CN114958658A - 一株鼠李糖乳杆菌a21149及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株抑制幽门螺杆菌的鼠李糖乳杆菌A21149及其应用。本发明所述鼠李糖乳杆菌A21149对人工胃肠液及胆盐具有良好的耐受性，可定植于胃肠道中，不引起溶血，在使用过程中不会导致人体产生不良反应；相比其他现有菌株，能显著增强对幽门螺旋杆菌的互交凝集率、降低幽门螺旋杆菌尿素酶的活性、降低幽门螺旋杆菌对AGS细胞的黏附率、AGS细胞IL‑8的分泌量，抑制幽门螺杆菌。

Description

一株鼠李糖乳杆菌A21149及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株鼠李糖乳杆菌A21149及其应用。
背景技术
幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性的微需氧细菌，迄今为止，幽门螺杆菌感染被认为是世界范围内最常见的细菌感染。在我国各个地区感染幽门螺杆菌的概率有明显差异，平均感染率为59％。幽门螺杆菌是公认的病原体和致癌物，可引起活动性胃炎、消化性溃疡、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤以及胃癌，感染临床表现的严重程度与细菌负荷有关。虽然有些免疫力较强感染者并未发现有不适症状，但是幽门螺杆菌的感染始终是一个危险因素，一旦感染者的免疫力下降幽门螺杆菌就会诱发严重的胃部损伤和病变。
幽门螺杆菌治疗最普遍的现行疗法是通过几种抗生素和质子泵抑制剂的组合来根除病原体，如抗生素三联疗法、四联疗法等。现行疗法在根除幽门螺杆菌的同时也导致了严重的副作用和幽门螺杆菌的耐药。一方面，现行疗法使用两种以上的抗生素会导致肠道菌群的失调，引起胃肠道功能紊乱。另一方面，抗生素疗法中的抑酸药物使得胃部pH升高，胃酸的屏障作用被削弱，使得更多的病原菌或其它条件致病菌可以通过胃部顺利到达肠道，从而引起其它的消化道疾病。由于治疗的副作用和抗生素耐药性的增加，导致根除幽门螺杆菌的成功率低于80％。
因此，除了现行的抗生素疗法外亟需发展一种既不会引起其它的副作用，也不会增加幽门螺杆菌的耐药性的新的治疗方式。
发明内容
本发明的目的在于提供一株鼠李糖乳杆菌A21149及其应用，有效抑制幽门螺杆菌。
本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)A21149，所述鼠李糖乳杆菌A21149的保藏编号为GDMCC No.62226。
本发明还提供了所述的鼠李糖乳杆菌A21149在制备幽门螺杆菌尿素酶抑制剂中的应用。
本发明还提供了所述的鼠李糖乳杆菌A21149在制备抑制幽门螺杆菌的产品中的应用。
本发明还提供了一种幽门螺杆菌抑制剂，包括上述技术方案所述的鼠李糖乳杆菌A21149。
优选的，所述幽门螺杆菌抑制剂中鼠李糖乳杆菌A21149的有效活菌数为1×107～1×1012CFU/mL。
本发明还提供了一种幽门螺杆菌抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
将鼠李糖乳杆菌A21149的接种至MRS液体培养基培养16～24h，得发酵液；
所述发酵液中含有所述幽门螺杆菌抑制剂；
每1L所述MRS液体培养基中包括如下组分：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.6g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠2.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g和余量的水；所述MRS液体培养基pH为6.5。
本发明还提供了一种冻干粉，包括上述技术方案所述制备方法得到的幽门螺杆菌抑制剂和冻干保护剂。
优选的，所述幽门螺杆菌抑制剂和冻干保护剂的质量比为1：1。
本发明还提供了一种益生菌菌剂，包括上述技术方案所述的冻干粉和辅料。
本发明还提供了一种发酵牛乳，其特征在于，由上述技术方案所述的冻干粉在30～40℃条件下发酵6～10h得到。
