BR112017026564B1 - Células de bactéria, usos das mesmas, e composição - Google Patents

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Abstract

composições compreendendo cepas bacterianas. a invenção fornece composições compreendendo cepas bacterianas para tratar e prevenir doenças inflamatórias e automimunes.

Description

CAMPO TÉCNICO
[0001] Esta invenção é no campo de composições compreenden do cepas bacterianas isoladas do trato digestivo mamífero e a utilização de tais composições no tratamento de doença.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] Acredita-se que o intestino humano seja estéril in utero, mas seja exposto a uma grande variedade de micróbios maternos e ambientais imediatamente após o nascimento. Posteriormente, ocorre um período dinâmico de colonização e sucessão microbiana, que é influenciado por fatores como o modo de parto, o meio ambiente, a dieta e o genótipo do hospedeiro, todos os quais influenciam a composição da microbiota intestinal, particularmente durante o início da vida. Posteriormente, a microbiota se estabiliza e se torna adulta [I]. A microbiota do intestino humano contém mais de 500 a 1000 filótipos diferentes pertencendo essencialmente a duas principais divisões bacte- rianas, os Bacteroidetes e os Firmicutes [II]. As relações simbióticas bem sucedidas decorrentes da colonização bacteriana do intestino humano produziram uma grande variedade de funções metabólicas, estruturais, protetoras e outras benéficas. As atividades metabólicas melhoradas do intestino colonizado garantem que os componentes dietéticos, de outra forma, não sejam destruídos com a liberação de subprodutos fornecendo uma importante fonte de nutrientes para o hospedeiro. Da mesma forma, a importância imunológica da microbiota intestinal é bem reconhecida e é exemplificada em animais sem germe que têm um sistema imunológico comprometido que é funcionalmente reconstituído após a introdução de bactérias comensais [III-IV].
[0003] Alterações dramáticas na composição de microbiota foram documentadas em distúrbios gastrointestinais, como a doença inflama- tória intestinal (IBD). Por exemplo, os níveis de agrupamento de Clostridium de bactérias XIVa são reduzidos em pacientes com IBD enquanto números de E. coli são aumentados, sugerindo uma mudança no equilíbrio de simbiontes e patobiontes dentro do intestino [V-VI]. Curiosamente, essa disbiose microbiana também está associada a desequilíbrios nas populações de células T efetoras.
[0004] Em reconhecimento do potencial efeito positivo que certas cepas bacterianas podem ter no intestino animal, várias cepas foram propostas para uso no tratamento de várias doenças (ver, por exemplo, [VII-VIII]). Além disso, certas cepas, incluindo principalmente cepas Lactobacillus e Bifidobacterium, foram propostas para uso no tratamento de várias doenças inflamatórias e autoimunes que não estão diretamente ligadas aos intestinos (ver [IX] e [X] para comentários). No entanto, a relação entre diferentes doenças e diferentes cepas bacte- rianas, e os efeitos precisos de cepas bacterianas específicas no intestino e em um nível sistêmico e em qualquer tipo particular de doenças, são mal caracterizados.
[0005] Existe um requisito na técnica para novos métodos de tra tamento de doenças inflamatórias e autoimunes. Existe também um requisito para que os efeitos potenciais das bactérias intestinais sejam caracterizados de modo que novas terapias que usem bactérias intestinais possam ser desenvolvidas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0006] Os inventores desenvolveram novas terapias para tratar e prevenir doenças inflamatórias e autoimunes. Em particular, os inventores desenvolveram novas terapias para tratar e prevenir doenças e condições mediadas por IL-17 ou a via Th17. Em particular, os inventores identificaram uma nova cepa bacteriana que é eficaz para reduzir a resposta inflamatória de Th17. Conforme descrito nos exemplos, a administração oral de composições compreendendo a bactéria deposi- tada sob o número de acesso NCIMB 42380 pode reduzir a gravidade da resposta inflamatória, incluindo a resposta inflamatória Th17, em modelos de camundongos de asma, artrite reumatoide e esclerose múltipla. Tal como também descrito nos exemplos, a administração oral de composições compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 pode reduzir o tamanho do tumor em modelos de câncer de camundongo que podem estar associados com a resposta inflamatória Th17.
[0007] Por conseguinte, numa primeira modalidade, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo do mesma, para uso num método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição mediada por IL-17 ou a via Th17. Os inventores identificaram que o tratamento com tais cepas bacterianas pode reduzir os níveis de citocinas que fazem parte da via Th17, incluindo IL-17, pode aliviar a resposta inflamatória Th17 e pode proporcionar benefícios clínicos em modelos de camundongos de doenças inflamatórias e autoimunes mediadas por IL -17 e via Th17.
[0008] Em modalidades particulares, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo do mesma, para uso num método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição selecionada do grupo que consiste em: esclerose múltipla; artrite, como artrite reu- matoide, osteoartrite, artrite psoriática ou artrite idiopática juvenil; neu- romielite óptica (doença de Devic); espondilite anquilosante; espondi- loartrite; psoríase; lúpus eritematoso sistêmico; doença inflamatória intestinal, como doença de Crohn ou colite ulcerativa; doença celíaca; asma, como asma alérgica ou asma neutrofílica; doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD); câncer, como câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pulmão ou câncer de ovário; uveíte; esclerite; vasculi- te; Doença de Behcet; aterosclerose; dermatite atópica; enfisema; pe- riodontite; rinite alérgica; e rejeição de aloenxertos. O efeito mostrado para a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 na resposta inflamatória Th17 pode fornecer benefícios terapêuticos para doenças e condições mediadas pela IL-17 e via Th17, como as mencionadas acima.
[0009] Em modalidades preferidas, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo do mesma, para uso num método de tratamento ou prevenção de asma, tal como asma neutrófila ou asma alérgica. Os inventores identificaram que o tratamento com a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 pode reduzir o recrutamento de neutrófilos e eosinófilos nos pulmões, o que pode ajudar a tratar ou prevenir a asma. Além disso, os inventores testaram e demonstraram a eficácia da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 em modelos de camundongos de asma. Em certas modalidades, a composição é para uso num método de tratamento ou prevenção de asma neutrofílica ou asma eosinofílica. O efeito mostrado para as composições da invenção em neutrófilos e eosi- nófilos significa que eles podem ser particularmente eficazes para tratar ou prevenir asma neutrófila e asma eosinofílica. De fato, em certas modalidades, a composição é para uso em um método de redução de uma resposta inflamatória neutrofílica no tratamento ou prevenção de asma, ou a composição é para uso em um método de redução de uma resposta inflamatória eosinofílica no tratamento ou prevenção de asma. Em certas modalidades, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo do mesma, para uso no tratamento da asma. Em modalidades especialmente preferidas, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, para uso no tratamento de asma e, em particular, asma neutrofílica. A bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 mostrou ter um efeito particularmente pronunciado sobre neutrófilos em modelos de asma e o tratamento com esta bactéria pode ser particularmente eficaz para o tratamento de asma neutrofílica.
[00010] Em outras modalidades preferidas, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo do mesma, para uso num método de tratamento ou prevenção de artrite reumatoide. Os inventores identificaram que o tratamento com a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 pode proporcionar benefícios clínicos em um modelo de camundongo de artrite reumatoide e pode reduzir o inchaço nas articulações. Em modalidades preferidas, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo do mesma, para uso no tratamento da artrite reumatoide. As composições que utilizam a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 podem ser particularmente eficazes para o tratamento da artrite reumatoide.
[00011] Em outras modalidades preferidas, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo do mesma, para uso em um método de tratamento ou prevenção de esclerose múltipla. Os inventores identificaram que o tratamento com a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 pode reduzir a incidência da doença e a gravidade da doença em um modelo de esclerose múltipla. Em modalidades preferidas, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo do mesma, para uso no tratamento da esclerose múltipla. As composições que utilizam a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 podem ser particularmente eficazes para o tratamento da esclerose múltipla.
[00012] Em outras modalidades preferidas, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo do mesma, para uso num método de tratamento ou prevenção de câncer, como câncer de mama, pulmão ou fígado. Os inventores identificaram que o tratamento com a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 pode reduzir o crescimento tumoral em modelos de camundongos de câncer de mama, pulmão e fígado. Em certas modalidades, a composição é para uso em um método de redução do tamanho do tumor ou prevenção do crescimento tumoral no tratamento de câncer.
[00013] Em outras modalidades preferidas, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo do mesma, para uso num método de tratamento ou prevenção de uveíte, como uveíte posterior. As composições que compreendem a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo do mesma podem ser particularmente eficazes para o tratamento de uveíte.
[00014] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso num método para reduzir a produção de IL-17 ou reduzir a diferenciação de células Th17 no tratamento ou prevenção de uma doença ou condição mediada por IL-17 ou a via Th17. Em particular, as composições da invenção podem ser utilizadas na redução da produção de IL-17 ou na redução da diferenciação de células Th17 no tratamento ou prevenção de asma, artrite reumatoide ou esclerose múltipla ou de asma, artrite reumatoide, esclerose múltipla, câncer ou uveí- te. De preferência, a invenção proporciona composições compreen-dendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo da mesma, para uso na redução da produção de IL-17 ou redução da diferenciação de células Th17 no tratamento ou prevenção de asma, artrite reumatoide ou esclerose múltipla. A invenção também proporciona composições compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo da mesma, para uso na redução da produção de IL-17 ou redução da diferenciação celular Th17 no tratamento ou prevenção de câncer.
[00015] Em certas modalidades, a composição é para uso em um paciente com níveis elevados de IL-17 ou células Th17. O efeito sobre a resposta inflamatória Th17 mostrada para a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 pode ser particularmente benéfico para esses pacientes.
[00016] Em modalidades preferidas da invenção, a cepa bacteriana na composição é a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380. Também podem ser utilizadas cepas bacterianas de biotipo, tais como cepas bacterianas clínicas que possuem uma sequência de rRNA de 16s que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de rRNA de 16s da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380. De preferência, a cepa bacteriana tem uma sequência de rRNA de 16s que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1. De preferência, a cepa bacteriana para uso na invenção tem a sequência de rRNA de 16s representada pela SEQ ID NO: 1.
[00017] Em certas modalidades, a composição da invenção é para administração oral. A administração oral das cepas da invenção pode ser eficaz para o tratamento de doenças e condições mediadas por IL- 17 ou a via Th17. Além disso, a administração oral é conveniente para pacientes e profissionais e permite a distribuição e/ou a colonização parcial ou total do intestino.
[00018] Em certas modalidades, a composição da invenção compreende um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
[00019] Em certas modalidades, a composição da invenção compreende uma cepa bacteriana que foi liofilizada. A liofilização é uma técnica eficaz e conveniente para a preparação de composições estáveis que permitem a distribuição de bactérias.
[00020] Em certas modalidades, a invenção proporciona um produto alimentar compreendendo a composição como descrito acima.
[00021] Em certas modalidades, a invenção proporciona uma composição de vacina compreendendo a composição como descrito acima.
[00022] Adicionalmente, a invenção proporciona um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição mediada por IL-17 ou a via Th17, compreendendo administrar uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um bio- tipo da mesma.
[00023] Ao desenvolver a invenção acima, os inventores identificaram e caracterizaram uma cepa bacteriana que é particularmente útil para a terapia. A bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 mostra-se eficaz para o tratamento das doenças aqui descritas, tais como artrite, asma e esclerose múltipla. Portanto, em outro aspecto, a invenção fornece uma célula da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, ou um derivado da mesma. A invenção também proporciona composições compreendendo tais células, ou culturas biologicamente puras de tais células. A invenção também fornece uma célula da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, ou um derivado da mesma, para uso em terapia, em particular para as doenças aqui descritas. A bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 também se mostra eficaz para o tratamento do câncer.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00024] Figura 1: Modelo de camundongo de asma induzida por ácaros da poeira doméstica - Contagem total de células de fluido BAL.
[00025] Figura 2: Modelo de camundongo de asma induzida por ácaros da poeira doméstica - Contagem total de eosinófilos em BALF.
[00026] Figura 3: Modelo de camundongo de asma induzida por ácaros da poeira doméstica - Proporção de eosinófilos em BALF.
[00027] Figura 4: Modelo de camundongo de asma induzida por ácaros da poeira doméstica - Contagem macrófagos de eosinófilos em BALF.
[00028] Figura 5: Modelo de camundongo de asma induzida por ácaros da poeira doméstica - Proporção de macrófagos em BALF.
[00029] Figura 6: Modelo de camundongo de asma induzida por ácaros da poeira doméstica - Contagem total de neutrófilos em BALF.
[00030] Figura 7: Modelo de camundongo de asma induzida por ácaros da poeira doméstica - Proporção de neutrófilo em BALF.
[00031] Figura 8: Modelo de camundongo de asma induzida por ácaros da poeira doméstica - Contagem total de linfócito em BALF.
[00032] Figura 9: Modelo de camundongo de asma induzida por ácaros da poeira doméstica - Proporção de linfócitos em BALF.
[00033] Figura 10: Modelo de camundongo de asma neutrofílica grave - Contagem total de células de fluido BAL.
[00034] Figura 11: Modelo de camundongo de asma neutrofílica grave - Contagem total de eosinófilos em BALF.
[00035] Figura 12: Modelo de camundongo de asma neutrofílica grave - Proporção de eosinófilos em BALF.
[00036] Figura 13: Modelo de camundongo de asma neutrofílica grave - Contagem total de macrófagos em BALF.
[00037] Figura 14: Modelo de camundongo grave - Proporção de macrófagos em BALF. de asma neutrofílica
[00038] Figura 15: Modelo de camundongo grave - Contagem total de neutrófilos em BALF. de asma neutrofílica
[00039] Figura 16: Modelo de camundongo de asma neutrofílica grave - Proporção de neutrófilos em BALF.
[00040] Figura 17. Modelo de camundongo de asma neutrofílica grave - Contagem total de linfócitos em BALF.
[00041] Figura 18: Modelo de camundongo de asma neutrofílica grave - Proporção de linfócitos em BALF.
[00042] Figura 19: Modelo de camundongo de artrite reumatoide - Peso corporal, dias -14 a 0. Os dados são apresentados como percentagens Média ± SEM dos pesos corporais iniciais (Dia -14). Significân- cia estatística: ▲ p <0,05 e ▲▲▲▲ p <0,0001 quando comparado ao grupo tratado com veículo.
[00043] Figura 20: Modelo de camundongo de artrite reumatoide - Peso corporal, dias 0 a 42. Os dados são apresentados como percentagens Média ± SEM dos pesos corporais iniciais (Dia 0). ▲ p <0,05, ♦ p <0,05, ▲▲▲ p <0,001, •••• p <0,0001 quando comparado ao grupo tratado com veículo.
[00044] Figura 21. Modelo de camundongo da artrite reumatoide - Pontuações clínicas. Os dados são apresentados como Média ± SEM. **** p <0,0001 quando comparado ao dia 21 no grupo tratado com veículo. ♦, O p <0,05 quando comparado ao grupo tratado com veículo em um determinado dia.
[00045] Figura 22: Modelo de camundongo da artrite reumatoide - resposta proliferativa dos esplenócitos ao colágeno II. Fundo de meio subtraído [fundo de meio estimulado por CII] contagens por minuto com base na incorporação de 3H-TdR. Todos os dados são apresentados como Média ± SEM. ** p <0,01 em comparação com o grupo do veículo.
[00046] Figura 23: Modelo de camundongo da artrite reumatoide - Níveis de IFNY em sobrenadantes de cultura de tecidos. As linhas representam os valores médios do grupo.
[00047] Figura 24: Modelo de camundongo da artrite reumatoide - Níveis de IL-17A em sobrenadantes de cultura de tecidos. As linhas representam os valores médios do grupo.
[00048] Figura 25: Modelo de camundongo da artrite reumatoide - Níveis de IL-10 em sobrenadantes de cultura de tecidos. As linhas representam os valores médios do grupo.
[00049] Figura 26: Modelo de camundongo da artrite reumatoide - Níveis de IL-6 em sobrenadantes de cultura de tecidos. As linhas representam os valores médios do grupo.
[00050] Figura 27: Sistema de pontuação histopatológica.
[00051] Figura 28: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica - IgE total no soro
[00052] Figura 29: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica- IgG1 específica de HDM no soro
[00053] Figura 30: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica - IgE total em BALF
[00054] Figura 31: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica- IgG1 específica de HDM em BALF
[00055] Figura 32: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica - Análise histológica - Pontuação média da infiltração peribronquiolar
[00056] Figura 33: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica- Análise histológica - Pontuação média da infiltração perivascular
[00057] Figura 34: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica - Análise histológica - Pontuação inflamatória média (média da pontuação de infiltração peribronquiolar e perivascular)
[00058] Figura 35: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica- Análise histológica - Pontuação de muco
[00059] Figura 36: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica - nível de IL-9 no tecido pulmonar
[00060] Figura 37: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica- nível de IL-1a no tecido pulmonar
[00061] Figura 38: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica - nível de IFNg no tecido pulmonar
[00062] Figura 39: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica- nível de IL-17A no tecido pulmonar
[00063] Figura 40: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica- nível de IL-4 no tecido pulmonar
[00064] Figura 41: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica- nível de IL-5 no tecido pulmonar
[00065] Figura 42: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica- nível de IL-1b no tecido pulmonar
[00066] Figura 43: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica - nível de RANTES no tecido pulmonar
[00067] Figura 44: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica- nível de MIP-1a no tecido pulmonar
[00068] Figura 45: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica - nível de KC no tecido pulmonar
[00069] Figura 46: Modelo de camundongo da asma induzida por ácaros da poeira doméstica- nível de MIP-2 no tecido pulmonar
[00070] Figura 47: Modelo de camundongo da asma neutrofílica severa - IgG1 específica de HDM no soro
[00071] Figura 48: Modelo de camundongo da asma neutrofílica severa - IgG2a específica de HDM no soro
[00072] Figure 49: Modelo de camundongo da asma neutrofílica severa - IgG1 específica de HDM em BALF
[00073] Figura 50: Modelo de camundongo da asma neutrofílica severa - IgG2a específica de HDM em BALF
[00074] Figura 51: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - Análise histológica - Pontuação média de infiltração peribron- quiolar
[00075] Figura 52: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - Análise histológica - Pontuação média da infiltração perivascular
[00076] Figura 53: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - Análise histológica - Pontuação inflamatória média (Média da pontuação de infiltração peribronquiolar e perivascular)
[00077] Figura 54: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - nível de TNFa no tecido pulmonar
[00078] Figura 55: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - nível de IL-1a no tecido pulmonar
[00079] Figura 56: Modelo de camundongo de asma neutrofílica grave - nível de IFNg no tecido pulmonar
[00080] Figura 57: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - nível de IL-17F no tecido pulmonar
[00081] Figura 58: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - nível de IL-1b no tecido pulmonar
[00082] Figura 59: Modelo de camundongo de asma neutrofílica grave - nível de RANTES no tecido pulmonar
[00083] Figura 60: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - nível de MIP-2 no tecido pulmonar
[00084] Figura 61: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - nível de KC no tecido pulmonar
[00085] Figura 62: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - nível de IL-17A no tecido pulmonar
[00086] Figura 63: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - nível de MIP-1a no tecido pulmonar
[00087] Figura 64: Modelo de camundongo da asma neutrofílica grave - nível de IL-33 no tecido pulmonar
[00088] Figura 65: Modelo de camundongo de artrite reumatoide - Modelo Visual para Pontuação de Histopatologia. Imagens representativas mostrando pontuação composta das articulações tarsais do camundongo em um estudo de artrite induzido por colágeno.
[00089] Figura 66: Modelo de camundongo de artrite reumatoide - Histopatologia: Pontuação de inflamação. Os dados são apresentados como Média ± SEM. ** p <0,01 quando comparado ao grupo tratado com veículo.
[00090] Figura 67: Modelo de camundongo de artrite reumatoide - Histopatologia: Pontuações de cartilagem. Os dados são apresentados como Média ± SEM. *** p < 0,001 quando comparado ao grupo tratado com veículo.
[00091] Figura 68: Modelo de camundongo de artrite reumatoide - Histopatologia: Pontuações de osso. Os dados são apresentados como Média ± SEM. *** p < 0,001 quando comparado ao grupo tratado com veículo.
[00092] Figura 69: Modelo de camundongo de artrite reumatoide - Histopatologia: Pontuações totais. Os dados são apresentados como Média ± SEM. * p < 0,05, *** p < 0,001 quando comparado ao grupo tratado com veículo.
[00093] Figura 70: Modelo de camundongo de artrite reumatoide - Histopatologia: Imagens representativas. ID animal (#n. n) e membro (R para direita, L para esquerda) são indicados entre parênteses. Imagem superior esquerda (veículo): destruição extensiva das articulações e ossos com inflamação e fibrose que se estendem aos tecidos moles peri-articulares.
[00094] Figura 71: Modelo de camundongo da esclerose múltipla - pontuação clínica.
[00095] Figura 72: Modelo de camundongo da esclerose múltipla - incidência da doença.
[00096] Figura 73: Modelo de camundongo do câncer de mama - volume do tumor.
[00097] Figura 74: Modelo de camundongo do câncer de pulmão - volume tumoral.
[00098] Figura 75: Modelo de camundongo do câncer de fígado- peso do fígado.
[00099] Figura 76: Anexo de cepas do tipo MRX004 e B. breve para células humanas.
[000100] Figura 77: Ensaio de produção de exopolissacarídeos.
[000101] Figura 78: Produção de exopolissacarídeos ligada e liberada por MRX004.
[000102] Figura 79: Anexo de MRX004 às células Caco-2.
