CN105451561A - 组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开含有非致病性的有萌发能力的细菌芽孢的治疗组合物，其用于预防、控制和治疗胃肠疾病、病症和病状以及用于一般营养保健。

Description

组合物和方法
相关申请
本申请要求2013年2月4日提交的美国临时申请No.61/760,584和2013年2月4日提交的美国临时申请No.61/760,585和2013年2月4日提交的美国临时申请No.61/760,574和2013年2月4日提交的美国临时申请No.61/760,606和2014年1月13日提交的美国临时申请No.61/926,918的优先权。这些申请都出于所有目的以全文引用的方式并入。
对序列表的提及
本申请包括以命名为25970PCT_sequencelisting.txt的文本文件形式通过电子方式提交的序列表，所述文件创建于2014年2月2日，大小为4,100,000字节。所述序列表是以引用的方式并入。
背景技术
微生物定殖在哺乳动物的胃肠(GI)道中，皮肤上，和其他上皮和组织生境如口腔、眼表面和阴道中。胃肠道具有丰富多样的微生物群落。它是一个复杂的系统，为许多不同的物种或生物体(包括多种细菌菌株)的群落提供环境或生境。数百种不同的物种可在健康人的胃肠道中形成共生群落，并且生物体的这种补体从出生时发展到约3岁，最终形成功能上成熟的微生物群体。这些群体中的微生物菌株之间以及微生物与宿主之间的相互作用，例如宿主免疫系统，塑造群落结构，对于影响微生物分布的资源具有可用性并存在竞争。这些资源可能是食品、位置和生长空间可用性或微生物可能附着的物理结构。例如，宿主饮食参与塑造胃肠道菌群。
健康的微生物群向宿主提供多种益处，包括对广谱病原体定殖的抗性、必需营养素生物合成和吸收，和维持健康的肠道上皮的免疫刺激和适当控制的全身免疫性。在‘生态失调’或共生破坏的情形下，微生物群功能可能会丧失或错乱，从而导致对于病原体的易感性增加，代谢特征改变，或可导致局部或全身炎症或自身免疫的促炎信号的诱导。因此，肠道微生物群在许多疾病和病症(包括肠道的多种病原体感染)的发病机理中起到显著的作用。例如，当由于使用广谱抗生素而使正常的肠道微生物群被扰乱时，受试者变得更易受病原体感染。这些疾病和病症中的许多是显著降低受试者的生活质量并且可能最终致命的慢性病状。
益生菌制造商已经宣称，其细菌制剂通过在胃肠道中保持天然微生物菌群并增强对于异常免疫反应的正常控制而促进哺乳动物健康。参见例如美国专利No.8,034,601。然而，益生菌局限于非常狭窄的属群和相应有限数目的物种；因而，在许多情况下它们不能充分地代替胃肠道中缺失的天然微生物菌群。
因此，从业者需要一种通过微生物群的多样和有用的选择而使其在受试者的胃肠道中增殖以改变生态失调的方法。
因此，响应于对于通过恢复或增强微生物群功能来治疗胃肠道疾病的持久、高效和有效组合物和方法的需要，我们通过提供用于治疗受试者的组合物和方法来解决现有技术的这些和其他缺点。
发明内容
本文公开了含有非致病性的有萌发能力的细菌芽孢的治疗组合物，其用于预防、控制和治疗胃肠疾病、病症和病状以及用于一般营养保健。这些组合物在适于安全施用至人类和其他哺乳动物受试者中是有利的并且在众多胃肠疾病、病症和病状中以及一般营养保健中是有效的。
附图简要说明
图1A提供16SrRNA基因的示意图并且指示高变区1-9(V1-V9)的坐标。基于使用由Brosius等,Completenucleotidesequenceofa16SribosomalRNAgene(16SrRNA)fromEscherichiacoli,PNAS75(10):4801-4805(1978)定义的命名法的大肠埃希氏菌系统的编号，V1-V9的坐标分别是69-99、137-242、433-497、576-682、822-879、986-1043、1117-1173、1243-1294和1435-1465。图1B以粗体突出显示由Brosius等描述的示例性参考大肠埃希氏菌16S序列中的每个高变区的核苷酸序列。
图2示出CsCl梯度的照片，其显示芽孢与其他残栖物质(residualhabitatmaterial)的分离。
图3示出三个相差图像，其显示来自粪便悬浮液的芽孢的逐步富集；乙醇处理、CsCl纯化的芽孢制剂；和乙醇处理、CsCl纯化、蔗糖纯化的芽孢制剂。
图4示出一组存活曲线，其显示芽孢群体在艰难梭菌(C.difficile)的小鼠预防模型中的功效。
图5提供一组存活曲线，其显示芽孢群体在艰难梭菌的仓鼠复发预防模型中的功效。
图6示出在多种乙醇和热处理下持续不同时间长度的细胞活力。
图7示出四个供体粪便样品在60℃下热处理5分钟后的细胞存活率。
图8示出乙醇在数秒内将厌氧和需氧细菌物种减少几个数量级。
图9示出来自多个供体的粪便捐献物随时间变化的芽孢浓度。
图10示出通过耦合荧光测定法得到的DPA浓度测量结果与活芽孢菌落形成单位之间的强烈相关性和线性对应关系。
图11示出各种萌发处理对于从芽孢群体培养营养期细菌(vegetativebacteria)的能力的影响。
图12示出使用萌发剂处理使来自芽孢群体的营养期细菌生长所致的细菌多样性增加。
图13示出在各种温度下的热活化对于来自三个不同供体粪便样品的芽孢的作用。
图14示出利用热活化的溶菌酶处理在大多数温度下改善萌发。
图15示出在各种培养基上生长的粪便样品中存在的芽孢浓度。
图16示出芽孢群体在具有各种培养基的平板上萌发后2天和7天，来自培养板的类似芽孢产生。
图17示出在用艰难梭菌攻毒的小鼠中如通过在实验过程中的小鼠体重变化所测量的芽孢群体的保护功效。每个曲线图记录了在实验过程中单独小鼠的体重相对于第-1天的变化。在实验过程中的死亡数指示在图表顶部并且由第6天之前的线终止显示。顶部图(从左到右)是媒介物对照组、粪便悬浮液组和未被处理的天然对照组，而底部图是乙醇处理、梯度纯化的芽孢制剂；乙醇处理、梯度纯化的“可萌发”芽孢制剂，和乙醇处理、梯度纯化的“可孢子化”制剂。
图18示出在乙醇处理的芽孢处理样品和患者治疗前和治疗后样品中测量的微生物多样性。总微生物多样性是使用Chao1α-多样性指数来定义的并且是在相同的基因组采样深度下测量以确认足够的序列覆盖率来测定目标样品中的微生物组。患者治疗前(紫色)的微生物组相比于乙醇处理的芽孢处理(红色)和患者治疗后第5天(蓝色)、第14天(橙色)和第25天(绿色)具有显著降低的总体多样性。
图19示出患者微生物生态如何通过用乙醇处理的芽孢处理治疗而从生态失调状态转变为健康状态。基于患者治疗前和治疗后的总体多样性和微生物组结构(BrayCurtisβ多样性)的原则坐标分析勾画出，从芽孢治疗植入OTU与强化患者微生物生态的组合导致不同于治疗前微生物组和乙醇处理的芽孢治疗生态的微生物生态。
图20示出在用芽孢群体治疗的患者中的拟杆菌物种的强化。比较来自治疗前和治疗后第4周的粪便悬浮液的拟杆菌菌落数，揭示出增加4log或更多。通过连续稀释和平板接种在对脆弱拟杆菌(B.fragilis)群具高度选择性的拟杆菌胆汁七叶苷(BacteroidesBileEsculin)琼脂上来对菌落进行计数。通过16S全长序列鉴定来确定物种。
图21示出在用乙醇处理的芽孢群体治疗后的患者的微生物组中植入物种和强化物种的数目增加。基于16S序列读数数目来确定如所述植入或强化的物种的相对丰度。每个曲线图是来自用乙醇处理的芽孢群体针对复发性艰难梭菌治疗的不同患者。
所述附图仅出于说明目的来描绘本发明的各种实施方案。本领域技术人员根据以下讨论将容易认识到，可在不脱离本文所述发明原理的情况下使用本文所说明的结构和方法的替代实施方案。
表格说明
表1.对属(Genus)、种(Species)和系统发育分支(PhylogeneticClade)进行分类分配的操作分类单元(OperationalTaxonomicUnit，OTU)的列表。细菌OTU的分支成员是基于16S序列数据。分支是基于使用具有系统发育学领域的普通技术的个体所熟知的最大似然法由全长16S序列构建的系统发育树的拓扑结构进行定义。构建分支以确保给定分支中的所有OTU是：(i)彼此在指定数目的引导程序支持节点内，和(ii)在5％遗传相似性内。基于16S-V4序列数据，在相同分支内的OTU可以区分为在遗传上和系统发育上不同于在不同分支内的OTU，而处于相同分支内的OTU紧密相关。使用16S-V4序列数据，处于相同分支内的OTU在进化上紧密相关并且可能可彼此区分或可能不可彼此区分。相同分支的成员由于其进化相关性而在例如人类肠道中所存在的微生物生态中发挥类似的功能作用。用来自相同分支的另一个物种代替一种物种的组合物可能具有保守的生态功能并且因此可用于本发明中。所有OTU都关于其假定形成芽孢能力和其是否是病原体或病生菌(Pathobiont)进行指示(关于“病生菌”的描述，参见定义)。NIAID优先病原体以‘A类’、‘B类’或‘C类’表示，并且机会病原体以‘OP’表示。不具致病性或未知其以病原体形式存在的能力的OTU以‘N’表示。‘SEQID编号’表示序列表文件中的OTU的标识符并且‘公共DB保藏’表示公共序列库中的OTU的标识符。
表2含有在CsCl梯度纯化之前和之后由乙醇处理的芽孢群体的16s分析鉴定的细菌OTU。
表3含有用不同稀释度下的供体粪便悬浮液和乙醇和/或热处理的芽孢制剂治疗的小鼠的死亡率和体重变化。
表4含有通过从涉及各种热处理的芽孢制剂挑取菌落而产生的芽孢形成物质所鉴定的OTU。
表5含有在未被处理的粪便浆液中未鉴定出，而在乙醇处理或热处理的芽孢群体中鉴定出的OTU。
表6含有从来自供体A的微生物组样品中分离的乙醇处理的芽孢群体中鉴定出的OTU。
表7含有从来自供体B的微生物组样品中分离的乙醇处理的芽孢群体中鉴定出的OTU。
表8含有从来自供体C的微生物组样品中分离的乙醇处理的芽孢群体中鉴定出的OTU。
表9含有从来自供体D的微生物组样品中分离的乙醇处理的芽孢群体中鉴定出的OTU。
表10含有从来自供体E的微生物组样品中分离的乙醇处理的芽孢群体中鉴定出的OTU。
表11含有从来自供体F的微生物组样品中分离的乙醇处理的芽孢群体中鉴定出的OTU。
表12含有从在不同培养基类型上生长的乙醇处理的芽孢群体中鉴定的OTU。
表13.通过菌落挑取法鉴定为“可萌发”和“可孢子化”的物种。
表YYY.使用16S-V4NGS法鉴定为“可萌发”的物种。
表ZZZ.使用16s-V4NGS法鉴定为“可孢子化”的物种。
表AC示出来自用于成功地治疗3名罹患复发性艰难梭菌感染的患者的3种不同乙醇处理的芽孢制剂的芽孢含量数据。
表AD.当根据每剂4×105SCFU标准化时表AC中的DPA剂量。
表GB.在至少一种乙醇处理的芽孢制剂中通过最少十个16S-V4序列读数检测的OTU(全微生物组)。指示出植入所治疗患者中的OTU和植入它们的患者的百分比，以及分支、芽孢形成状态和关键(Keystone)OTU状态。以星号标记的OTU在≥80％的乙醇制剂中存在并且植入≥50％的所治疗患者中。
表GC通过CES评定前20种OTU，其中进一步需要必须显示为植入以视为核心生态的要素的OTU。
表GD：在艰难梭菌小鼠模型中测试的核心生态(CoreEcology)的子集。
表GE：在艰难梭菌小鼠模型中测试的细菌组合物的结果。
表GF.在三元组合中测试的OTU和其分支分配，其中具有在体外抑制测定法中的结果。
表ZA.在第1天经口管饲施用的微生物组合物。
表TAB.在给与微生物组合物后第2天、第3天和第4天的OTU群体。
表TAC.在给与微生物组合物后第2天、第3天和第4天的分支群体。
表TAD.在第0天用104.5个艰难梭菌芽孢攻毒的小鼠中的实验组的死亡率。
具体实施方式
概述
本文公开含有非致病性的有萌发能力的细菌芽孢的治疗组合物，其用于预防、控制和治疗胃肠疾病、病症和病状以及用于一般营养保健。这些组合物在适于安全施用至人类和其他哺乳动物受试者中是有利的并且在众多胃肠疾病、病症和病状中以及一般营养保健中是有效的。虽然基于芽孢的组合物是已知的，但它们通常是根据各种技术如液体细菌培养物的冻干或喷雾干燥来制备的，从而导致不良功效、不稳定性、相当大的可变性和缺乏足够的安全性和功效。