本发明提供了一种抑制幽门螺杆菌的鼠李糖乳杆菌A21149，已进行生物保藏，保藏编号为GDMCC No.62226。本发明从广西合浦县健康百岁老人的新鲜粪便样品中筛选获得1株抑制幽门螺杆菌的鼠李糖乳杆菌A21149，该菌株可以显著抑制幽门螺旋杆菌尿素酶活性，进而抑制了幽门螺旋杆菌的生存和定植。实施例结果表明，本发明鼠李糖乳杆菌A21149能降低幽门螺旋杆菌对AGS细胞的黏附率、AGS细胞IL-8的分泌量，在辅助预防和治疗幽门螺旋杆菌感染定植方面具有广泛的市场应用前景；并且本发明鼠李糖乳杆菌A21149对人工胃肠液及胆盐具有良好的耐受性，可见鼠李糖乳杆菌A21149对体内胃肠道环境具有良好适应性，可定植于胃肠道中，在使用过程中不会导致人体产生不良反应。鼠李糖乳杆菌A21149溶血试验表明，鼠李糖乳杆菌A21149不引起溶血，安全性较高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为鼠李糖乳杆菌A21149平板菌落形态；
图2为不同菌株对尿素酶相对活力的影响；
图3为不同菌株前感染对AGS细胞黏附率的影响；
图4为不同菌株后感染对AGS细胞黏附率的影响；
图5为鼠李糖乳杆菌A21149对AGS细胞IL-8分泌量的影响；
图6为鼠李糖乳杆菌A21149溶血评价结果。
生物保藏信息
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)A21149，于2022年1月20日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏号为GDMCC No.62226。
具体实施方式
本发明提供了一株抑制幽门螺杆菌的鼠李糖乳杆菌A21149，所述鼠李糖乳杆菌A21149已进行生物保藏，保藏编号为GDMCC No.62226。
本发明所述鼠李糖乳杆菌A21149是从广西合浦县健康百岁老人的新鲜粪便样品中筛选得到，所述鼠李糖乳杆菌A21149的16S rDNA序列优选如SEQ ID NO.1所示：5’-GAACTATGGCGGGTGCCTATAAATGCAAGTCGAACGAGTTCTGATTATTGAAAGGTGCTTGCATCTTGATTTAATTTTGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGTGCATCGGAAACTGGRAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTTTAACCAAATTGGT-3’
本发明所述鼠李糖乳杆菌A21149在MRS固体培养基上，菌落为圆形，乳白色，菌落突起、光滑，边缘整齐，不透明。革兰氏染色后显微镜观察显色，菌株为杆状，革兰氏阳性。
本发明实施例中，所述鼠李糖乳杆菌A21149可显著降低幽门螺旋杆菌对AGS细胞的黏附率和AGS细胞IL-8的分泌量；对人工胃肠液及胆盐具有良好的耐受性，对体内胃肠道环境具有良好适应性，可定植于胃肠道中。溶血试验表明，鼠李糖乳杆菌A21149不引起溶血，安全性较高。鼠李糖乳杆菌是一种益生菌，已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，本发明所述鼠李糖乳杆菌A21149在使用过程中不会导致人体产生不良反应，可辅助预防和治疗幽门螺旋杆菌感染。
根据本发明所述所述鼠李糖乳杆菌A21149的生理生化特性，以下内容均应在本发明保护范围之内：鼠李糖乳杆菌A21149在制备幽门螺杆菌尿素酶抑制剂中的应用；鼠李糖乳杆菌A21149在制备抑制幽门螺杆菌的产品中的应用；利用鼠李糖乳杆菌A21149制备得到的幽门螺杆菌尿素酶抑制剂；利用鼠李糖乳杆菌A21149制备得到的抑制幽门螺杆菌的产品。本发明所述产品优选包括一般性食品和保健性食品；所述一般性食品优选包括发酵食品，例如发酵乳制品、发酵果蔬制品、饮料、零食等。本发明对所述保健性食品的剂型没有严格要求，胶囊剂、片剂、颗粒剂、粉剂、液体剂等均可。
本发明还提供了一种幽门螺杆菌抑制剂，包括上述技术方案所述的鼠李糖乳杆菌A21149。本发明所述幽门螺杆菌抑制剂中，所述的鼠李糖乳杆菌A21149的有效活菌数为1×107～1×1012CFU/mL，优选为5×107～8×1011CFU/mL，进一步优选为1×108～1×1010CFU/mL，更优选为5×108～8×109CFU/mL，最优选为1×109～5×109CFU/mL。利用本发明所述的幽门螺杆菌抑制剂可显著抑制幽门螺旋杆菌尿素酶活性，抑制幽门螺旋杆菌的生存和定植。如实施例结果显示，添加鼠李糖乳杆菌A21149后幽门螺旋杆菌对AGS细胞的黏附率和AGS细胞IL-8的分泌量均降低。
本发明还提供了一种幽门螺杆菌抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
将鼠李糖乳杆菌A21149的接种至MRS液体培养基培养16～24h，得发酵液；
所述发酵液即为幽门螺杆菌抑制剂；