[000103] Figura 80: ID Rápido 32 Um perfil de MRX004 sozinha (A) e em comparação com cepas do tipo B. breve (B). Branco = reação negativa (sem mudança de cor), cruzada descendente = reação positiva intermediária (mudança de cor fraca) e preto = reação positiva (forte mudança de cor apropriada).
[000104] Figura 81: Análise API® 50 CH de MRX004. Cruzado ascendente = reação negativa (sem mudança de cor), cruzado descendente = reação positiva intermediária (mudança de cor fraca), preto = reação positiva (forte mudança de cor apropriada) e branco = reação duvidosa (mudança de cor inesperada).
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO Cepas bacterianas
[000105] As composições da invenção compreendem a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo da mesma. Os exemplos demonstram que tais bactérias são úteis para tratar ou prevenir doenças e condições mediadas por IL-17 ou a via Th17. Os exemplos também demonstram que tais bactérias são úteis para tratar ou prevenir o câncer. A cepa bacteriana preferida é a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380.
[000106] A bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 foi testada nos Exemplos e também é aqui referida como a cepa 751 ou MRX004. Uma sequência de rRNA de 16S parcial para a cepa 751 que foi testada é fornecida na SEQ ID NO: 1. A cepa 751 foi depositada junto da autoridade internacional de depósito NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escócia) pela GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Escócia) em 12 de março de 2015 e foi atribuída o número de acesso NCIMB 42380. A GT Biologics Ltd. mudou o nome para a 4D Pharma Research Limited.
[000107] Uma sequência de genoma para a cepa 751 é fornecida na SEQ ID NO: 2.
[000108] As cepas bacterianas que são biotipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 também devem ser eficazes para tratar ou prevenir doenças e condições mediadas por IL-17 ou a via Th17. As cepas bacterianas que são biotipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 também devem ser eficazes para tratar ou prevenir o câncer. Um biotipo é uma cepa estreitamente relacionada que possui as características fisiológicas e bioquímicas mesmo ou muito semelhantes.
[000109] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem uma sequência de rRNA de 16s que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de rRNA de 16s da bactéria depositado sob o número de acesso NCIMB 42380. De preferência, a cepa bacteriana para uso na invenção tem uma sequência de rRNA de 16s que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1. De preferência, a cepa bacteriana para uso na invenção tem a sequência de rRNA de 16s representada pela SEQ ID NO: 1.
[000110] Alternativamente, as cepas que são biotipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 e que são adequadas para uso na invenção podem ser identificadas por sequenciação de outras sequências de nucleotídeos para a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380. Por exemplo, substancialmente o genoma completo pode ser sequenciado e uma cepa de biotipo para uso na invenção pode ter pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência em pelo menos 80% de todo o genoma (por exemplo, em pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99%, ou em todo o seu genoma). Outras sequências adequadas para uso na identificação de cepas de biotipo podem incluir hsp60 ou sequências repetitivas, como BOX, ERIC, (GTG)5, ou REP ou [XI]. As cepas de biotipo podem ter sequências com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência correspondente da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380.
[000111] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem um genoma com identidade de sequência para SEQ ID NO: 2. Em modalidades preferidas, a cepa bacteriana para uso na invenção tem um genoma com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de sequência identidade) para SEQ ID NO: 2 em pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de SEQ ID NO: 2. Por exemplo, a cepa bacteriana para uso na invenção pode ter um genoma com pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 70% de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 80% de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 90% de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 100% de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 70% de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 80% de SEQ ID NO: 2, ou pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 90% de SEQ ID NO: 2, ou pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 100% de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 98% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 70% de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 98% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 80% de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 98% identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 90% de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 98% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 em 100% de SEQ ID NO: 2.
[000112] Alternativamente, as cepas que são biotipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 e que são adequadas para uso na invenção podem ser identificadas utilizando o número de acesso NCIMB 42380, análise de fragmento de depósito e restrição e/ou análise de PCR, por exemplo, utilizando polimorfismo amplificado de comprimento de fragmento fluorescente (FAFLP) e impressões digitais repetitivas de elementos de DNA (rep)-PCR, ou perfil de proteínas, ou sequenciação parcial de rDNA 16S ou 23s. Em modalidades preferidas, tais técnicas podem ser utilizadas para identificar cepas da mesma espécie que a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380.
[000113] Em certas modalidades, as cepas que são biotipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 e que são adequadas para uso na invenção são cepas que proporcionam o mesmo padrão que a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 quando analisada por análise de restrição de DNA ri- bossômico amplificada (ARDRA), por exemplo, quando se utiliza a en- zima de restrição Sau3AI (para métodos exemplificativos e orientação, ver, por exemplo, [XII]). Alternativamente, as cepas de biotipos são identificadas como cepas que possuem os mesmos padrões de fermentação de carboidratos que a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380.
[000114] As cepas bacterianas que são biotipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 e que são úteis nas composições e métodos da invenção podem ser identificadas utilizando qualquer método ou estratégia apropriada, incluindo os ensaios descritos nos exemplos. Por exemplo, os biotipos para uso na invenção podem ser identificados por cultura em YCFA anaeróbico e/ou administrando as bactérias ao modelo de camundongo de artrite induzido por colágeno de tipo II e depois avaliando os níveis de citocinas. Em particular, as cepas bacterianas que têm padrões de crescimento semelhantes, tipo metabólico e/ou antígenos de superfície para a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 podem ser úteis na invenção. Uma cepa de biotipo terá atividade moduladora imune comparável à cepa NCIMB 42380. Em particular, uma cepa de biotipo provocará efeitos comparáveis sobre os modelos de doença de asma, artrite, esclerose múltipla e câncer e efeitos comparáveis sobre os níveis de citocinas aos efeitos mostrados nos Exemplos, que podem ser identificados usando os protocolos de cultura e administração descritos nos Exemplos.
[000115] Uma cepa particularmente preferida da invenção é a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380. Esta é a cepa 751 exemplificativa testada nos exemplos e mostrou ser eficaz no tratamento da doença. Portanto, a invenção fornece uma célula, tal como uma célula isolada, da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, ou um derivado da mesma. A invenção também fornece uma composição compreendendo uma célula da bactéria deposita- da sob o número de acesso NCIMB 42380, ou um derivado da mesma. A invenção também fornece uma cultura biologicamente pura da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380. A invenção também fornece uma célula da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, ou um derivado da mesma, para uso em terapia, em particular para as doenças aqui descritas.
[000116] Um derivado da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 pode ser uma cepa filha (progênie) ou uma cepa cultivada (subclonada) da original. Um derivado de uma cepa da invenção pode ser modificado, por exemplo, a nível genético, sem ablação da atividade biológica. Em particular, uma estirpe derivada da invenção é terapeuticamente ativa. Uma cepa derivada terá atividade moduladora imune comparável à cepa NCIMB 42380. Em particular, uma cepa derivada provocará efeitos comparáveis sobre os modelos de doença de asma, artrite, esclerose múltipla e câncer e os mesmos efeitos comparáveis sobre os níveis de citocinas aos efeitos mostrados nos Exemplos, que podem ser identificados usando os protocolos de cultura e administração descritos nos Exemplos. Um derivado da cepa NCIMB 42380 geralmente será um biotipo da cepa NCIMB 42380.
[000117] As referências a células da bactéria depositadas sob o número de acesso NCIMB 42380 abrangem quaisquer células que tenham as mesmas características de segurança e eficácia terapêutica que a cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 e tais células são abrangidas pela invenção.
[000118] Em modalidades preferidas, as cepas bacterianas nas composições da invenção são viáveis e capazes de colonizar parcial ou totalmente o intestino.
[000119] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem baixa adesão às células epiteliais intestinais humanas, em particular células Caco-2. Em uma modalidade preferida, a cepa bacte- riana para uso na invenção tem baixa adesão a células epiteliais intestinais humanas, em particular células Caco-2, em YCFA em comparação com Bifidobacteria, em particular B. breve. Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção exibe a aderência de menos de 1% da cultura total, tal como de preferência inferior a 0,5% ou inferior a 0,3%, quando testada nas condições descritas no Exemplo 12.
[000120] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção produz exopolissacarídeos, por exemplo, em que os exopolis- sacarídeos estão ligados à superfície extracelular da cepa bacteriana. Em certas modalidades, a produção dos exopolissacarídeos ligados aumenta a adesão da estirpe bacteriana para uso na invenção ao muco ou à superfície de células epiteliais, por exemplo, células epiteliais intestinais humanas. Em uma modalidade preferida, a cepa bacteriana para uso na invenção produz exopolissacarídeos superficiais mais ligados em comparação com Bifidobacteria, em particular B. breve.
[000121] Em uma modalidade preferida, a cepa bacteriana para uso na invenção ambas têm baixa adesão a células epiteliais intestinais humanas, em particular células Caco-2, em YCFA em comparação com Bifidobacteria, em particular B. breve (tal como a aderência de menos de 1% da cultura total, tal como de preferência inferior a 0,5% ou inferior a 0,3%, quando testada nas condições descritas no Exemplo 12) e produz exopolissacarídeos de superfície mais ligados em comparação com Bifidobacteria, em particular B. breve.
[000122] Em certas modalidades preferidas, a cepa bacteriana para uso na invenção é capaz de fermentar a rafinose de polissacarídeos, por exemplo, quando cultivada num meio de suspensão apropriado (tal como meio de suspensão API) a 37°C durante 4 horas.
[000123] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem capacidade reduzida para fermentar α-glicosidase e/ou β- glicosidase em comparação com Bifidobacteria, em particular B. breve, por exemplo, quando cultivados em um meio de suspensão apropriado (como meio de suspensão API) a 37°C por 4 horas.
[000124] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende um ou mais dos genes listados na Tabela 1, tais como 5, 10, 20, 50 ou todos os genes na Tabela 1. Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende um ou mais dos genes listados na Tabela 1 que são destacados com um sublinhado único, tal como o componente de Transmembrana BL0694 do módulo de energização do transportador ECF previsto e/ou o componente ATPase Duplicado BL0693 do módulo de emergização do transportador ECF previsto. Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende um ou mais dos genes listados na Tabela 1 que são destacados com sublinhado duplo e em negrito, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 genes selecionados de: maltodextrina glicosidase (EC 3.2.1.20), galactosidase putativa, celulose sintase (UDP-formando) (EC 2.4.1.12), quitinase (EC 3.2.1.14) e proteína sensorial/proteína da família GGDEF. Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende um ou mais dos genes listados na Tabela 1 que são destacados com itálico, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 genes selecionados a partir de: subunidade de sintetização de ácidos graxos poli-insaturados omega-3 PfaA, policétida sintetase do tipo I, hidrologia de glicosil putativa de função desconhecida (DUF1680), componente de ATPase BioM do módulo de energização do transportador de biotina ECF, família de ATPase E1-E2 de transporte de cátions, Proteína de permease do sistema de transporte Ribose ABC RbsC (TC 3.A.1.2.1), sistema de transporte de Ribose ABC, proteína de ligação a ATP RbsA (TC 3.A.1.2.1), oligoribonuclease de 3' a 5' (orn) proteína da membrana relacionada à proteína Actinobacillus (1944168).
[000125] Em modalidades preferidas, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende um ou mais genes (tais como 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50 ou todos) selecionados de: sintase de ácido 2-succinil-5- enolpiruvil-6-hidroxi-3-ciclo-hexeno-1-carboxílico (EC 2.2.1.9); oligoribonuclease 3' a 5' (orn); Alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); componente ATPase do módulo de energização geral dos transportadores ECF; componente ATPase STY3233 do módulo de energização do transportador ECF regulado por queuosina; DNA helicase dependente de ATP recG (EC 3.6.1.-); Beta-glicosidase (EC 3.2.1.21); Celulose sintase (formadora de UDP) (EC 2.4.1.12); Chitinase (EC 3.2.1.14); COG1309: Regulador de transcrição; D-alanil-D-alanina carboxipeptidase (EC 3.4.16.4); componente ATPase duplicado BL0693 do módulo de ener- gização do transportador ECF previsto; Frutoquinase (EC 2.7.1.4); gli- cose/manose: H+ symporter GlcP; Glicosiltransferase (EC 2.4.1.-); GMP sintase [hidrolisação de glutamina] (EC 6.3.5.2); Hipocese de açúcar quinase em agrupamento com indigoidina sintase indA, família de quinases PfkB; Inosina-uridina preferindo nucleosídeo hidrolase (EC 3.2.2.1); LSU proteina ribossômica L31p @ LSU proteina ribos- sômica L31p, independente de zinco; LSU proteina ribossômica L33p @ LSU proteina ribossômica L33p, independente de zinco; Maltodex- trina glicosidase (EC 3.2.1.20); proteína membranar, relacionada à protéina Actinobacillus (1944168); Precursor de transglicosilase D de mureína lítica ligado a membrana (EC 3.2.1.-); Metiltransferase (EC 2.1.1.-); butanol desidrogenase A dependente de NADH (EC 1.1.1.-); Fosfoglicolato fosfatase (EC 3.1.3.18); fosforibosilantranilato isomerase (EC 5.3.1.24); Glicosil hidrolase putativa de função desconhecida (DUF1680); Permease de translocação de polissacarídeo contendo Ramnose; Riboquinase (EC 2.7.1.15); Sistema de transporte Ribose ABC, proteína de ligação à ATP RbsA (TC 3.A.1.2.1); Sistema de transporte Ribose ABC, proteína de ligação à ATP RbsA (TC 3.A.1.2.1); Sistema de transporte Ribose ABC, RbsD de permease de alta afinidade (TC 3.A.1.2.1); Sistema de transporte Ribose ABC, proteína periplasmática de ligação à ribose RbsB (TC 3.A.1.2.1); Sistema de transporte de Ribose ABC, proteína de permease RbsC (TC 3.A.1.2.1); Sistema de transporte de Ribose ABC, proteína de permease RbsC (TC 3.A.1.2.1); Sorbitol desidrogenase (EC 1. 1. 1. 14); Proteína ribossômica SSU S14p (S29e) @ proteína ribossômica SSU S14p (S29e), independente de zinco; componente específico do substrato STY3230 do transportador ECF regulado por queuosina; Sacaro- se-6-fosfato hidrolase (EC 3. 2. 1. B3); proteína de ligação a ATP de exportação de ácido teicoico TagH (EC 3. 6. 3. 40); Componente de Transmembrana BL0694 do módulo de energização do transportador ECF previsto; Componente de Transmembrana STY3231 do módulo de energização do transportador ECF regulado por queuosina; Regu-lador de resposta de dois componentes colocalizado com o transportador HrtAB; Sistema de modificação de restrição de tipo I, subunidade de DNA-metiltransferase M (EC 2.1.1.72); Sistema de modificação de restrição de Tipo I, subunidade de restrição R (EC 3.1.21.3); Sistema de modificação de restrição de tipo I, subunidade de especificação S (EC 3.1.21.3); Sistema de modificação de restrição de tipo I, subuni- dade de especificação S (EC 3.1.21.3); Sistema de modificação de restrição de tipo I, subunidade de especificação S (EC 3.1.21.3); Xilitol desidrogenase (EC 1.1.1.9); e transportador de Xilose ABC, proteína de ligação xilose periplasmática XylF. Em modalidades preferidas, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende um ou mais genes (tais como 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou todos) que estão listados na frase anterior e que não estão destacados na Tabela 1. Usos terapêuticos
[000126] Conforme demonstrado nos exemplos, as composições bacterianas da invenção são eficazes para reduzir a resposta inflamatória de Th17. Em particular, o tratamento com composições da inven- ção atinge uma redução nos níveis de IL-17A e outras citocinas de via Th17 e melhorias clínicas em modelos animais de condições mediadas por IL-17 e via Th17. Portanto, as composições da invenção podem ser úteis para tratar ou prevenir doenças inflamatórias e autoimunes, e em particular doenças ou condições mediadas por IL-17. Em particular, as composições da invenção podem ser úteis para reduzir ou prevenir a elevação da resposta inflamatória de IL-17.
[000127] As células Th17 são um subconjunto de células T auxiliares que produzem, por exemplo, IL-17A, IL17-F, IL-21 e IL-22. A diferenciação de células Th17 e a expressão de IL-17 podem ser conduzidas por IL-23. Essas citocinas e outras formam partes importantes da via Th17, que é uma via de sinalização inflamatória bem estabelecida que contribui para e está subjacente a uma série de doenças inflamatórias e autoimunes (como descrito em, por exemplo, [XIII-XIV]). Doenças em que a via Th17 é ativada são doenças mediadas pela via Th17. As doenças mediadas pela via Th17 podem ser melhoradas ou aliviadas pela repressão da via Th17, que pode ser através de uma redução na diferenciação das células Th17 ou de uma redução na sua atividade ou de uma redução no nível das citocinas da via Th17. As doenças mediadas pela via Th17 podem ser caracterizadas por níveis aumentados de citocinas produzidas por células Th17, como IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26, IL-9 (revisado em [XV]). As doenças mediadas pela via Th17 podem ser caracterizadas pelo aumento da expressão de genes relacionados a Th-17, como Stat3 ou IL-23R. Doenças mediadas pela via Th17 podem estar associadas a níveis aumentados de células Th17.
[000128] A IL-17 é uma citocina pró-inflamatória que contribui para a patogênese de várias doenças e doenças inflamatórias e autoimunes. A IL-17, tal como aqui utilizado, pode referir-se a qualquer membro da família IL-17, incluindo IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E e IL- 17F. As doenças e condições mediadas por IL-17 são caracterizadas por uma elevada expressão de IL-17 e/ou a acumulação ou presença de células positivas para IL-17 num tecido afetado pela doença ou condição. Do mesmo modo, as doenças e condições mediadas por IL- 17 são doenças e condições que são exacerbadas por altos níveis de IL-17 ou um aumento nos níveis de IL-17 e que são aliviados por baixos níveis de IL-17 ou uma redução nos níveis de IL-17. A resposta inflamatória da IL-17 pode ser local ou sistêmica.
[000129] Exemplos de doenças e condições que podem ser mediadas pela IL-17 ou a via Th17 incluem esclerose múltipla; artrite, como artrite reumatoide, osteoartrite, artrite psoriática ou artrite idiopática juvenil; neuromielite óptica (doença de Devic); espondilite anquilo- sante; espondiloartrite; psoríase; lúpus eritematoso sistêmico; doença inflamatória intestinal, como doença de Crohn ou colite ulcerativa; doença celíaca; asma, como asma alérgica ou asma neutrofílica; doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD); câncer, como câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pulmão ou câncer de ovário; uveíte; esclerite; vasculite; Doença de Behcet; aterosclerose; dermatite atópica; en- fisema; periodontite; rinite alérgica; e rejeição de aloenxertos. Em modalidades preferidas, as composições da invenção são utilizadas para tratar ou prevenir uma ou mais destas condições ou doenças. Em outras modalidades preferidas, estas condições ou doenças são mediadas por IL-17 ou a via Th17.
[000130] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso num método para reduzir a produção de IL-17 ou reduzir a diferenciação de células Th17 no tratamento ou prevenção de uma doença ou condição mediada por IL-17 ou a via Th17. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de uma doença inflamatória ou autoimune, em que o referido tratamento ou prevenção é obtido através da redução ou prevenção da elevação da resposta inflamatória de Th17. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de um paciente com uma doença inflamatória ou autoimune, em que o paciente tem níveis elevados de IL-17 ou células Th17 elevadas ou está apresentando uma resposta inflamatória de Th17. Em certas modalidades, o paciente pode ter sido diagnosticado com uma doença ou condição inflamatória ou autoimune crônica, ou a composição da invenção pode ser para uso na prevenção de uma doença ou condição inflamatória ou autoimune em desenvolvimento de uma doença ou condição inflamatória ou autoimune crônica. Em certas modalidades, a doença ou condição pode não ser sensível ao tratamento com inibidores de TNF-α. Estas utilizações da invenção podem ser aplicadas a qualquer das doenças ou condições específicas listadas no parágrafo anterior.
[000131] A IL-17 e a via Th17 são frequentemente associadas a doenças inflamatórias e autoimunes crônicas, de modo que as composições da invenção podem ser particularmente úteis para tratar ou prevenir doenças ou condições crônicas como mencionado acima. Em certas modalidades, as composições são para uso em pacientes com doença crônica. Em certas modalidades, as composições são para uso na prevenção do desenvolvimento de doenças crônicas.
[000132] As composições da invenção podem ser úteis para o tratamento de doenças e condições mediadas pela IL-17 ou a via Th17 e para abordar a resposta inflamatória de Th17, de modo que as composições da invenção podem ser particularmente úteis para tratamento ou prevenção de doenças crônicas, tratamento ou prevenção de doenças em pacientes que não tenham respondido a outras terapias (como o tratamento com inibidores de TNF-α) e/ou tratamento ou prevenção do dano tecidual e sintomas associados às células IL-17 e Th17. Por exemplo, a IL-17 é conhecida por ativar a destruição da matriz na cartilagem e tecido ósseo e IL-17 tem um efeito inibitório na produção da matriz em condrócitos e osteoblastos, de modo que as composições da invenção podem ser úteis para tratar ou prevenir erosão óssea ou danos na cartilagem.
[000133] Em certas modalidades, o tratamento com composições da invenção proporciona uma redução ou evita uma elevação nos níveis de IL-17, em particular níveis de IL-17A. Em certas modalidades, o tratamento com composições da invenção proporciona uma redução ou impede uma elevação nos níveis de IFN-Y, IL-1β, RANTES, MIP-1α, IL-8 ou IL-6. Essa redução ou prevenção de níveis elevados destas citocinas pode ser útil para tratar ou prevenir doenças e condições inflamatórias e autoimunes, em particular as mediadas por IL-17 ou a via Th17.
[000134] Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção proporciona um bloqueio da ligação ou invasão de células humanas, por exemplo, células epiteliais humanas por células patogênicas, por exemplo, E. coli e/ou S. enteritidis.