现已发现，细菌芽孢群体可以获自从哺乳动物受试者(包括人类)获得的生物材料。这些群体被配制成如本文所提供的组合物，并且使用如本文所提供的方法施用至哺乳动物受试者。
定义
“微生物群(Microbiota)”是指在动物受试者、通常是哺乳动物如人类之中和之上(持续地或短暂地)存在的微生物群落，包括真核生物、古细菌、细菌和病毒(包括细菌病毒，即噬菌体)。
“微生物组(Microbiome)”是指持续地和短暂地生活在人体之中和之上的微生物群落的遗传内容，包括真核生物、古细菌、细菌和病毒(包括细菌病毒(即噬菌体))，其中“遗传内容”包括基因组DNA、RNA如核糖体RNA、表观基因组、质粒和所有其他类型的遗传信息。
“微生物携带(MicrobialCarriage)”或简称“携带”是指居留在人类之内或之上的生境内的微生物群体。携带通常以相对丰度进行定义。例如，OTU1包含60％的总微生物携带，这是指OTU1相比于进行测量的样品中的其他OTU具有60％的相对丰度。携带最通常是基于基因组测序数据，其中单个OTU或一组OTU的相对丰度或携带是由相对于样品的测序读数的总数而分配至所述OTU的测序读数数目来定义。
“微生物强化(MicrobialAugmentation)”或简称“强化”是指微生物群体的建立或显著增多，所述微生物(i)从所施用的治疗性微生物组合物中不存在或不可检测(如通过使用标准的基因组和微生物计数所测定)，(ii)在递送微生物组合物之前在宿主生境(例如：胃肠道、皮肤、鼻前孔或阴道)中不存在、不可检测或以低频率存在，和(iii)在它们以低频率存在的情况下，在施用微生物组合物之后存在或显著增加，例如2倍、5倍、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107或大于1×108。包含强化生态的微生物可源自外部来源如食品和环境，或从它们以低频率驻留的宿主内的微生境中出芽。
治疗性微生物组合物的施用诱导目标生境中的环境改变，其促进这些共生微生物的生长的有利条件。在不存在用治疗性微生物组合物进行治疗的情况下，宿主可能不断地暴露于这些微生物；然而，未观察到包含强化生态的微生物水平增加的稳定群体的持续生长和与其相关的积极健康影响。
“微生物植入”或简称“植入”是指在治疗之前在所治疗宿主中不存在的在目标生境中包含治疗性微生物组合物的OTU的建立。包含植入生态的微生物存在于治疗性微生物组合物中并且在治疗时作为宿主微生物生态的成分建立。植入OTU可以建立短暂时段，或在用治疗性微生物组合物治疗后显示在宿主中增殖的微生物生态的长期稳定性。所植入生态可诱导目标生境中的环境改变，其促进能够催化从生态失调的生态变为代表健康状态的生态的用于共生微生物生长的有利条件。
“生态生境(EcologicalNiche)”或简称“生境”是指一种生物体或一组生物体所占据的生态空间。生境描述生物体或生物体群体如何响应于资源分布、物理参数(例如，宿主组织空间)和竞争者(例如，当资源丰富时并且当掠食者、寄生虫和病原体稀少时，通过生长)和它如何反过来改变那些相同的因素(例如，限制其他生物体对资源的获取，充当捕食者和猎物消费者的食物来源)。
“生态失调”是指其中生态网络的正常多样性和/或功能被破坏的受试者的肠道或其他身体区域(包括粘膜或皮肤表面)的微生物群状态。这种不健康状态可能是由于多样性降低，一种或多种病原体或病生菌的过度生长，只有当某些遗传和/或环境条件存在于受试者中时才能够引起疾病的共生生物体，或者不再向宿主受试者提供基本功能的生态微生物网络的转变，并且因此不再促进健康。
“病生菌”或“机会病原体”是指只有当某些遗传和/或环境条件存在于受试者中时才能够引起疾病的共生生物体。
“系统发育树”是指一种遗传序列与使用一组限定的系统发育重建算法(例如简约法、最大似然法或贝叶斯(Bayesian)法)生成的另一种遗传序列的进化关系的图形表示。树中的节点代表不同的祖先序列并且任何节点的置信度是由引导或贝叶斯后验概率提供，其衡量分支不确定性。
“操作分类单元”、“OTU”(或多个“OTU”)是指系统发育树中的终端叶并且由核酸序列(例如，整个基因组)或特定遗传序列和在物种水平下与这种核酸序列共有序列同一性的所有序列定义。在一些实施方案中，特定遗传序列可为16S序列或16S序列的一部分。在其他实施方案中，对两个实体的整个基因组进行测序并比较。在另一个实施方案中，可对所选区域如多位点序列标签(MLST)、特定基因或基因组进行遗传比较。在16S实施方案中，在整个16S或16S的一些可变区上共有≥97％平均核苷酸同一性的OTU被视为相同的OTU(参见例如ClaessonMJ,WangQ,O'SullivanO,Greene-DinizR,ColeJR,RosRP和O'ToolePW.2010.Comparisonoftwonext-generationsequencingtechnologiesforresolvinghighlycomplexmicrobiotacompositionusingtandemvariable16SrRNAgeneregions.核酸研究(NucleicAcidsRes)38:e200；KonstantinidisKT,RametteA和TiedjeJM.2006.Thebacterialspeciesdefinitioninthegenomicera.英国皇家学会哲学学报B系列：生物科学(PhilosTransRSocLondBBiolSci)361:1929-1940)。在涉及完整基因组的实施方案中，共用≥95％平均核苷酸同一性的MLST、特定基因或一组基因OTU被视为相同的OTU(参见例如AchtmanM和WagnerM.2008.Microbialdiversityandthegeneticnatureofmicrobialspecies.自然评论：微生物学(Nat.Rev.Microbiol.)6:431-440；KonstantinidisKT,RametteA和TiedjeJM.2006.Thebacterialspeciesdefinitioninthegenomicera.英国皇家学会哲学学报B系列：生物科学(PhilosTransRSocLondBBiolSci)361:1929-1940)。OTU通常通过比较生物体之间的序列来定义。通常，具有小于95％序列同一性的序列不被认为构成相同OTU的一部分。OTU也可由核苷酸标志物或基因的任何组合、特别是高度保守的基因(例如，“管家”基因)或它们的组合表征。这种表征使用例如WGS数据或全基因组序列。
“残栖产物(Residualhabitatproduct)”是指源自人类或动物之内或之上的微生物群栖息地的材料。例如，微生物群生活在胃肠道中的粪便中，其皮肤上，唾液中，呼吸道粘液中，或生殖泌尿道的分泌物中(即，与微生物群落相关的生物物质)。基本上不含残栖产物是指细菌组合物不再含有与人类或动物受试者之上或之中的微生物环境相关的生物物质并且100％不含、99％不含、98％不含、97％不含、96％不含或95％不含任何与微生物群落相关的污染的生物物质。残栖产物可包括非生物材料(包括未消化的食物)或者它可包括不需要的微生物。基本上不含残栖产物也可能意味着细菌组合物不含来自人类或动物的可检测细胞并且仅微生物细胞是可检测的。在一个实施方案中，基本上不含残栖产物也可能意味着细菌组合物不含可检测病毒(包括细菌病毒(即噬菌体))、真菌、支原体污染物。在另一个实施方案中，这意味着，与微生物细胞相比，细菌组合物中少于1×10-2％、1×10-3％、1×10-4％、1×10-5％、1×10-6％、1×10-7％、1×10-8的活细胞是人类或动物。存在多种方式来实现这种纯度，它们都不具限制性。因此，可通过经由对固体培养基上的单菌落进行多个划线接种步骤来分离所需成分直至来自系列单菌落的重复(例如但不限于两个)划线仅显示单菌落形态来降低污染。可选地，可以通过对单一所需细胞进行多个回合的连续稀释(例如，10-8或10-9的稀释)，例如经由多次10倍连续稀释来实现污染的降低。这可通过显示多种分离菌落具有类似的细胞形状和革兰氏染色行为得到进一步证实。用于证实足够纯度的其他方法包括遗传分析(例如PCR、DNA测序)、血清学和抗原分析、酶学和代谢分析，和使用诸如利用区分所需成分与污染物的试剂进行的流式细胞仪等仪器的方法。
“分支”是指在系统发育树中的统计学有效节点下游的系统发育树的OTU或成员。所述分支包含系统发育树中的一组末端叶，其为明显的单系进化单元并且共有一定程度的序列相似性。
在微生物学中，“16S测序”或“16S-rRNA”或“16S”是指通过表征包含16S核糖体RNA基因的核苷酸而衍生的序列。细菌16SrDNA的长度为约1500个核苷酸并且用于使用系统发育方法来重建一种细菌分离株与另一种细菌分离株的进化关系和序列相似性。16S序列被用于系统发育重建，因为它们一般是高度保守的，但含有具有足够核苷酸多样性以区分大多数细菌的属和种的特定高变区。
16SrRNA的“V1-V9区”是指16SrRNA基因的第一至第九高变区，其用于对细菌样品进行基因分型。使用基于命名法的大肠埃希氏菌系统的编号，细菌中的这些区域分别由核苷酸69-99、137-242、433-497、576-682、822-879、986-1043、1117-1173、1243-1294和1435-1465限定。Brosius等,Completenucleotidesequenceofa16SribosomalRNAgenefromEscherichiacoli,PNAS75(10):4801-4805(1978)。在一些实施方案中，V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8和V9区域中的至少一个用于表征OTU。在一个实施方案中，V1、V2和V3区域用于表征OTU。在另一个实施方案中，V3、V4和V5区域用于表征OTU。在另一个实施方案中，V4区域用于表征OTU。本领域普通技术人员可以通过比较所讨论的候选序列与参考序列并基于与参考高变区的类似性以鉴定高变区来鉴定候选16SrRNA的特定高变区，或者可选地，可以使用微生物或微生物群落的全基因组鸟枪(WholeGenomeShotgun，WGS)序列表征。
术语“受试者”是指任何动物受试者，包括人类、实验动物(例如，灵长类动物、大鼠、小鼠)、家畜(例如，牛、绵羊、山羊、猪、火鸡和鸡)，和家养宠物(例如，狗、猫和啮齿动物)。所述受试者可能罹患生态失调，包括(但不限于)由于胃肠道病原体所致的感染，或者可能处于患上由于胃肠道病原体所致的感染或将其传播给其他人的风险中。
术语“表型”是指单独的实体的一组可观察到的特性。例如，单独的受试者可能具有“健康”或“疾病”的表型。表型描述实体的状态并且一种表型内的所有实体共有同一组描述所述表型的特性。个体的表型部分地或完全地由实体基因组和/或微生物组与环境的相互作用产生。
术语“网络生态(NetworkEcology)”是指在一些数目的受试者中共同出现的OTU的同生群。如本文所用，“网络”是由描绘特定节点(即OTU)和边缘(特定OTU之间的连接)如何彼此相关以限定OTU的同生群的结构生态的曲线图以数学方式进行定义的。任何给定的网络生态将具有固有的系统发育多样性和功能特性。网络生态也可以在功能方面进行定义，其中例如节点将由诸如(但不限于)酶、直系同源组集群(COGS；http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21090/)或KEGG路径(www.genome.jp/kegg/)等要素构成。