每1所述MRS液体培养基中包括如下组分：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.6g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠2.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g，蒸馏水1000mL，pH6.5。
本发明将所述的鼠李糖乳杆菌A21149接种至MRS液体培养基前，优选将鼠李糖乳杆菌A21149接种到MRS固体培养基上进行活化，得到活化后的鼠李糖乳杆菌A21149。本发明每1L所述MRS固体培养基优选包括：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.6g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠2.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g，溴甲酚紫0.1g，琼脂粉18.0g；所述MRS固体培养基的pH优选为6.5。
本发明优选将所述活化后的鼠李糖乳杆菌A21149接种于MRS液体培养基中，于37℃培养6～12h，得鼠李糖乳杆菌A21149种子液。
本发明优选将所述鼠李糖乳杆菌A21149种子液以2％(体积比)的接种量接种至MRS液体培养基，37℃培养16～24h，得发酵液。所述发酵液中含有所述幽门螺杆菌抑制剂。
本发明优选对所述发酵液进行离心，收集菌体，得幽门螺杆菌抑制剂。本发明所述离心的条件优选为：4℃条件下4000-6000r/min离心10min。
本发明还提供了一种冻干粉，包括上述技术方案所述的幽门螺杆菌抑制剂和冻干保护剂。
在本发明中，所述幽门螺杆菌抑制剂和冻干保护剂的质量比优选为1：1。本发明对所述冻干保护剂的种类没有严格要求，采用常规冻干保护剂即可，例如脱脂乳粉。
本发明在制备所述冻干粉的过程中，优选将所述幽门螺杆菌抑制剂(鼠李糖乳杆菌A21149发酵液离心得到的菌体)和冻干保护剂混合均匀，得菌悬液；将所述菌悬液转移到冻干容器中，梯度降温冷冻，再用真空冷冻干燥机进行冻干，得到冻干粉。本发明对所述梯度降温冷冻的条件没有严格要求，常规进行即可。
本发明还提供了一种益生菌菌剂，包括上述技术方案所述的冻干粉和辅料。本发明对所述辅料的具体类型不做严格要求，根据具体的菌剂剂型常规选择即可。
本发明还提供了一种发酵牛乳，由上述技术方案所述的冻干粉在37～40℃条件下发酵8h得到。
在本发明实施例中，鼠李糖乳杆菌A21149能够可显著降低幽门螺旋杆菌对AGS细胞的黏附率和AGS细胞IL-8的分泌量；对人工胃肠液及胆盐具有良好的耐受性，对体内胃肠道环境具有良好适应性，可定植于胃肠道中；不引起溶血，安全性较高。本发明所述鼠李糖乳杆菌A21149可辅助预防和治疗幽门螺旋杆菌感染，应用广泛。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所用培养基和试剂如下：
MRS显色培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.6g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠2.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g，溴甲酚紫0.1g，琼脂粉18.0g，蒸馏水1000mL，pH6.5，115℃灭菌20min；
哥伦比亚血琼脂培养基：胰酪蛋白胨1.2g、蛋白胨0.5g、酵母粉0.3g、牛肉粉0.3g，可溶性淀粉0.1g、氯化钠0.5g、琼脂粉1.5g，蒸馏水95mL，溶解后调pH值为7.3，121℃灭菌15min，温度降至45℃加入5mL脱纤维绵阳血；
BHI培养基配方为：胰蛋白胨1.0g、牛心浸粉1.75g、氯化钠0.5g、葡萄糖0.2g、十二水合磷酸氢二钠0.25g，蒸馏水100mL，重复溶解后调pH值为7.4，121℃灭菌15min；
尿素酶测试液配方为：0.9％NaCl，20mmol/L尿素，14μg/mL苯酚红。用HCl调pH至6.8；
MRS液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.6g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠2.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g，蒸馏水1000mL，pH6.5，115℃灭菌20分钟后使用。