[000135] Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção reduz ou impede a ligação de células patogênicas, por exemplo, E. coli e/ou S. enteritidis, às células epiteliais humanas, por exemplo, células epiteliais intestinais humanas.
[000136] Em certas modalidades, a produção e liberação de exopo- lissacarídeos pelas cepas bacterianas das composições da invenção podem ter efeitos protetores contra espécies patogênicas, por exemplo, E. coli e/ou S. enteritidis. Em certas modalidades, a produção e liberação de exopolissacarídeos pelas cepas bacterianas das composições da invenção pode mediar o efeito da bactéria na via IL-17 ou Th17 e pode influenciar a resposta imune do hospedeiro. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na produção de exopolissacarídeos no tratamento de doenças inflamatórias e au- toimunes, e em particular doenças ou condições mediadas por IL-17.
[000137] Em certas modalidades, a baixa adesão às células epiteliais intestinais humanas, em particular células Caco-2, das cepas bacteria- nas das composições da invenção pode aumentar o efeito benéfico das composições da invenção na via IL-17 ou Th17 e em doenças mediadas por IL-17 ou a via Th17.
[000138] Em certas modalidades, o tratamento com composições da invenção proporciona uma fermentação aumentada de rafinose no intestino. Os exemplos demonstram que as cepas bacterianas das composições da invenção fermentam a rafinose de polissacarídeos e a fermentação com rafinose pode conferir efeitos sobre o hospedeiro, como o aumento do butirato cecal e o aumento da proliferação gastrointestinal. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na fermentação crescente de rafinose no intestino no tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes, e em particular doenças ou condições mediadas por IL-17.
Asma
[000139] Em modalidades preferidas, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de asma. Os exemplos demonstram que as composições da invenção conseguem uma redução no recrutamento de neutrófilos e/ou eosinófilos nas vias aéreas após a sensibilização e desafio com o extrato de ácaros da poeira doméstica e, portanto, podem ser úteis no tratamento ou prevenção da asma. A asma é uma doença crônica caracterizada por inflamação e restrição das vias aéreas. A inflamação na asma pode ser mediada por células IL-17 e/ou Th17, e as composições da invenção podem ser particularmente eficazes para prevenir ou tratar a asma. A inflamação na asma pode ser mediada por eosinófilos e/ou neutrófilos.
[000140] Em certas modalidades, a asma é asma eosinofílica ou alérgica. A asma eosinofílica e alérgica são caracterizadas por um aumento do número de eosinófilos no sangue periférico e nas secre- ções das vias aéreas e está associada patologicamente ao espessa- mento da zona da membrana basal e farmacologicamente pela resposta de corticosteroides [XVI]. As composições que reduzem ou inibem o recrutamento ou a ativação de eosinófilos podem ser úteis para tratar ou prevenir a asma eosinofílica e alérgica.
[000141] Em modalidades adicionais, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de asma neutrofílica (ou asma não eosinofílica). O alto número de neutrófilos está associado a asma grave que pode ser insensível ao tratamento com corticosteroi- des. As composições que reduzem ou inibem o recrutamento ou ativação de neutrófilos podem ser úteis para tratar ou prevenir a asma neu- trofílica.
[000142] Asma eosinofílica e neutrofílica não são condições mutuamente exclusivas e os tratamentos que ajudam a abordar as respostas de eosinófilos e neutrófilos podem ser úteis para o tratamento da asma em geral.
[000143] O aumento dos níveis de IL-17 e a ativação da via Th17 estão associados à asma severa, de modo que as composições da invenção podem ser úteis para prevenir o desenvolvimento de asma grave ou para tratar a asma grave.
[000144] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso em métodos que reduzem uma resposta inflamatória eosino- fílica no tratamento ou prevenção de asma, ou para uso em métodos de redução de uma resposta inflamatória neutrofílica no tratamento ou prevenção de asma. Conforme observado acima, níveis elevados de eosinófilos na asma estão associados patologicamente ao espessa- mento da zona da membrana basal, de modo que a redução da resposta inflamatória eosinofílica no tratamento ou prevenção da asma pode abordar especificamente essa característica da doença. Além disso, os neutrófilos elevados, em combinação com eosinófilos eleva- dos ou em sua ausência, estão associados à asma grave e estreitamento crônico das vias aéreas. Portanto, reduzir a resposta inflamatória neutrofílica pode ser particularmente útil para tratar a asma grave.
[000145] Em certas modalidades, as composições reduzem a infiltração peribronquiolar na asma alérgica, ou são para uso na redução da infiltração peribronquiolar no tratamento de asma alérgica. Em certas modalidades, as composições reduzem a infiltração peribronquiolar e/ou perivascular na asma neutrofílica, ou são para uso na redução da infiltração peribronquiolar e/ou perivascular no tratamento de asma alérgica neutrofílica.
[000146] Em certas modalidades, o tratamento com composições da invenção proporciona uma redução ou impede uma elevação nos níveis de IL-1 β, IFNy, RANTES, MIP-1α ou IL-8.
[000147] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso num método de tratamento de asma que resulta numa redução da resposta inflamatória eosinofílica e/ou neutrofílica. Em certas modalidades, o paciente a ser tratado tem ou já foi identificado como tendo níveis elevados de neutrófilos ou eosinófilos, por exemplo, identificados através de amostragem de sangue ou análise de escarro.
[000148] As composições da invenção podem ser úteis para prevenir o desenvolvimento de asma em um recém-nascido quando administrado ao recém-nascido, ou a uma mulher grávida. As composições podem ser úteis para prevenir o desenvolvimento de asma em crianças. As composições da invenção podem ser úteis para tratar ou prevenir a asma de início adulto. As composições da invenção podem ser úteis para gerenciar ou aliviar a asma. As composições da invenção podem ser particularmente úteis para reduzir os sintomas associados à asma que são agravados por alérgenos, como os ácaros da poeira doméstica.
[000149] O tratamento ou a prevenção da asma podem referir-se, por exemplo, a um alívio da gravidade dos sintomas ou a uma redução na frequência das exacerbações ou ao alcance dos desencadeantes que são um problema para o paciente.
[000150] Em certas modalidades, o tratamento com composições da invenção proporciona uma redução nas concentrações de fenilalanina e/ou histidina, por exemplo nos intestinos ou no plasma. Os exemplos demonstram que as cepas bacterianas das composições da invenção testadas positivas para a fermentação de aminoácidos, incluindo feni- lalanina e histidina, e o aumento das concentrações plasmáticas de fenilalanina e histidina foram associados a efeitos adversos na asma. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução das concentrações plasmáticas de fenilalanina e/ou histidina no tratamento da asma e, em particular, no tratamento da produção de histamina ou hiper-responsividade das vias aéreas associada à asma.
[000151] Em certas modalidades, o tratamento com composições da invenção proporciona uma redução nas concentrações de galactose e/ou frutose, por exemplo, nos intestinos. Os exemplos demonstram que as cepas bacterianas das composições da invenção fermentam substratos de carboidrato incluindo galactose e frutose e galactose α- 1,3-galactose derivada de fontes de carne é um alérgeno conhecido e agente causador de anafilaxia e níveis de ingestão de frutose dietética estão correlacionados com o aumento da gravidade da asma. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução de concentrações de galactose e/ou frutose no tratamento de asma e, em particular, no tratamento de asma grave.
Artrite
[000152] Em modalidades preferidas, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de artrite reumatoide (RA). Os exemplos demonstram que as composições da invenção conseguem uma redução nos sinais clínicos de RA em um modelo de ca- mundongo, reduzem a lesão na cartilagem e nos ossos e reduzem a resposta inflamatória de IL-17 e, portanto, podem ser úteis no tratamento ou prevenção de RA. A RA é uma doença inflamatória sistêmica que afeta principalmente as articulações. A RA está associada a uma resposta inflamatória que resulta em inchaço das articulações, hiper- plasia sinovial e destruição da cartilagem e do osso. As células IL-17 e Th17 podem ter um papel fundamental na RA, por exemplo porque a IL-17 inibe a produção da matriz em condrócitos e osteoblastos e ativa a produção e a função das metaloproteinases da matriz e porque a atividade da doença RA está correlacionada com os níveis de IL-17 e número de células Th -17 [XVII,XVIII], de modo que as composições da invenção podem ser particularmente eficazes para prevenir ou tratar RA.
[000153] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução dos níveis de IL-17 ou na prevenção da elevação dos níveis de IL-17 no tratamento ou prevenção de RA. Em certas modalidades, o tratamento com composições da invenção proporciona uma redução ou evita uma elevação nos níveis de IL-17, em particular níveis de IL-17A. Em certas modalidades, o tratamento com composições da invenção proporciona uma redução ou impede uma elevação nos níveis de IFN-Y ou IL-6.
[000154] Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção resulta em uma redução no inchaço das articulações. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso em pacientes com articulações inchadas ou pacientes identificados como em risco de ter articulações inchadas. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso em um método de redução do inchaço nas articulações RA.
[000155] Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção resulta em uma redução no dano da cartilagem ou danos nos ossos. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução ou prevenção de danos na cartilagem ou nos ossos no tratamento de RA. Em certas modalidades, as composições são para uso no tratamento de pacientes com RA grave que correm o risco de danos na cartilagem ou nos ossos.
[000156] O aumento dos níveis de IL-17 e o número de células Th17 estão associados à destruição da cartilagem e osso na RA [26,27]. IL- 17 é conhecida por ativar a destruição da matriz na cartilagem e tecido ósseo e IL-17 tem um efeito inibitório na produção da matriz em con- drócitos e osteoblastos. Portanto, em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na prevenção da erosão óssea ou danos na cartilagem no tratamento da RA. Em certas modalidades, as composições são para uso no tratamento de pacientes que exibem erosão óssea ou dano de cartilagem ou pacientes identificados como em risco de erosão óssea ou danos na cartilagem.
[000157] TNF-α também está associado à RA, mas o TNF-α não está envolvido na patogênese das fases posteriores da doença. Em contraste, a IL-17 tem um papel em todas as etapas da doença crônica [XIX]. Por conseguinte, em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de RA crônica ou RA tardia, tal como doença que inclui destruição das articulações e perda de cartilagem. Em certas modalidades, as composições da invenção são para o tratamento de pacientes que receberam previamente terapia anti-TNF- α. Em certas modalidades, os pacientes a serem tratados não respondem ou não respondem mais à terapia anti-TNF-α.
[000158] As composições da invenção podem ser úteis para modular o sistema imunológico de um paciente, de modo que, em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na prevenção de RA em um paciente que foi identificado como em risco de RA ou que foi diagnosticado com RA de fase inicial. As composições da invenção podem ser úteis para prevenir o desenvolvimento de RA.
[000159] As composições da invenção podem ser úteis para gerenciar ou aliviar RA. As composições da invenção podem ser particularmente úteis para reduzir os sintomas associados ao inchaço da articulação ou à destruição óssea. O tratamento ou a prevenção da RA podem referir-se, por exemplo, a um alívio da gravidade dos sintomas ou a uma redução na frequência das exacerbações ou ao alcance dos desencadeantes que são um problema para o paciente. Esclerose Múltipla
[000160] Em modalidades preferidas, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de esclerose múltipla. Os exemplos demonstram que as composições da invenção conseguem uma redução na incidência da doença e na gravidade da doença em um modelo de esclerose múltipla (modelo EAE) e, portanto, podem ser úteis no tratamento ou prevenção da esclerose múltipla. A esclerose múltipla é uma doença inflamatória associada ao dano das bainhas de mielina dos neurônios, particularmente no cérebro e na coluna vertebral. A esclerose múltipla é uma doença crônica, que é progressivamente incapacitante e que evolui em episódios. As células IL-17 e Th17 podem ter um papel fundamental na esclerose múltipla, por exemplo, porque os níveis de IL-17 podem se correlacionar com lesões de esclerose múltipla, a IL-17 pode interromper as junções estreitas das células endoteliais da barreira do cérebro sanguíneo e as células Th17 podem migrar para o sistema nervoso central e causa perda neuronal [XX,XXI]. Portanto, as composições da invenção podem ser particularmente eficazes para prevenir ou tratar a esclerose múltipla.
[000161] Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção resulta numa redução na incidência da doença ou na gravidade da doença. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução da incidência da doença ou da gravidade da doença. Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção evita um declínio na função motora ou resulta em função motora melhorada. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na prevenção de uma diminuição da função motora ou para o uso na melhoria da função motora. Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção evita o desenvolvimento de paralisia. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na prevenção da paralisia no tratamento da esclerose múltipla.
[000162] As composições da invenção podem ser úteis para modular o sistema imunológico de um paciente, de modo que, em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na prevenção da esclerose múltipla num paciente que foi identificado como em risco de esclerose múltipla ou que foi diagnosticado com esclerose múltipla em fase inicial ou esclerose múltipla "recidivante-remitente". As composições da invenção podem ser úteis para prevenir o desenvolvimento de esclerose. De fato, os exemplos mostram que a administração de composições da invenção impediu o desenvolvimento de doença em muitos camundongos.
[000163] As composições da invenção podem ser úteis para gerenciar ou aliviar esclerose múltipla. As composições da invenção podem ser particularmente úteis para reduzir os sintomas associados à esclerose múltipla. O tratamento ou a prevenção da esclerose múltipla podem referir-se, por exemplo, a um alívio da gravidade dos sintomas ou a uma redução na frequência das exacerbações ou ao alcance dos desencadeantes que são um problema para o paciente. Uveíte
[000164] Em modalidades preferidas, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de uveíte. As composições da invenção podem atingir uma redução na incidência da doença e gravidade da doença em um modelo animal de uveíte e, portanto, podem ser úteis no tratamento ou prevenção de uveíte. A uveíte é inflamação da úvea e pode resultar na destruição do tecido retiniano. Pode apresentar-se em diferentes formas anatômicas (anterior, intermediária, posterior ou difusa) e resulta de causas diferentes, mas relacionadas, incluindo distúrbios autoimunes sistêmicos. A IL-17 e a via Th17 estão envolvidas centralmente na uveíte, de modo que as composições da invenção podem ser particularmente eficazes para prevenir ou tratar a uveíte. Referências [XXII-XXIII] descrevem os níveis séricos elevados de interleucina-17A em pacientes com uveíte, a associação específica de variantes genéticas de IL17A com panuveíte, o papel das citocinas associadas à Th17 na patogênese da uveíte autoimune experimental, o desequilíbrio entre as células Th17 e as células T reguladoras durante a uveíte autoimune experimental monofásica, a su- prarregulação de IL-17A em pacientes com uveíte e doenças ativas de Adamantiades-Behçet e Vogt-Koyanagi-Harada (VKH), o tratamento de uveíte não infecciosa com secuquinumabe (anticorpo anti-IL-17A) e Th17 em olhos uveíticos.
[000165] Em certas modalidades, a uveíte é uveíte posterior. A uveí- te posterior apresenta principalmente a inflamação da retina e do co- roide e as composições da invenção podem ser eficazes para reduzir a inflamação e os danos da retina.
[000166] Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção resulta em uma redução no dano da retina. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução ou prevenção de dano da retina no tratamento da uveíte. Em certas modalidades, as composições são para uso no tratamento de pacientes com uveíte grave que correm o risco de danos na retina. Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção resulta em uma redução na inflamação do disco óptico. Em certas modalida- des, as composições da invenção são para uso na redução ou prevenção da inflamação do disco óptico. Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção resulta numa redução na infiltração do tecido retiniano por células inflamatórias. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução da infiltração do tecido retiniano por células inflamatórias. Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção resulta na manutenção ou melhoria da visão. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na manutenção ou melhoria da visão.
[000167] Em certas modalidades, as composições são para uso no tratamento ou prevenção de uveíte associada a uma doença não infecciosa ou autoimune, como a doença de Behçet, a doença de Crohn, a iridociclite heterocromática de Fuchs, a granulomatose com polian- ganite, uveíte relacionada com HLA-B27, artrite idiopática juvenil, sar- coidose, espondiloartrite, oftalmia simpática, nefrite tubulointersticial e síndrome de uveíte ou síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada. A IL-17A mostrou-se envolvida, por exemplo, nas doenças de Behçet e Vogt- Koyanagi-Harada.
[000168] O tratamento ou a prevenção da uveíte podem referir, por exemplo, um alívio da gravidade dos sintomas ou uma prevenção da recidiva.
Tratando câncer
[000169] Em modalidades preferidas, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer. Os exemplos demonstram que a administração das composições da invenção pode levar a uma redução no crescimento do tumor em vários modelos tu- morais.
[000170] Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção resulta em uma redução no tamanho do tumor ou uma redução no crescimento do tumor. Em certas modalidades, as compo- sições da invenção são para uso na redução do tamanho do tumor ou na redução do crescimento tumoral. Os exemplos demonstram que as composições da invenção podem ser eficazes para reduzir o tamanho ou crescimento do tumor. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso em pacientes com tumores sólidos. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução ou prevenção de angiogênese no tratamento de câncer. As células IL- 17 e Th17 têm papéis centrais na angiogênese. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na prevenção de me- tástases.
[000171] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de mama. Os exemplos demonstram que as composições da invenção podem ser eficazes para o tratamento do câncer de mama. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução do tamanho do tumor, reduzindo o crescimento do tumor ou reduzindo a angiogênese no tratamento do câncer de mama. Em modalidades preferidas, o câncer é o carcinoma mamário. Em modalidades preferidas, o câncer é câncer de mama na fase IV.
[000172] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de pulmão. Os exemplos demonstram que as composições da invenção podem ser eficazes para o tratamento do câncer de pulmão. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução do tamanho do tumor, reduzindo o crescimento do tumor ou reduzindo a angiogênese no tratamento do câncer de pulmão. Em modalidades preferidas, o câncer é o carcinoma de pulmão.
[000173] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de fígado. Os exemplos demonstram que as composições da invenção podem ser efica- zes para o tratamento do câncer de fígado. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução do tamanho do tumor, reduzindo o crescimento do tumor ou reduzindo a angiogênese no tratamento do câncer de fígado. Em modalidades preferidas, o câncer é hepatoma (carcinoma hepatocelular).
[000174] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de carcinoma. Os exemplos demonstram que as composições da invenção podem ser eficazes para o tratamento de numerosos tipos de carcinoma. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer não imunogênico. Os exemplos demonstram que as composições da invenção podem ser eficazes para o tratamento de cânceres não imunogênicos.
[000175] A IL-17 e a via Th17 têm papéis centrais no desenvolvimento e progressão do câncer e, embora os papéis das células IL-17 e Th17 no câncer não sejam totalmente compreendidos, são conhecidos numerosos efeitos pró-tumorais das células IL-17 e Th17. Por exemplo, as células Th17 e a IL-17 podem promover a angiogênese, aumentar a proliferação e a sobrevida das células tumorais e ativar os fatores de transcrição que promovem os tumores [XXIV-XXV]. Portanto, as composições da invenção podem ser úteis para tratar ou prevenir o câncer. Além disso, os exemplos demonstram que as composições da invenção são eficazes para reduzir o volume do tumor no cân-cer de mama, pulmão e fígado e as células IL-17 e Th17 têm papéis importantes nestes tipos específicos de câncer [XXVI-XXVII].
[000176] Os efeitos terapêuticos das composições da invenção em câncer podem ser mediados por um mecanismo pró-inflamatório. A inflamação pode ter um efeito supressor de câncer [XXVIII] e citocinas pró-inflamatórias como a TNFα estão sendo investigadas como terapias contra o câncer [XXIX]. As composições da invenção podem ser úteis para tratar o câncer através de um mecanismo semelhante. Por exemplo, as composições da invenção podem desencadear uma resposta do tipo IFNY. IFNY é um potente fator ativador de macrófagos que pode estimular a atividade tumirocida [XXX], e CXCL9 e CXCL10, por exemplo, também têm efeitos anticancerígenos [XXXI-XXXII]. Por conseguinte, em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na promoção da inflamação no tratamento de câncer. Em modalidades preferidas, as composições da invenção são para uso na promoção da inflamação Th1 no tratamento de câncer. As células Th1 produzem IFNY e possuem potentes efeitos anticancerígenos [45]. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de um câncer em fase inicial, tal como um câncer que não tem metástase, ou um câncer de fase 0 ou de fase 1. Promover a inflamação pode ser mais eficaz contra os cânceres em fase inicial [45]. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na promoção da inflamação para aumentar o efeito de um segundo agente anticancerígeno.
[000177] Em outras modalidades, as composições da invenção são destinadas a tratar ou prevenir leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, carcinoma de células basais, câncer do ducto biliar, câncer de bexiga, tumor ósseo, histioci- toma fibroso maligno/osteossarcoma, glioma do tronco cerebral, tumor cerebral, astrocitoma cerebelar, glioma maligno/astrocitoma cerebral, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos de supratentoriais, câncer de mama, adenomas/carcinoides brônqui- cos, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, câncer cervical, leucemia lin- focítica crônica, leucemia mieloide crônica, doenças mieloproliferativas crônicas, câncer de cólon, linfoma de célula T cutâneo, câncer endometrial, ependimoma, câncer de esôfago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, câncer de vesícula biliar, câncer gástri- co, tumor gastrointestinal carcinoide, tumor estromal gastrointestinal (GIST), tumor de células germinativas, glioma, caminho óptico da infância e hipotalâmico, linfoma de Hodgkin, melanoma, carcinoma de células da ilhota, sarcoma de Kaposi, câncer de células renais, câncer de laringe, leucemia, linfomas, mesotelioma, neuroblastoma, linfoma não Hodgkin, câncer orofaríngeo, osteossarcoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de paratireoide, cancro da faringe, adenoma pituitário, neoplasia de células plasmáticas, câncer de próstata, carcinoma de células renais, retinoblastoma, sarcoma, câncer testicular, câncer de tireoide ou câncer de útero.
