KR101255894B1

KR101255894B1 - 락토바실러스 플란타룸 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101255894B1
Application number: KR1020100104353A
Authority: KR
Inventors: 웬-흐신 린
Original assignee: 차이나 메디칼 유니버시티
Priority date: 2010-07-20
Filing date: 2010-10-26
Publication date: 2013-04-17
Also published as: JP5134060B2; US8415135B2; US20120020943A1; JP2012024074A; TWI401086B; KR20120010080A; TW201204374A; MY151204A

Abstract

타이완에 소재하는 FIRDI(Food Industry Research and Development Institute)에 수탁번호 BCRC 910472호, 및 독일의 DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에 수탁번호 DSM 23780호로 기탁된, 단리된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995가 제공된다. 또한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995를 포함하는 조성물 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995의 용도도 제공된다. 상기 균주는 병원체를 억제하고, 위장관을 보호하며, 및/또는 요관의 감염을 예방 또는 치료하기 위하여 의약 또는 건강 식품으로서 제조된다.

Description

락토바실러스 플란타룸 및 그의 용도{Lactobacillus plantarum and uses thereof}

본 발명은 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 균주 및 그의 용도, 특히 단리(isolated) 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995 및 그의 용도에 관한 것이다.

락토바실러스(Lactobacillus)는 인간 또는 동물의 장관(intestinal tract)에 존재하는 주요 세균의 하나이다. 인간 또는 동물 몸의 생리학적 활성에 대한 유리한 효과로 인하여, 락토바실러스(Lactobacillus)는 다양한 생균제(probitoc) 제품에 흔히 부가된다. 예를 들어, 락토바실러스(Lactobacillus)는 장내 독소[살모넬라(Salmonella) 또는 에쉐리키아(Escherichia)와 같은]의 생장을 억제하거나 또는 독소 침습을 견딜 수 있고, 예컨대 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)이 위장관 상피세포로 침습하는 것을 방지한다.

현재, 병원체를 억제하기 위한 락토바실러스(Lactobacillus)의 적용에 관련한 특허가 다수 존재한다. 예컨대, 미국특허 번호 5,603,930호는 장내독소 및 장내 침습성 병원체를 억제할 수 있는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)를 개시하며; 미국특허 번호 3,953,609호는 소화계에서 에쉐리키아(Escherichia)의 생장을 억제할 수 있는 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis)를 개시하고 있고; 또 미국특허 번호 6,491,956호는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 감염에 의해 유발된 위염, 십이지장궤양, 및 위궤양을 방지하고 치료할 수 있는 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 개시한다.

기본적인 생리학적/약리학적 활성 이외에, 락토바실러스는 동물체내에서 효과적으로 작용하는 2개의 중요한 특징을 가져야 한다. 먼저, 락토바실러스는 소화계에서 살아남아서 위장관에서 그 기능을 나타낼 만큼 위장관에 도달하기 위하여 동물 위장관에 의해 분비되는 위산과 콜린(choline)에 대하여 강한 내성을 가져야 한다. 이어, 락토바실러스는 위장관에서 다른 병원체와 경쟁하여서 병원체에 의해 배출되지 않도록 동물 숙주의 장내 상피세포에 강하게 부착할 수 있어야 한다. 또한, 병원체는 장내 상피세포에 부착하는 것에 의해 동물체내를 감염하기 때문에, 락토바실러스가 장내 상피세포에 대하여 비교적 강한 접착능을 가지고 있다면, 위장관이 감염되지 않게 보호하기 위하여 병원체를 배출할 수 있다.

본 발명의 발명자들은 새로 태어난 어린이의 분비물로부터 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 신규 균주를 스크리닝하고 또 상대적 생체내 및 시험관내 실험을 통하여, 병원체를 억제하는 이외에, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이 위장관 및 요관의 세포에 대한 탁월한 접착능을 가지므로 위장관 및 요관을 병원체 감염으로부터 효과적으로 또 지속적으로 보호할 수 있음을 밝혀내었다. 본 발명자들은 또한 상기 균주가 병원체에 의해 유발된 질병을 예방 및 치료하기 위하여 병원체의 생장을 직접적으로 억제할 수 있음을 밝혀내었다.