MRS固体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.6g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠2.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g，琼脂粉18.0g，蒸馏水1000mL，pH6.5，115℃灭菌20min。
本发明对比例提及的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LGG来源于美国模式培养物集存库(ATCC)，保藏编号为ATCC 53103；罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)17938来源于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，保藏编号为DSM17938。
实施例1
1.1菌株的分离
采集广西合浦县健康百岁老人的新鲜粪便样品，称取1.0g新鲜的粪便样品加入9.0mL无菌生理盐水中，震荡混合均匀制成菌悬液。将菌悬液用无菌PBS缓冲液进行梯度稀释，取适当稀释度的稀释液涂布于MRS显色培养基上。37℃厌氧培养2～4d，挑取有黄色变色圈的菌株划线于MRS固体培养基上进行纯化，纯化好的菌株进行斜面保藏备用；
将指示菌(幽门螺旋杆菌)接种于哥伦比亚血琼脂平板，在37℃三气培养箱(5％氧气、10％二氧化碳、85％氮气)培养72～96h。收集幽门螺旋杆菌菌体，用PBS缓冲液洗2次，用BHI培养基重悬并调节菌体浓度为1×107CFU/mL得到幽门螺旋杆菌菌悬液。待测菌株用MRS液体培养基培养16～24h后于6000rpm/min离心5min，收集上清发酵液，并用0.22μm微孔滤膜对上清发酵液进行过滤得到待测发酵液。在96孔板中，加入40μL幽门螺旋杆菌菌悬液和10μL待测发酵液混合均匀后，放入三气培养箱中共培养48h。然后取出加入150μL尿素酶测试液，振荡后用550nm的酶标仪测定吸光值。选取OD550值低的菌株备用；
1.2菌株的鉴定
对上述挑选出的菌株进行生理生化鉴定，并进行PCR扩增菌株的16S rDNA序列，PCR引物采用27F、1492R通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成。反应采用25μL体系：2×San Taq PCR Mix 12.5μL，模板1μL，上下游引物各1μL，补足ddH2O至25μL。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共执行30个循环，最后72℃延伸10min，16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，对序列进行测序后比对分析。结果显示其中一株菌株的序列与NCBI数据库中鼠李糖乳杆菌的同源性高达99.7％；
将上述挑选出的菌株涂布于MRS固体培养基上进行菌落形态观察(如图1所示)，该菌株为圆形，乳白色，菌落突起、光滑，边缘整齐，不透明。革兰氏染色后显微镜观察显色，菌株为杆状，革兰氏阳性。将该菌鉴定为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌A21149。
实施例2
(1)幽门螺旋杆菌菌悬液制备：
将幽门螺旋杆菌悉尼株SS1接种于哥伦比亚血琼脂平板，在三气培养箱培养72～96h。收集幽门螺旋杆菌菌体，用PBS缓冲液洗2次，用BHI培养基重悬并调节菌体浓度为1×107CFU/mL得到幽门螺旋杆菌菌悬液；
(2)鼠李糖乳杆菌A21149发酵上清的制备
将实施例1分离得到的鼠李糖乳杆菌A21149用MRS液体培养基培养16～24h后于6000rpm/min离心5min，收集上清发酵液，并用0.22μm微孔滤膜对上清发酵液进行过滤，得到鼠李糖乳杆菌A21149发酵上清。
对比例1
同实施例2，区别在于制备鼠李糖乳杆菌LGG发酵上清，培养条件与鼠李糖乳杆菌A21149一致。
对比例2
同实施例2，区别在于制备罗伊氏乳杆菌17938发酵上清，培养条件与鼠李糖乳杆菌A21149一致。
测试例1
以40μL幽门螺旋杆菌菌悬液为对照，记为HP模型组；
以40μL幽门螺旋杆菌菌悬液+实施例2鼠李糖乳杆菌A21149发酵上清为处理1，记为HP+鼠李糖乳杆菌A21149发酵上清；
以40μL幽门螺旋杆菌菌悬液+对比例4罗鼠李糖乳杆菌LGG发酵上清为处理2，记为HP+鼠李糖乳杆菌LGG发酵上清；
以40μL幽门螺旋杆菌菌悬液+对比例5罗伊氏乳杆菌17938发酵上清为处理3，记为HP+罗伊氏乳杆菌17938发酵上清；