术语“网络等级(NetworkClass)”、“核心网络(CoreNetwork)”和“核心网络生态(CoreNetworkEcology)”是指通常以计算方式确定为包含具有相似系统发育和/或功能特性的生态的一组网络生态。因此，核心网络含有一组(即簇)相关网络生态在系统发育上或功能上限定的重要的生物特征。核心网络生态的一种表示是所设计的微生物、通常非致病性细菌的同生群，其代表在许多不同受试者中可见的一组系统发育上或功能上相关的网络生态的核心特征。在许多情形下，核心网络虽然如本文所述进行设计，但以在一个或多个受试者中观察到的网络生态存在。核心网络生态可用于逆转或减少其中潜在的相关网络生态已经被破坏的受试者中的生态失调。
术语“关键OTU”是指为许多网络生态所共有并且是在许多受试者中存在(即是普遍的)的网络生态成员的一种或多种OTU(图1)。由于关键OTU的普遍存在的性质，它们对于健康受试者中的网络生态的功能是重要的并且在患有疾病的受试者中通常缺失或处于降低的水平。关键OTU可在受试者中以低、中等或高丰度存在。
术语“非关键OTU”是指在网络生态中观察到并且不是关键OTU的OTU。
术语“系统发育多样性”是指在基于构成网络的OTU的给定网络生态或核心网络生态中存在的生物多样性。系统发育多样性是一个相对的术语，其是指相比于另一个网络具有相对更大的系统发育多样性的网络生态或核心网络含有更大数目的独特物种、属和分类家族。物种、属或分类家族的独特性通常是使用代表所有物种、属或分类家族相对于彼此的遗传多样性的系统发育树来定义的。在另一个实施方案中，可使用系统发育树的总分支长度或平均分支长度来测量系统发育多样性。
“芽孢”或“内芽孢”是指处于休眠、非营养和非繁殖阶段的实体，特别是细菌实体。芽孢通常抵抗环境应力，例如辐射、干燥、酶处理、温度变化、营养素缺乏和化学消毒剂。
“芽孢群体”是指组合物中存在的多个芽孢。本文使用的同义术语包括芽孢组合物、芽孢制剂、乙醇处理的芽孢级分(sporefraction)和芽孢生态。芽孢群体可例如经由乙醇或热处理、或密度梯度分离或本文所述方法的任何组合从粪便捐献物纯化以增加样品中芽孢的纯度、效能和/或浓度。可选地，可经由从分离的芽孢形成剂(sporeformer)物质或芽孢形成剂OTU或从呈营养期或芽孢形式的这些物种的混合物起始的培养方法获得芽孢群体。
在一个实施方案中，芽孢制剂包含芽孢形成物质，其中残余非芽孢形成物质已通过包括乙醇、洗涤剂、加热、超声处理等的化学或物理处理灭活；或其中非芽孢形成物质已通过包括密度梯度、离心、过滤和/或色谱法的各种分离步骤从芽孢制剂中去除；或其中将灭活和分离方法组合以制造芽孢制剂。在另一个实施方案中，芽孢制剂包含在活的非芽孢形成剂或营养期形式的芽孢形成剂上富集的芽孢形成物质。在这个实施方案中，相比于所有营养期形式的细菌，芽孢富集2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍、10,000倍或大于10,000倍。在另一个实施方案中，芽孢制剂中的芽孢在加工和配制期间经历部分萌发以使得最终组合物包含由芽孢形成物质衍生的芽孢和营养期细菌。
“萌发剂(germinant)”是能够诱导呈休眠芽孢形式的细菌或呈芽孢形式的细菌群组在宿主生物体和/或在体外直接或间接地营养期生长的材料或组合物或物理-化学过程。
“芽孢形成诱导剂”是能够诱导细菌在宿主生物体中和/或在体外直接或间接地芽孢形成的材料或物理-化学过程。
为“增加细胞芽孢的产生”包括活性或芽孢形成诱导剂。“产生”包括营养期细菌细胞转化为芽孢和这种转化速率的强化，以及降低芽孢形式的细菌的萌发，降低体内或离体芽孢衰变速率，或增加芽孢总输出(例如经由粪便材料的体积输出增加)。
宿主生物体的“定殖”包括细菌或其他微观生物体的非短暂驻留。如本文所用，病原体细菌在宿主受试者的胃肠道(或任何其他微生物群生境)“减少定殖”包括减少病原体在胃肠道中的驻留时间以及减少病原体在胃肠道中或粘附到胃肠道腔表面的数目(或浓度)。测量粘附病原体的减少可例如通过活检样品证明，或者可例如通过测量哺乳动物宿主大便中的致病负担来间接测量降低。
两种或更多种细菌的“组合”包括两种细菌在相同材料或产品或物理连接产品中的物理共存，以及两种细菌的暂时共同施用或共同定位。
“细胞毒性”活性或细菌包括杀死细菌细胞例如致病性细菌细胞的能力。“细胞抑制”活性或细菌包括部分或完全地抑制细菌细胞如致病性细菌细胞的生长、代谢和/或增殖的能力。
不含“非可食用产品”是指本文提供的细菌组合物或其他材料不具有大量的非可食用产品，例如，在适于施用(例如经口施用)至人类受试者的产品中不可食用、有害或以其他方式不合需要的产品或材料。非可食用产品通常存在于根据现有技术的细菌制剂中。
如本文所用，术语“维生素”应理解为包括对于身体的正常生长和活动微量必需并且从植物和动物食品天然获得或合成制得的各种脂溶性或水溶性有机物质(非限制性实例包括维生素A、维生素B1(硫胺素(thiamine))、维生素B2(核黄素(riboflavin))、维生素B3(烟酸(niacin)或烟酰胺))、维生素B5(泛酸(pantothenicacid))、维生素B6(吡哆醇(pyridoxine)、吡哆醛(pyridoxal)或吡哆胺(pyridoxamine)、或盐酸吡哆醇)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)和维生素B12(各种钴胺素(cobalamin)；在维生素补充剂中通常为氰钴胺素(cyanocobalamin))、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、K1和K2(即MK-4、MK-7)、叶酸和生物素)、维生素原、衍生物、类似物中的任一种。
如本文所用，术语“矿物”应理解为包括硼、钙、铬、铜、碘、铁、镁、锰、钼、镍、磷、钾、硒、硅、锡、钒、锌或它们的组合。
如本文所用，术语“抗氧化剂”应理解为包括多种物质中的任一种或多种，例如β-胡萝卜素(维生素A前体)、维生素C、维生素E和硒，其抑制氧化或由活性氧物质(“ROS”)和其他自由基和非自由基物质促进的反应。另外，抗氧化剂是能够减缓或防止其他分子氧化的分子。抗氧化剂的非限制性实例包括虾青素、类胡萝卜素、辅酶Q10(“CoQ10”)、类黄酮、谷胱甘肽、枸杞(枸杞子)、橙皮苷、乳枸杞、木脂素、叶黄素、番茄红素、茶多酚、硒、维生素A、维生素C、维生素E、玉米黄质或它们的组合。
本发明的组合物
本文公开含有非致病性的有萌发能力的细菌芽孢的治疗组合物，其用于预防、控制和治疗胃肠疾病、病症和病状以及用于一般营养保健。这些组合物在适于安全施用至人类和其他哺乳动物受试者中是有利的并且在众多胃肠疾病、病症和病状中以及一般营养保健中是有效的。虽然基于芽孢的组合物是已知的，但它们通常是根据各种技术如液体细菌培养物的冻干或喷雾干燥来制备的，从而导致不良功效、不稳定性、相当大的可变性和缺乏足够的安全性和功效。
现已发现，细菌芽孢的群体可以获自从哺乳动物受试者(包括人类)获得的生物材料。这些群体被配制成如本文所提供的组合物，并且使用如本文所提供的方法施用至哺乳动物受试者。
本文提供含有纯化的细菌芽孢群体的治疗组合物。如本文所用，术语“纯化(purify)”、“纯化的”和“纯化(purifying)”是指已经历一个或多个纯化过程(例如所需细胞芽孢的选择或富集，或可选地如本文所述的残栖产物的去除或降低)的所需细胞芽孢的群体(例如，多个已知或未知的量和/或浓度)的状态。在一些实施方案中，纯化群体不具有可检测的不希望的活性，或可选地，不希望的活性的水平或量处于或低于可接受的水平或量。在其他实施方案中，纯化群体具有处于或高于可接受的量和/或浓度的所需细胞芽孢的量和/或浓度。在其他实施方案中，所需/非所需活性的比率(例如芽孢相比于营养期细菌)已改变2、5、10、30、100、300、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108或大于1×108。在其他实施方案中，相比于获得群体的原料(例如，粪便材料)，纯化的细菌芽孢群体得到富集。相比于原料，这种富集可能是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、99.9999％、99.9999％或大于99.999999％。
在某些实施方案中，纯化的细菌芽孢群体具有降低或不可检测水平的一种或多种致病活性，例如毒性、造成哺乳动物受体受试者感染的能力、不希望的免疫调节活性、自身免疫反应、代谢反应、或炎症反应或神经系统反应。相比于原料，致病活性的这种降低可能是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、99.9999％或大于99.9999％。在其他实施方案中，纯化的细菌芽孢群体相比于粪便材料具有降低的感官成分，例如降低的气味、味道、外观和鲜味。
提供基本上不含残栖产物的纯化的细菌芽孢群体。在某些实施方案中，这是指细菌芽孢组合物不再含有大量的与微生物群落相关的生物物质，而生存在人类或动物受试者之上或之中，并且纯化的芽孢群体可能100％不含、99％不含、98％不含、97％不含、96％不含或95％不含与微生物群落相关的生物物质的任何污染。基本上不含残栖产物也可能是指细菌芽孢组合物不含可检测的来自人类或动物的细胞，并且仅微生物细胞是可检测的，特别是，仅所需的微生物细胞是可检测的。在另一个实施方案中，这意味着与微生物细胞相比，细菌组合物中少于1×10-2％、1×10-3％、1×10-4％、1×10-5％、1×10-6％、1×10-7％、1×10-8％的细胞是人类或动物。在另一个实施方案中，纯化群体中存在的残栖产物相比于从哺乳动物供体受试者获得的粪便材料至少减少特定水平，例如，减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、99.9999％或大于99.9999％。
在一个实施方案中，基本上不含残栖产物或基本上不含可检测水平的致病物质是指细菌组合物不含可检测的病毒(包括细菌病毒(即噬菌体))、真菌、或支原体或弓形虫污染物，或真核寄生虫如蠕虫。可选地，纯化的芽孢群体基本上不含非细胞材料，例如，DNA、病毒涂层材料或非活细菌材料。可选地，纯化的芽孢群体可通过杀死、灭活或去除一种或多种特定不需要的病毒如肠道病毒(包括诺如病毒、脊髓灰质炎病毒或甲型肝炎病毒)的方法处理。
如本文所述，纯化的芽孢群体可通过如下证实：遗传分析(例如，PCR、DNA测序)、血清学和抗原分析、显微镜分析、包括萌发和培养的微生物分析，和使用诸如利用区分所需细菌芽孢与不希望的污染材料的试剂进行的流式细胞仪等仪器的方法。
示例性生物材料包括粪便材料，例如从小肠和大肠的各个区段分离的粪便或材料。粪便材料是从哺乳动物供体受试者获得的，或者可获自一个以上的供体受试者，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、400、500、750、1000个或多于1000个供体，其中然后在纯化所需细胞芽孢之前将所述材料汇集。在另一个实施方案中，粪便材料可以在多个时间内获自单一供体受试者并且从多个样品汇集，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、32、35、40、45、48、50、100个来自单一供体的样品。
在替代实施方案中，所需的细菌芽孢是从由单一供体获得的单个粪便材料样品中纯化的，并且在这种纯化后与来自其他纯化的纯化芽孢群体组合，后者在不同时间来自相同供体，或来自一个或多个不同供体，或两者。