발명의 요약

본 발명의 주요 목적은 타이완에 소재하는 FIRDI(Food Industry Research and Development Institute)에 수탁번호 BCRC 910472로 기탁되고 또 독일의 DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에 수탁번호 DSM 23780으로 기탁된 단리된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 병원체를 억제하고, 위장관을 보호하며, 및/또는 요관을 보호하기 위한 의약 또는 건강식품을 제조하기 위한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명을 실시하기 위한 상세한 기술 및 바람직한 구체예는 당업자들이 청구된 발명의 특징을 잘 이해할 수 있도록 첨부한 도면을 비롯한 이하의 단락에서 자세하게 기재된다.

도 1은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995의 유전자 핑거프린팅(fingerprinting) 지도를 도시한다.

본 발명의 발명자들은 새로 태어난 건강한 어린이의 분비물로부터 신규 락토바실러스(Lactobacillus)의 균주를 스크리닝하여 단리하고, 그 균주를 락토바실러스 플란타룸으로 확인하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995으로 명명하였다.

상기 기재한 바와 같이, 락토바실러스는 위장관 부착을 위해 병원체와 경쟁하기 위하기 위하여 동물 숙주의 장내 상피세포에 강하게 부착해야 하고, 또 소망하는 생리학적 효과를 달성하도록 병원체를 배출해야 한다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995는 위장관 상피세포에 부착할 수 있고, 시중에서 흔히 볼 수 있는 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) GG (LGG)에 비하여 위장관 상피세포에 훨씬 더 강한 접착능으로 부착될 수 있음이 밝혀졌다.

위장관 상피세포에 부착되는 것과 별도로, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995는 요관 상피세포에도 단단하게 부착할 수 있어, 요관에 부착하기 위해 병원체와 경쟁할 수 있고 또 요관을 보호하기 위해 병원체를 제거할 수 있다.

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995는 위장관 및 요관에 잘 부착될 수 있기 때문에, 병원체 감염을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예방을 위하여, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995는 사료, 음료수, 영양보조제 또는 기타 건강식품에 부가될 수 있어, 상기 균주는 이들 제품을 소비하는 사람을 보호하기 위하여 위장관 또는 요관에 부착할 수 있다. 병원체가 위장관 또는 요관을 침입하면, 이들은 부착하기 위하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995와 경쟁할 수 없으므로, 감염 메카니즘을 개시할 수 없어 체외로 배출된다. 치료의 경우, 인체 또는 동물의 위장관 또는 요관이 병원체에 의해 감염되면, 예컨대 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995를 포함하는 의약을 섭취하며, 위장관 또는 요관에 부착된 병원체는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995가 위장관 및 요관에 흡착하는 특징에 의해 제거되어 치료 효과를 달성할 것이다. 따라서, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995는 병원체 감염을 예방 또는 치료하기 위하여 강한 흡착능을 통하여 위장관 또는 요관의 세포에 병원체가 부착되는 것을 억제할 수 있다.

간접적으로 감염을 억제하기 위하여 위장관 또는 요관에 병원체가 부착되는 것을 억제하는 이외에, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995는 병원체의 생장을 직접적으로 억제할 수 있으므로, 이들 2개의 억제 메카니즘의 상승작용에 의해 위장관 및/또는 요관을 보호할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "병원체를 억제하는"은 병원체가 위장관에 부착되는 것을 억제하는 것, 병원체가 요관에 부착되는 것을 억제하는 것, 및 병원체의 생장을 억제하는 것을 포함하는 말이다.

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995는 위장관 및/또는 요관에서 다양한 병원체를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 살모넬라 속(Salmonella spp.), 에쉐리키아 속(Escherichia spp.), 스타필로코커스 속(Staphylococcus spp.), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 병원체를 억제할 수 있다. 특히, 헬리코박터 파이로리를 억제하기 위해 사용될 수 있다.

헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)는 그램-음성, 미세호기성(microaerophilic)의 병원체로서 위장 및 십이지장의 다양한 부위에서 생존할 수 있다. 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)의 전염 경로는 지금까지 밝혀져 있지 않지만, 위점막 만성 염증을 초래하여서, 결국 위궤양과 십이지장 궤양 또는 위암을 초래할 수 있다. 따라서, 세계보건기구(WHO)는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)가 발암성 미생물 유형이며, 또 발암성으로 밝혀진 최초의 원핵생물이라고 공표하였다. 세계 인구의 절반 이상이 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 보균자이며, 이들 대부분은 개도국에서 살고 있다. 현재, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)에 의해 유발된 질병을 치료하기 위한 주요 방법은 항생제를 사용한 치료이다. 그러나, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)의 약물 내성으로 인하여, 다수의 항생제는 더 이상 만족스런 치료 결과를 내지 못하고 있다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)의 생장과 장내 상피세포에 대한 부착을 현저하게 억제할 수 있기 때문에, 헬리코박터 파이로리에 의해 유발된 다양한 질병을 효과적으로 예방하거나 치료하기 위하여 전통적으로 사용되는 항생제와 조합되거나 대체할 수 있다.