[000178] As composições da invenção podem ser particularmente eficazes quando utilizadas em combinação com outros agentes terapêuticos. Os efeitos imunomoduladores das composições da invenção podem ser eficazes quando combinados com agentes anticanceríge- nos mais diretos. Por conseguinte, em certas modalidades, a invenção proporciona uma composição compreendendo a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um biotipo da mesma e um agente anticancerígeno. Em modalidades preferidas, o agente anti- cancerígeno é um inibidor de ponto de controle imune, uma imunote- rapia com anticorpo alvo, uma terapia com células CAR-T, um vírus oncolítico ou uma droga citostática. Em modalidades preferidas, a composição compreende um agente anticancerígeno selecionado do grupo que consiste em: Yervoy (ipilimumabe, BMS); Keytruda (pem- brolizumabe, Merck); Opdivo (nivolumab, BMS); MEDI4736 (AZ/MedImmune); MPDL3280A (Roche/Genentech); Tremelimumabe (AZ/MedImmune); CT-011 (pidilizumabe, CureTech); BMS-986015 (liri- lumabe, BMS); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MSB-0010718C (Merck); PF-05082566 (Pfizer); MEDI6469 (AZ/MedImmune); BMS-986016 (BMS); BMS-663513 (urelumabe, BMS); IMP321 (Prima Biomed); LAG525 (Novartis); ARGX-110 (arGEN-X); PF-05082466 (Pfizer); CDX-1127 (varlilumabe; CellDex Therapeutics); TRX-518 (GITR Inc.);MK-4166 (Merck); JTX-2011 (Jounce Therapeutics); ARGX-115 (arGEN-X); NLG-9189 (indoximod, NewLink Genetics); INCB024360 (Incyte); IPH2201 (Innate Immotherapeutics/AZ); NLG-919 (NewLink Genetics); anti-VISTA (JnJ); Epacadostat (INCB24360, Incyte); F001287 (Flexus/BMS); CP 870893 (Universidade da Pensilvânia); MGA271 (Macrogenix); Emactuzumabe (Roche/Genentech); Galuni- sertibe (Eli Lilly); Ulocuplumabe (BMS); BKT140/BL8040 (Biokine Therapeutics); Bavituximabe (Peregrine Pharmaceuticals); CC 90002 (Celgene); 852A (Pfizer); VTX-2337 (VentiRx Pharmaceuticals); IMO- 2055 (Hybridon, Idera Pharmaceuticals); LY2157299 (Eli Lilly); EW- 7197 (Ewha Women's University, Korea); Vemurafenibe (Plexxikon); Dabrafenibe (Genentech/GSK); BMS-777607 (BMS); BLZ945 (Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre); Unituxin (dinutuximabe, United Therapeutics Corporation); Blincyto (blinatumomabe, Amgen); Cyramza (ramucirumabe, Eli Lilly); Gazyva (obinutuzumabe, Ro- che/Biogen); Kadcyla (ado-trastuzumabe emtansina, Ro- che/Genentech); Perjeta (pertuzumabe, Roche/Genentech); Adcetris (brentuximabe vedotina, Takeda/Millennium); Arzerra (ofatumumabe, GSK); Vectibix (panitumumabe, Amgen); Avastin (bevacizumabe, Ro- che/Genentech); Erbitux (cetuximabe, BMS/Merck); Bexxar (tositu- momabe-I131, GSK); Zevalin (ibritumomabe tiuxetano, Biogen); Campath (alemtuzumabe, Bayer); Mylotarg (gemtuzumabe ozogamicina, Pfizer); Herceptin (trastuzumabe, Roche/Genentech); Rituxan (rituxi- mabe, Genentech/Biogen); volociximabe (Abbvie); Enavatuzumabe (Abbvie); ABT-414 (Abbvie); Elotuzumabe (Abbvie/BMS); ALX-0141 (Ablynx); Ozaralizumabe (Ablynx); Actimabe-C (Actínio); Actimabe-P (Actínio); Milatuzumabe-dox (Actínio); Emabe-SN-38 (Actínio); Naptu- monmabe estafenatox (Active Biotech); AFM13 (Affimed); AFM11 (Af- fimed); AGS-16C3F (Agensys); AGS-16M8F (Agensys); AGS-22ME (Agensys); AGS-15ME (Agensys); GS-67E (Agensys); ALXN6000 (samalizumabe, Alexion); ALT-836 (Altor Bioscience); ALT-801 (Altor Bioscience); ALT-803 (Altor Bioscience); AMG780 (Amgen); AMG 228 (Amgen); AMG820 (Amgen); AMG172 (Amgen); AMG595 (Amgen); AMG110 (Amgen); AMG232 (adecatumumabe, Amgen); AMG211 (Amgen/MedImmune); BAY20-10112 (Amgen/Bayer); Rilotumumabe (Amgen); Denosumabe (Amgen); AMP-514 (Amgen); MEDI575 (AZ/MedImmune); MEDI3617 (AZ/MedImmune); MEDI6383 (AZ/MedImmune); MEDI551 (AZ/MedImmune); Moxetumomabe pasu- dotox (AZ/MedImmune); MEDI565 (AZ/MedImmune); MEDI0639 (AZ/MedImmune); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MEDI562 (AZ/MedImmune); AV-380 (AVEO); AV203 (AVEO); AV299 (AVEO); BAY79-4620 (Bayer); Anetumabe ravtansine (Bayer); vantictumabe (Bayer); BAY94-9343 (Bayer); Sibrotuzumabe (Boehringer Ingleheim); BI-836845 (Boehringer Ingleheim); B-701 (BioClin); BIIB015 (Biogen); Obinutuzumabe (Biogen/Genentech); BI-505 (Bioinvent); BI-1206 (Bioinvent); TB-403 (Bioinvent); BT-062 (Biotest) BIL-010t (Biosceptre); MDX-1203 (BMS); MDX-1204 (BMS); Necitumumabe (BMS); CAN-4 (Cantargia AB); CDX-011 (Celldex); CDX1401 (Celldex); CDX301 (Celldex); U3-1565 (Daiichi Sankyo); patritumabe (Daiichi Sankyo); ti- gatuzumabe (Daiichi Sankyo); nimotuzumabe (Daiichi Sankyo); DS- 8895 (Daiichi Sankyo); DS-8873 (Daiichi Sankyo); DS-5573 (Daiichi Sankyo); MORab-004 (Eisai); MORab-009 (Eisai); MORab-003 (Eisai); MORab-066 (Eisai); LY3012207 (Eli Lilly); LY2875358 (Eli Lilly); LY2812176 (Eli Lilly); LY3012217(Eli Lilly); LY2495655 (Eli Lilly); LY3012212 (Eli Lilly); LY3012211 (Eli Lilly); LY3009806 (Eli Lilly); cixu- tumumabe (Eli Lilly); Flanvotumabe (Eli Lilly); IMC-TR1 (Eli Lilly); Ra- mucirumabe (Eli Lilly); Tabalumabe (Eli Lilly); Zanolimumabe (Emergent Biosolution); FG-3019 (FibroGen); FPA008 (Five Prime Therapeutics); FP-1039 (Five Prime Therapeutics); FPA144 (Five Prime Thera- peutics); catumaxomabe (Fresenius Biotech); IMAB362 (Ganymed); IMAB027 (Ganymed); HuMax-CD74 (Genmab); HuMax-TFADC (Gen- mab); GS-5745 (Gilead); GS-6624 (Gilead); OMP-21M18 (demcizu- mab, GSK); mapatumumab (GSK); IMGN289 (ImmunoGen); IMGN901 (ImmunoGen); IMGN853 (ImmunoGen); IMGN529 (ImmunoGen); IMMU-130 (Immunomedics); milatuzumab-dox (Immunomedics); IMMU-115 (Immunomedics); IMMU-132 (Immunomedics); IMMU-106 (Immunomedics); IMMU-102 (Immunomedics); Epratuzumabe (Immunomedics); Clivatuzumabe (Immunomedics); IPH41 (Innate Immunotherapeutics); Daratumumabe (Janssen/Genmab); CNTO-95 (Inte- tumumabe, Janssen); CNTO-328 (siltuximabe, Janssen); KB004 (Ka- loBios); mogamulizumabe (Kyowa Hakko Kirrin); KW-2871 (ecromexi- mabe, Life Science); Sonepcizumabe (Lpath); Margetuximabe (Macro- genics); Enoblituzumabe (Macrogenics); MGD006 (Macrogenics); MGF007 (Macrogenics); MK-0646 (dalotuzumabe, Merck); MK-3475 (Merck); Sym004 (Symphogen/Merck Serono); DI17E6 (Merck Sero- no); MOR208 (Morphosys); MOR202 (Morphosys); Xmab5574 (Morphosys); BPC-1C (ensituximabe, Precision Biologics); TAS266 (Novartis); LFA102 (Novartis); BHQ880 (Novartis/Morphosys); QGE031 (Novartis); HCD122 (lucatumumabe, Novartis); LJM716 (Novartis); AT355 (Novartis); OMP-21M18 (Demcizumabe, OncoMed); OMP52M51 (On- comed/GSK); OMP-59R5 (Oncomed/GSK); vantictumabe (Onco- med/Bayer); CMC-544 (inotuzumabe ozogamicin, Pfizer); PF- 03446962 (Pfizer); PF-04856884 (Pfizer); PSMA-ADC (Progenics); REGN1400 (Regeneron); REGN910 (nesvacumabe, Regene- ron/Sanofi); REGN421 (enoticumabe, Regeneron/Sanofi); RG7221, RG7356, RG7155, RG7444, RG7116, RG7458, RG7598, RG7599, RG7600, RG7636, RG7450, RG7593, RG7596, DCDS3410A, RG7414 (parsatuzumabe), RG7160 (imgatuzumabe), RG7159 (obintuzumabe), RG7686, RG3638 (onartuzumabe), RG7597 (Roche/Genentech); SAR307746 (Sanofi); SAR566658 (Sanofi); SAR650984 (Sanofi); SAR153192 (Sanofi); SAR3419 (Sanofi); SAR256212 (Sanofi), SGN- LIV1A (lintuzumabe, Seattle Genetics); SGN-CD33A (Seattle Genetics); SGN-75 (vorsetuzumabe mafodotin, Seattle Genetics); SGN-19A (Seattle Genetics) SGN-CD70A (Seattle Genetics); SEA-CD40 (Seattle Genetics); ibritumomabe tiuxetan (Spectrum); MLN0264 (Takeda); ga- nitumabe (Takeda/Amgen); CEP-37250 (Teva); TB-403 (Thromboge- nic); VB4-845 (Viventia); Xmab2512 (Xencor); Xmab5574 (Xencor); nimotuzumabe (YM Biosciences); Carlumab (Janssen); NY-ESO TCR (Adaptimmune); MAGE-A-10 TCR (Adaptimmune); CTL019 (Novartis); JCAR015 (Juno Therapeutics); KTE-C19 CAR (Kite Pharma); UCART19 (Cellectis); BPX-401 (Bellicum Pharmaceuticals); BPX-601 (Bellicum Pharmaceuticals); ATTCK20 (Unum Therapeutics); CAR- NKG2D (Celyad); Onyx-015 (Onyx Pharmaceuticals); H101 (Shanghai Sunwaybio); DNX-2401 (DNAtrix); VCN-01 (VCN Biosciences); Colo- Ad1 (PsiOxus Therapeutics); ProstAtak (Advantagene); Oncos-102 (Oncos Therapeutics); CG0070 (Cold Genesys); Pexa-vac (JX-594, Jennerex Biotherapeutics); GL-ONC1 (Genelux); T-VEC (Amgen); G207 (Medigene); HF10 (Takara Bio); SEPREHVIR (HSV1716, Virttu Biologics); OrienX010 (OrienGene Biotechnology); Reolysin (Oncolytics Biotech); SVV-001 (Neotropix); Cacatak (CVA21, Viralytics); Alimta (Eli Lilly), cisplatina, oxaliplatina, irinotecano, ácido folíni- co,metotrexato, ciclofosfamida, 5-fluorouracil, Zykadia (Novartis), Ta- finlar (GSK), Xalkori (Pfizer), Iressa (AZ), Gilotrif (Boehringer Ingelheim), Tarceva (Astellas Pharma), Halaven (Eisai Pharma), Veliparibe (Abbvie), AZD9291 (AZ), Alectinibe (Chugai), LDK378 (Novartis), Ge- netespibe (Synta Pharma), Tergenpumatucel-L (NewLink Genetics), GV1001 (Kael-GemVax), Tivantinibe (ArQule); Cytoxan (BMS); Oncovin (Eli Lilly); Adriamycin (Pfizer); Gemzar (Eli Lilly); Xeloda (Roche); Ixempra (BMS); Abraxane (Celgene); Trelstar (Debiopharm); Taxotere (Sanofi); Nexavar (Bayer); IMMU-132 (Immunomedics); E7449 (Eisai); Thermodox (Celsion); Cometriq (Exellxis); Lonsurf (Taiho Pharmaceuticals); Camptosar (Pfizer); UFT (Taiho Pharmaceuticals); e TS-1 (Tai- ho Pharmaceuticals).
Modos de administração
[000179] De preferência, as composições da invenção devem ser administradas ao trato gastrointestinal de modo a permitir a distribuição e/ou a colonização parcial ou total do intestino com a cepa bacte- riana da invenção. Geralmente, as composições da invenção são administradas por via oral, mas podem ser administradas por via retal, intranasal ou através de vias bucais ou sublinguais.
[000180] Em certas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas como uma espuma, como uma pulverização ou um gel.
[000181] Em certas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas como um supositório, tal como um supositório retal, por exemplo sob a forma de um óleo de teobroma (manteiga de cacau), gordura rígida sintética (por exemplo, suppocire, witepsol), gli- cero-gelatina, polietilenoglicol, ou composição de sabão e glicerina.
[000182] Em certas modalidades, a composição da invenção é administrada ao trato gastrointestinal através de um tubo, como um tubo nasogástrico, tubo orogástrico, tubo gástrico, tubo de jejunostomia (tubo J), gastrostomia endoscópica percutânea (PEG) ou uma porta, tal como uma porta de parede torácica que fornece acesso ao estômago, jejuno e outras portas de acesso adequadas.
[000183] As composições da invenção podem ser administradas uma vez, ou podem ser administradas sequencialmente como parte de um regime de tratamento. Em certas modalidades, as composições da invenção devem ser administradas diariamente.
[000184] Em certas modalidades da invenção, o tratamento de acor- do com a invenção é acompanhado de avaliação da microbiota do intestino do paciente. O tratamento pode ser repetido se a distribuição e/ou a colonização parcial ou total com a cepa da invenção não for obtida de tal forma que a eficácia não seja observada ou o tratamento pode ser interrompido se a distribuição e/ou a colonização parcial ou total for bem sucedida e a eficácia for observada.
[000185] Em certas modalidades, a composição da invenção pode ser administrada a uma animal grávida, por exemplo, um mamífero tal como um humano, a fim de evitar que uma doença inflamatória ou au- toimune se desenvolva em seu filho in utero e/ou depois de nascer.
[000186] As composições da invenção podem ser administradas a um paciente que tenha sido diagnosticado com uma doença ou condição mediada por IL-17 ou a via Th17, ou que tenha sido identificada como sendo em risco de uma doença ou condição mediada por IL-17 ou a via Th17. As composições também podem ser administradas como uma medida profilática para prevenir o desenvolvimento de doenças ou condições mediadas pela IL-17 ou a via Th17 em um paciente saudável.
[000187] As composições da invenção podem ser administradas a um paciente que foi identificado como tendo uma microbiota de intestino anormal. Por exemplo, o paciente pode ter uma colonização reduzida ou ausente pela bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380.
[000188] As composições da invenção podem ser administradas como um produto alimentar, tal como um suplemento nutricional.
[000189] Geralmente, as composições da invenção são para o tratamento de seres humanos, embora possam ser usadas para tratar animais, incluindo mamíferos monogástricos, como aves, porcos, gatos, cachorros, cavalos ou coelhos. As composições da invenção podem ser úteis para aumentar o crescimento e o desempenho dos ani- mais. Se administrado a animais, pode-se usar a sonda oral.
Composições
[000190] Geralmente, a composição da invenção compreende bactérias. Em modalidades preferidas da invenção, a composição é formulada em forma liofilizada. Por exemplo, a composição da invenção pode compreender grânulos ou cápsulas de gelatina, por exemplo, cápsulas de gelatina dura, compreendendo uma cepa bacteriana da invenção.
[000191] De preferência, a composição da invenção compreende bactérias liofilizadas. A liofilização de bactérias é um procedimento bem estabelecido e orientações relevantes estão disponíveis, por exemplo, referências [XXXIII-XXXIV].
[000192] Alternativamente, a composição da invenção pode compreender uma cultura bacteriana ativa viva.
[000193] Em modalidades preferidas, a composição da invenção é encapsulada para permitir a distribuição da cepa bacteriana para o intestino. A encapsulação protege a composição da degradação até a distribuição no local alvo, por exemplo, com ruptura com estímulos químicos ou físicos, como pressão, atividade enzimática ou desintegração física, que pode ser desencadeada por alterações no pH. Qualquer método de encapsulamento apropriado pode ser usado. As técnicas de encapsulamento exemplificativas incluem aprisionamento dentro de uma matriz porosa, fixação ou adsorção em superfícies portadoras sólidas, autoagregação por floculação ou com agentes de reti- culação e contenção mecânica por trás de uma membrana microporo- sa ou uma microcápsula. A orientação sobre o encapsulamento que pode ser útil para preparar composições da invenção está disponível, por exemplo, nas referências [XXXV] e [XXXVI].
[000194] A composição pode ser administrada por via oral e pode estar na forma de um comprimido, cápsula ou pó. Os produtos encap- sulados são preferidos porque a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 pode ser uma anaeróbia. Outros ingredientes (como a vitamina C, por exemplo), podem ser incluídos como elimina- dores de oxigênio e substratos prebióticos para melhorar a distribuição e/ou a colonização e sobrevida parcial ou total in vivo. Alternativamente, a composição probiótica da invenção pode ser administrada oralmente como um produto alimentar ou nutricional, tal como leite ou produto lácteo fermentado baseado em soro de leite, ou como um produto farmacêutico.
[000195] A composição pode ser formulada como um probiótico.
[000196] Uma composição da invenção inclui uma quantidade tera- peuticamente eficaz de uma cepa bacteriana da invenção. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana é suficiente para exercer um efeito benéfico sobre um paciente. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana pode ser suficiente para resultar na administração e/ou a colonização parcial ou total do intestino do paciente.
[000197] Uma dose diária adequada das bactérias, por exemplo, para um adulto humano, pode ser de cerca de 1 x 103 a cerca de 1 x 1011 unidades formadoras de colônias (CFU); por exemplo, de cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 1010 CFU; em outro exemplo de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 1010 CFU.
[000198] Em certas modalidades, a composição contém a cepa bac- teriana numa quantidade de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 1011 CFU/g, em relação ao peso da composição; por exemplo, de cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 1010 CFU/g. A dose pode ser, por exemplo, 1 g, 3 g, 5 g e 10 g.
[000199] Tipicamente, um probiótico, tal como a composição da invenção, é opcionalmente combinado com pelo menos um composto prebiótico adequado. Um composto prebiótico geralmente é um car- boidrato não digerível, como um oligo ou polissacarídeo, ou um álcool de açúcar, que não é degradado ou absorvido no trato digestivo superior. Prebióticos conhecidos incluem produtos comerciais como inulina e transgalacto-oligossacarídeos.
[000200] Em certas modalidades, a composição probiótica da presente invenção inclui um composto prebiótico numa quantidade de cerca de 1 a cerca de 30% em peso, em relação à composição do peso total (por exemplo, de 5 a 20% em peso). Carboidratos podem ser selecionadom do grupo que consiste em: fruto-oligossacarídeos (ou FOS), fruto-oligossacarídeos de cadeia curta, inulina, isomalt- oligossacarídeos, pectinas, xileólogos-oligossacarídeos (ou XOS), qui- tosana-oligossacarídeos (ou COS), beta-glucanos, amido e manteiga cultivável, polidextrose, D-tagatose, fibras de acácia, alfarrobeiras, aveia e fibras cítricas. Em um aspecto, os prebióticos são os fruto- oligossacarídeos de cadeia curta (por simplicidade mostrada abaixo como FOSs-cc); os FOSs-cc não são carboidratos digeríveis, geral-mente obtidos pela conversão do açúcar de beterraba e incluindo uma molécula de sacarose à qual três moléculas de glicose estão ligadas.
[000201] As composições da invenção podem compreender excipi- entes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de tais ex- cipientes adequados podem ser encontrados na referência [XXXVII]. Os veículos ou diluentes aceitos para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica e são descritos, por exemplo, na referência [XXXVIII]. Exemplos de veículos adequados incluem lactose, amido, glicose, metilcelulose, estearato de magnésio, manitol, sorbitol e semelhantes. Exemplos de diluentes adequados incluem etanol, gli- cerol e água. A escolha do veículo, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser selecionada em relação à via de administração pretendida e à prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem compreender como, além do veículo, excipiente ou diluente qualquer aglutinante(s) adequado(s), lubrificante(s), agente(s) de suspensão, agente(s) de revestimento, agente(s) solubilizante(s). Exemplos de aglutinantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais, tais como glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, edulcorantes de milho, gomas naturais e sintéticas, tais como acácia, tragacanto ou alginato de sódio, carboximetilcelulose e polietilenogli- col. Exemplos de lubrificantes adequados incluem oleato de sódio, es- tearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes. Conservantes, estabilizan- tes, corantes e mesmo agentes aromatizantes podem ser fornecidos na composição farmacêutica. Exemplos de conservantes incluem ben- zoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Podem também ser utilizados antioxidantes e agentes de suspensão.