哺乳动物供体受试者一般具有良好健康并且具有与这种良好健康一致的微生物群。通常，在收集粪便材料之前，供体受试者在特定时期内未施用抗生素化合物。在某些实施方案中，供体受试者不肥胖或超重，并且可具有低于25、例如介于18.5与24.9之间的身体质量指数(BMI)评分。在其他实施方案中，供体受试者没有精神疾病或者不具有精神疾病史或家族史，例如焦虑症、抑郁症、双相情感障碍、自闭症、精神分裂症、恐慌症、注意力缺陷(多动)障碍、进食障碍或情绪障碍。在其他实施方案中，供体受试者不具有肠易激病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎)、肠易激综合征、乳糜泻、结肠直肠癌或这些疾病的家族史。在其他实施方案中，已经使用本领域技术人员已知的标准技术(例如核酸检测、血清学检测、抗原检测、培养技术、酶测定法、在易感细胞培养基质上寻找毒素的不含细胞的粪便滤液的测定法)对供体筛选血源性病原体和粪便传染性病原体。
在一些实施方案中，也针对提供含有属或种的治疗组合物的增加功效的这些特定属和/或种的存在选择供体。在其他实施方案中，相比于其他供体在粪便材料中产生相对更高浓度的芽孢的供体是优选的。在其他实施方案中，提供纯化获得具有增加功效的芽孢的粪便材料的供体是优选的；这种增加的功效是使用如下文所述的体外或动物研究测量的。在一些实施方案中，供体可经受一个或多个预捐献处理以减少粪便材料中不需要的材料，和/或增加所需的芽孢群体。
在收集粪便材料之前并任选地在收集粪便材料之后一次或多次筛选供体受试者的健康是有利的。这种筛选鉴定携带致病物质如病毒(HIV、肝炎、脊髓灰质炎)和致病细菌的供体。收集后，在大约一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、六个月、一年或一年以上筛选供体，并且这种筛选的频率可以是每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两月一次、每半年一次或每年一次。在捐献之前或之后或两者，经过筛选并且检测非阳性的供体被视为“验证的”供体。
溶剂处理。为了纯化细菌芽孢，对粪便材料进行一次或多次溶剂处理。溶剂处理是可混溶溶剂处理(部分可混溶或完全可混溶)或不可混溶溶剂处理。混溶性是两种液体各自混合以形成均质溶液的能力。水和乙醇例如完全混溶以使得含有任何比率的水和乙醇的混合物将显示仅单相。混溶性以重量/重量％或一种溶剂于100g最终溶液中的重量提供。如果两种溶剂在所有比例下完全混溶，则其混溶性为100％。以与水的完全混溶溶液形式提供的是醇，例如，甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙二醇、丁二醇等。醇可与水组合提供；例如，含有10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、89％、85％、90％、95％或大于95％的溶液。其他溶剂仅部分可混溶，这意味着仅一些部分将溶解在水中。二乙醚例如与水部分混溶。高达7克的二乙醚将溶解在93g水中以得到7％(重量/重量％)溶液。如果添加更多的二乙醚，则由于不同的二乙醚层在水上方而将产生两相溶液。其他部分混溶的材料包括醚、丙酸酯、丁酸酯、氯仿、二甲氧基乙烷或四氢呋喃。与此相反，诸如烷烃等油与水是不可混溶的并且形成两相。此外，不混溶处理任选地与洗涤剂(离子型洗涤剂或非离子型洗涤剂)组合。示例性洗涤剂包括TritonX-100、Tween20、Tween80、NonidetP40、pluronic或多元醇。溶剂处理步骤将非芽孢形成细菌物质的活力降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、99.9％、99.99％、99.999％或99.9999％，并且其可任选地降低污染的原生生物、寄生生物和/或病毒的活力。
色谱处理。为了纯化芽孢群体，依序或并行地对粪便材料进行一次或多次色谱处理。在色谱处理中，使含有粪便材料的溶液与含有疏水相互作用色谱(HIC)介质或亲和色谱介质的固体介质接触。在一个替代实施方案中，使能够吸收粪便材料中存在的残栖产物的固体介质与吸附残栖产物的固体介质接触。在某些实施方案中，HIC介质含有琼脂糖或衍生化琼脂糖，例如丁基琼脂糖、辛基琼脂糖、苯基琼脂糖或丁基-s琼脂糖。在其他实施方案中，亲和色谱介质含有用I、II、III、IV、V或VI型粘蛋白衍生的材料，或从I、II、III、IV、V或VI型粘蛋白衍生或与其类似的低聚糖。可选地，亲和色谱介质含有用识别芽孢形成细菌的抗体衍生的材料。
机械处理。本文提供粪便材料的物理破坏，特别是通过一种或多种机械处理如共混、混合、摇荡、涡旋、冲击粉碎和超声处理。如本文所提供，机械破坏处理基本上破坏粪便材料中存在的非芽孢材料并且基本上不破坏粪便材料中存在的芽孢，或其对芽孢材料的破坏可能小于非芽孢材料，例如小2倍、5倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍或1000倍以上。此外，机械处理将材料均质化以用于后续取样、测试和处理。机械处理任选地包括过滤处理，其中所需要的芽孢群体被保留在过滤器上，而不合需要的(非芽孢)粪便成分通过，并且然后从过滤介质中回收芽孢级分。可选地，不合需要的颗粒和真核细胞可以被保留在过滤器上，而包括芽孢的细菌细胞通过。在一些实施方案中，保留在过滤介质上的芽孢级分进行渗滤步骤，其中使保留的芽孢与洗涤液接触，所述洗涤液通常是含无菌盐水的溶液或其他稀释剂如水相容性聚合物(包括低分子聚乙二醇(PEG)溶液)，以进一步降低或去除不合需要的粪便成分。
热处理。本文提供粪便材料的热破坏。通常，将粪便材料混合在含盐水溶液如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并经受受热环境如温室、培养箱、水浴等，以使得在受热环境与粪便材料之间发生有效的热传递。优选地，粪便材料溶液在温育期间混合以增强热导率并破坏颗粒聚集体。可通过环境温度和/或热处理的持续时间来调节热处理。例如，粪便材料或包含粪便材料的液体经受受热环境，例如，至少约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或大于100℃的热水浴，持续至少约1、5、10、15、20、30、45秒、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50分钟、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时或10小时以上。在某些实施方案中，在两种不同温度下进行热处理，例如在100℃环境中30秒，接着在50℃环境中10分钟。在优选实施方案中，热处理的温度和持续时间足以杀死或去除致病物质，而基本上不破坏或降低芽孢的萌发能力。在其他优选实施方案中，热处理的温度和持续时间足够短以降低芽孢群体的萌发。
辐照处理。提供用在足以杀死致病物质而基本上不破坏所需芽孢群体的能级下提供的电离辐射(通常是γ辐照、紫外辐照或电子束辐照)处理粪便材料或粪便材料的分离内含物的方法。例如，在低于约22,000微瓦秒/平方厘米的能级下提供的254nm紫外辐射通常不会破坏所需芽孢。
离心和密度分离处理。提供通过离心从粪便材料的其他成分分离所需芽孢群体的方法。对含有粪便材料的溶液进行一次或多次离心处理，例如，在约200×g、1000×g、2000×g、3000×g、4000×g、5000×g、6000×g、7000×g、8000×g或大于8000×g下。差速离心将所需芽孢与不合需要的非芽孢材料分离；在较低的力下，芽孢保留在溶液中，而在较高的力下，芽孢形成球粒，而较小的杂质(例如，病毒粒子、噬菌体、微观纤维、生物大分子如游离蛋白质、核酸和脂质)保留在溶液中。例如，第一低力离心使纤维材料形成球粒；第二较高的力离心使不合需要的真核细胞形成球粒，并且第三更高的力离心使所需芽孢形成球粒，而较小的污染物留在悬浮液中。在一些实施方案中，使用密度或迁移率梯度或衬垫(例如，梯级衬垫)如CsCl、Percoll、Ficoll、Nycodenz、Histodenz或蔗糖梯度将所需芽孢群体与粪便材料中的其他材料分离。
本文还提供制造芽孢群体的方法，其将本文所述的两种或更多种处理组合以协同纯化所需芽孢，同时从所述芽孢群体杀死或去除不合需要的材料和/或活性。通常希望在非萌发和非生长促进条件和介质下保留芽孢群体，以将芽孢群体中存在的致病细菌的生长降至最低并且将芽孢萌发为营养期细菌细胞降至最低。
纯化的芽孢群体。如本文所述，纯化的芽孢群体含有人类肠道微生物群的共生细菌与当施用至哺乳动物受试者时有意义地提供健康微生物群的功能的能力的组合。不限于特定的机理，据认为，这些组合物抑制病原体如艰难梭菌、沙门氏菌属(Salmonellaspp.)、肠致病性大肠埃希氏菌、梭杆菌属(Fusobacteriumspp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiellaspp.)和耐万古霉素肠球菌属(Enterococcusspp.)的生长，因此可以维持健康、多样和保护性的微生物群，或者在致病性细菌感染如艰难梭菌感染的情况下，在肠腔恢复种群以重建对潜在病原体的生态控制。在一个实施方案中，纯化的芽孢群体可以植入宿主中并保持存在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、25天、30天、60天、90天或90天以上。另外，纯化的芽孢群体可以诱导在健康肠道中存在的其他健康共生细菌以植入在纯化芽孢群体中不存在或以较低水平存在的宿主中并且因此这种物种被视为“强化”递送的芽孢群体。以这种方式，纯化的芽孢群体在受体肠道中的共生物种强化导致比最初存在更多样的肠道微生物群的群体。
优选的细菌属包括厌氧醋菌属(Acetanaerobacterium)、醋弧菌属(Acetivibrio)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、嗜碱菌属(Alkaliphilus)、厌氧梭状菌属(Anaerofustis)、厌氧孢杆菌属(Anaerosporobacter)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、厌氧干菌属(Anaerotruncus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、布劳特氏菌属(Blautia)、短螺旋体属(Brachyspira)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、布兰特氏菌属(Bryantella)、布雷德菌属(Bulleidia)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、链杆菌属(Catenibacterium)、衣原体目(Chlamydiales)、梭菌科(Clostridiaceae)、梭菌目(Clostridiales)、梭菌属(Clostridium)、柯林斯菌属(Collinsella)、粪芽孢菌属(Coprobacillus)、粪球菌属(Coprococcus)、柯克斯体属(Coxiella)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)、多利菌属(Dorea)、伊格尔兹氏菌属(Eggerthella)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、产乙醇杆菌属(Ethanoligenens)、真杆菌属(Eubacterium)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、产线菌属(Filifactor)、黄杆菌属(Flavonifractor)、弯枝菌属(Flexistipes)、黄单胞菌属(Fulvimonas)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、吉米菌属(Gemmiger)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、粘杆菌属(Gloeobacter)、霍