또한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995는 병원체의 생장을 직접적으로 억제할 수 있기 때문에, 상기 병원체에 의해 유발된 질병을 예방 및 치료할 수 있도록 사용될 수 있으며, 또 상기 질병들은 위장관 질병에 한정되지 않는다. 예컨대, 스타필로코커스 속(Staphylococcus spp.)은 위장관뿐만 아니라 호흡기관, 요관, 정맥, 상처, 등과 같은 다른 부위를 감염시킬 수 있으므로, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995에 의한 스타필로코커스 속(Staphylococcus spp.)의 생장 억제는 상술한 부위의 감염을 치료 및 예방하기 위해 이용될 수 있다. 다른 양태로서, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 위장관뿐만 아니라 구강, 요관 등의 점막 조직을 감염시킬 수 있어, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995에 의한 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 생장 억제는 구강 또는 요관의 감염을 치료 또는 예방하기 위해 이용될 수 있다.

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995의 병원체 생장을 억제하는 부착 특징 및 능력으로 인하여, 다양한 의약 제품 및 건강 제품에서 널리 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995의 상술한 특정 특징을 기초로 하여, 본 발명의 조성물은 병원체를 억제하고, 위장관을 보호하며, 요관을 보호하고, 또는 이들의 조합을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 임의 형태로 제조될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 조성물은 약학적 조성물, 사료, 음료수, 영양보조제, 유제품, 식품, 건강식품, 스프레이 및 좌약으로 이루어진 군으로부터 선택된 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 양태로서, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995는 식품 제품, 예컨대 유제품에 부가될 수 있다. 약학적 조성물 및 식품 제품에 락토바실러스를 적용하는 것은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되는 타이완 공개특허공보 200708622호 및 타이완 공개특허공보 200611973호에서 찾아 볼 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 병원체의 부착 및 생장 억제 효과를 더욱 개선하기 위하여 적합한 첨가제와 함께 경우에 따라 부가될 수 있다. 다르게는, 기타 영양제 또는 약학 성분을 조성물에 부가하여 적용의 유연성을 증가시킬 수 있다. 예컨대 본 발명의 조성물은, 활성 성분이 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995에 대하여 나쁜 효과를 갖지 않는 한 제산제, 기타 생균제 등과 같은 1 이상의 활성 성분을 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 병원체를 억제하고, 위장관을 보호하며 및/또는 요관을 보호하기 위하여 의약 또는 건강 식품을 제조하기 위한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995의 용도를 제공한다.

이후, 본 발명은 이하의 실시예를 참조하여 더욱 자세하게 설명할 것이다. 그러나, 이들 실시예는 예시적 목적으로 제공된 것일 뿐이므로, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

[ 실시예 1] 부착 분석

실험 A. 락토바실러스 균주의 제조

위장관 세포의 부착 분석을 실시하기 위해 사용된 락토바실러스 균주는 다음을 포함한다: 락토바실러스 플란타룸 CMU995, 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (LGG), 및 실험실로부터 단리된 락토바실러스 균주 B7P3, A7G1, B1T4, IA5, 및 HT5. 모든 락토바실러스 균주는 MRS 배지 용액 (Difco, Detroit, Michigan, USA)에 의해 2회 활성화되며, 또 이들은 전달되고 MRS 배지 용액(5mL)에서 배양하였다. 24시간 후, 1 mL의 브로쓰(broth)를 취하고 10분간 원심분리(6000 rpm)한 다음 포스페이트 완충 용액(PBS, pH 7.2)을 사용하여 2회 헹구어서 다음 부착 실험을 진행하였다. 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG는 대조군으로 사용하였다.