按照上述处理方式将40μL幽门螺旋杆菌菌悬液和10μL待测发酵液混合均匀后放在无菌96孔板中，放入三气培养箱中共培养48h后分别加入150μL尿素酶测试液，振荡后用酶标仪测定550nm的吸光值，计算尿素酶相对活力如表1和图2所示。
表1各处理组尿素酶相对活力
处理方式 尿素酶相对活力(％)
HP模型组 100
HP+鼠李糖乳杆菌A21149发酵上清 25.0
HP+鼠李糖乳杆菌LGG发酵上清 26.1
HP+罗伊氏乳杆菌17938发酵上清 50.9
根据表1和图2可以看出，鼠李糖乳杆菌A21149菌株发酵上清液对幽门螺旋杆菌尿素酶具有较强的抑制能力，高于其他菌株。
实施例3
幽门螺旋杆菌细胞粘附力抑制实验
(1)AGS细胞准备：在无菌96孔板中接种AGS细胞，细胞接种量为2×104个细胞/孔，以F12K+10％胎牛血清为培养基，培养过夜贴壁。
(2)幽门螺旋杆菌菌悬液准备：培养好的新鲜幽门螺旋杆菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×107CFU/mL。
(3)待测菌菌悬液准备：将培养好的实施例2鼠李糖乳杆菌A21149菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×107CFU/mL；
将培养好的对比例1鼠李糖乳杆菌LGG菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×107CFU/mL；
(4)先感染模型：96孔板中培养过夜的AGS细胞用PBS缓冲液洗3次除去未贴壁的细胞后加入0.1mL幽门螺旋杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。培养结束后用PBS缓冲液洗3次除去未黏附的幽门螺旋杆菌，加入0.1mL步骤(3)制备得到的待测菌悬液，加入在三气培养箱中共培养2h。以未感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞为空白组，以感染幽门螺旋杆菌但未经待测菌处理的AGS细胞为模型组，记HP模型组；以感染幽门螺旋杆菌且经待测菌处理的AGS细胞为实验组，依次记为HP+A2149、HP+LGG。培养结束后用PBS洗3次，再加入0.2mL尿素酶试剂，并于550nm处检测各孔的吸光值。
(5)后感染模型：96孔板中培养过夜的AGS细胞用PBS缓冲液洗3次除去未贴壁的细胞后加入0.1mL待测菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。培养结束后用PBS缓冲液洗3次除去未黏附的待测菌，加入0.1mL幽门螺旋杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。以未感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞为空白组，以感染幽门螺旋杆菌但未经待测菌处理的AGS细胞为模型组，以感染幽门螺旋杆菌且经待测菌处理的AGS细胞为实验组。培养结束后用PBS洗3次，再加入0.2mL尿素酶试剂，并于550nm处检测各孔的OD值。
黏附率计算以模型组OD值减去空白组OD值为100％，实验组黏附率计算公式为：
Figure BDA0003637438180000101
先感染模型结果如图3所示，和HP模型组对比，经A21149菌株处理后幽门螺旋杆菌对细胞的粘附率降低到39.31％，经LGG菌株处理后幽门螺旋杆菌对细胞的粘附率降低到53.24％；后感染模型结果如图4所示，A21149菌株可将幽门螺旋杆菌对细胞粘附率降低到39.33％，经LGG菌株处理后幽门螺旋杆菌对细胞的粘附率降低到58.68％。由图3和图4结果可知，本发明鼠李糖乳杆菌A21149菌株可显著降低幽门螺旋杆菌对细胞的黏附率。
实施例4
AGS细胞IL-8分泌量检测
(1)AGS细胞准备：在无菌24孔板中接种AGS细胞，细胞接种量为1×105个细胞/孔，以F12K+10％胎牛血清为培养基，培养过夜贴壁。
(2)幽门螺旋杆菌菌悬液准备：培养好的新鲜幽门螺旋杆菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×107CFU/mL。
(3)待测菌菌悬液准备：将培养好的实施例2鼠李糖乳杆菌A21149菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×107CFU/mL；