尔德曼氏菌属(Holdemania)、产氢厌氧杆菌属(Hydrogenoanaerobacterium)、考克氏菌属(Kocuria)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、毛螺菌属(Lachnospira)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)、内酯杆菌属(Lactonifactor)、钩端螺旋体(Leptospira)、鲁替孢菌属(Lutispora)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、柔膜细菌目(Mollicutes)、穆尔氏菌属(Moorella)、诺卡氏菌属(Nocardia)、颤杆菌属(Oscillibacter)、颤螺旋菌属(Oscillospira)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、帕匹杆菌属(Papillibacter)、假黄杆菌属(Pseudoflavonifractor)、罗宾氏菌属(Robinsoniella)、罗斯氏菌属(Roseburia)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、八叠球菌属(Sarcina)、索拉杆菌属(Solobacterium)、孢杆菌属(Sporobacter)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、萨特菌属(Sutterella)、互营球菌属(Syntrophococcus)、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、高温双岐菌属(Thermobifida)、图利杆菌属(Turicibacter)。
优选的细菌物种提供于表1并且界定为芽孢形成剂。在提供特定菌株的物种时，本领域技术人员将认识到，其他菌株的物种可以取代所提及的菌株。
在一些实施方案中，芽孢形成细菌由调节芽孢形成的核酸序列的存在来鉴定。特别是，标记芽孢形成基因在关系较远的属成员(包括梭菌和芽孢杆菌)之间高度保守。正向遗传学的传统方法已经鉴定了许多(如果不是全部)对于芽孢形成(spo)必需的基因。芽孢形成的发育程序由四种隔室特异性σ因子的连续作用(以σF、σE、σG和σK的顺序出现)部分地支配，所述因子的活性局限于前芽孢(σF和σG)或母细胞(σE和σK)。在其他实施方案中，芽孢形成细菌由DPA产生酶的生物化学活性或通过分析培养物的DPA含量来鉴定。作为细菌芽孢形成的一部分，产生大量的DPA，并且占芽孢质量的5-15％。因为并非所有的活芽孢在已知介质条件下萌发和生长，所以难以评估细菌群体中的总芽孢计数。因此，DPA含量的测量与芽孢含量高度相关并且是用于表征细菌群体中的总芽孢含量的适当量度。
提供含有一种以上类型的细菌的芽孢群体。如本文所用，一种“类型”或一种以上“类型”的细菌可在属水平、种水平、亚种水平、菌株水平或通过如本文所述和本领域中以其他方式已知的任何其他分类方法区分。
在一些实施方案中，纯化群体中存在的所有或基本上所有的细菌芽孢获自如本文所述或以本领域中已知的其他方式处理的粪便材料。在替代实施方案中，一种或一种以上的细菌芽孢或者一种或一种以上类型的细菌芽孢在培养中产生并组合以形成纯化的芽孢群体。在其他替代实施方案中，这些培养产生的芽孢群体中的一种或多种与粪便材料源芽孢群体组合以产生杂合芽孢群体。细菌组合物可含有至少两种类型的这些优选细菌，包括相同物种的菌株。例如，细菌组合物可包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或至少20或20种以上类型的如由物种或涵盖这些物种的操作分类单元(OTU)所定义的细菌。
因此，本文提供用于制造含有适于治疗性施用至有需要的哺乳动物受试者的细菌芽孢群体的组合物的方法。并且所述组合物一般是通过以下步骤来制造：(a)提供从哺乳动物供体受试者获得的粪便材料；和(b)在使得从所述粪便材料产生细菌芽孢群体的条件下对所述粪便材料进行至少一个纯化处理或步骤。将所述组合物配制以使得单一口服剂量含有至少约1×104菌落形成单位的细菌芽孢，并且单一口服剂量通常将含有约1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015或大于1×1015CFU的细菌芽孢。在给定纯化芽孢群体中，给定类型的细菌芽孢的存在和/或浓度可能是已知或未知的。如果已知，则例如给定菌株或所有菌株的聚集体的芽孢浓度为例如每克组合物或每施用剂量1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015或大于1×1015个活细菌芽孢。
在一些制剂中，以质量计，组合物含有至少约0.5％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％芽孢。在一些制剂中，施用剂量不超过200、300、400、500、600、700、800、900毫克或1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9克质量。
细菌芽孢组合物通常被配制用于经口或经胃施用，通常施用至哺乳动物受试者。在特定实施方案中，组合物被配制以固体、半固体、凝胶或液体形式，例如以丸剂、片剂、胶囊或糖锭形式经口施用。在一些实施方案中，这些制剂含有肠溶衣或被包覆肠溶衣以保护细菌通过胃和小肠，但芽孢通常耐胃和小肠。在其他实施方案中，细菌芽孢组合物可被配制具有萌发剂以增强植入或功效。在其他实施方案中，细菌芽孢组合物可与益生元物质共同配制或共同施用，以增强植入或功效。
细菌芽孢组合物可经配制以在单次施用中或经多次施用在给定哺乳动物受试者中有效。例如，单次施用基本上可有效降低被施用组合物的哺乳动物受试者中的艰难梭菌和/或艰难梭菌毒素含量。基本上有效是指在施用组合物后，受试者中的艰难梭菌和/或艰难梭菌毒素含量降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99％以上。可选地，可在2天、4天、1周、2周、4周、8周或大于8周后通过腹泻症状的不存在或艰难梭菌或艰难梭菌毒素携带的不存在来测量功效。
细菌组合物
提供当施用至哺乳动物宿主时能够有意义地提供健康微生物群功能的人类肠道微生物群的细菌和细菌组合。不限于特定机理，据认为，这些组合物抑制一种或多种致病细菌在生态失调的微生物群生境中的生长、增殖和/或定殖，以使得健康、多样和保护性的微生物群在肠腔中定殖并增殖以建立或重建对病原体或潜在病原体的生态控制(例如，一些细菌仅当存在于生态失调环境中时才是致病细菌)。病原体的抑制包括诸如艰难梭菌、沙门氏菌属、肠致病性大肠埃希氏菌、多重耐药性细菌如克雷伯氏菌(Klebsiella)、和大肠埃希氏菌、耐碳青霉烯肠杆菌(CRE)、广谱耐β内酰胺肠球菌(ESBL)和耐万古霉素肠球菌(VRE)等病原体。
如本文所用，一种“类型”或一种以上“类型”的细菌可在属水平、种水平、亚种水平、菌株水平或通过如本文所述和本领域中以其他方式已知的任何其他分类方法区分。
细菌组合物可包含两种类型的细菌(称为“二元组合”或“二元对”)或大于两种类型的细菌。例如，细菌组合物可包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、或至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或至少40、至少50或大于50种类型的如由物种或操作分类单元(OTU)或如本文所提供其他方式定义的细菌。
在另一个实施方案中，细菌组合物中存在的细菌类型数目处于或低于已知值。例如，在这些实施方案中，细菌组合物包含50种或更少类型的细菌，例如49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、或10种或更少、或9种或更少类型的细菌、8种或更少类型的细菌、7种或更少类型的细菌、6种或更少类型的细菌、5种或更少类型的细菌、4种或更少类型的细菌、或3种或更少类型的细菌。在另一个实施方案中，细菌组合物包含2至不超过40、2至不超过30、2至不超过20、2至不超过15、2至不超过10、或2至不超过5种类型的细菌。
由物种描述的细菌组合物
可制备包含选自表1中的物种的至少两种类型的分离细菌的细菌组合物。
在一个实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(先前称为粪链球菌(Streptococcusfaecalis))、无害梭菌(Clostridiuminnocuum)、多枝梭菌(Clostridiumramosum)、卵形拟杆菌(Bacteroidesovatus)、普通拟杆菌(Bacteroidesvulgatus)、多形拟杆菌(Bacteroidesthetaoiotaomicron)、大肠埃希氏菌(1109和1108-1)、双酶梭菌和产生布劳特氏菌(Blautiaproducta)(先前称为产生消化链球菌(Peptostreptococcusproductus))。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
在一个实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：粪肠球菌(先前称为粪链球菌)、无害梭菌、多枝梭菌、卵形拟杆菌、普通拟杆菌、多形拟杆菌、大肠埃希氏菌(1109和1108-1)、双酶梭菌和产生布劳特氏菌(先前称为产生消化链球菌)。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
在另一个实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：肠氨基酸球菌(Acidaminococcusintestinalis)、卵形拟杆菌、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)的两个菌株、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)的两个菌株、产生布劳特氏菌、耳蜗形梭菌(Clostridiumcocleatum)、产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)、长链多利菌(Dorealongicatena)的两个菌株、大肠埃希氏菌、链状真杆菌(Eubacteriumdesmolans)、挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、直肠真杆菌(Eubacteriumrectale)的四个菌株、凸腹真杆菌(Eubacteriumventriosumi)、普氏粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、裂果胶毛螺菌(Lachnospirapectinoshiza)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、干酪/副干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei/paracasei)、吉氏副拟杆菌(Paracateroidesdistasonis)、拉乌尔菌属(Raoultellasp.)、罗斯氏菌属的一个菌株(选自粪罗斯氏菌(Roseburiafaecalis)或粪便罗斯氏菌(Roseburiafaecis))、肠道罗斯氏菌(Roseburiaintestinalis)、扭链瘤胃球菌(Ruminococcustorques)的两个菌株、卵形瘤胃球菌(Ruminococcusobeum)的两个菌株和缓症链球菌(Streptococcusmitis)。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