실험 B. 위장관 및 요관 세포주의 세포 배양

이 실험에 사용된 위장관 세포주는 Caco-2 인간 결장 선암(수탁번호: ATCC CRL 2102) 및 AGS 위장 선암(수탁번호: ATCC CRL1739)이었다. 사용된 요관 세포주는 Hela 인간 경부 상피세포(수탁번호: ATCC CCL-2)이었고, 또 상기 세포들(Caco-2 인간 결장 선암, AGS 위장 선암, 및 Hela 인간 경부 상피세포)은 타이완에 소재하는 BCRC(Bioresource Collection and Research Center)로부터 구입하였으며 또 세균, 진균류, 및 미코플라스마의 오염 시험을 통과한 것이었다. 이들 세포주를 얻은 후, 이들을 일정한 온도하의 37℃에서 물중탕기로 즉각 전달하여 해동하고, 25 cm²의 페트리 접시에서 배양한 다음 37℃에서 5 vol% 이산화탄소를 함유하는 세포 배양기에 두고 배양하였다. 세포들을 활성화시키고 또 몇 차례 계대배양한 다음, 세포주가 안정한 후 다른 실험을 실시하였다. Caco-2 세포의 배양 배지는 듈베코의 변형 배지(DMEM, 깁코 코포레이션으로부터 구입)였고; AGS 세포의 배양 배지는 F-12 배지(깁코 코포레이션으로부터 구입)였으며; 또 Hela 세포의 배양 배지는 최소 필수 배지(MEM, 깁코 코포레이션으로부터 구입)였다. 상술한 모든 배양 배지에는 10 vol% 우태아 혈청(FBS)이 부가되었다.

실험 C. 락토바실러스의 부착 분석

실험 B로부터 제조된 세포주를 0.05vol% 트립신(1mL)과 5분간 처리한 다음, 96-웰 플레이트로 전달하며, 이때 각 웰에는 1x10⁴개 세포가 부가되며, 또 상기 배지는 매일 신선한 배지(200 μL)로 교체하였다. 이어, 실험 A에서 제조된 락토바실러스(Lactobacillus) 브로쓰(20μL)를 상기 세포에 부가하고 또 1시간 동안 배양하여 락토바실러스를 세포에 부착시켰다. 1시간 부착시킨 후, 배지를 제거하고, 또 상기 세포들을 포스페이트 완충 용액(PBS)을 사용하여 5회 헹구어서 세포에 부착되지 않은 락토바실러스를 제거하고, 또 10 vol% 포르말린(100μL)을 부가하여 세포 및 락토바실러스를 안정화시켰다. 30분 후, 세포들을 PBS로 3회 헹구고, 또 마지막으로 크리스탈 바이올렛(100μL)으로 5분간 염색하고, 즉시 75 vol% 알코올 최소량으로 세척하여 세포 상의 염색을 제거하였다.

위장관 또는 요관의 상피세포에 다양한 락토바실러스가 부착하는 능력을 관찰하기 위하여 상 대조 현미경을 사용하였고, 또 무작위 현미경 영역하에서, 락토바실러스가 50개 세포에 부착하는 것을 관찰하고 계산하여 각 세포에 부착하는 락토바실러스의 평균양을 산출하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타낸다.

표 1로부터 알 수 있듯이, 기타 공지된 락토바실러스(국제적으로 잘 알려져있고 시장에서 흔히 볼 수 있는 락토바실러스 람노수스 GG를 비롯)와 비교하여, 락토바실러스 플란타룸 CMU995는 위장관 및 요관의 세포에 훨씬 더 우수한 부착력을 가지므로, 위장관 및 요관에 대하여 더욱 오래 지속적으로 보호를 제공할 수 있다.

[ 실시예 2] 병원체의 생장의 억제 시험

실험 D. 페트리 접시 시험

웰-확산 방법을 이용하여 병원체 생장에 대한 락토바실러스의 억제능을 평가하였다. 멸균 브루셀라 한천(Brucella agar) 배지(Difco 제조, 미국 미시간 디트로이트 소재)를 세균 페트리 접시에 붓고 고화시켰다. 이어, 철야 배양하고, 위장관의 예시적 병원체인 헬리코박터 파이로리(수탁번호: BCRC 17021) 및 임상적으로 단리된 헬리코박터 파이로리 CMU83을 상기 한천 배지 상에 균일하게 발랐다. 브로쓰가 약간 건조된 후, 직경 7 mm의 구멍을 페트리 접시내의 한천 플레이트 상에 만들고, 실험 A에서 MRS 배지에서 24 시간 동안 배양된 락토바실러스 플란타룸 CMU 995의 브로쓰(70 μL)를 상기 구멍에 부가하였다. 또한, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) CMU20, 에쉐리키아 속( Escherichia spp .), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 속(Salmonella spp.), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 포함한 기타 위장관 병원체를 분석하기 위하여 상기 방법을 또한 이용하였다. 각 샘플을 3회 반복해서 분석하고, 배양 배지를 세균 배양기에 넣고, 16 내지 18시간 후, 세균 억제 영역(써클)의 직경을 측정하였다. 여기서, 락토바실러스 람노수스 GG의 발효액을 양성 대조군으로 사용하였고, 또 pH 6.3의 MRS 배지를 음성 대조군으로 사용하였다. 결과를 하기 표 2에 나타낸다.