(4)24孔板中培养过夜的AGS细胞用PBS缓冲液洗3次除去未贴壁的细胞后加入0.5mL幽门螺旋杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。培养结束后用PBS缓冲液洗3次除去未黏附的幽门螺旋杆菌，加入0.5mL待测菌悬液，在三气培养箱中共培养24h。以未感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞为对照组，以感染幽门螺旋杆菌但未经待测菌处理的AGS细胞为模型组，记HP模型组；以感染幽门螺旋杆菌且经待测菌处理的AGS细胞为实验组，记为HP+A21149。培养结束后收集细胞培养液，在4℃以4000rpm/min离心10min，收集上清液。上清液根据ELISA试剂盒(购自上海江莱生物公司)提供的方法进行IL-8含量检测。
检测结果如图5所示，对照组AGS细胞的IL-8分泌量为3.60pg/mL，和对照组相比，感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞上清液IL-8浓度显著增加到28.64pg/mL；经A21149菌株处理后，AGS细胞的IL-8分泌量显著减少到1.48pg/mL。该结果表明，鼠李糖乳杆菌A21149可以显著抑制幽门螺旋杆菌对细胞的感染。
实施例5
菌株对幽门螺旋杆菌的抑制
将活化好的幽门螺旋杆菌接入BHI+5％胎牛血清液体培养基中，在37℃、5％氧气、10％二氧化碳条件下培养至菌液浓度为1×108CFU/mL。取0.1mL幽门螺旋杆菌菌液涂布于哥伦比亚血琼脂平板上，制备成幽门螺旋杆菌平板。
将实施例2鼠李糖乳杆菌A21149转接活化2次后接入MRS液体培养基中37℃下厌氧培养24h。培养好的菌液于6000rpm/min条件下离心5min，取上清液用0.22微米无菌微孔滤膜过滤得待测上清液。用牛津杯法检测待测上清液对幽门螺旋杆菌得抑制效果。检测效果如表2所示。
表2菌株抑菌圈测量结果
Figure BDA0003637438180000111
根据表2记载的内容可以看出，本发明鼠李糖乳杆菌A21149菌株可显著抑制幽门螺旋杆菌的生长。
实施例6
菌株对幽门螺旋杆菌的互交凝集能力
(1)菌悬液制备：将活化好的待测菌及幽门螺旋杆菌菌体用无菌PBS缓冲液洗涤2次，用PBS缓冲液重悬后调整菌悬液浓度为1×108CFU/mL。
(2)将实施例2与对比例4待测菌菌悬液分别与幽门螺旋杆菌菌悬液进行等量混合，震荡3～5min充分混合均匀后置于37℃静置培养，并于0h、2h、16h取样上层液体进行OD600吸光值检测。根据公式计算待测菌对幽门螺旋杆菌的互交凝集率，检测结果如表3所示。
Figure BDA0003637438180000121
Aa：0h待测菌悬液OD600值；
Ab：0h幽门螺旋杆菌菌悬液OD600值；
Amix：各检测时间点的混合菌悬液OD600值。
表3菌株对幽门螺旋杆菌的互交凝集能力
Figure BDA0003637438180000122
根据表3可以看出，A21149菌株对幽门螺旋杆菌的互交凝集率随着时间的延长而增加，16h时A21149菌株对幽门螺旋杆菌的互交凝集率达到52.61％，高于其他菌株。这表明A21149菌株与幽门螺旋杆菌具有较强的结合能力，二者形成凝集体有助于将幽门螺旋杆菌排除体外。
实施例7
菌株对人工胃肠液的耐受性
(1)菌悬液制备：将实施例2菌株从保藏斜面上转接活化2次后接入MRS培养基培养16～24h，将菌悬液浓度调整至1×109CFU/mL。
(2)耐人工胃液实验：取1mL菌悬液添加入9mLpH值2.5的人工胃液中，在37℃厌氧培养3h；分别于0h和3h对培养液进行梯度稀释后涂布于MRS平板进行平板计数。根据公式计算存活率。
人工胃液存活率＝(3h平板菌落数/0h平板菌落数)×100％
(3)耐人工肠液实验：取1mL菌悬液添加入9mLpH值2.5的人工胃液中，37℃厌氧培养3h后取1mL加入到9mLpH值8.0的人工肠液中，37℃厌氧培养7h；加入人工肠液后分别于0h和7h取培养液进行梯度稀释后涂布于MRS平板进行平板计数，根据公式计算存活率。人工肠液存活率＝(7h平板菌落数/0h平板菌落数)×100％
存活率统计结果如表4所示。
表4菌株人工胃肠液耐受检测结果
菌株编号 人工胃液存活率(％) 人工肠液存活率(％)
鼠李糖乳杆菌A21149 187％ 40.0％
根据表4记载的内容可以看出，本发明鼠李糖乳杆菌A21149可以很好地耐受胃酸环境，对肠液也具有较好的耐受性。
实施例8
菌株对胆盐的耐受性
(1)菌悬液制备：将实施例2菌株从保藏斜面上转接活化2次后接入MRS培养基培养16-24h，并将培养液浓度调整至1×107CFU/mL。
