymotrypsin - α-fucosidase +
Acid phosphatase +
내산성시험은 0.1M 인산염 완충용액(pH 7.0)을 10% HCl 용액으로 pH 2.3과 3.0 으로 보정한 용액에 MRS 배지에서 24시간 배양된 IDCC 3201 배양액을 넣고 30분, 60분 및 120분 방치한 후 혐기용액(Mitsuoka수)으로 적절하게 희석하고 MRS 한천배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 생균수를 측정하여 평가하였다. 내담즙산성시험은 0.1M 인산염 완충용액(pH 7.0)에 옥스갈(sigma)을 각각 0.1, 0.3, 0.5 및 1.0% 농도로 첨가한 용액에 MRS 배지에서 24시간 배양된 균배양액을 넣고 30분, 60분 및 120분 방치한 후 혐기용액으로 연속희석하고 MRS 한천배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 생균수를 측정하여 평가하였다.
IDCC 3201은 pH 2.3 용액에서 120분 방치 후 82% 생존율을 보여 내산성이 우수한 균주로 알려진 락토바실루스(Lactobacillus) GG 74% 보다 높은 내산성을 보였다. 또한 내담즙산성도 86% 이상의 생존율을 보여 락토바실루스 GG 76% 보다 우수하였다[표 7].
IDCC 3201의 내산성 및 내담즙산성
균주 생존율 (%)
pH 2.3/120 min 옥스갈1 % /120 min
IDCC 3201 82 86
L. GG 74 76
< 실시예 6> IDCC 3201의 DNA 핑거프린팅( fingerprinting ) 및 종특이 중합연쇄반응 분석
상기 실시예 5에서 IDCC 3201이 락토바실루스 속으로 판명되었고, 이를 유전자수준에서 확인하고 동정하기 위해 IDCC 3201의 유전자특성을 알아보았다.
<6-1> 중합연쇄반응 샘플의 준비
IDCC 3201을 MRS 한천배지에 접종하고 37℃에서 2일간 배양하여 활성화시킨 후 지름 1㎜ 정도의 단일 콜로니를 취하여 680㎚에서 흡광도가 0.8~1.0 정도가 되게 멸균수에 현탁시켜 -20℃에서 저장하였다. 이와 같이 준비한 현탁액을 중합연쇄반응 샘플로 사용하였다.
<6-2> DNA 핑거프린팅( fingerprinting )
중합연쇄반응 샘플은 서열번호 1로 기재되는 P32-W 프라이머와 결합시켜 군체중합연쇄반응법으로 증폭시켰다(Appl . Environ . Microbiol. 2000, 66: 2227~2231). 상기의 중합연쇄반응 혼합물로부터 얻은 핑거프린팅 유전자 분획물은 1.0% TAE (40mM Tris-acetate, 1mM EDTA) 완충액을 사용하여 1.5% 아가로스겔 상에서 전기영동 방법으로 결과를 확인하였다.
[도 5]에서 보는 바와 같이 IDCC 3201은 P32-W 프라이머를 이용한 핑거프린팅 결과 0.1 ~ 1.6kb 사이에 6 ～ 10개 정도의 유전자 분획물을 가지며 약 1.1, 1.0, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 kb에서 주요 분획물이 나타난다. 이런 유전자 지문은 다른 락토바실루스 종들 중에서 락토바실루스 람노서스 표준균주인 ATCC 7469에 유사하지만 1.0 ~ 1.5 kb 사이의 주요 분획물 일부의 위치가 다르며 0.5 kb 이하의 분획물의 발현 양상에서도 차이를 보여 동일 균주가 아님을 알 수 있었다.
<6-3> 종특이 중합연쇄반응
종특이 중합연쇄반응은 중합연쇄반응 샘플을 락토바실루스 람노서스 종특이 프라이머와 결합시켜 군체중합연쇄반응법으로 증폭시켰다[표 8]. 중합연쇄반응 중합물로부터 얻은 핑거프린팅 유전자 분획물은 1.0% TAE(40mM Tris acetate, 1mM EDTA) 완충액을 사용하여 0.75% 아가로스겔 상에서의 전기영동 방법으로 결과를 확인하였다.
[도 5]에서 보는바와 같이 IDCC 3201은 서열번호 2로 기재되는 IDL04-F와 서열번호 3으로 기재되는 IDL73-R 프라이머 쌍을 이용한 락토바실루스 람노서스 종특이 중합연쇄반응 결과 락토바실루스 람노서스 표준균주인 ATCC 7469와 동일한 표적밴드(448 bp)를 생산하였다. 따라서 IDCC 3201은 락토바실루스 람노서스 균으로 판단된다.