표 2에서의 결과는 락토바실러스 람노수스 GG에 비하여, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 CMU995가 훨씬 더 우수한 병원체 생장 억제 효능을 가지므로, 병원체에 의해 유발된 질병을 예방하고 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 병원체 감염으로부터 위장관을 보호하기 위해 사용될 수 있다.

[ 실시예 3] 병원체 감염의 억제 시험 및 부착 시험

Caco-2 세포, AGS 세포, 및 Hela 세포(각 1 mL; 밀도: 5 x 0⁴ 세포/mL)를 24-웰 세포 배양 플레이트에서 배양하고, 또 5 vol% 이산화탄소/95 vol% 공기를 포함하는 세포 배양기, 37℃에 두고, 또 2일간 배양한 다음 다음 2종류의 시험을 실시하였다.

실험 E. 예방 및 방지 형태

실험 A에서 24시간 동안 배양한 락토바실러스 플란타룸 CMU995의 발효액(100 μL)을 2일간 배양된 Caco-2 세포, AGS 세포, 또는 Hela 세포에 부가하고 또 균일하게 혼합하며, 상기 세포들을 세포 배양기에 넣어 0.5 시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 세포들을 멸균 염수를 사용하여 헹구어서 세포에 부착되지 않은 락토바실러스를 제거하였다. 이들 세포에 헬리코박터 파이로리 CMU83, 장관부착성 (Enteroadherent aggregative) 대장균(EAggEC), 또는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) (각 1 mL, 1 x 10⁷ cfu/mL)를 부가하고 또 균일하게 혼합하며, 상기 세포들을 세포 배양기에 넣고 1 시간 동안 배양하여, 병원체가 세포를 감염하게 하였다. 이어, 상기 배지를 제거하고, 세포를 멸균 염수용액으로 헹구어서 세포를 감염시키지 않은 병원체를 제거하고, 또 0.1 vol% 트리톤-X-100 (1mL) (시그마 제조, 미국 미주리 루이스 소재)을 더 부가하여 세포를 용해시켜 감염성 병원체를 방출하였다. 마지막으로, 용해된 세포를 함유하는 용액을 수집하고 PBS 용액(9 mL)에 두었다. 이 용액을 약간 희석한 후, 세균의 수를 산출하기 위하여 혼석평판법(pour plate method)을 이용하였다. 여기서, 세포가 락토바실러스와 함께 부가되지 않은 실험은 대조군으로 작용하며, 계산 결과를 다음 식에 적용하여 락토바실러스 플란타룸 CMU995의 감염 억제율을 산출하였다. 결과를 하기 표 3에 나타낸다.

감염 억제율 = (대조군에서 병원체 수 - 락토바실러스를 부가한 군에서 병원체의 수)/대조군에서 병원체의 수 x 100%

실험 F. 치료 및 제거 형태

Caco-2 세포, AGS 세포, 또는 Hela 세포를 각각 2일 동안 배양하고, 또 헬리코박터 파이로리 CMU83, 장내부착성 대장균(EAggEC), 또는 살모넬라 엔테리티디스(각 1 mL, 1 x 10⁷ cfu/mL)를 각 세포에 부가하고, 또 세포들을 0.5 시간 동안 배양하여 병원체가 세포들을 감염시키도록 하였다. 이어 세포들을 멸균 염수 용액으로 헹구어서 세포를 침입하지 않은 병원체를 제거하였다. 실험 A에서 24시간 동안 배양된 락토바실러스 플란타룸 CMU995의 발효액(100 μL)을 상기 세포에 부가하고, 또 세포들을 1시간 동안 배양하여 락토바실러스 플란타룸 CMU995이 병원체를 배출하게한다. 마지막으로, 세포들을 멸균 염수 용액으로 헹구어서 세포에 부착하지 않은 락토바실러스를 제거하고 병원체는 배출하였다. 0.1 vol% 트리톤-X-100(1mL)를 부가하여 세포를 용해시켜 감염성 병원체를 방출하게 하였다. 용해된 세포를 함유하는 용액을 수집하고 또 약간 희석한 후, 혼석평판법으로 세균의 수를 산출하였다. 여기서, 세포가 락토바실러스와 함께 부가되지 않은 실험은 대조군으로 작용하였고, 또 산출 결과를 상기 식에 적용하여 락토바실러스 플란타룸 CMU995의 감염 억제율을 산출하였다. 결과를 하기 표 4에 나타낸다.