(2)取1mL菌悬液加入9mL含有0.3％牛胆盐的MRS培养基中，37℃厌氧培养24h，分别于0h、24h取培养液进行梯度稀释后涂布于MRS平板进行平板计数，根据公式计算存活率。0.3％胆盐存活率＝(24h平板菌落数/0h平板菌落数)×100％。存活率统计结果如表5所示。
表5菌株0.3％浓度胆盐存活率
菌株编号 0.3％胆盐存活率(％)
鼠李糖乳杆菌A21149 63.33％
根据表5可以看出，本发明鼠李糖乳杆菌A21149对0.3％浓度的胆盐具有较好的耐受能力。
实施例9
菌株溶血评价
在无菌条件下，实施例2菌株转接活化2次后用无菌接种环划线接种于含有5％绵阳血的血平板上，37℃厌氧培养48h，观察血平板上是否有溶血圈出现。菌株培养结果如图6所示：菌落周围的培养基没有出现溶血圈，表明培养基中的红细胞没有被溶解，该菌株具有相对安全性。
实施例10
冻干菌粉及益生菌菌剂的制作
将鼠李糖乳杆菌A21149接种至MRS固体培养基中进行活化，将活化后的菌株接种至MRS液体培养基中制备种子液。制备好的种子液以2％接种量接种至MRS液体培养基中，37℃培养24h进行大批量发酵。发酵结束镜检确认无污染后，将菌液在4℃条件下4000-6000r/min离心10min收集菌体。
收集好的菌体用无菌生理盐水洗2次后在菌体中按1:1加入脱脂乳粉等常规冻干保护剂，混合均匀制备成菌悬液。将菌液转移至冻干容器中，梯度降温冷冻，再用真空冷冻干燥机进行冻干。将冻干的菌体进行粉碎研磨后即可得到鼠李糖乳杆菌A21149冻干菌粉。
鼠李糖乳杆菌A21149冻干菌粉与常用辅料进行混合后经过压片或填充胶囊可制作成片剂或胶囊等益生菌菌剂。
实施例11
含有鼠李糖乳杆菌A21149的发酵牛乳制作
将牛乳或脱脂牛乳按常规工艺进行巴氏杀菌，冷却至37℃后加入鼠李糖乳杆菌A21149菌粉，搅拌均匀。在37-40℃条件下发酵8h，即得含有鼠李糖乳杆菌A21149的发酵牛乳。
本发明所述鼠李糖乳杆菌A21149对人工胃肠液及胆盐具有良好的耐受性，可定植于胃肠道中，不引起溶血，在使用过程中不会导致人体产生不良反应；相比其他现有菌株，能显著降低幽门螺旋杆菌对AGS细胞的黏附率、AGS细胞IL-8的分泌量，抑制幽门螺杆菌。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 广西爱生生命科技有限公司
广西自贸区爱生生物技术有限公司
<120> 一株鼠李糖乳杆菌A21149及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1483
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaactatggc gggtgcctat aaatgcaagt cgaacgagtt ctgattattg aaaggtgctt 60
gcatcttgat ttaattttga acgagtggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc 120
cttaagtggg ggataacatt tggaaacaga tgctaatacc gcataaatcc aagaaccgca 180
tggttcttgg ctgaaagatg gcgtaagcta tcgcttttgg atggacccgc ggcgtattag 240
ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc aatgatacgt agccgaactg agaggttgat 300
cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct 360
tccacaatgg acgcaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ctttcgggtc 420
gtaaaactct gttgttggag aagaatggtc ggcagagtaa ctgttgtcgg cgtgacggta 480
tccaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa 540
gcgttatccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga 600
aagccctcgg cttaaccgag gaagtgcatc ggaaactggr aaacttgagt gcagaagagg 660
acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg 720
aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga 780
ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gatgaatgct aggtgttgga gggtttccgc 840
ccttcagtgc cgcagctaac gcattaagca ttccgcctgg gggagtacga ccgcaaggtt 900
gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 960
gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcttttgat cacctgagag atcaggtttc 1020
cccttcgggg gcaaaatgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1080
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatgactagt tgccagcatt tagttgggca 1140
ctctagtaag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 1200
ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt tgcgagaccg 1260
cgaggtcaag ctaatctctt aaagccattc tcagttcgga ctgtaggctg caactcgcct 1320
acacgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg 1380
gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccgaagc cggtggcgta 1440
acccttttag ggagcgagcc gtctaaggtt taaccaaatt ggt 1483

Claims (10)

1.一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)A21149，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌A21149保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:62226。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌A21149在制备幽门螺杆菌尿素酶抑制剂中的应用。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌A21149在制备抑制幽门螺杆菌的产品中的应用。
4.一种幽门螺杆菌抑制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌A21149。
5.根据权利要求4所述的幽门螺杆菌抑制剂，其特征在于，所述幽门螺杆菌抑制剂中鼠李糖乳杆菌A21149的有效活菌数为1×107～1×1012CFU/mL。
6.一种幽门螺杆菌抑制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将鼠李糖乳杆菌A21149的接种至MRS液体培养基培养16～24h，得发酵液；
所述发酵液中含有所述幽门螺杆菌抑制剂；
每1L所述MRS液体培养基中包括如下组分：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.6g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠2.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0g和余量的水；所述MRS液体培养基pH为6.5。
7.一种冻干粉，其特征在于，包括权利要求6所述制备方法得到的幽门螺杆菌抑制剂和冻干保护剂。
8.根据权利要求7所述的幽门螺杆菌冻干粉，其特征在于，所述幽门螺杆菌抑制剂和冻干保护剂的质量比为1：1。
9.一种益生菌菌剂，其特征在于，包括权利要求7或8所述的冻干粉和辅料。
10.一种发酵牛乳，其特征在于，由权利要求7或8所述的冻干粉在30～40℃条件下发酵6～10h得到。
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