在另一个实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：人肠巴尼斯菌(Barnesiellaintestinihominis)；罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)；表征为海氏肠球菌(Enterococcushirae)、屎肠球菌(Enterococusfaecium)或耐久肠球菌(Enterococcusdurans)之一的物种；表征为粪厌氧棒状菌(Anaerostipescaccae)或吲哚梭菌(Clostridiumindolis)之一的物种；表征为沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)或巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)之一的物种；和伊氏阿德勒菌(Adlercreutziaequolifaciens)。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
在其他实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：不同梭菌(Clostridiumabsonum)、阿根廷梭菌(Clostridiumargentinense)、霸氏梭菌(Clostridiumbaratii)、巴氏梭菌(Clostridiumbartlettii)、双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、尸毒梭菌(Clostridiumcadaveris)、卡米斯梭菌(Clostridiumcamis)、隐藏梭菌(Clostridiumcelatum)、肖氏梭菌(Clostridiumchauvoei)、梭状梭菌(Clostridiumclostridioforme)、匙形梭菌(Clostridiumcochlearium)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、谲诈梭菌(Clostridiumfallax)、费新尼亚梭菌(Clostridiumfelsineum)、戈氏梭菌(Clostridiumghonii)、乙二醇梭菌(Clostridiumglycolicum)、溶血梭菌(Clostridiumhaemolyticum)、矛形梭菌(Clostridiumhastiforme)、溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)、吲哚梭菌、无害梭菌、不规则梭菌(Clostridiumirregulare)、泥渣梭菌(Clostridiumlimosum)、恶名梭菌(Clostridiummalenominatum)、诺维梭菌(Clostridiumnovyi)、乳清酸梭菌(Clostridiumoroticum)、类腐败梭菌(Clostridiumparaputrificum)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、发状梭菌(Clostridiumpiliforme)、腐化梭菌(Clostridiumputrefaciens)、腐败梭菌(Clostridiumputrificum)、多枝梭菌、撒丁岛梭菌(Clostridiumsardiniense)、煎盘梭菌(Clostridiumsartagoforme)、闪烁梭菌(Clostridiumscindens)、败毒梭菌(Clostridiumsepticum)、索氏梭菌(Clostridiumsordellii)、楔形梭菌(Clostridiumsphenoides)、螺状梭菌(Clostridiumspiroforme)、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、近端梭菌(Clostridiumsubterminale)、共生梭菌(Clostridiumsymbiosum)、第三梭菌(Clostridiumtertium)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)和多毛梭菌(Clostridiumvillosum)。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
在一个实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：无害梭菌、双酶梭菌、丁酸梭菌、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)、多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)、大肠埃希氏菌的三个菌株和乳杆菌属。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
在一个实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：双酶梭菌、无害梭菌、丁酸梭菌、大肠埃希氏菌的三个菌株、拟杆菌的三个菌株和产生布劳特氏菌。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
在一个实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：拟杆菌属、大肠埃希氏菌和非致病性梭菌属(包括无害梭菌、双酶梭菌和多枝梭菌)。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
在一个实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：拟杆菌物种、大肠埃希氏菌和非致病性梭菌属如丁酸梭菌、双酶梭菌和无害梭菌。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
在一个实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：粪拟杆菌(Bacteroidescaccae)、多毛拟杆菌(Bacteroidescapillosus)、凝结拟杆菌(Bacteroidescoagulans)、狄氏拟杆菌(Bacteroidesdistasonis)、埃氏拟杆菌(Bacteroideseggerthii)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌-ryhm、纤细拟杆菌(Bacteroidesgracilis)、利氏拟杆菌(Bacteroideslevii)、猕猴拟杆菌(Bacteroidesmacacae)、屎拟杆菌(Bacteroidesmerdae)、卵形拟杆菌、侵肺拟杆菌(Bacteroidespneumosintes)、腐败拟杆菌(Bacteroidesputredinis)、化脓拟杆菌(Bacteroidespyogenes)、内脏拟杆菌(Bacteroidessplanchnicus)、粪便拟杆菌(Bacteroidesstercoris)、隐蔽拟杆菌(Bacteroidestectum)、多形拟杆菌、单形拟杆菌、解脲拟杆菌(Bacteroidesureolyticus)和普通拟杆菌。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
在一个实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：拟杆菌属、真杆菌属、梭杆菌属、丙酸杆菌属(Propionibacteria)、乳杆菌属、厌氧性球菌属、瘤胃球菌属、大肠埃希氏菌、芽殖菌属(Gemmiger)、脱硫单胞菌属(Desulfomonas)和消化链球菌属(Peptostreptococcus)。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
在一个实施方案中，细菌组合物包含以下中的至少一种并且优选一种以上：脆弱拟杆菌普通亚种(Bacteroidesfragilisss.Vulgatus)、产气真杆菌(Eubacteriumaerofaciens)、脆弱拟杆菌多形亚种(Bacteroidesfragilisss.Thetaiotaomicron)、产生布劳特氏菌(先前称为产生消化链球菌II)、脆弱拟杆菌吉氏亚种(Bacteroidesfragilisss.Distasonis)、普氏梭杆菌(Fusobacteriumprausnitzii)、规则粪球菌(Coprococcuseutactus)、产气真杆菌III、产生布劳特氏菌(先前称为产生消化链球菌I)、布氏瘤胃球菌(Ruminococcusbronii)、青春双歧杆菌、甲酸芽殖菌(Gemmigerformicilis)、长双歧杆菌、惰性真杆菌(Eubacteriumsiraeum)、扭链瘤胃球菌、直肠真杆菌III-H、直肠真杆菌IV、挑剔真杆菌、埃氏拟杆菌、柔嫩梭菌(Clostridiumleptum)、脆弱拟杆菌两形真杆菌亚种(Bacteroidesfragilisss.A,Eubacteriumbiforme)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、直肠真杆菌III-F、陪伴粪球菌(Coprococcuscomes)、多毛拟杆菌、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、产甲酸真杆菌(Eubacteriumformicigenerans)、霍氏真杆菌(Eubacteriumhallii)、凸腹真杆菌I、鲁斯梭杆菌(Fusobacteriumrussii)、卵形瘤胃球菌、直肠真杆菌II、多枝梭菌I、赖氏乳杆菌(Lactobacillusleichmanii)、伶俐瘤胃球菌(Ruminococcuscailidus)、穗状丁酸弧菌(Butyrivibriocrossotus)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcusfermentans)、凸腹真杆菌、脆弱拟杆菌脆弱亚种、拟杆菌AR、灵巧粪球菌(Coprococcuscatus)、庞大真杆菌(Eubacteriumhadrum)、柱状真杆菌(Eubacteriumcylindroides)、反刍真杆菌(Eubacteriumruminantium)、真杆菌CH-1、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、消化链球菌BL、粘液真杆菌、锐利拟杆菌(Bacteroidespraeacutus)、拟杆菌L、死亡梭杆菌I(FusobacteriummortiferumI)、舟形梭杆菌(Fusobacteriumnaviforme)、无害梭菌、多枝梭菌、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、瘤胃球菌AT、消化球菌AU-1、真杆菌AG、真杆菌AK、真杆菌AL、真杆菌AL-1、真杆菌AN；脆弱拟杆菌卵形亚种、脆弱拟杆菌d亚种、脆弱拟杆菌f亚种；拟杆菌L-1、L-5；具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、死亡梭杆菌、大肠埃希氏菌、麻疹链球菌(Streptococcusmorbiliorum)、大消化球菌(Peptococcusmagnus)、消化球菌G、AU-2；中间链球菌(Streptococcusintermedius)、酸奶瘤胃球菌(Ruminococcuslactaris)、瘤胃球菌CO、吉米菌X、粪球菌BH、粪球菌CC；纤细真杆菌(Eubacteriumtenue)、细枝真杆菌(Eubacteriumramulus)、真杆菌AE、真杆菌AG-H、真杆菌AG-M、真杆菌AJ、真杆菌BN-1；梭形拟杆菌梭形亚种(Bacteroidesclostridiiformisss.clostridliformis)、凝结拟杆菌、口腔拟杆菌(Bacteroidesorails)、栖瘤胃拟杆菌短亚种(Bacteroidesruminicolass.brevis)、栖瘤胃拟杆菌栖瘤胃亚种(Bacteroidesruminicolass.ruminicola)、内脏拟杆菌、惰性脱硫单胞菌(Desuifomonaspigra)、拟杆菌L-4、拟杆菌N-i；梭杆菌H、乳杆菌G和琥珀酸弧菌A。在一个替代实施方案中，至少一种前述物种基本上不存在于细菌组合物中。