표 3 및 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸 CMU995는 병원체 감염 억제에서 탁월한 효능을 갖는다. 특히, 치료 및 제거 형태에서의 결과는 락토바실러스 플란타룸 CMU995가 위장관 및 요관의 세포에 병원체 부착되는 것을 효과적으로 감소시킬 수 있고 또 병원체를 세포 밖으로 배출하여 감염을 억제 효능을 갖는다는 것을 분명히 보여준다. 또한 락토바실러스 플란타룸 CMU995는 대장균 또는 살모넬라 속(Salmonella spp.)에 대하여 탁월한 억제 효과를 갖는다.

[ 실시예 4] 동물 시험

실험 G. 실험 동물 그루핑 ( grouping )

6-주령 웅성 C57BL/6 마우스(라스코 인코포레이티드로부터 구입, 타이완 소재)를 이 실험에 사용하였다. 마우스의 체중은 20 내지 26 g 범위이고 또 마우스들은 온도가 22℃로 유지되고 규칙적으로 12-시간 낮과 밤이 있는 독립적인 IVC 마우스 사육 시스템에서 사육하였다. 이들 마우스에게 멸균 사료와 역삼투수를 자유로이 먹도록 공급하였다. 실험을 개시하기 전에, 이들 마우스들은 2주간 환경에 적응하도록 두었다. 이들 마우스에게 무작위로 8마리씩 4개 그룹으로 나누었다. 헬리코박터 파이로리에 의해 감염시키기 전에, 각 그룹의 마우스들은 상이한 농도의 200 μL의 새로이 제조된 락토바실러스 플란타룸 CMU 995 브로쓰를 특정한 시간에 7일간 경구 투여하고 매일 1회 사료 공급하였다. 각 그룹의 실험 조건은 이하에 수록한 바와 같다.

그룹 A: 생리학적 염수 용액/음성 대조군

마우스들은 멸균 여과된 생리학적 염수 용액을 공급받았다.

그룹 B; 1 x 10¹⁰ 콜로니 형성 유닛(cfu)/mL의 락토바실러스 플란타룸 CMU995 그룹

락토바실러스 플란타룸 CMU995를 MRS 배양 용액을 사용하여 24시간 동안 배양하고, 브로쓰를 수집하여 원심분리한 다음 생리학적 염수 용액으로 재용해시켰다. 세균 농도를 1 x 10¹⁰cfu/mL으로 조정한 다음, 세균을 마우스에 공급하였다.

그룹 C: 1 x 10⁹ cfu/mL의 락토바실러스 플란타룸 CMU995 그룹

락토바실러스 플란타룸 CMU995를 MRS 배양 용액을 사용하여 24시간 동안 배양하고, 브로쓰를 수집하여 원심분리한 다음 생리학적 염수 용액을 사용하여 재용해시켰다. 세균 농도는 1 x 10⁹cfu/mL로 조정하였고, 또 세균을 마우스에 공급하였다.

그룹 D: 1 x 10⁸ cfu/mL의 바실러스 플란타룸 CMU995 그룹

락토바실러스 플란타룸 CMU995를 MRS 배양 용액을 사용하여 24시간 동안 배양하고, 브로쓰를 수집하여 원심분리한 다음 생리학적 염수 용액을 사용하여 재용해시켰다. 세균 농도는 1 x 10⁸cfu/mL로 조정하였고, 또 세균을 마우스에 공급하였다.