[000202] As composições da invenção podem ser formuladas como um produto alimentar. Por exemplo, um produto alimentar pode pro-porcionar benefícios nutricionais além do efeito terapêutico da invenção, como por exemplo, em um suplemento nutricional. De modo semelhante, um produto alimentar pode ser formulado para aumentar o sabor da composição da invenção ou para tornar a composição mais atraente para consumir por ser mais semelhante a um alimento comum, em vez de uma composição farmacêutica. Em certas modalidades, a composição da invenção é formulada como um produto à base de leite. O termo "produto à base de leite" significa qualquer produto líquido ou semissólido com leite ou soro com um teor de gordura variável. O produto à base de leite pode ser, por exemplo, leite de vaca, leite de cabra, leite de ovelha, leite desnatado, leite integral, leite re- combinado a partir de leite em pó e soro sem processamento, ou um produto processado, como iogurte, leite coalhado, coalhada, leite azedo, leite integral amargo, leite com manteiga e outros produtos lácteos azedos. Outro grupo importante inclui bebidas lácteas, como bebidas de soro de leite, leites fermentados, lã condensada, leite para bebês ou bebê; leite aromatizado, sorvete; alimentos contendo leite, como doces.
[000203] Em certas modalidades, as composições da invenção contêm uma única cepa ou espécie bacteriana e não contêm outras cepas ou espécies bacterianas. Tais composições podem compreender apenas de minimis ou quantidades biologicamente irrelevantes de outras cepas ou espécies bacterianas. Tais composições podem ser uma cultura que é substancialmente livre de outras espécies de organismos.
[000204] As composições para uso de acordo com a invenção podem ou não requerer aprovação de marketing.
[000205] Em alguns casos, a cepa bacteriana liofilizada é reconstituída antes da administração. Em alguns casos, a reconstituição é por uso de um diluente aqui descrito.
[000206] As composições da invenção podem compreender exci- pientes, diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
[000207] Em certas modalidades, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; onde a cepa bacteriana é em quantidade suficiente para tratar um distúrbio quando administrado em um sujeito em necessidade do mesmo; e onde o distúrbio é selecionado do grupo que consiste em asma, asma alérgica, asma neutrofílica, osteoartrite, artrite psoriática, artrite idi- opática juvenil, neuromielite óptica (doença de Devic), espondilite an- quilosante, espondilartrose, lúpus eritematoso sistêmico, doença celíaca, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), câncer, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de ovário, uveíte, esclerite, vasculite, doença de Behçet, aterosclerose, dermatite atópi- ca, enfisema, periodontite, rinite alérgica e rejeição de aloenxerto.
[000208] Em certas modalidades, a invenção proporciona uma com- posição farmacêutica compreendendo: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou condição mediada por IL-17 ou a via Th17. Em modalidades preferidas, a referida doença ou condição é selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide, esclerose múltipla, psoríase, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença celíaca, asma, asma alérgica, asma neutrófi- la, osteoartrite, artrite psoriática, artrite idiopática juveni, neuromielite óptica (doença de Devic), espondilite anquilosante, espondiloartrite, lúpus eritematoso sistêmico, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), câncer, câncer de mama, câncer de colon, câncer de pulmão, câncer de ovário, uveíte, esclerite, vasculite, doença de Behcet, ate- rosclerose, dermatite atópica, enfisema, periodontite, rinite alérgica e rejeição de aloenxertos.
[000209] Em certas modalidades, a invenção proporciona a composição farmacêutica acima, em que a quantidade da cepa bacteriana é de aproximadamente 1 x io3 a cerca de 1 x 1011 unidades formadoras de colônias por grama em relação a um peso da composição.
[000210] Em certas modalidades, a invenção proporciona a composição farmacêutica acima, em que a composição é administrada numa dose de 1 g, 3 g, 5 g ou 10 g.
[000211] Em certas modalidades, a invenção proporciona a composição farmacêutica acima, em que a composição é administrada por um método selecionado do grupo que consiste em oral, retal, subcutâneo, nasal, bucal e sublingual.
[000212] Em certas modalidades, a invenção proporciona a composição farmacêutica acima, compreendendo um veículo selecionado do grupo que consiste em lactose, amido, glicose, metilcelulose, estearato de magnésio, manitol e sorbitol.
[000213] Em certas modalidades, a invenção proporciona a composição farmacêutica acima, compreendendo um diluente selecionado do grupo que consiste em etanol, glicerol e água.
[000214] Em certas modalidades, a invenção proporciona a composição farmacêutica acima, compreendendo um excipiente selecionado do grupo que consiste em amido, gelatina, glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, edulcorante de milho, acácia, traga- canto, alginato de sódio, carboximetil celulose, polietilenoglicol, oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio e cloreto de sódio.
[000215] Em certas modalidades, a invenção proporciona a composição farmacêutica acima, compreendendo ainda pelo menos um de um conservante, um antioxidante e um estabilizador.
[000216] Em certas modalidades, a invenção proporciona a composição farmacêutica acima, compreendendo um conservante selecionado do grupo que consiste em benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico.
[000217] Em certas modalidades, a invenção proporciona a composição farmacêutica acima, em que a referida cepa bacteriana é liofili- zada.
[000218] Em certas modalidades, a invenção proporciona a composição farmacêutica acima, em que quando a composição é armazenada num recipiente vedado a cerca de 4°C ou cerca de 25°C e o recipiente é colocado numa atmosfera com 50% de umidade relativa, pelo menos 80% da cepa bacteriana medida em unidades formadoras de colônias, permanece após um período de pelo menos aproximadamente: 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos.
Métodos de cultura
[000219] As cepas bacterianas para uso na presente invenção po- dem ser cultivadas utilizando técnicas de microbiologia padrão como detalhado, por exemplo, referências [XXXIX-XL].
[000220] O meio sólido ou líquido utilizado para a cultura pode ser ágar YCFA ou meio YCFA. O meio YCFA pode incluir (por 100ml, valores aproximados): Casitona (1,0 g), extrato de levedura (0,25 g), NaHCO3 (0,4 g), cisteína (0,1 g), K2HPO4 (0,045 g), KH2PO4 (0,045 g), NaCI (0,09 g), (NH4)2SO4 (0,09 g), MgSO4^ 7H2O (0,009 g), CaCh (0,009 g), resazurina (0,1 mg), hemina (1 mg), biotina (1 μg), cobala- mina (1 μg), ácido p-aminobenzoico (3 μg), ácido fólico (5 μg) e pirido- xamina (15 μg). Cepas bacterianas para uso em composições de vacinas
[000221] Os inventores identificaram que as cepas bacterianas da invenção são úteis para tratar ou prevenir doenças ou condições mediadas por IL-17 ou a via Th17. Provavelmente é um resultado do efeito que as cepas bacterianas da invenção têm no sistema imunológico do hospedeiro. Portanto, as composições da invenção também podem ser úteis para prevenir doenças ou condições mediadas por IL-17 ou a via Th17, quando administradas como composições de vacina. Em certas modalidades, as cepas bacterianas da invenção podem ser mortas, inativadas ou atenuadas. Em certas modalidades, as composições podem compreender um adjuvante de vacina. Em certas modalidades, as composições são para administração via injeção, como via via injeção subcutânea. Geral
[000222] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, métodos convencionais de química, bioquímica, biologia molecular, imunologia e farmacologia, dentro da habilidade da técnica. Essas técnicas são explicadas totalmente na literatura. Ver, por exemplo, referências [XLI] e [XLII-XLIII], etc.
[000223] O termo "compreendendo" engloba "incluindo", bem como "consistindo", por exemplo, uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional por exemplo, X + Y.
[000224] O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x é opcional e significa, por exemplo, x+10%.
[000225] A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida na definição da invenção.
[000226] As referências a uma percentagem de identidade de sequência entre duas sequências de nucleotídeos significam que, quando alinhadas, essa percentagem de nucleotídeos é a mesma na comparação das duas sequências. Este alinhamento e a percentagem de homologia ou identidade de sequência podem ser determinados utilizando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo os descritos na seção 7. 7. 18 da referência. [XLIV]. Um alinhamento preferido é determinado pelo algoritmo de busca de homologia de SmithWaterman usando uma busca de gap afim com uma penalidade de gap aberto de 12 e uma penalidade de extensão de gap de 2, matriz BLOSUM de 62. O algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman é divulgado na ref. [XLV].
[000227] A não ser que se especifique especificamente, um processo ou método que compreende várias etapas pode compreender etapas adicionais no início ou no final do método, ou pode incluir etapas intermediárias adicionais. Além disso, as etapas podem ser combinadas, omitidas ou executadas em uma ordem alternativa, se apropriado.
[000228] Várias modalidades da invenção são aqui descritas. Será apreciado que as características especificadas em cada modalidade podem ser combinadas com outras características especificadas, para proporcionar outras modalidades. Em particular, as modalidades aqui destacadas como sendo adequadas, típicas ou preferidas podem ser combinadas entre si (exceto quando elas são mutuamente exclusivas). MELHORES MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO
Exemplo 1 - Eficácia dos inóculos bacterianos em um modelo de camundongo de asma induzida por ácaros da poeira doméstica Sumário
[000229] Os camundongos foram administrados com composições compreendendo cepas bacterianas de acordo com a invenção e foram subsequentemente desafiados com o extrato de ácaros da poeira doméstica (HDM) para provocar uma resposta inflamatória alérgica. A resposta inflamatória ao HDM inclui componentes eosinofílicos e neu- trofílicos, é mediada por IL-17 e a via Th17 e é um modelo para a asma. A magnitude e as características da resposta inflamatória exibida por camundongos tratados com composições da invenção foram comparadas aos grupos de controle. Descobriu-se que as composições da invenção aliviam a resposta inflamatória e reduzem o recrutamento de eosinófilos e neutrófilos, indicando que podem ser úteis para o tratamento de condições mediadas por IL-17, tais como eosinofilia, neutro- filia e asma. Cepa
[000230] 751: bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380
Desenho do estudo
[000231] Grupos:
[000232] 1. Grupo de controle negativo. Tratamento com controle de veículo (por via oral).
[000233] 4. Tratamento com cepa de inóculo de bactérias terapêuti cas 751 (por via oral).
[000234] 7. Grupo de controle positivo. Tratamento com Dexameta- sona (i. p.).
[000235] 8. Grupo de controle sem tratamento.
[000236] Número de camundongos por grupo = 5
[000237] Dia 14 a dia 13: Administração diária do controle do veículo por via oral (Grupo 1).
[000238] Dia 14 a dia 13: Administração diária de inóculo de bactérias terapêuticas por via oral (Grupo 2-6).
[000239] Dia 0, 2, 4, 7, 9, 11 Administração de 15ug HDM (extrato de ácaro da poeira doméstica - Número do catálogo: XPB70D3A25, Número do lote: 231897, Greer Laboratories, Lenoir, NC, EUA) em um volume de 30 ul de PBS por nasal (Grupo 1-8).
[000240] Dia 0, 2, 4, 7, 9, 11 Administração de Dexametasona (i. p.,3mg/kg, Sigma-Aldrich, Número de catálogo D1159) (Grupo 7).
[000241] Dia 14 Sacrifício de todos os animais para análise.
[000242] Número total de camundongos = 40. Pontos finais e análise
[000243] No dia 14, os animais foram sacrificados por injeção letal intraperitoneal com pentabarbitol (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) imediatamente seguido por lavagem broncoalveolar (BAL).
[000244] As células foram isoladas do líquido BAL (lavagem bronco- alveolar) e as contagens de células diferenciais realizadas (200 conta- gens/amostras de células). Material e métodos
[000245] Camundongos. Os camundongos BALB/c de 7 semanas de idade foram comprados dos laboratórios Charles River e alocados aleatoriamente para gaiolas totalmente 5 camundongos por gaiola (gaiolas ventiladas provenientes da Indulab AG, Gams, Tipo gaiola Su- íca: “The SealsafeTM - IVC cage. Número do produto 1248L). As gaiolas foram rotuladas com número de estudo, número de grupo e data de início experimental. Os camundogos foram monitorados semanalmente e aclimatados às instalações durante 7 dias antes do início do estudo (Dia de Estudo -14). Os animais tinham 8 semanas de idade no Dia do Estudo -14. Água potável e alimentos estavam disponíveis ad libitum. O enriquecimento da gaiola estava presente. Os cuidados diários dos animais foram realizados de acordo com o número de licença de autorização local 2283. 1 (emitido e aprovado por: Service de la consommation et des affaires vétérinaires du Canton de Vaud). Água potável e alimentos estavam disponíveis ad libitum e atualizados uma vez por dia. O enriquecimento da gaiola estava presente. Os regulamentos de bem-estar dos animais foram observados como dados pelas autoridades oficiais da Suíça, de acordo com a ordem 455. 163 do FVO (Instituto Federal de Veterinária) sobre criação de animais de laboratório, produção de animais geneticamente modificados e métodos de experimentação animal.
[000246] Cultivo de inóculo de bactérias. Dentro de uma estação de trabalho estéril, um crio-frasco de bactéria foi descongelado por aquecimento em mão enluvada e ~ 0,7 ml de conteúdo injetado em um tubo Hungate (Número de gato, 1020471, Glasgeratebau Ochs, Bo- venden-Lenglern, Alemanha), contendo 8 ml de YCFA anaeróbico. Dois tubos por cepa geralmente foram preparados. Os tubos Hungate foram então incubados (estático) a 37°C durante 16 h (cepa 751).
[000247] Cultivo de controle de veículo. Um tubo de Hungate contendo 8 ml de YCFA anaeróbico foi incubado (estático) a 37°C durante 16 h.
[000248] Administração do inóculo de bactérias ou controle de veículo. 400 ul de inóculo de bactéria cultivada ou controle de veículo foram administrados por dia por gavagem oral.
[000249] Sensibilização intranasal. Os camundongos foram anestesiados por injeção i. p. com 9,75 mg de xilasol e 48,75 mg de keta- sol por kg (Dr. E. Graeub AG, Berna, Suíça) e administrado com 15ug de HDM (Número de catálogo: XPB70D3A25, Número do lote: 231897, Greer Laboratories, Lenoir, NC, EUA) em um volume de 30 ul de PBS por nasal.
[000250] Preparação e administração de composto de controle positivo Dexametasona. O sal dissódico de 21-fosfato de dexameta- sona (Sigma-Aldrich, Número de catálogo D1159, N° de lote SLBD. 1030V) foi solvido em H2O e administrado aos animais numa dose de 3mg/kg num volume de 200ul por via oral nos dias indicados no protocolo de estudo acima.
[000251] Procedimento terminal. No dia 14, os animais foram sacrificados por injeção letal i.p. com pentabarbitol (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) imediatamente seguido por lavagem bronco- alveolar (BAL) em 500 ul de solução salina.
[000252] Medição de infiltrados celulares em BAL. As células foram isoladas a partir do fluido BAL e as contagens de células diferenciais foram realizadas com base em critérios morfológicos e citoquími- cos padrão.
[000253] Gráficos e análise estatística. Todos os gráficos foram gerados com Graphpad Prism Versão 6 e foi aplicado um ANOVA uni- direcional. Os resultados da análise estatística foram fornecidos com as tabelas de dados individuais. As barras de erro representam o Erro Padrão da Média (SEM). Resultados e análise
[000254] Os resultados dos experimentos são mostrados nas Figuras 1-9.
[000255] Não foi observada morbidade ou mortalidade nos camundongos tratados com a bactéria ou o veículo. Os dois controles, o tratamento do veículo (controle negativo) e o tratamento com dexameta- sona (controle positivo) comportaram-se como esperado, com eosinofi- lia e neutrofilia prejudicadas após o tratamento com dexametasona.
[000256] Os resultados mais importantes deste experimento são apresentados nas Figuras 6 e 7, que relatam o número total e porcentagem de neutrófilos detectados em lavagem bronquiolar após o desafio com HDM. A cepa 751 reduziu os neutrófilos totais e a proporção de neutrófilos em BAL em relação ao controle exclusivo do veículo.
Exemplo 2 - Eficácia de inóculos bacterianos em um modelo de camundongo de asma neutrofílica grave Sumário
[000257] Os camundongos foram administrados com composições compreendendo cepas bacterianas de acordo com a invenção e foram subsequentemente sensibilizados com administrações subcutâneas de extrato de ácaro de poeira doméstica (HDM) e desafiados com uma administração intranasal de HDM para modelar a resposta inflamatória de asma neutrofílica grave. A magnitude e as características da resposta inflamatória exibida por camundongos tratados com composições da invenção foram comparadas aos grupos de controle. Verificou-se que as composições da invenção aliviam a resposta inflamatória e, em particular, reduzem o recrutamento de neutrófilos, de uma maneira comparável ao controle positivo que compreende administra-ções de anticorpos anti-IL-17. Os dados indicam, portanto, que as composições da invenção podem ser úteis para tratar condições mediadas por IL-17 e Th17 tais como neutrofilia e asma. Cepa
[000258] 751: bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 Desenho do estudo
[000259] Grupos:
[000260] 1. Grupo de controle negativo. Tratamento com controle de veículo (por via oral).
[000261] 4. Tratamento com cepa de inóculo de bactérias terapêuti cas 751 (por via oral).
[000262] 7. Grupo de controle positivo. Tratamento anti-IL-17 (i. p.).
[000263] 8. Grupo de controle sem tratamento.
[000264] 9: Camundongos saudáveis (linha de base).
[000265] Número de camundongos por grupo (Grupo 1-8) = 5
[000266] Dia -14 ao dia 17: Administração diária do controle do veículo por via oral (Grupo 1).
[000267] Dia -14 ao dia 17: Administração diária de inóculo de bactérias terapêuticas por via oral (Grupo 2-6).
[000268] Dia 0: Sensibilização com HDM em CFA (s. c.)(Grupo 1-8).
[000269] Dia 7: Sensibilização com HDM em CFA (s. c.)(Grupo 1-8).
[000270] Dia 13, 15, 17: Administração do anticorpo neutralizante anti-IL-17 por i. p. (Grupo 7).
[000271] Dia 14, 15, 16, 17: Desafio com HDM em PBS 30ul por nasal (Grupo 1-8).
[000272] Dia 18: Sacrifício de todos os animais para análise. Pontos finais e análise:
[000273] No dia 14, os animais foram sacrificados por injeção letal intraperitoneal com pentabarbitol (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) imediatamente seguido por lavagem broncoalveolar (BAL). As células foram isoladas do líquido BAL e as contagens de células diferenciais realizadas (200 contagens/amostras de células).
Material e Métodos.
[000274] Camundongos. Os camundongos C57BL/6 de 7 semanas de idade foram comprados dos laboratórios Charles River e alocados aleatoriamente para gaiolas totalmente 5 camundongos por gaiola (gaiolas ventiladas provenientes da Indulab AG, Gams, Tipo gaiola Su- íca: “The SealsafeTM - IVC cage. Número do produto 1248L). As gaiolas foram rotuladas com número de estudo, número de grupo e data de início experimental. Os camundogos foram monitorados semanalmente e aclimatados às instalações durante 7 dias antes do início do estudo (Dia de Estudo -14). Os animais tinham 8 semanas de idade no Dia do Estudo -14. Água potável e alimentos estavam disponíveis ad libitum. O enriquecimento da gaiola estava presente. Os cuidados diários dos animais foram realizados de acordo com o número de licença de autorização local 2283. 1 (emitido e aprovado por: Service de la consommation et des affaires vétérinaires du Canton de Vaud). Água potável e alimentos estavam disponíveis ad libitum e a-tualizados uma vez por dia. O enriquecimento da gaiola estava presente. Os regulamentos de bem-estar dos animais foram observados como dados pelas autoridades oficiais da Suíça, de acordo com a ordem 455. 163 do FVO (Instituto Federal de Veterinária) sobre criação de animais de laboratório, produção de animais geneticamente modificados e métodos de experimentação animal.
[000275] Cultivo de inóculo de bactérias. Dentro de uma estação de trabalho estéril, um crio-frasco de bactéria foi descongelado por aquecimento em mão enluvada e ~ 0,7 ml de conteúdo injetado em um tubo Hungate (Número de gato, 1020471, Glasgeratebau Ochs, Bo- venden-Lenglern, Alemanha), contendo 8 ml de YCFA anaeróbico. Dois tubos por cepa geralmente foram preparados. Os tubos Hungate foram então incubados (estático) a 37°C durante 16 h (cepa 751).
[000276] Cultivo de controle de veículo. Um tubo de Hungate contendo 8 ml de YCFA anaeróbico foi incubado (estático) a 37°C durante 16 h.
[000277] Administração do inóculo de bactérias ou controle de veículo. 400 ul de inóculo de bactéria cultivada ou controle de veículo foram administrados por dia por gavagem oral.
[000278] Sensibilização com HDM. 50 μg de HDM (Número de catálogo: XPB70D3A25, Número do lote: 231897, Greer Laboratories, Lenoir, NC, EUA) em PBS foi emulsionada em igual volume de adjuvante completo de Freund (CFA Chondrex Inc. Washington, EUA) e administrados por via subcutânea em um volume de 200 μl, duas vezes em duas semanas em flancos opostos. Uma semana após a segunda imunização, os camundongos foram anestesiados por injeção i. p. com 9,75 mg de xilasol e 48,75 mg de ketasol por kg (Dr. E. Graeub AG, Berna, Suíça) e, em seguida, apresentou desafios intranasais de 15 μg de HDM em um volume de PBS de 30 ul em 4 dias consecutivos. A análise foi realizada um dia após o desafio final.