由操作分类单元(OTU)描述的细菌组合物
可制备包含选自表1中的物种的至少两种类型的分离细菌的细菌组合物。
在一个实施方案中，OTU可由16S序列的一个或多个可变区(V1-V9)表征。使用基于命名法的大肠埃希氏菌系统的编号，细菌中的这些区域分别由核苷酸69-99、137-242、433-497、576-682、822-879、986-1043、1117-1173、1243-1294和1435-1465限定。(参见例如Brosius等,Completenucleotidesequenceofa16SribosomalRNAgenefromEscherichiacoli,PNAS75(10):4801-4805(1978))。在一些实施方案中，V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8和V9区域中的至少一个用于表征OTU。在一个实施方案中，V1、V2和V3区域用于表征OTU。在另一个实施方案中，V3、V4和V5区域用于表征OTU。在另一个实施方案中，V4区域用于表征OTU。
不包括某些细菌物种或菌株的细菌组合物
在一个实施方案中，细菌组合物不包含粪肠球菌(先前称为粪链球菌)、无害梭菌、多枝梭菌、卵形拟杆菌、普通拟杆菌、多形拟杆菌、大肠埃希氏菌(1109和1108-1)、双酶梭菌和产生布劳特氏菌(先前称为产生消化链球菌)中的至少一种。
在另一个实施方案中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：肠氨基酸球菌、卵形拟杆菌、青春双歧杆菌的两个物种、长双歧杆菌的两个物种、产气柯林斯菌、长链多利菌的两个物种、大肠埃希氏菌、挑剔真杆菌、粘液真杆菌、直肠真杆菌的四个物种、凸腹真杆菌、普氏粪杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、吉氏副拟杆菌、拉乌尔菌属、罗斯氏菌属的一个物种(选自粪罗斯氏菌或粪便罗斯氏菌)、肠道罗斯氏菌、扭链瘤胃球菌的两个物种、和缓症链球菌。
在另一个实施方案中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：人肠巴尼斯菌；罗伊氏乳杆菌；表征为海氏肠球菌、屎肠球菌或耐久肠球菌之一的物种；表征为粪厌氧棒状菌或吲哚梭菌之一的物种；表征为沃氏葡萄球菌或巴氏葡萄球菌之一的物种；和伊氏阿德勒菌。
在其他实施方案中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：不同梭菌、阿根廷梭菌、霸氏梭菌、双酶梭菌、肉毒梭菌、丁酸梭菌、尸毒梭菌、卡米斯梭菌、隐藏梭菌、肖氏梭菌、梭状梭菌、匙形梭菌、艰难梭菌、谲诈梭菌、费新尼亚梭菌、戈氏梭菌、乙二醇梭菌、溶血梭菌、矛形梭菌、溶组织梭菌、吲哚梭菌、无害梭菌、不规则梭菌、泥渣梭菌、恶名梭菌、诺维梭菌、乳清酸梭菌、类腐败梭菌、产气荚膜梭菌、发状梭菌、腐化梭菌、腐败梭菌、多枝梭菌、撒丁岛梭菌、煎盘梭菌、闪烁梭菌、败毒梭菌、索氏梭菌、楔形梭菌、螺状梭菌、生孢梭菌、近端梭菌、共生梭菌、第三梭菌、破伤风梭菌、魏氏梭菌和多毛梭菌。
在另一个实施方案中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：无害梭菌、双酶梭菌、丁酸梭菌、脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、大肠埃希氏菌的三个菌株和乳杆菌属。
在另一个实施方案中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：双酶梭菌、无害梭菌、丁酸梭菌、大肠埃希氏菌的三个菌株、拟杆菌的三个菌株，和产生布劳特氏菌(先前称为产生消化链球菌)。
在另一个实施方案中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：拟杆菌属、大肠埃希氏菌，和非致病性梭菌，包括无害梭菌、双酶梭菌和多枝梭菌。
在另一个实施方案中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：一种以上的拟杆菌物种、大肠埃希氏菌和非致病性梭菌如丁酸梭菌、双酶梭菌和无害梭菌。
在另一个实施方案中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：粪拟杆菌、多毛拟杆菌、凝结拟杆菌、狄氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、福氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌-ryhm、纤细拟杆菌、利氏拟杆菌、猕猴拟杆菌、屎拟杆菌、卵形拟杆菌、侵肺拟杆菌、腐败拟杆菌、化脓拟杆菌、内脏拟杆菌、粪便拟杆菌、隐蔽拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、解脲拟杆菌和普通拟杆菌。
在另一个实施方案中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：拟杆菌属、真杆菌属、梭杆菌属、丙酸杆菌属、乳杆菌属、厌氧性球菌属、瘤胃球菌属、大肠埃希氏菌、芽殖菌属、脱硫单胞菌属和消化链球菌属。
在另一个实施方案中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：脆弱拟杆菌普通亚种、产气真杆菌、脆弱拟杆菌多形亚种、产生布劳特氏菌(先前称为产生消化链球菌II)、脆弱拟杆菌吉氏亚种、普氏梭杆菌、规则粪球菌、产气真杆菌III、产生布劳特氏菌(先前称为产生消化链球菌I)、布氏瘤胃球菌、青春双歧杆菌、甲酸芽殖菌、长双歧杆菌、惰性真杆菌、扭链瘤胃球菌、直肠真杆菌III-H、直肠真杆菌IV、挑剔真杆菌、埃氏拟杆菌、柔嫩梭菌、脆弱拟杆菌两形真杆菌亚种、婴儿双歧杆菌、直肠真杆菌III-F、陪伴粪球菌、多毛拟杆菌、白色瘤胃球菌、产甲酸真杆菌、霍氏真杆菌、凸腹真杆菌I、鲁斯梭杆菌、卵形瘤胃球菌、直肠真杆菌II、多枝梭菌I、赖氏乳杆菌、伶俐瘤胃球菌、穗状丁酸弧菌、发酵氨基酸球菌、凸腹真杆菌、脆弱拟杆菌脆弱亚种、拟杆菌AR、灵巧粪球菌、庞大真杆菌、柱状真杆菌、反刍真杆菌、真杆菌CH-1、表皮葡萄球菌、消化链球菌BL、粘液真杆菌、锐利拟杆菌、拟杆菌L、死亡梭杆菌I、舟形梭杆菌、无害梭菌、多枝梭菌、痤疮丙酸杆菌、生黄瘤胃球菌、瘤胃球菌AT、消化球菌AU-1、真杆菌AG、真杆菌AK、真杆菌AL、真杆菌AL-1、真杆菌AN；脆弱拟杆菌卵形亚种、脆弱拟杆菌d亚种、脆弱拟杆菌f亚种；拟杆菌L-1、L-5；具核梭杆菌、死亡梭杆菌、大肠埃希氏菌、麻疹链球菌、大消化球菌、消化球菌G、AU-2；中间链球菌、酸奶瘤胃球菌、瘤胃球菌CO、吉米菌X、粪球菌BH、粪球菌CC；纤细真杆菌、细枝真杆菌、真杆菌AE、真杆菌AG-H、真杆菌AG-M、真杆菌AJ、真杆菌BN-1；梭形拟杆菌梭形亚种、凝结拟杆菌、口腔拟杆菌、栖瘤胃拟杆菌短亚种、栖瘤胃拟杆菌栖瘤胃亚种、内脏拟杆菌、惰性脱硫单胞菌、拟杆菌L-4、拟杆菌N-i；梭杆菌H、乳杆菌G和琥珀酸弧菌A。
细菌病原体的抑制
在一些实施方案中，细菌组合物提供针对一种或多种相关GI病原体感染的保护性或治疗性作用。
如由病原体状态所指示，示例性细菌病原体的列表提供于表1中。
在一些实施方案中，致病细菌选自：耶尔森氏菌属(Yersinia)、弧菌属(Vibrio)、密螺旋体属(Treponema)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、立克次体属(Rickettsia)、东方体属(Orientia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、奈瑟菌属(Neisseria)、支原体属(Mycoplasma)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、李斯特菌属(Listeria)、钩端螺旋体属(Leptospira)、军团菌属(Legionella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、幽门螺杆菌属(Helicobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、埃希氏菌属(Escherichia)、埃利希氏体属(Ehrlichia)、肠球菌属(Enterococcus)、柯克斯体属、棒杆菌属(Corynebacterium)、梭菌属、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣体属(Chlamydophila)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、布鲁菌属(Brucella)、疏螺旋体属(Borrelia)、鲍特菌属(Bordetella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、多重耐药性细菌、广谱耐β内酰胺肠球菌(ESBL)、耐碳青霉烯肠杆菌(CRE)和耐万古霉素肠球菌(VRE)。
在一些实施方案中，这些病原体包括(但不限于)嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacterfetus)、志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、肠集聚性大肠埃希氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、肠产毒性大肠埃希氏菌(例如但不限于LT和/或ST)、大肠埃希氏菌0157:H7、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsielliapneumonia)、单核细胞增生性李斯特菌(Lysteriamonocytogenes)、志贺邻单胞菌、沙门氏菌属、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonellaparatyphi)、志贺氏菌属(Shigellaspp.)、葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、耐万古霉素肠球菌属、弧菌属(Vibriospp.)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)。