실험 H. 헬리코박터 파이로리 감염 시험

마우스에 락토바실러스 플란타룸 CMU995 브로쓰를 7일간 공급한 후, 그 다음 날, 마우스에게 2 x 10⁷ 콜로니 형성 유닛(cfu)의 헬리코박터 파이로리 CMU83을 함유하는 브로쓰를 경구 공급하였다. 이들 마우스에게는 3일 동안 연속적으로 공급되어 감염을 유발하고, 그 다음날, 마우스를 1일간 굶겼다. 이어, 마우스를 이산화탄소를 사용하여 죽인 다음 이들의 경부 및 척추를 분리하였다. 이 마우스의 위 및 십이지장 부분(약 0.5 g)을 취하여 9.5 mL의 멸균 PBS 용액을 함유하는 에펜도르프관에 넣고, 균질기를 이용하여 3분간 진탕하였다. 발효된 조직을 함유하는 용액(1mL)을 취한 다음 멸균 PBS 용액을 사용하여 연속적으로 10배 희석하였다. 상이한 희석배율의 희석 용액(100 μL)을 취하고, 각각을 도말평판법(Spread-plate method)에 의해 브루셀라 한천 배지 상에 도포하고, 또 헬리코박터 파이로리를 스크리닝하기 위하여 2.5vol% 우태아 혈청 및 선택성 배지첨가제(Selective Supplements) SR147E (옥소이드 제조 영국 햄프셔 소재)를 배지에 부가하였다. 이 배지를 시험하여 본 실험에 사용된 헬리코박터 파이로리 CMU83을 스크리닝할 수 있는 것으로 확인되었다. 배지를 37℃에서 미세호기성 조건하에 48시간 동안 두어 세균을 배양하고, 세균의 콜로니 형성 유닛(cfu)을 산출하였다. 각 실험의 통계적 분석은 3회 반복하며, 실험 결과는 SPSS 10.0 소프트웨어에 의해 분석하였다. 먼저, 원웨이 ANOVA (분산(variance)의 분석)를 이용하여 각 그룹 사이의 유의한 차이를 시험하였고, 또 결정 표준은 p<0.05이었다. 결과를 하기 표 5에 나타낸다.

표 5는 마우스가 1 x 10⁹ cfu/mL 또는 1 x 10¹⁰cfu/mL 농도의 락토바실러스 플란타룸 CMU995를 공급받은 후, 마우스 위장관에 대한 헬리코박터 파이로리 감염을 현저히 억제하였고, 따라서 락토바실러스 플란타룸 CMU995는 병원체 감염으로부터 위장관을 보호하는 효능을 달성할 수 있음을 보여준다.

[ 실시예 5]

실험 I. 균주의 확인

[락토바실러스 확인 키트 분석]

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 CMU995를 MRS 배양 배지와 함께 16시간 동안 활성화하고 배양하며, 또 락토바실러스의 확인을 주안점으로 하는 API 50 CHL 확인 키트(Biomerieux, Marcy I'Etoile, France)를 이용하여 균주의 종을 분석하고 확인하였다.

[유전자 서열 분석]

락토바실러스에 대한 특정 프라이머를 사용하여 락토바실러스 플란타룸 CMU995의 16S-23S rRNA 부분의 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였고, 생성한 생성물의 서열을 분석하였다. 얻은 PCR 생성물의 서열을 분석하고, 그 서열의 일부를 서열번호 1에 나타낸다.

서열번호(SEQ ID NO): 1

ACATTGCAACAGCGCGTGCCGTATTTTAATTATCGGCTAGCCACAGAGATCTATCCGTTAAACAAACAATTTACTGAGAAATACGGGAATAAGTATGGGAAATATCCCTAGCGAACCCTAAATAATGGCCCCCCTGTCTTGAACAGATAGACTGGCCAAACTCCTACGGGAGAAAACGTTGGGAAATTTTGCTCAATGGGCCCAACCCTGAGGCGCCCCTGCCACATATATGAGGAAAGCCTTCGGGTTATAAAATTTTTTTTCAGCGAGGAGTGAAGTGAGGATAAGAACCTTCTACA

이 분석에 사용된 프라이머는 LU-5 및 Lac-2이었다. 그 서열을 하기에 나타낸다:

LU-5: 5'-CTAGCGGGTGCGACTTTGTT-3' 서열번호: 2

Lac-2: 5'-CCTCTTCGCTCGCCGCTACT-3' 서열번호: 3

[PFGE(Pulsed Field Gel Electrophoresis) 분석]

PFGE는 락토바실러스 플란타룸 CMU995의 게놈 DNA를 분석하기 위하여 사용하였고, 또 SgsI(프로메가 코포레이션 제조, 미국 매디슨 소재)는 제한효소로 사용하여 락토바실러스 플란타룸 CMU995의 유전자 핑거프린팅 지도를 얻으며, 그 결과를 도 1에 도시한다. 도 1에 도시된 유전자 핑거프린팅 지도는 락토바실러스 플란타룸 CMU995의 유전자 핑거프린팅 확인을 위한 참조로서 제공될 뿐이며, 균주의 유전자 확인 결과를 제한하기 위하여 제공되는 것은 아니다.