[000279] Preparação e administração de anticorpo anti-IL-17 an- ticamundongo de controle positivo. O anticorpo neutralizante anti- IL-17 foi obtido da Bio X Cell e foi armazenado a 4°C (Clone 17F3,Número de catálogo BE0173, Bio X Cell) e administrado por i. p. a uma dose de 12,5 mg/kg nos dias indicados no protocolo de estudo acima.
[000280] Procedimento terminal. No dia 18, os animais foram sacrificados por injeção letal i.p. com pentabarbitol (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) imediatamente seguido por lavagem bronco- alveolar (BAL) em 500 ul de solução salina.
[000281] Medição de infiltrados celulares em BAL. As células foram isoladas a partir do fluido BAL e as contagens de células diferenciais foram realizadas com base em critérios morfológicos e citoquími- cos padrão.
[000282] Gráficos e análise estatística. Todos os gráficos foram gerados com Graphpad Prism Versão 6 e foi aplicado um ANOVA uni- direcional. Os resultados da análise estatística são fornecidos com as tabelas de dados individuais. As barras de erro representam o Erro Padrão da Média (SEM). Resultados e análise
[000283] Os resultados do experimento são mostrados nas Figuras 10-18.
[000284] Não foi observada morbidade ou mortalidade nos camun- dongos tratados com a bactéria ou o veículo. Conforme mostrado nas Figuras 15 e 16, a cepa 751 foi altamente eficaz para aliviar a magnitude da resposta inflamatória neutrofílica. De fato, o tratamento com a cepa 751 mostrou resultados comparáveis ao tratamento com anticorpos anti-IL-17. Além disso, a cepa 751 reduziu os números de eosinófi- los em relação aos controles, como mostrado nas Figuras 11 e 12.
Exemplo 3 - Eficácia de inóculos bacterianos para tratar artrite em um modelo de camundongo de artrite induzida por colágeno tipo II Materiais e métodos Cepas
[000285] 751: bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 Culturas bacterianas
[000286] As culturas bacterianas foram cultivadas para administração em uma estação de trabalho anaeróbica (Don Whitley Scientific).
[000287] A cepa bacteriana #751 foi cultivada usando estoques de glicerol. Os estoques de glicerol foram armazenados a -80°C. Três vezes por semana, os estoques de glicerol foram descongelados à temperatura ambiente e estriados em placas de YCFA. Uma nova alíquota de glicerol foi usada em cada ocasião. As bactérias foram autorizadas a crescer em uma determinada placa por até 72 horas.
[000288] As soluções a serem administradas aos animais foram preparadas duas vezes ao dia com um intervalo de oito horas para os tratamentos da manhã (AM) e da tarde (PM). Uma colônia bacteriana foi colhida do prato estriado e transferida para um tubo contendo meio YCFA. A cepa bacteriana # 751 foi permitida a crescer durante 16 horas antes das administrações AM. As bactérias foram subcultivadas em 1% na mídia YCFA para as administrações PM. Os valores de DO foram registrados para cada cepa após as preparações de tratamento da manhã e da tarde. Modelo de camundongo de artrite induzida por colágeno tipo II
[000289] Os camundongos do sexo masculino adultos DBA/1 foram alocados aleatoriamente para grupos experimentais e permitiram acalmar-se durante duas semanas. No Dia 0, os animais foram administrados por injeção subcutânea com 100 microlitros de uma emulsão contendo 100 microgramas de colágeno tipo II (CII) em adjuvante incompleto de Freund suplementado com 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra. No Dia 21, os animais foram administrados por injeção subcutânea com uma emulsão de reforço contendo 100 μg de coláge- no tipo II em adjuvante incompleto de Freund.
[000290] Os tratamentos foram dados de acordo com o cronograma de administração abaixo. Do Dia -14 até o final do experimento no Dia 45, os animais foram pesados três vezes por semana. Do Dia 21 até o final do experimento, os animais foram classificados três vezes por semana para sinais clínicos de artrite para incluir inchaço das patas traseiras e dianteiras, articulações rádio-carpal (punho) e articulações tibio-tarsal (tornozelo).
[000291] No dia 45, os camundongos foram abatidos e amostras de sangue terminais foram retiradas para análise de citocinas.
[000292] No Dia 14, Dia 0 e Dia 45, amostras fecais foram coletadas para análise microbiológica, imediatamente congeladas instantaneamente e armazenadas a -80°C.
[000293] O modelo de camundongo da artrite induzida por colágeno (CIA) é um modelo de camundongo bem estabelecido para a artrite reumatoide [XLVI]. A imunização com CII causa uma patogênese que inclui várias características patológicas importantes da artrite reuma- toide, incluindo hiperplasia sinovial, infiltração de células mononuclea- res e degradação da cartilagem. Significativamente, o desenvolvimento da CIA é mediado por células Th17 através da secreção de IL-17A [XLVII]. A resposta imune subjacente ao modelo de artrite é reforçada pelo uso do adjuvante de Freund suplementado com Mycobacterium tuberculosis.
[000294] No Dia 21, foram coletados baços de três animais satélites em cada grupo. As células foram cultivadas durante 72 horas na presença ou ausência de colágeno tipo II. Citocinas, incluindo TNF-α, IL- 6, IFN-y, IL-4, IL-10 e IL-17, foram quantificadas nos sobrenadantes da cultura e no soro terminal por Luminex. A proliferação celular foi quantificada utilizando um método de incorporação de timidina tritiada. Grupos de tratamento e doses
[000295] Todos os grupos foram n = 15 (n = 12 para o grupo de estudo principal e n = 3 para grupos de satélites)
[000296] O veículo usado para os bioterapêuticos foi o meio de extrato de levedura-ácidos graxos casítonos (YCFA). Grupo Dose Administração Indução da doença Via Regime 1 Veículo 5 ml/kg PO BID: Dia 14 - Final Dia 0: Colá- geno/CFA, uma vez, SC Dia 21: Colá- geno/IFA, uma vez, SC 2 Bioterapêutica #751 5 ml/kg PO BID: Dia 14 - Final PO: gavagem oral SC: injeção subcutânea, BID: duas vezes ao dia, CFA: adjuvante de Freund completo. Pesos corporais
[000297] Do Dia -14 até o final do experimento, os animais foram pesados três vezes por semana. Os dados foram representados graficamente (Média ± SEM). Observações clínicas não específicas
[000298] Do Dia -14 até o final do experimento, os animais foram verificados diariamente para sinais clínicos não específicos para incluir pos- tura anormal (encurvada), condição de revestimento anormal (piloere- ção) e níveis anormais de atividade (atividade reduzida ou aumentada). Observações clínicas
[000299] Do Dia 21 até o final do experimento no Dia 45, os animais foram classificados três vezes por semana para sinais clínicos de artrite para incluir inchaço das patas traseiras e dianteiras, articulações rádio-carpal (punho) e articulações tibio-tarsal (tornozelo). Cada membro foi marcado usando a seguinte escala: (0) normal, (1) inchaço leve, (2) inchaço brando, (3) inchaço moderado e (4) inchaço severo. Um resultado clínico foi calculado adicionando cada pontuação de membro. O máximo de pontuação clínica possível para um animal foi de (16). Animais com uma pontuação igual a (12) em duas ocasiões consecutivas e animais com uma pontuação maior que (12) em qualquer ocasião foram abatidos. Os dados foram representados graficamente (Média ± SEM). Análise da proliferação celular
[000300] No dia 21, três animais de satélite por grupo foram abatidos e os baços foram dissecados. As células do baço foram cultivadas durante 72 horas na presença ou ausência de colágeno tipo II. Após 72 horas, as células foram pulsadas durante a noite na presença de timi- dina tritiada. A proliferação celular foi quantificada pela medição da incorporação de timidina. Os dados foram representados graficamente (Média ± SEM). Os sobrenadantes foram retirados e testados quanto à presença de citocinas chave. Análise de citocinas
[000301] Os sobrenadantes terminais das culturas de células de baço foram testados para quantificar TNF-α, IL-6, IFN-y, IL-4, IL-10 e IL-17 por Luminex. Os dados foram representados graficamente (Média ± SEM). Análise microbiológica
[000302] No Dia -14, Dia 0 e Dia 45, amostras fecais foram coletadas de cada animal, imediatamente congeladas instantaneamente e armazenadas a -80°C. O Caeca (incluindo o conteúdo) foi instantaneamente congelado e armazenado a -80°C. Um teste de identificação bacte- riana foi realizado diariamente pelo revestimento das bactérias. Histopatologia
[000303] No final do experimento, as patas traseiras foram armazenadas em fixador de tecidos. As amostras foram transferidas para a solução de descalcificação. As amostras de tecido foram processadas, seccionadas e coradas com Hematoxilina e Eosina. As seções foram classificadas por um histopatologista qualificado, cego ao desenho experimental, por sinais de artrite para incluir inflamação, lesão da cartilagem articular e danos ao osso metafisário subjacente. Foi utilizado um sistema de pontuação detalhado (ver abaixo). Os dados foram representados graficamente (Média ± SEM). Os dados em bruto e analisados foram fornecidos, bem como fotos representativas. Tabela 1: Sistema de pontuação histopatológica.
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Resultados e análise Sobrevida e observações clínicas não específicas
[000304] Alguns animais foram retirados antes do final agendado do estudo devido à gravidade dos sinais clínicos de artrite ou devido à gravidade das observações clínicas não específicas.
[000305] Três animais foram abatidos ou encontrados mortos ou abatidos durante o período de pré-tratamento (Dia -14 a Dia 0): um animal no grupo 1 (animal tratado, animal chegou do fornecedor com pata quebrada e foi abatido) e dois animais no grupo 2 (tratamento bio- terapêutico #751, possível dose pulmonar no primeiro dia de pré- tratamento e sinais clínicos pós-dose no segundo dia de pré- tratamento).
[000306] Oito animais foram abatidos devido à gravidade dos sinais clínicos de artrite: Cinco animais no Grupo 1 (tratados com veículo) e três animais no Grupo 2 (tratados com bioterapêutica #751).
[000307] Quatro animais foram abatidos devido à gravidade dos sinais clínicos não específicos, incluindo a postura anormal (encurvada), condição de revestimento anormal (piloereção), níveis anormais de atividade (atividade reduzida): três animais no Grupo 1 (tratado com veículo) e um animal no Grupo 2 (tratamento bioterapêutico #751). Pesos corporais
[000308] Os dados de peso corporal registrados a partir do Dia -14 até o Dia 0 e expressos como percentagem dos pesos corporais ini- ciais (Dia -14) foram analisados por ANOVA bidirecional, seguido do pós-teste de Dunnett para comparações múltiplas com o Dia -14 então para comparação múltipla com o grupo tratado com veículo. Os dados são apresentados na Figura 19. Os dados de animais retirados antes do final programado do experimento foram excluídos das análises.
[000309] Quando comparado ao Dia -14, as administrações duas vezes por dia por gavagem oral induziram uma perda significativa de peso corporal no grupo tratado com veículo no Dia -9 e Dia -7.
[000310] Os pesos corporais medidos entre o Dia -14 e o Dia -1 nos grupos tratados com bioterapêuticos não diferiram dos pesos corporais medidos no grupo tratado com veículo em qualquer dia.
[000311] Os dados de peso corporal registrados a partir do Dia 0 até o Dia 28 e expressos como percentagem dos pesos corporais iniciais (Dia -0) foram analisados por ANOVA bidirecional, seguido do pós- teste de Dunnett para comparações múltiplas com o Dia -0 no grupo de veículo então para comparação múltipla com o grupo tratado com veículo. Os dados são apresentados na Figura 20. Os dados de animais retirados antes do final programado do experimento e de animais de satélite foram excluídos das análises. Os dados do Dia 28, Dia 35 e Dia 42 foram analisados por ANOVA unidirecional seguido do pós- teste de Dunnett para comparações múltiplas ao grupo tratado com veículo.
[000312] O início de sinais clínicos de artrite foi associado a uma perda significativa de peso corporal no Dia 26 e no Dia 28 (p <0,0001) quando comparado ao dia 0 no grupo tratado com veículo.
[000313] Não houve diferença significativa entre os grupos experimentais no Dia 35 ou no Dia 42. Observações clínicas
[000314] Os dados de pontuação clínica foram analisados por ANO- VA de dois sentidos, seguido do pós-teste de Dunnett para compara- ções múltiplas entre os dias no grupo tratado com o veículo, em seguida, para comparações múltiplas entre grupos experimentais e o grupo tratado com veículo a cada dia. Os dados são apresentados na Figura 21. Os dados registrados dos animais retirados antes do final do experimento foram excluídos da análise. Quando os animais foram abatidos devido à gravidade dos sinais clínicos de artrite, a última pontuação registrada foi relatada nos dias seguintes e utilizado nas análises estatísticas.
[000315] Observou-se um aumento significativo das pontuações clínicas no grupo tratado com veículo do dia 28 até o Dia 45 (p <0,0001) quando comparado ao Dia 21.
[000316] O Bioterapêutico #751 induziu uma redução das pontuações clínicas quando comparado ao grupo tratado com veículo do Dia 31 até o Dia 45, embora a diferença não tenha sido significativa. Análise da proliferação celular
[000317] Para validar o ensaio, os esplenócitos foram cultivados na presença de anti-CD3 e anti-CD28 solúveis (anti-CD3/CD28) como estímulos de controle positivos para confirmar o potencial proliferativo das células.
[000318] Foram observadas fortes respostas proliferativas a anti- CD3 CD28 em todos os grupos experimentais, mostrando células saudáveis, viáveis e capazes de responder a sinais de ativação.
[000319] Para testar a resposta proliferativa na presença de coláge- no II (CII), os esplenócitos foram cultivados na presença de CII a 50 μg/ml. A resposta proliferativa dos esplenócitos ao CII foi analisada por ANOVA de dois sentidos, seguida do pós-teste de Sydak para comparações múltiplas entre esplenócitos não estimulados e estimulados com CII e ANOVA unidirecional seguido pelo pós-teste de Dunnett para comparação de resposta estimulada por CII em diferentes grupos experimentais com o grupo tratado com veículo. Os dados são apre- sentados na Figura 22.
[000320] O CII induziu um aumento altamente significativo de incorporação de 3H-timidina (cpm) quando comparada aos esplenócitos não estimulados no grupo tratado com veículo (p <0,0001).
[000321] Os grupos tratados com bioterapêutico #751 demonstraram níveis significativamente mais baixos de proliferação de esplenócitos induzidos por CII do que o grupo tratado com veículo. Níveis de citocinas em sobrenadantes de cultura de tecidos
[000322] Os níveis de cada citocina foram medidos em sobrenadan- tes de cultura de tecidos derivados de culturas estimuladas anti- CD3/CD28 por análise de luminex. Estes mostraram respostas robustas para todas as citocinas medidas (os níveis médios no grupo de veículo foram os seguintes: IL-4 = 6,406 pg/ml; IL-6 = 306 pg/ml; IL-10 = 10,987 pg/ml; IL-17A = 11,447 pg/ml; IFN-Y = 15,581 pg/ml; TNF-α = 76 pg/ml).
[000323] As seções a seguir resumem os dados obtidos das culturas estimuladas com Colágeno II. Quando aplicável, as análises estatísticas das diferenças entre os níveis de citocinas nos sobrenadantes de esplenócitos não estimulados e estimulados por CII foram conduzidas utilizando ANOVA bidirecional seguidas do pós-teste de Sidak para comparações múltiplas, enquanto a ANOVA unidirecional seguida pelo pós-teste de Dunnett foi utilizada para comparação de resposta estimulada por CII em grupos tratados com bioterapêutico com o grupo tratado com veículo. Não houve diferença significativa nos níveis de citocinas entre os grupos em ambos os casos. Isto é provavelmente devido ao pequeno tamanho de amostra usado (n = 3).
[000324] A fim de apresentar mais precisamente a distribuição dos dados para as citocinas com disseminação substancial dos dados, estes são apresentados como gráficos de dispersão.
[000325] As médias de grupo de IL-4 em sobrenadantes de cultura de tecidos após a estimulação com CII foram <5pg/ml. Estas não são consideradas biologicamente significativas e não estão incluídas aqui. As médias de grupo de TNF-α em sobrenadantes de cultura de tecidos após a estimulação com colágeno foram abaixo do limite de quantificação. Níveis de sobrenadante de IFN-Y (Figura 23)
[000326] Junto com IL-17, o IFN-Y é a principal doença de condução de citocinas no modelo da CIA. O gráfico de dispersão na Figura 23 demonstra os níveis de IFN-y após a estimulação do CII, sendo a mediana do grupo maior para o grupo tratado com o veículo em comparação com o bioterapêutico. O resultado anexo do mesmo sujeito do grupo 2 é responsável pela maior mediana neste grupo para IFN-y e IL-10. Níveis de sobrenadante de IL-17A (Figura 24)
[000327] Os níveis de IL-17A foram de 50pg/ml em culturas estimuladas por CII para o grupo tratado com veículo. Os níveis desta citoci- na parecem ser menores no grupo bioterapêutico em comparação com o tratado com veículo. Níveis de sobrenadante de IL-10 (Figura 25)
[000328] Os níveis de IL-10 no grupo tratado com veículo foram de 13 pg/ml e 2,1 pg/ml para culturas de controle estimuladas por CII e controle de meio, respectivamente. Níveis mais elevados de IL-10 (que é uma citocina anti-inflamatória) para o grupo tratado com veículo podem ser esperados porque a inflamação e a indução de citocinas pró- inflamatórias podem ser acompanhadas por um mecanismo de feedback anti-inflamatório. Níveis de sobrenadante de IL-6 (Figura 26)
[000329] As citocinas inflamatórias tais como a IL-6 e TNF-α não são tipicamente produzidas a níveis elevados em culturas anti-CII. No entanto, seus níveis podem ser alterados como resultado da modulação imunológica. Os níveis de IL-6 em culturas estimuladas por CII foram modestos, atingindo 10pg/ml. Embora maiores do que nas culturas de controle de meio, essas diferenças eram muito pequenas para fornecer razões para a realização de análises estatísticas. Análise microbiológica
[000330] O crescimento bacteriano foi confirmado medindo a densidade óptica a 600 nm utilizando um espectrofotômetro. A identidade bacteriana foi confirmada através da comparação de imagens de placas estriadas para imagens de referência.
[000331] Seguindo o método de preparação bacteriana melhorado, doses consistentes de cepa bacteriana foram administradas a partir do Dia -2 e do Dia -3 como indicado pelos valores elevados de DO medidos.
[000332] As amostras fecais foram coletadas e congeladas instantaneamente no Dia 14, Dia 0 e no término. Histopatologia
[000333] Os resultados da histopatologia são mostrados nas Figuras 66-70. Como esperado para este modelo, a variabilidade intraindividual e interindividual foi observada em termos de presença/ausência de artrite ou a gravidade da alteração presente.
[000334] A natureza da patologia era conforme o esperado para este modelo, com uma extensa inflamação crônica e crônica de sinóvia e bursa que se estende para envolver os tecidos moles peri-articulares (músculo, tecido adiposo, colágeno dérmico). Nas articulações mais severamente afetadas, houve degeneração e perda de cartilagem articular com detritos intra-articulares e inflamação e ruptura da estrutura articular e óssea por fibrose e inflamação.
[000335] A incidência de alterações histopatológicas foi: veículo - 80% (16/20); Bioterapêutico #751 - 45% (9/20). O tratamento com Bio- terapêutico #751 reduziu a incidência de pontuação histopatológica em membros traseiros do camundongo quando comparado ao grupo tratado com veículo (ver Figuras 66-69). As pontuações de histopatologia foram analisadas por ANOVA unidirecional para dados não paramétricos (teste de Kruskal-Wallis), seguido do pós-teste de Dunn para comparações múltiplas ao grupo tratado com veículo. O Bioterapêutico #751 induziu uma redução significativa das pontuações de inflamação articular observadas em histopatologia quando comparado ao grupo tratado com veículo (p <0,01). O Bioterapêutico #751 induziu uma redução significativa das pontuaões de dano da cartilagem observadas em histopatologia quando comparado ao grupo tratado com veículo (p <0,001). O Bioterapêutico #751 induziu uma redução significativa das pontuações de dano ósseo observadas em histopatologia quando comparado ao grupo tratado com veículo (p <0,01). O Bioterapêutico #751 induziu uma redução significativa das pontuações de histopato- logia total quando comparado ao grupo tratado com veículo (p <0,001). Sumário
[000336] Pontuações clínicas aumentadas foram observadas a partir do Dia 28 após a primeira administração de colágeno tipo II, como esperado neste modelo de artrite em camundongos DBA/1. O Biotera- pêutico #751 mostrou-se eficaz no tratamento da artrite neste modelo e o Bioterapêutico #751 foi eficaz para reduzir a gravidade das pontuações clínicas. O Bioterapêutico #751 também foi eficaz para reduzir a doença patológica nas articulações, como demonstrado na análise his- topatológica.
[000337] As respostas de reparação proliferativa ao colágeno II foram observadas em culturas de esplenócitos de todos os grupos experimentais. A resposta específica ao colágeno foi significativamente reduzida após o tratamento com bioterapêutico #751 (Grupo 2).
[000338] A maioria das citocinas de células T testadas apresentou aumentos detectáveis entre os controles estimulados pelo colágeno II e os controles de meio no grupo tratado com veículo. Estes aumentos não foram tão óbvios no grupo tratado com bioterapêutico. Isto apoia amplamente as respostas de reparação proliferativa ao colágeno II descrito acima.