종특이 프라이머들의 염기배열 순서와 프라이머 부착 온도
이름 균종 염기 배열 순서 부착온도 (℃) 결과물 ( bp )
IDL04-F Lactobacillus rhamnosus 서열번호 2 56 448
IDL73-R 서열번호 3
< 실시예 7> IDCC 3201의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석
<7-1> 중합연쇄반응 샘플의 준비
IDCC 3201을 MRS 한천배지에 접종하여 37℃에서 2일간 배양하여 활성화시킨 후 지름 1㎜ 정도의 단일 콜로니를 취하여 680㎚에서 흡광도가 0.8~1.0 정도가 되게 멸균수에 현탁시켜 -20℃에서 저장하였다. 이와 같이 준비한 현탁액을 중합연쇄반응 샘플로 사용하였다.
<7-2> 염기 배열 분석을 위한 DNA 의 준비
16S rRNA 유전자의 중합연쇄반응 샘플은 서열번호 4로 기재되는 ID8-F와 서열번호 5로 기재되는 ID8-R 프라이머를 1:1 비율로 섞은 혼합 프라이머와 결합시켜 군체중합연쇄반응법으로 증폭시켰다[표 9]. 중합연쇄반응 혼합물로부터 얻은 16S rRNA 유전자 분획물은 1% TAE(40mM Tris acetate, 1mM EDTA) 완충액을 사용하여 0.75% 아가로스겔 상에서의 전기영동 방법으로 분리하였다.
에티디움-브로마이드 염색 및 UV 조사 후 원하는 DNA 단편이 있는 겔을 일정한 크기로 절단하여 유전자정제 키트(GENE ALL-GEL SV, Generalbiosystem)를 사용하여 DNA를 정제하고 BamHI과 XhoI 제한효소로 이중 절단하여 pcDNA3.1/Hygro(+)(5.6 kb) 플라스미드 벡터에 연결하였다. 16S rRNA 유전자를 함유하는 플라스미드(pcDNA3.1/Hygro(+)-3201, 7.1kb)로 대장균 숙주세포를 형질전환시킨 후 형질전환된 세포만을 선별하여 대량배양함으로써 원하는 플라스미드를 대량 확보하였다. 확보된 플라스미드는 다시 유전자정제 키트로 정제 후 염기 서열을 분석하였다.
염기 배열 분석을 위해 사용된 프라이머
이름 목표 위치 염기 배열 순서
ID8-F 16S rRNA 1-19 서열번호 4
ID8-R 16S rRNA 1501-1528 서열번호 5
T7-F pcDNA3.1 . 서열번호 6
BGH-R pcDNA3.1 . 서열번호 7
ID13S-F 16S rRNA 498-515 서열번호 8
<7-3> 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석
IDCC 3201 샘플에서 유래된 16S rRNA 유전자는 서열번호 6으로 기재되는T7-F, 서열번호 7로 기재되는 BGH-R, 서열번호 8로 기재되는 ID138S-F 등의 프라이머로 시퀀싱(염기 서열반응)을 수행하였다. 염기 서열 반응은 Perkin Elmer로부터 구입한 싸이클 시퀀싱 키트(cycle sequencing kit)와 염료 종결제(dye terminator)를 사용하여 실시하였고 16S rRNA 유전자 염기 서열은 ABI prism 310 자동 DNA 서열분석기(automatical DNA sequencer)를 사용하였다. IDCC 3201의 16S rRNA 유전자는 서열번호 9로 기재되는 1,528 bp의 염기 서열을 갖는다. 이 염기서열은 GenBank에 AY094065로 등록하였다. 이렇게 얻어진 16S rRNA 유전자와 이미 알려진 세균의 16S rRNA 유전자 염기 서열과의 유사성은 블라스트 유사성 조사 프로그램(Blast similarity search program : National Institute of Biotechnology Information)으로 계산하였다. 이 염기서열은 락토바실루스 람노서스 ATCC 7469의 16S rRNA 염기서열과 비교했을 때(Blast2), 전체 1,515bp 중 오직 4군데만 차이가 있었다(99.7% 상동성). 또한 IDCC 3201의 분자생물학적 동정을 위하여 GenBank에 등록된 9개의 속(Genus)과 85개의 락토바실루스 종(Species), 그리고 17개의 락토바실루스 람노서스를 포함한 카제이 계열 주(Strain)의 16S rRNA 유전자 서열들과 함께 각각 다중 서열 정렬을 진행한 후 계통수(phylogenic tree)에서의 위치를 판별하였다. 다중 서열 정렬 프로그램(multiple sequence alignment program)은 ClustalX를 사용하였다. 계통수 상에서 IDCC 3201 16S rRNA 유전자는 락토바실루스 람노서스에 가장 가까운 위치에 배치되었다. 또한 F11(AF243146), ATCC 7469(D16552), DSM 20021(M58815) 등 락토바실루스 람노서스로 등록된 3주의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 Blast 2 상동성 검색 결과 평균 99.1%의 높은 동일성을 나타내었다.
상기 실시예 6, 7과 같이 IDCC 3201을 분자생물학적으로 동정한 결과 이 균주는 락토바실루스 람노서스균으로 동정되었다. 따라서 상기의 균주를 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201로 명명하였다.