API 50 CHL 확인 키트의 결과에 따르면, 락토바실러스 플란타룸 CMU995가 락토바실러스플란타룸에 속한다는 것을 나타낸다. PCR 산물의 유전자 서열에 대한 대조 결과는 상기 균주가 신규한 락토바실러스 플란타룸이라는 것을 또한 제공한다.

락토바실러스 플란타룸 CMU995는 타이완에 소재하는 FIRDI(Food Industry Research and Development Institute)에 수탁번호 BCRC 910472호 및 독일의 DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에 수탁번호 DSM 23780호로 기탁되었다.

상기 실시예는 락토바실러스 플란타룸 CMU995가 위장관 및 요관에 병원체가 부착하는 것을 억제하여 위장관의 세포를 보호하고 병원체 감염을 감소할 수 있으며, 또 병원체의 생장을 직접적으로 억제할 수 있으므로 이들 2개의 억제 메카니즘의 상승효과에 의해 위장관 및 요관을 보호할 수 있음을 나타낸다.

상기 내용은 상세한 기술 내용 및 본 발명의 특징에 관련된다. 당업자들은 이러한 본 발명의 이러한 기술내용 및 제안을 토대로, 본 발명의 특징에서 벗어나지 않고도 다양한 변형과 교체를 실시할 수 있을 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 변형과 교체는 상술한 상세한 설명에 자세히 기재되어 있지 않지만, 이들은 이하에 첨부된 특허청구범위에 실질적으로 포함되는 것이다.

DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)

DSM23780

20100715

FIRDI(Food Industry Research and Development Institute)

BCRC910472

20100430

SEQUENCE LISTING <110> China Medical University <120> LACTOBACILLUS PLANTARUM AND USES THEREOF <130> Taiwan Patent Application No. 099123851 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 299 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum CMU995 <400> 1 acattgcaac agcgcgtgcc gtattttaat tatcggctag ccacagagat ctatccgtta 60 aacaaacaat ttactgagaa atacgggaat aagtatggga aatatcccta gcgaacccta 120 aataatggcc cccctgtctt gaacagatag actggccaaa ctcctacggg agaaaacgtt 180 gggaaatttt gctcaatggg cccaaccctg aggcgcccct gccacatata tgaggaaagc 240 cttcgggtta taaaattttt tttcagcgag gagtgaagtg aggataagaa ccttctaca 299 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 2 ctagcgggtg cgactttgtt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 3 cctcttcgct cgccgctact 20

Claims

타이완에 소재하는 FIRDI(Food Industry Research and Development Institute)에 수탁번호 BCRC 910472호, 및 독일의 DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에 수탁번호 DSM 23780호로 기탁된, 단리된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CMU995.
제 1항에 있어서, 위장관 및/또는 요관에 부착할 수 있는 락토바실러스 플란타룸 CMU995.
제 1항에 있어서, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 살모넬라 속(Salmonella spp.), 에쉐리키아 속(Escherichia spp.), 스타필로코커스 속(Staphylococcus spp.), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원체의 생장을 억제할 수 있는 락토바실러스 플란타룸 CMU995.
삭제
제 3항에 있어서, 상기 병원체는 헬리코박터 파이로리인 락토바실러스 플란타룸 CMU995.
제 1항에 있어서, 포유동물의 위장관 및/또는 요관에 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 살모넬라 속(Salmonella spp.), 에쉐리키아 속(Escherichia spp.), 스타필로코커스 속(Staphylococcus spp.), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원체가 부착하는 것을 억제할 수 있는 락토바실러스 플란타룸 CMU995.
삭제
제 6항에 있어서, 상기 병원체는 헬리코박터 파이로리인 락토바실러스 플란타룸 CMU995.
제 1항에 청구된 바와 같은 락토바실러스 플란타룸 CMU995를 포함하는, 병원체를 억제하고, 위장관 및/또는 요관을 보호하기 위한 약학적 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 병원체는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 살모넬라 속(Salmonella spp.), 에쉐리키아 속(Escherichia spp.), 스타필로코커스 속(Staphylococcus spp.), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
삭제
삭제
제 1항에 청구된 바와 같은 락토바실러스 플란타룸 CMU995를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 사료인 조성물.
제 1항에 청구된 바와 같은 락토바실러스 플란타룸 CMU995를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 음료, 영양보조제, 유제품, 식품 또는 건강식품인 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 스프레이 또는 좌약인 약학적 조성물.