[000339] Houve evidências de supressão do eixo Th1/Th17, que é a resposta patogênica neste modelo e na RA humana. A correlação de níveis reduzidos de citocinas com proliferação reduzida é sugestiva de modulação imune. Não houve evidência de que essa modulação resultasse em níveis melhorados de IL-4 associada a Th2 ou com aumentos na citocina de modulação imune, IL-10. Exemplo 4 - Análise adicional do efeito de inóculos bacterianos no modelo de camundongo de asma induzida por ácaros da poeira doméstica
[000340] Os camundongos testados no Exemplo 1 foram submetidos à análises adicionais para caracterizar ainda mais o efeito das composições da invenção na resposta inflamatória de asma alérgica. Materiais e métodos
[000341] Remoção de sangue e preparação de soro no dia 14. Amostras de sangue de animais foram coletadas por punção cardíaca. O soro foi isolado da amostra de sangue por centrifugação durante 5 min a 14. 000 g e armazenado a -20°C.
[000342] Remoção de órgãos no dia 14. Coleção do lóbulo do pulmão esquerdo em formalina para análise histológica de seguimento. Coleção dos lóbulos pulmonares direito (todos os lóbulos remanescentes) e remoção do soro para congelamento instantâneo e análise subsequente. O fluido BAL restante foi congelado para análise subsequente. Medição dos níveis de anticorpos no soro e no fluido BAL
[000343] Produção de anticorpos IgG1 específicos de acáros da poeira doméstica (HDM) e IgE total foi medida no BAL e no soro por meio de ensaio ELISA. Isolamento da análise pulmonar e histológica
[000344] Os lóbulos do pulmão esquerdo foram fixados em formalina, seguido de incorporação em parafina, seccionamento e coloração com hematoxilina e eosina e PAS. A pontuação histológica subsequente foi realizada cega como se segue: Cinco campos de visão aleatórios por amostra foram marcados para inflamação (infiltração peribronquial e infiltração perivascular) e produção de muco. A infiltração inflamatória foi avaliada com o seguinte sistema de classificação:
[000345] 0 - normal
[000346] 1 - infiltrados inflamatórios brandos
[000347] 2 - infiltrados inflamatórios moderados
[000348] 3 - infiltrados inflamatórios marcados
[000349] 4 - infiltrados inflamatórios graves
[000350] 5 - infiltrados inflamatórios muito graves
[000351] Em cada campo de visão, as vias aéreas foram medidas em tamanho e o número de células mucosas foi quantificado/ um. Medição de mediadores inflamatórios no tecido pulmonar
[000352] Os lóbulos do pulmão direito (todos os lóbulos remanescentes) isolados para a quantificação de mediadores inflamatórios foram instantaneamente congelados para medição subsequente de CCL11, IFN-gama, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-4, IL-5, IL-9, IL-17A, CXCL1, CCL3, CXCL2 e CCL5 por ensaio multiplex comercialmente disponível (Merck-Millipore). A análise foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Resultados e análise
[000353] Os resultados dos experimentos são mostrados nas Figuras 28-46.
[000354] Em apoio dos achados descritos no Exemplo 1, a análise dos infiltrados celulares no tecido pulmonar de camundongos tratados com a cepa 751 mostrou uma redução notável e estatisticamente significativa noa pontuação de inflamação média (ver Figuras 32 e 34).
[000355] Os níveis de anticorpo no fluido BAL e soro foram analisados (ver Figuras 28-31). Não foi observado efeito claro do tratamento bacteriano nos níveis séricos de anticorpos. Isso pode refletir uma falha no experimento, porque a disseminação de dados e as barras de erro para cada tratamento são grandes e os controles positivos e negativos não parecem se comportar como seria esperado. Além disso, os níveis de anticorpos séricos basais poderiam ter ocultado quaisquer alterações.
[000356] Da mesma forma, não foi observado efeito claro do tratamento bacteriano sobre os níveis de citocinas no tecido pulmonar (ver Figuras 36-46). Novamente, isso pode refletir uma falha no experimento, porque a disseminação de dados e as barras de erro para cada tratamento são grandes e os controles positivos e negativos não parecem se comportar como seria esperado. Também é possível que o mecanismo de ação envolvido influencie as respostas anteriores de citoci- nas que já não eram detectáveis no dia 4 após o desafio final das vias aéreas por HDM. Alguns cuidados devem ser tomados ao interpretar os dados de citocinas no presente estudo, devido à variabilidade nos níveis detectados. Esta variabilidade poderia, em parte, ser explicada pelo fato de que o tecido pulmonar foi separado para as diferentes análises e, portanto, um lóbulo pulmonar pode não ter sido totalmente representativo ou comparável ao mesmo lóbulo em outros camundongos devido à distribuição irregular da inflamação. Exemplo 5 - Análise adicional do efeito de inóculos bacterianos no modelo de camundongo de asma neutrofílica grave
[000357] Os camundongos testados no Exemplo 2 foram submetidos a análises adicionais para caracterizar ainda mais o efeito das composições da invenção sobre a resposta neutrofílica associada à asma grave. Materiais e métodos
[000358] Remoção de órgãos no dia 18. Coleção do lóbulo do pulmão esquerdo em formalina para análise histológica de seguimento. Coleção dos lóbulos pulmonares direito (todos os lóbulos remanescentes) e remoção do soro para congelamento instantâneo e análise subsequente. O fluido BAL restante foi congelado para análise subsequente.
[000359] Medição de mediadores inflamatórios no tecido pulmonar (análise subsequente). Os lóbulos pulmonares direitos (todos os lóbulos remanescentes) isolados para quantificação de mediadores inflamatórios foram congelados instantaneamente para medição subsequente de IFN-gama, IL-1 alfa, IL-1 beta, CXCL1, CCL3, CXCL2, CCL5, IL-17A, TNF-alfa, IL-17F, IL-23 e IL-33 por ensaio multiplex comercialmente disponível (Merck-Millipore). A análise foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.
[000360] Medição dos níveis de anticorpos no soro e no fluido BAL (análise subsequente). A produção de anticorpos IgG1 e IgG2a específicos para o ácaro da poeira doméstica(HDM) foi medida no BAL e no soro por meio de ensaio ELISA.
[000361] Isolamento da análise pulmonar e histológica (análise subsequente). Os lóbulos do pulmão esquerdo foram fixados em formalina, seguido de incorporação em parafina, seccionamento e coloração com hematoxilina e eosina e PAS. A pontuação histológica subsequente foi realizada cega como se segue: Cinco campos de visão aleatórios por amostra foram marcados para inflamação (infiltração peribronquial e infiltração perivascular) e produção de muco. A infiltração inflamatória foi avaliada com o seguinte sistema de classificação:
[000362] 0 - normal
[000363] 1 - infiltrados inflamatórios brandos
[000364] 2 - infiltrados inflamatórios moderados
[000365] 3 - infiltrados inflamatórios marcados
[000366] 4 - infiltrados inflamatórios graves
[000367] 5 - infiltrados inflamatórios muito graves Resultados e análise
[000368] Os resultados dos experimentos são mostrados nas Figuras 47-64.
[000369] Uma análise posterior dos níveis de anticorpos revelou que a eficácia da cepa bacteriana 751 também se refletiu nos níveis de IgG1 específicos de HDM reduzidos no fluido e no soro de BAL (ver Figuras 47 e 49). Conclusões firmes sobre um efeito nos níveis de IgG2a não podem ser desenhadas. Em geral, os dados da análise de anticorpos sugerem uma redução relacionada a uma resposta inflamatória reduzida geral, em oposição a um efeito seletivo na troca de isoti- po de anticorpos.
[000370] A análise histológica suportou as contagens de células diferenciais do fluido BAL, mostrando um infiltrado celular reduzido em camundongos tratados com a Cepa 751 (ver Figuras 51-53).
[000371] Em relação aos níveis de citocinas, como para o Exemplo 4, a disseminação de dados e as barras de erro para cada tratamento são grandes e os controles positivos e negativos não parecem ter se comportado como necessariamente seria esperado. Também é possível que o mecanismo de ação envolva influenciar as respostas anteriores de citocinas que já não eram detectáveis no dia 4 após o desafio final das vias aéreas por HDM. Alguns cuidados devem ser tomados ao interpretar os dados de citocinas no presente estudo, devido à variabilidade nos níveis detectados. Esta variabilidade poderia, em parte, ser explicada pelo fato de que o tecido pulmonar foi separado para as diferentes análises e, portanto, um lóbulo pulmonar pode não ter sido totalmente representativo ou comparável ao mesmo lóbulo em outros camundongos devido à distribuição irregular da inflamação. Apesar desta variabilidade, mostrou-se um efeito anti-inflamatório claro nos níveis de citocinas para a cepa 751, e o controle positivo anti-IL-17 Ab geralmente se comportou como esperado.
[000372] Com as ressalvas acima, os dados nas Figuras 56, 58, 59, 61 e 63 sugerem que o tratamento com as cepas bacterianas da invenção, e em particular a cepa 751, pode conseguir uma redução nos níveis de IL-1b, IFNg, RANTES, MIP-1a e KC (o ortólogo do camundongo de IL-8 humana), que pode ser indicativo de um mecanismo de ação relacionado a influências na liberação de quimiocinas (e, portanto, recrutamento de células) por células estromais ou imunes inatas. Essas citocinas são parte da via Th17. Tomando este conjunto de dados em conjunto, pode-se concluir claramente que a Cepa 751 foi al-tamente eficaz na proteção de camundongos contra a inflamação neste modelo de camundongo de asma neutrofílica grave.
Exemplo 6 - Eficácia dos inóculos bacterianos em um modelo de esclerose múltipla do camundongo Sumário
[000373] Os camundongos foram administrados com composições compreendendo cepas bacterianas de acordo com a invenção e os camundongos foram subsequentemente imunizados com glicoproteína de oligodendrócitos de mielina para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE). A EAE é o modelo experimental mais utilizado para a esclerose múltipla humana. Verificou-se que as composições da invenção têm um efeito marcante na incidência da doença e na gravidade da doença. Cepa
[000374] 751: bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 Desenho do estudo
[000375] Grupos:
[000376] 1. Grupo de controle negativo. Tratamento com controle de veículo (por via oral).
[000377] 4. Tratamento com cepa de inóculo de bactérias terapêuti cas 751 (por via oral).
[000378] 9. Grupo de controle positivo. Tratamento com Dexameta- sona (i. p.).
[000379] 10. Grupo de controle sem tratamento.
[000380] Número de camundongos por grupo = 10
[000381] Dias -14 a dia 27: Administração diária do controle do veículo por via oral (Grupo 1).
[000382] Dias -14 a dia 27: Administração diária de inóculo de bactérias terapêuticas por via oral (Grupo 4).
[000383] Dias 0 a 28: administração de Dexametasona (i. p.) três vezes por semana (Grupo 9)
[000384] Dia 0: MOG35-55 (glicoproteína oligodendrocitária de mieli- na - 2 mg/ml) e CFA (MTB 2 mg/ml) foram misturados 1: 1 resultando em soluções de 1 mg/ml. 100 μl da mistura peptídeo-CFA foram injetados subcutaneamente em cada pata traseira. Administração de toxina pertussis intraperitonealmente (300 ng).
[000385] Dia 1: Administração de toxina pertussis intraperitoneal- mente (300 ng).
[000386] Dias 7 em diante: Medição da incidência e peso da doença três vezes por semana. Pontos finais e análise
[000387] Os camundongos foram analisados quanto à incidência da doença e à gravidade da doença três vezes por semana. A pontuação foi realizada cega. A gravidade da doença foi avaliada usando uma pontuação clínica que varia de 0 a 5, com 5 indicando um camundongo morto (ver o sistema de pontuação clínica abaixo). Monitoramento
[000388] Nos dias indicados, os camundongos foram pesados e ob- servados para a pontuação de atividade da doença e a incidência da doença.
[000389] Observações da pontuação da atividade da doença:
[000390] 0 - Nenhuma mudança óbvia na função motora em comparação com camundongos não imunizados.
[000391] 0,5 - A ponta da cauda está mole.
[000392] 1,0 - Cauda mole.
[000393] 1,5 - Cauda mole e inibição da pata traseira
[000394] 2,0 - Cauda mole e fraqueza das patas traseiras.
[000395] OU - Existem sinais óbvios de inclinação de cabeça quando a caminhada é observada. O saldo é ruim.
[000396] 2,5 - Cauda mole e arrastando as patas traseiras.
[000397] - OU - Existe uma forte inclinação da cabeça que faz com que o camundongo ocasionalmente caia.
[000398] ras. 3,0 - Cauda mole e paralisia completa das patas trasei-
[000399] ras. 3,5 - Cauda mole e paralisia completa das patas trasei-
[000400] Além de: O camundongo estar se movendo em volta da gaiola, mas quando colocado em posição lateral, não consegue endireitar-se.
[000401] As patas traseiras estão juntas em um lado do corpo.
[000402] 4,0 - Cauda mole, paralisia completa da pata traseira e paralisia parcial da pata dianteira.
[000403] - O camundongo se move minimamente ao redor da gaiola, mas parece alerta e se alimentando
[000404] 4,5 - Paralisia completa da pata traseira e paralisia parci al da pata dianteira, sem movimento ao redor da gaiola.
[000405] O camundongo é imediatamente eutanizado e removido da gaiola.
[000406] 5,0 O camundongo é eutanizado devido a uma paralisia grave.
[000407] Quando um animal tem uma pontuação de atividade de doença igual ou mais que 1, considera-se que tem uma pontuação de incidência de doença positiva. Resultados
[000408] Os resultados do estudo são apresentados nas Figuras 71 e 72.
[000409] A indução de doenças nos grupos de controle negativo foi bem sucedida com altas pontuações mostradas pelo controle do veículo e pelo controle não tratado. O efeito do tratamento com a cepa 751 foi marcante e os camundongos tratados com a cepa 751 exibiram uma incidência de doença e gravidade da doença particularmente reduzida. De fato, a redução da incidência da doença e da gravidade da doença foi comparável ao grupo de controle positivo. Estes dados indicam que a cepa 751 pode ser útil para tratar ou prevenir a esclerose múltipla.
Exemplo 7 - Eficácia de inóculos bacterianos em modelos de câncer de camundongo Sumário
[000410] Este estudo testou a eficácia de composições compreendendo cepas bacterianas de acordo com a invenção em quatro modelos tumorais. Materiais
[000411] Substância de teste - Cepa bacteriana #MRX004 (cepa 751).
[000412] Substância de referência - anticorpo anti-CTLA-4 (clone: 9H10, catálogo: BE0131, isotipo: Syrian Hamster IgG1, Bioxcell).
[000413] Veículos de teste e de substâncias de referência - Meio de cultura bacteriana (extrato de levedura, Casitona, Meio de ácido graxo (YCFA)). Cada dia de injeção em camundongos, o anticorpo foi diluído com PBS (ref: BE14-516F, Lonza, França).
[000414] Doses de tratamento - Bactérias: 2x108 em 200 μL. O a- CTLA-4 foi injetado a 10 mg/kg/inj. Anti-CTLA-4 foi administrado num volume de dose de 10 mL/kg/adm (isto é, para um camundongo que pesa 20 g, serão administrados 200 μL de substância de teste) de acordo com o peso corporal mais recente de camundongos.
[000415] Vias de administração - O inóculo bacteriano foi administrado por gavagem oral (per os, PO) através de uma cânula. As cânulas foram descontaminadas todos os dias. Anti-CTLA-4 foi injetado na cavidade peritoneal de camundongos (Intraperitonealmente, IP).
[000416] Condições culturais de cepa bacteriana - As condições de cultura para a cepa bacteriana foram as seguintes:
[000417] • Pipetar 10 mL de YCFA (das garrafas de laboratório de E&O preparadas de 10 mL) em tubos Hungate
[000418] • Vedar os tubos e nivelar o CO2 usando uma entrada de seringa e sistema de exaustão
[000419] • Autoclavar os tubos Hungate
[000420] • Quando resfriado, inocular os tubos Hungate com 1 mL dos estoques de glicerol
[000421] • Colocar os tubos em uma incubadora estática de 37°C durante cerca de 16 horas.
[000422] • No dia seguinte, tirar 1 mL desta subcultura e inocular 10 mL de YCFA (tubos previamente congelados aquecidos novamente, todos em duplicado)
[000423] • Colocá-los em uma incubadora estática de 37°C durante 5 a 6h Linhagem celular de câncer e condições de cultura -
[000424] As linhagens celulares que foram usadas são detalhadas na tabela abaixo:
Figure img0004
[000425] A linhagem celular EMT-6 foi estabelecida a partir de um carcinoma mamário murino transplantável que surgiu em um camundongo BALB/cCRGL após a implantação de um nódulo alveolar mamário hiperplásico [XLVIII].
[000426] A linhagem celular LL/2 (LLC1) foi estabelecida a partir do pulmão de um camundongo C57BL com tumor resultante de uma implantação de carcinoma primário de pulmão de Lewis [XLIX].
[000427] A linhagem celular Hepa 1-6 é um derivado do hepatoma do camundongo BW7756 que surgiu em um camundongo C57/L [L].
[000428] Condições de cultura celular - Todas as linhagens celulares foram cultivadas como monocamadas a 37°C numa atmosfera umidificada (5% de CO2, 95% de ar). O meio de cultura e o suplemen- to estão indicados na tabela abaixo:
Figure img0005
[000429] Para uso experimental, as células tumorais aderentes foram separadas do frasco de cultura por um tratamento de 5 minutos com tripsina-verseno (ref: BE17-161E, Lonza), no meio de Hanks sem cálcio ou magnésio (ref: BE10-543F, Lonza) e neutralizado por adição de meio de cultura completo. As células foram contadas em um hemoci- tômetro e sua viabilidade será avaliada por 0,25% de teste de exclusão de azul de tripano. Uso de animais -
[000430] Os camundongos Balb/C (BALB/cByJ) fêmeas saudáveis, de peso e idade correspondentes, foram obtidos da CHARLES RIVER (L'Arbresles) para os experimentos do modelo EMT6.
[000431] Os camundongos C57BL/6 (C57BLl6J) fêmeas saudáveis, de peso e idade correspondentes, foram obtidos da CHARLES RIVER (L'Arbresles) para os experimentos do modelo LL/2 (LLC1) e Hepa1-6.
[000432] Os animais foram mantidos no estado de saúde SPF de acordo com as diretrizes da FELASA, e os procedimentos de habitação e procedimentos experimentais de acordo com o Regulamento Francês e Europeu e o Guia NRC para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório foram seguidos [LI,LII]. Os animais foram mantidos em salas de habitação sob condições ambientais controladas: Temperatura: 22 ± 2°C, umidade 55 ± 10%, fotoperíodo (12h luz/12h escuro), ar filtrado por HEPA, 15 trocas de ar por hora sem recirculação. Os invólucros de animais foram fornecidos com espaço estéril e adequado com material de leito, comida e água, enriquecimento ambiental e social (alojamento em grupo) como descrito: gaiolas de 900 cm2 (ref: verde, Tecniplast) em racks ventilados, leito Epicea (SAFE), 10 kGy de Alimentação irradiada (A04-10, SAFE), Alimentação completa para roedores imuno-competentes - Extrudado R/MH, água de garrafas de água. Projeto experimental e tratamentos Atividade antitumoral, Modelo EMT6
[000433] Cronograma de tratamento - O início da primeira dosagem foi considerado como D0. Em D0, os camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em grupos de 9/8 usando o software Vivo manager® (Biosystemes, Cou- ternon, França). Em D0, os camundongos receberam o veículo (meio de cultura) ou a cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxertados com células tumorais EMT-6 como descrito abaixo. Em D24, os camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos de anticorpos anti-CTLA-4.
[000434] O cronograma de tratamento está resumido na tabela abaixo:
Figure img0006
[000435] O monitoramento de animais foi realizado conforme descrito abaixo.
[000436] Indução de tumores EMT6 em animais - Em D14, os tumores foram induzidos por injeção subcutânea de 1x106 células EMT-6 em 200 μL de RPMI 1640 no flanco direito de camundongos.
[000437] Eutanásia - Cada camundongo foi eutanasiado quando atingiu um ponto final humano como descrito abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o início da dosagem. Atividade antitumoral, modelo LL/2 (LLC1)
[000438] Cronograma de tratamento- O início da primeira dosagem foi considerado como D0. Em D0, os camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em 7 grupos de 9/8 usando o software Vivo manager® (Biosystemes, Cou- ternon, França). Em D0, os camundongos irão receber o veículo (meio de cultura) ou a cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxertados com células tumorais LL/2 como descrito abaixo. Em D27, os camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos de anticorpos anti-CTLA-4.
[000439] O cronograma de tratamento está resumido na tabela abaixo:
Figure img0007
[000440] O monitoramento de animais foi realizado conforme descrito abaixo.
[000441] Indução de tumores LL/2 (LLC1) em animais - Em D14, os tumores foram induzidos por injeção subcutânea de 1x106 células LL/2 (LLC1) em 200 μL de RPMI 1640 no flanco direito de camundongos.
[000442] Eutanásia - Cada camundongo foi eutanasiado quando atingiu um ponto final humano como descrito abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o início da dosagem. Atividade antitumoral, modelo Hepa1-6
[000443] Cronograma de tratamento- O início da primeira dosagem foi considerado como D0. Em D0, os camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em 7 grupos de 9 usando o software Vivo manager® (Biosystemes, Couter- non, França). Em D0, os camundongos receberam o veículo (meio de cultura) ou a cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxertados com células tumorais Hepa 1-6 como descrito abaixo. Em D16, os camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos de anticorpos anti-CTLA-4.
[000444] O cronograma de tratamento está resumido na tabela abaixo:
Figure img0008
[000445] O monitoramento de animais foi realizado conforme descrito abaixo.