< 제제예 1> 건강기능성식품 제조
락토바실루스 람노서스 IDCC 3201을 주 성분으로 함유하는 건강기능성식품을 하기와 같이 제조하였다.
락토바실루스 람노서스 IDCC 3201 500 ㎎(10x 108 cfu/g)
치옥토산아미드 2 ㎎
니코틴산아미드 3 ㎎
염산리보플라빈나트륨 3 ㎎
염산피리독신 2 ㎎
유당 490 ㎎
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 그리고 캡슐제형으로 제조하였다.
< 제제예 2> 의약품의 제조
락토바실루스 람노서스 IDCC 3201을 주 성분으로 함유하는 의약품을 하기와 같이 제조하였다.
락토바실루스 람노서스 IDCC 3201 500 ㎎(10 x 108 cfu/g)
락토바실루스 아시도필루스 100 ㎎(10 x 108 cfu/g)
비피도박테리움 롱검 100 ㎎(10 x 108 cfu/g)
유당 100 ㎎
백당 100 ㎎
만니톨 80 ㎎
포도당가공품(prim) 18 ㎎
구연산 1.5 ㎎
PVP K--30 0.3 ㎎
황색4호 0.2 ㎎
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 세립제형으로 제조하였다.
< 실험예 1> 마우스에 대한 경구투여 급성 독성실험
6주령의 Balb/c 마우스를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 대조균주로는 락토바실루스 GG(Lactobacillus. GG)균을 사용하였다. 군당 10 마리씩의 마우스에 본 발명의 균주를 배양 후 균체를 수거하여 각각 2% 탈지분유용액에 현탁하였다(20 x 1010 cfu/㎖). 균체현탁액 100㎕를 마우스(25g)에 8일(2회/일) 연속 경구투여하였다. 시험균 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 실험종료시 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기를 관찰하였다. 시험결과, 시험균을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었다. 혈액검사에서 시험균은 검출되지 않았으며 생화학 검사에서도 특이한 변화는 관찰되지 않았고 체중변화도 없었다. 이상의 결과 IDCC 3201은 모든 마우스에서 160 x 1010 cfu/kg까지 독성변화를 나타내지 않아 경구투여시 160 x 1010 cfu/kg 이상 복용하여도 안전한 균으로 판단되었다.
< 실험예 2> 마우스에 대한 복강투여 급성 독성실험
6주령의 Balb/c 마우스를 사용하여 복강투여 급성독성실험을 실시하였다. 대조 균주로는 MIC 표준균주인 S. faecium MD 8b균을 사용하였다. 본 발명의 균주와 대조균주를 MRS 배지와 BHI 배지에서 각각 배양하여 20 x 1010 cfu/㎖, 10 x 1010 cfu/㎖, 5 x 1010 cfu/㎖ 그리고 2.5 x 1010 cfu/㎖로 조절된 균 현탁액을 조제한다. 이들 균 현탁액 100㎕를 마우스(25g)에 단회 복강투여하였다. 시험균 투여 후 7일간 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하였다. 시험결과, 반수치사량(LD50)은 IDCC 3201의 경우 40 ~ 80 x 1010 cfu/kg으로 S. faecium MD 8b균의 10 x 1010 cfu/kg보다 4배 이상 높은 것으로 나타났다[표 10]. 따라서 IDCC 3201의 복강투여 LD50은 40 x 1010 cfu/kg 이상인 안전한 균으로 판단되었다.
마우스에 대한 복강투여 급성시험
IDCC 3201 투여량 ( x 10 10 cfu /마우스) S. faecium MD 8b 투여량 ( x 10 10 cfu /마우스)
0.25 0.5 1 2 0.25 0.5 1 2
* 마우스 수 0/6 0/6 2/6 4/6 3/6 4/6 6/6 6/6
폐사율(%) 0 0 33 67 50 67 100 100
* 실험 중 죽은 마우수의 수/ 실험에 사용된 마우스 수
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201은 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성 및 유산생성능이 우수하고, 위장에서 헬리코박터 필로리의 부착능을 저해하는 작용이 우수하기 때문에 헬리코박터 필로리의 감염이나 증식을 효과적으로 억제할 수 있다. 경구투여시 급성, 만성독성이 나타나지 않아 안전하게 헬리코박터 필로리 활성 저해효능을 특징으로 하는 발효유, 건강기능성식품 및 의약품 등에 유용하게 사용될 수 있다.
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Claims (4)

  1. 헬리코박터 필로리 활성 저해능을 갖는 락토바실루스 람노서스 IDCC 3201균주(수탁번호 : KCTC-10833BP).
  2. 제 1항의 균주를 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 필로리 활성 저해제
  3. 제 1항의 균주를 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 필로리 활성 저하용 식품.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 식품은 발효유, 요구르트, 음료수, 우유 음료, 식품첨가물및 건강기능성식품으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식품
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