[000446] Indução ortotópica de células tumorais Hepa 1-6 em animais por injeção intraespecífica - Em D14, um milhão (1x106) de células de tumor Hepa 1-6 em 50 μL de meio RPMI 1640 foram transplantadas por injeção intraesplênica em camundongos. Resumidamente, uma pequena incisão de flanco subcostal esquerdo foi feita e o baço foi exteriorizado. O baço foi exposto em uma gaze estéril e foi injetado sob controle visual com a suspensão celular com uma agulha de calibre 27. Após a inoculação celular, o baço foi excisado.
[000447] Eutanásia - Cada camundongo foi eutanasiado quando atingiu um ponto final humano como descrito abaixo na seção, ou após um máximo de 6 semanas após o início da dosagem.
[000448] Avaliação do fardo tumoral na eutanásia - No momento do término, os fígados foram coletados e pesados. Monitoramento de animais
[000449] Monitoramento clínico - O comprimento e a largura do tumor foram medidos duas vezes por semana com calibradores e o volume do tumor foi estimado por esta fórmula [LIII]: Volume do tumor = largura2 x comprimento / 2
[000450] Pontos finais humanos [LIV]: Sinais de dor, sofrimento ou angústia: postura de dor, máscara facial de dor, comportamento; Tumor superior a 10% do peso corporal normal, mas não superior a 2000 mm3; Tumores que interferem com ambulação ou nutrição; Erupção ulcerada de tumor ou tecido; 20% de perda de peso corporal por 3 dias consecutivos; Condição corporal fraca, emaciação, caquexia, desidratação; Ausência prolongada de respostas voluntárias a estímulos externos; Respiração trabalhada rápida, anemia, hemorragia significativa; Sinais neurológicos: circular, convulsão, paralisia; Diminuição constante da temperatura corporal; Distensão abdominal.
[000451] Anestesia - Anestesia com gás isofurano foi utilizada para todos os procedimentos: cirurgia ou inoculação de tumor, injeções intravenosas, coleta de sangue. A anestesia com quetamina e xilazina foi utilizada para o procedimento cirúrgico de estereotaxia.
[000452] Analgesia - Carprofeno ou protocolo de analgesia de carprofeno/buprenorfina multimodal foram adaptados à gravidade do procedimento cirúrgico. Foram fornecidos cuidados não farmacológicos para todos os procedimentos dolorosos. Além disso, os cuidados farmacológicos que não interferem com os estudos (tratamento tópico) foram fornecidos por recomendação do veterinário assistente.
[000453] Eutanásia - A eutanásia de animais foi realizada por sobre- dosagem de anestesia com gás (Isoflurano), seguida de luxação cervical ou exsanguinação. Resultados Atividade antitumoral, Modelo EMT6
[000454] Os resultados são mostrados na Figura 73. O tratamento com a cepa bacteriana da invenção conduziu a uma redução clara no volume do tumor em relação aos dois controles negativos. O controle positivo também levou a uma redução no volume do tumor, como seria esperado. Atividade antitumoral, modelo LL/2 (LLC1)
[000455] Os resultados são mostrados na Figura 74. Os controles negativos e positivos não aparecem como seria esperado, porque o volume tumoral era maior nos camundongos tratados com controle positivo do que nos grupos controle negativos. No entanto, o volume tumoral nos camundongos tratados com a cepa bacteriana da invenção foi comparável ao grupo de controle positivo, o que é consistente com um efeito terapêutico útil. Atividade antitumoral, modelo Hepa1-6
[000456] Os resultados são mostrados na Figura 75. O controle negativo não tratado não aparece como seria esperado, porque o peso do fígado era menor neste grupo do que nos outros grupos. No entanto, o controle negativo do veículo e os grupos de controle positivo aparecem como seria esperado, porque os camundongos tratados com veículo sozinhos tinham fígados maiores que os camundongos tratados com anticorpos anti-CTLA4, refletindo uma maior carga de tumor no grupo de controle negativo do veículo. O tratamento com a cepa bacteriana da invenção levou a uma redução clara no peso do fígado (e, portanto, carga tumoral) em relação aos camundongos no grupo de controle negativo do veículo.
[000457] Estes dados indicam que a cepa 751/MRX004 pode ser útil para tratar ou prevenir o câncer e, em particular, para reduzir o volume do tumor nos cânceres de mama, pulmão e fígado.
Exemplo 8 - Anexo às células humanas em meio YCFA Sumário
[000458] O nível de ligação da cepa 751 e uma série de cepas Bifidobacterium breve para células humanas foram determinados em 3 pontos de tempo distintos em meio YCFA. As bactérias ligadas às células humanas foram ressuspensas em meio e a densidade óptica do meio foi então analisada: quanto maior a densidade óptica, maior o número de células bacterianas e, portanto, maior o nível de ligação das células bacterianas a células humanas. Verificou-se que a cepa 751 exibia uma menor ligação às células humanas em comparação com as cepas Bifidobacterium breve de referência. Resultados e análise
[000459] Os resultados do experimento são mostrados na Figura 76.
[000460] Conforme mostrado na Figura 76, as cepas Bifidobacterium breve mostram um alto nível de ligação às células humanas em todos os pontos de tempo. Por outro lado, a cepa 751 tem um nível de ligação drasticamente reduzido às células humanas. Portanto, a baixa adesão às células humanas da cepa 751 pode aumentar o efeito benéfico das composições da invenção em IL-17 ou na via Th17 e em doenças mediadas por IL-17 ou a via Th17. Exemplo 9 - Ensaio que detecta a produção de exopolissacarídeos Sumário
[000461] O nível de produção de exopolissacarídeos (EPS) pela cepa bacteriana da invenção (751) e uma série de cepas e Bifidobacterium breve foram analisados a 37°C por 48 horas e a 30°C por 72 horas. EPSs são polissacarídeos produzidos por certas bactérias que se ligam à superfície externa da célula bacteriana. O nível de EPSs na superfície das bactérias pode ser determinado usando um ensaio Vermelho Congo que se liga aos polissacarídeos. Uma maior intensidade da absorbância do Vermelho Congo indica uma maior concentra- ção de EPS na superfície das bactérias. Descobriu-se que a cepa bac- teriana da invenção produz e liga mais EPSs do que as cepas Bifidobacterium breve. Resultados e análise
[000462] Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 77.
[000463] Conforme mostrado na Figura 77, a cepa bacteriana da invenção mostrou uma maior absorbância do Vermelho Congo do que a cepa Bifidobacterium breve nas temperaturas e nos pontos de tempo. Portanto, a cepa da invenção exibe maior produção de EPS e um maior nível de EPSs extracelulares. À medida que os EPS permitem que as bactérias se liguem ao muco e às células epiteliais, a cepa bacteri- ana da invenção pode ser útil para competir com células patogênicas para sítios de ligação em células epiteliais e dentro de membranas mucosas. Assim, a cepa bacteriana da invenção pode ser útil para modular o microbioma e tratar uma série de doenças associadas ao microbioma. Exemplo 10 - Teste de estabilidade
[000464] Uma composição aqui descrita contendo pelo menos uma cepa bacteriana aqui descrita é armazenada num recipiente vedado em 25^C ou 4^C e o recipiente é colocado numa atmosfera com uma umidade relativa de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95%. Após 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da cepa bacteriana devem permanecer como medido em unidades formadoras de colônias determinadas por protocolos padrão. Exemplo 11 - Ensaio de produção de exopolissacarídeo ligado e liberado por MRX004
[000465] Para extração de EPS, o MRX004 foi cultivado em 10 ml de YCFA até atingir a fase exponencial tardia, quando as células bacteri- anas e os sobrenadantes foram separados por centrifugação. As célu- las foram lavadas uma vez com PBS para remover qualquer meio de cultura restante. O EPS (EPS-R) segregado ou liberado foi precipitado a partir de sobrenadantes de cultura por tratamento com 100% de eta- nol gelado (durante a noite a 4°C com agitação suave). Para extrair EPS capsular ou ligado (EPS-B), as células foram incubadas com EDTA 0,05 M (durante a noite a 4°C com agitação suave) e os sobre- nadantes deste tratamento foram coletados e subsequentemente tratados com etanol 100% gelado (durante a noite a 4°C com agitação suave) para precipitar EPS-B. O EPS-B precipitado e o EPS-R foram sedimentados por centrifugação e foram deixados secar brevemente em uma capa laminar antes de serem ressuspensos em água Ultrapu- re estéril suficiente para obter uma solução uniforme. Para purificar ainda mais as amostras, elas foram dialisadas contra água Ultrapura estéril na razão de 1: 100 durante 48 horas com 3 alterações de tampão. EPS-B e EPS-R foram quantificados utilizando o método do ácido fenol-ácido sulfúrico utilizando a glicose como padrão. Com este ensaio, descobriu-se que MRX004 produz uma maior quantidade de EPS-R (115 μg) do que EPS-B (17 μg) (Figura 78). Exemplo 12 - Ensaio de fixação de MRX004 a células Caco-2
[000466] A fixação de MRX004 às células hospedeiras foi analisada usando um ensaio de cocultura in vitro com células epiteliais intestinais Caco-2. As células de Caco-2 foram semeadas a uma densidade de 1 x 10 bactérias foram cultivadas em 10 ml de YCFA até chegarem à fase exponencial tardia, quando foram sedimentadas, lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em meio de cultura celular sem antibiótico. A densidade bacteriana foi ajustada para obter uma multiplicidade aproximada de infecção (MOI) de 10: 1 (o que foi confirmado por plaqueamento em ágar YCFA usando o protocolo padrão WASP) e MRX004 foi coincubado com células Caco-2 em condições anaeróbi- cas aos 37°C durante 2 horas. O meio foi subsequentemente removido e as bactérias não ligadas foram removidas lavando células Caco-2 três vezes com PBS. As células Caco-2 ligadas a bactérias foram lisa- das e removidas do recipiente usando o tratamento com 0,1% de Triton X-100 e 50 μl de volumes de lisado diluído foram plaqueados em ágar de YCFA usando o WASP. A fixação foi calculada contando o número de bactérias recuperadas a partir do lisado e expressando isso como uma porcentagem das bactérias totais. Verificou-se que MRX004 exibia adesão de baixo nível (0,3% da cultura total) às células Caco-2 (Figura 79). Exemplo 13 - Caracterização da atividade enzimática
[000467] O sistema de teste do Índice de Perfil Analítico (API®) consiste em tiras que contêm testes bioquímicos miniaturizados que avaliam a atividade enzimática em espécies bacterianas. O MRX004 (cepa 751, a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380) foi caracterizado utilizando dois sistemas de teste API: Identificação rápida 32A - Este sistema foi projetado especificamente para espécies anaeróbicas e abrange testes de metabolismo de carboidratos, amino- ácidos e nitratos, bem como a atividade da fosfatase alcalina; e API® 50 CH - Este sistema testa a fermentação de 49 fontes de carboidratos e pode ser utilizado em conjunto com o meio API® CHL para análise de espécies anaeróbicas.
[000468] O teste rápido ID 32A foi realizado em colônias bacterianas de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as bactérias foram cultivadas em ágar YCFA durante 24 horas a 37°C numa estação de trabalho anaeróbica. As colônias foram removidas de placas usando um circuito de inoculação esterilizado de 5 μl e ressuspen- sas em uma ampola de 2 ml de meio de Suspensão API® até uma densidade aproximadamente equivalente à do padrão McFarland No. 4 ser obtida. Cinquenta e cinco microlitros de suspensão bacteriana foram adicionados a cada cúpula em uma tira Rapid ID 32A, e o teste de urease foi sobreposto com duas gotas de óleo mineral. As tiras foram cobertas com uma tampa de plástico e incubadas de forma aeróbica a 37°C durante 4 horas, após o que a lâmina inferior de cúpulas foi desenvolvida usando os seguintes reagentes: NIT: 1 gota cada de NIT1 e NIT2; IND: 1 gota de reagente de James; todos as cúpulas restantes: 1 gota de reagente FastBlue. As tiras foram incubadas à temperatura ambiente durante 5 minutos, após o que a cor de cada cúpula foi gravada e atribuída um valor negativo, intermediário positivo ou positivo.
[000469] Os resultados da análise Rapid ID 32A são mostrados na Figura 80. O MRX004 mostrou positivo para a fermentação de várias fontes de carboidratos, a saber, α-galactosidase e β-galactosidase, α- glicosidase e β-glicosidase, α-arabinose, manose e rafinose, bem como os aminoácidos arginina, prolina, fenilalanina, leucina, tirosina, gli- cina e histidina. Curiosamente, foram relatados papéis para alguns desses aminoácidos na asma. Por exemplo, o aumento das concentrações plasmáticas de fenilalanina e a histidina foram associadas com efeitos adversos na asma, incluindo inflamação aumentada, produção de histamina e hiper-capacidade de resposta das vias aéreas. Além disso, o metabolismo da arginina está implicado na patogênese da asma, uma vez que os níveis aumentados do metabolito da arginina L- ornitina foram relatados em pacientes pediátricos e a administração de inflamação atenuada com arginina em um modelo de asma in vivo. Com base nesses relatórios, é possível que o metabolismo de aminoá- cidos MRX004 possa estar envolvido nos efeitos antiasma desta cepa.
[000470] Foi realizada uma análise comparativa Rapid ID 32A entre MRX004 e quatro cepas do tipo B. breve, que são anotadas na Figura 80B como Bif Ref 1 (DSM 20091), Bif Ref 2 (DSM 20213), Bif Ref 6 (JCM 7017) e Bif Ref 7 (UCC2003). Esta análise demonstrou que a MRX004 foi a única cepa testada para fermentar a rafinose de polissa- carídeos, o que pode ser significativo, porque a rafinose está envolvida na produção de componentes bacterianos, como exopolissacarídeos, e a fermentação com rafinose também pode conferir efeitos sobre o hospedeiro, como o aumento de cecal butirato, aumento da proliferação gastrointestinal e perda de peso.
[000471] O teste API® 50 CH foi realizado para examinar o metabolismo de carboidratos em MRX004. De acordo com as instruções do fabricante, as bactérias foram cultivadas em 10 ml de caldo YCFA durante 16-18 horas a 37°C em uma estação de trabalho anaeróbica. Esta cultura foi diluída em 10 ml de meio CHL de API® de modo a obter uma densidade aproximadamente equivalente ao padrão McFarland No. 2 e 110 μl desta mistura foram utilizados para inocular cada cúpula em um conjunto de tiras de teste API® 50 CH. As tiras de teste foram incubadas em uma caixa de incubação umidificada a 37°C em uma estação de trabalho anaeróbica durante 48 horas, após isso a cor de cada cúpula foi registrada e atribuída um valor negativo, intermediário positivo, positivo ou duvidoso.
[000472] Usando API® 50, MRX004 testou positivo para a utilização das seguintes fontes de carboidratos: amidona (amido), amigdalina, arbutina, celobiose, esculina, galactose, gentiobiose, glicose, glicogê- nio, frutose, fucose, lactose, maltose, manose, manitol, melibiose, me- lezitose, metil α-D-glicopiranosideo, N-acetilglicosamina, ribose, sacarose (sucrose), salicina, sorbitol, trealose, turanose e xilitol. Esses resultados correlacionaram-se com aqueles obtidos para testes Rapid ID 32A na medida em que MRX004 demonstrou fermentação de galactose, glicose, manose e rafinose em ambos os sistemas de teste. Curiosamente, alguns substratos de carboidratos MRX004, nomeadamente galactose e frutose, podem estar implicados no mecanismo de ação desta cepa, com base nos efeitos reportados na literatura. A galactose α-1,3-galactose derivada de fontes de carne é um alérgeno conhecido e agente causador da anafilaxia, e os níveis de ingestão de frutose dietética estão correlacionados com o aumento da gravidade da asma. Juntos, ambos os conjuntos de dados API® para MRX004 sugerem que o metabolismo desta cepa pode desempenhar um papel nos seus efeitos antiasma. Exemplo 14 - Análise do genoma
[000473] Uma comparação do conteúdo do genoma da cepa MRX004 e as cepas de referência de B. breve, 1, 2, 6 e 7 foram realizados usando blastn como parte do pacote BLAST + 2. 3. 0 de programas. Uma pontuação máxima de corte de E-value de 10E-5 foi empregada ao longo da análise.
[000474] Foram identificados 333 genes (Tabela 1) que estão presentes no genoma da cepa MRX004, mas estão ausentes das cepas B. breve de referência 1 (DSM 20091), 2 (DSM 20213), 6 (JCM 7017) e 7 (UCC2003). Muitos dos genes listados na Tabela 1 são frequentemente observados como hipervariáveis entre cepas B. breve [LV]. Como esperado, as regiões de variabilidade incluem genes que codificam proteínas envolvidas no metabolismo e transporte de carboidratos, genes associados a fagos, elementos móveis, bem como 173 genes preditos para codificar proteínas ou genes de função desconhecida.
[000475] Genes que estão presentes em MRX004, mas ausentes das cepas de referência B. breve 1, 2, 6 e 7 estão listados na Tabela 1. Os genes que não estão destacados estão ausentes em mais de uma das quatro cepas de referência. O grande número de genes que estão presentes em MRX004, mas não estão presentes em numerosas cepas de referência B. breve sugerem que a MRX004 é distinta e/ou distinguível dessas cepas B. breve conhecidas. Os genes destacados com um sublinhado único estão presentes em MRX004, mas ausentes na cepa de referência B. breve 1. Os genes destacados com sublinhado duplo e em negrito estão presentes em MRX004, mas au- sentes na cepa de referência B. breve 2. Genes destacados com itálico estão presentes em MRX004, mas ausentes na cepa de referência B. breve 6. Uma pontuação máxima de corte de E-value de 10E-5 foi empregada para a análise blastn. Tabela 1
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Sequências SEQ ID NO: 1 (sequência de rRNA de 16S consenso para a cepa 751) GGGACAGGCTCAGGATGAACGCCGGCGGCGTGCT- TAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCATCGGGCTTTGCCTGG- TGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTG- CCCCATGCACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCG- GATGCTCCATCACACCGCATGGTGTGTTGGGAAAGCCTTTGCGG- CATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGATGGCGGGG- TAACGGCCCACCATGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGG- CGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCC- TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAG- CCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGG- TTGTAAACCTCTTTTGTTAGGGAGCAAGGCACTTTGTGTTGAGTG- TACCTTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG- CGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCG- TAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAG- TCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGG- CTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTG- GAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGG- TCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAG- CGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTG- GATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGAGC- TAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGC- TAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAG- CATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGG- CTTGACATGTTCCCGACGATCCCAGAGATGGGGTTTCCCTT- CGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTG- TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG- CCCCGTGTTGCCAGCGGATTGTGCCGGGAACTCACGGGGGAC- CGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGAT- CATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGG- CCGGTACAACGGGATGCGACAGCGCGAGCTGGAGCGGA- TCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGA- CTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAACG- TCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT- CAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAAC- CCCTGCGGGAGGGAGCCKC SEQ ID NO: 2 (sequência do genoma da cepa 751) - ver a listagem de sequências eletrônica. 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Claims (19)

1. Uso de uma bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um derivado da mesma, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar ou prevenir asma neutrofílica, asma alérgica, asma eosinofílica, hiper- responsividade das vias aéreas ou câncer.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é para tratar ou prevenir asma, tal como asma neutrofílica ou asma alérgica; opcionalmente em que a composição é para reduzir neutrofilia ou eosinofilia no tratamento da asma.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é para tratar ou prevenir câncer, tais como câncer de pulmão, câncer de mama ou câncer de fígado; opcionalmente em que a composição é para reduzir o tamanho do tumor, reduzir o crescimento tumoral, prevenir metástases ou previnir a angiogê- nese.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição é para uso em um paciente com elevados níveis de IL-17 ou células Th17.
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o derivado é uma cepa bacteriana que utiliza as seguintes fontes de carboidratos: amidona, amigdalina, arbutina, celobiose, esculina, galactose, gentiobiose, glicose, glicogê- nio, frutose, fucose, lactose, maltose, manose, manitol, melibiose, me- lezitose, metil α-D-glucopiranosideo, N-acetilglucosamina, ribose, sacarose, salicina, sorbitol, trealose, turanose e xilitol.
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o derivado é uma cepa bacteriana que fornece o mesmo padrão que a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 quando analisada por análise de restrição de DNA ribossômico amplificado quando usando uma enzima de restrição Sau3AI.
7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o derivado é do gênero Bifidbacterium.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o derivado é da espécie Bifidobacterium breve.
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o derivado é positivo para fermentação de rafinose conforme determinado por um teste de Índice de Perfil Analítico.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a composição compreende pelo menos cerca de 1 x 106 CFU/g, em relação a um peso total da composição, da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 ou um derivado da mesma, em que o derivado é uma cepa de bactérias do gênero Bifidobacterium, em que a cepa de bactérias Bifidobacterium é positiva para fermentação de rafinose, conforme determinado por um teste de Índice de Perfil Analítico; em que a composição se destina ao tratamento do câncer por administração oral; e em que o câncer é um câncer de tumor sólido associado à diferenciação de células Th17.
11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que (i) a composição é para administração oral; e/ou (ii) a composição compreende um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis; e/ou (iii) a cepa bacteriana é liofilizada.
12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição é um produto alimentar ou uma vacina.
13. Célula de uma bactéria, caracterizada pelo fato de que a bactéria é depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, ou um derivado da mesma.
14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula de uma bactéria que é depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, ou um derivado da mesma; em que a composição compreende um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
15. Célula, caracterizada pelo fato de que é da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, ou um derivado da mesma, em que é para uso em terapia.
16. Uso da célula, como definida na reivindicação 15, carac-terizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar ou prevenir um distúrbio, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 10.
17. Uso de uma bactéria viável depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar ou prevenir câncer.
18. Uso de uma bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar ou prevenir asma neutrofílica.
19. Uso de uma bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar ou prevenir asma alérgica.
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