在一个实施方案中，相关病原体为选自艰难梭菌、沙门氏菌属、致病性大肠埃希氏菌、耐万古霉素肠球菌属和广谱耐β内酰胺肠球菌(ESBL)的至少一种病原体。
纯化芽孢群体
在一些实施方案中，细菌组合物包含纯化芽孢群体。纯化芽孢群体含有人类肠道微生物群的共生细菌与当施用至哺乳动物受试者时有意义地提供健康微生物群的功能的能力的组合。不限于特定的机理，据认为，这些组合物抑制病原体如艰难梭菌、沙门氏菌属、肠致病性大肠埃希氏菌和耐万古霉素肠球菌属的生长，因此可以维持健康、多样和保护性的微生物群，或者在致病性细菌感染如艰难梭菌感染的情况下，在肠腔恢复种群以重建对潜在病原体的生态控制。在一些实施方案中，出于治疗用途还对酵母芽孢和其他真菌芽孢进行纯化和选择。
本文公开含有非致病性的有萌发能力的细菌芽孢的治疗组合物，其用于预防、控制和治疗胃肠疾病、病症和病状以及用于一般营养保健。这些组合物在适于安全施用至人类和其他哺乳动物受试者中是有利的并且在众多胃肠疾病、病症和病状中以及一般营养保健中是有效的。虽然基于芽孢的组合物是已知的，但它们通常是根据各种技术如液体细菌培养物的冻干或喷雾干燥来制备的，从而导致不良功效、不稳定性、相当大的可变性和缺乏足够的安全性。
现已发现，细菌芽孢群体可以获自从哺乳动物受试者(包括人类)获得的生物材料。这些群体被配制成如本文所提供的组合物，并且使用如本文所提供的方法施用至哺乳动物受试者。
本文提供含有纯化的细菌芽孢群体的治疗组合物。如本文所用，术语“纯化(purify)”、“纯化的”和“纯化(purifying)”是指已经历一个或多个纯化过程(例如所需细胞芽孢的选择或富集，或可选地如本文所述的残栖产物的去除或降低)的所需细胞芽孢的群体(例如，多个已知或未知的量和/或浓度)的状态。在一些实施方案中，纯化群体不具有可检测的不希望的活性，或可选地，不希望的活性的水平或量处于或低于可接受的水平或量。在其他实施方案中，纯化群体具有处于或高于可接受的量和/或浓度的所需细胞芽孢的量和/或浓度。在其他实施方案中，纯化的细菌芽孢群体相比于获得群体的原料(例如，粪便材料)富集。相比于原料，这种富集可能是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、99.9999％或大于99.9999％。
在某些实施方案中，纯化的细菌芽孢群体具有降低或不可检测水平的一种或多种致病活性，例如毒性、哺乳动物受体受试者感染、免疫调节活性、自身免疫反应、代谢反应、或炎症反应或神经系统反应。相比于原料，致病活性的这种降低可能是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、99.9999％或大于99.9999％。在其他实施方案中，纯化的细菌芽孢群体相比于粪便材料具有降低的感官成分，例如降低的气味、味道、外观和鲜味。
提供基本上不含残栖产物的纯化的细菌芽孢群体。在某些实施方案中，这是指细菌芽孢组合物不再含有大量的与微生物群落相关的生物物质，而生存在人类或动物受试者之上或之中，并且纯化的芽孢群体可能100％不含、99％不含、98％不含、97％不含、96％不含或95％不含与微生物群落相关的生物物质的任何污染。基本上不含残栖产物也可能是指细菌芽孢组合物不含可检测的来自人类或动物的细胞，并且仅微生物细胞是可检测的，特别是，仅所需的微生物细胞是可检测的。在另一个实施方案中，这意味着与微生物细胞相比，细菌组合物中少于1×10-2％、1×10-3％、1×10-4％、1×10-5％、1×10-6％、1×10-7％、1×10-8％的细胞是人类或动物。在另一个实施方案中，纯化群体中存在的残栖产物相比于从哺乳动物供体受试者获得的粪便材料至少降低特定水平，例如，降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、99.9999％或大于99.9999％。
在一个实施方案中，基本上不含残栖产物或基本上不含可检测水平的致病物质是指细菌组合物不含可检测的病毒(包括细菌病毒(即噬菌体))、真菌、或支原体或弓形虫污染物，或真核寄生虫如蠕虫。可选地，纯化的芽孢群体基本上不含非细胞材料，例如，DNA、病毒涂层材料或非活细菌材料。
如本文所述，纯化的芽孢群体可通过如下证实：遗传分析(例如，PCR、DNA测序)、血清学和抗原分析，和使用诸如利用区分所需细菌芽孢与不希望的污染材料的试剂进行的流式细胞仪等仪器的方法。
示例性生物材料包括粪便材料，例如从小肠和大肠的各个区段分离的粪便或材料。粪便材料是从哺乳动物供体受试者获得的，或者可获自一个以上的供体受试者，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、400、500、750、1000个或多于1000个供体，其中然后在纯化所需细胞芽孢之前将所述材料汇集。
在替代实施方案中，所需的细菌芽孢是从由单一供体获得的单个粪便材料样品中纯化的，并且在这种纯化后与来自其他纯化的纯化芽孢群体组合，后者来自不同时间的相同供体，或来自一个或多个不同供体，或两者。
优选的细菌属包括醋丝菌属(Acetonema)、嗜碱菌属、脂环酸芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、制氨菌属(Ammonifex)、厌氧杆菌属(Anaerobacter)、厌氧梭状菌属、厌氧棒状菌属、厌氧干菌属、厌氧芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、布劳特氏菌属、短芽孢杆菌属、布兰特氏菌属、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、喜热菌属(Caloramator)、丝状菌属(Candidatus)、羧基双短菌属(Carboxydibrachium)、一氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)、梭菌属、科恩氏菌属(Cohnella)、粪球菌属、树源生孢杆菌属(Dendrosporobacter)、脱亚硫酸菌属、脱硫芽孢弯曲杆菌(Desulfosporosinus)、脱硫肠状菌属、多利菌属、真杆菌属、粪杆菌属、产线菌属、地芽孢杆菌属、盐拟杆菌属(halobacteroides)、太阳杆状菌属(Heliobacillus)、太阳杆菌属(Heliobacterium)、嗜日菌属(Heliophilum)、日绳菌属(Heliorestis)、毛绒厌氧杆菌属(Lachnoanaerobaculum)、赖氨酸芽孢杆菌属、穆尔氏菌属、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、奥芮氏菌属(Orenia(S.))、嗜草酸菌属(Oxalophagus)、产醋杆菌属(Oxobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、暗生孢菌属(Pelospora)、消化肠状菌属(Pelotomaculum)、丙酸孢菌属(Propionispora)、罗斯氏菌属、瘤胃球菌属、八叠球菌属、孢杆菌属、芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、鼠孢菌属(Sporomusa)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、芽孢肠状菌属(Sporotomaculum)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、共生小杆菌属(Symbiobacterium)、共养香肠样杆菌属(Syntrophobotulus)、共养生孢菌属(Syntrophospora)、土地芽孢杆菌属(Terribacillus)、嗜热厌氧杆菌属和热弯曲杆菌属(Thermosinus)。
优选的细菌物种提供于表X4。在提供特定菌株的物种时，本领域技术人员将认识到，其他菌株的物种可以取代所提及的菌株。
在一些实施方案中，芽孢形成细菌通过调节芽孢形成的核酸序列的存在来鉴定。特别是，标记芽孢形成基因在关系较远的属成员(包括梭菌和芽孢杆菌)之间高度保守。正向遗传学的传统方法已经鉴定了许多(如果不是全部)对于芽孢形成(spo)必需的基因。芽孢形成的发育程序由四种隔室特异性σ因子的连续作用(以σF、σE、σG和σK的顺序出现)部分地支配，所述因子的活性局限于前芽孢(σF和σG)或母细胞(σE和σK)。
提供含有一种以上类型的细菌的芽孢群体。如本文所用，一种“类型”或一种以上“类型”的细菌可在属水平、种水平、亚种水平、菌株水平或通过如本文所述和本领域中以其他方式已知的任何其他分类方法区分。
在一些实施方案中，纯化群体中存在的所有或基本上所有的细菌芽孢获自如本文所述或以本领域中已知的其他方式处理的粪便材料。在替代实施方案中，一种或一种以上的细菌芽孢或者一种或一种以上类型的细菌芽孢在培养中产生并组合以形成纯化的芽孢群体。在其他替代实施方案中，这些培养产生的芽孢群体中的一种或多种与粪便材料源芽孢群体组合以产生杂合芽孢群体。细菌组合物可含有至少两种类型的这些优选细菌，包括相同物种的菌株。例如，细菌组合物可包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或至少20或20种以上类型的如由物种或涵盖这些物种的操作分类单元(OTU)所定义的细菌。
因此，本文提供用于制造含有适于治疗性施用至有需要的哺乳动物受试者的细菌芽孢群体的组合物的方法。并且所述组合物一般是通过以下步骤来制造：(a)提供从哺乳动物供体受试者获得的粪便材料；和(b)在使得从所述粪便材料产生细菌芽孢群体的条件下对所述粪便材料进行至少一个纯化处理或步骤。将所述组合物配制以使得单一口服剂量含有至少约1×104菌落形成单位的细菌芽孢，并且单一口服剂量通常将含有约1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015或大于1×1015CFU的细菌芽孢。在给定纯化芽孢群体中，给定类型的细菌芽孢的存在和/或浓度可能是已知或未知的。如果已知，则例如给定菌株或所有菌株的聚集体的芽孢浓度为例如每克组合物或每施用剂量1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015或大于1×1015个活细菌芽孢。
在一些制剂中，以质量计，组合物含有至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％芽孢。在一些制剂中，施用剂量不超过200、300、400、500、600、700、800、900毫克或1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9克质量。
细菌芽孢组合物通常被配制用于经口或经胃施用，通常施用至哺乳动物受试者。在特定实施方案中，组合物被配制以固体、半固体、凝胶或液体形式，例如以丸剂、片剂、胶囊或糖锭形式经口施用。在一些实施方案中，这些制剂含有肠溶衣或被包覆肠溶衣以保护细菌通过胃和小肠，但芽孢通常耐胃和小肠。
细菌芽孢组合物可经配制以在单次施用中或经多次施用在给定哺乳动物受试者中有效。例如，单次施用基本上可有效降低被施用组合物的哺乳动物受试者中的艰难梭菌和/或艰难梭菌毒素含量。基本上有效是指在施用组合物后，受试者中的艰难梭菌和/或艰难梭菌毒素含量降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99％以上。
本发明的方法
用于测定16S序列的方法
通过rRNA基因的完全16S测序，通过这个基团的特定高变区(即V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8或V9)的测序，或通过来自这个基因的高变区的任何组合(例如V1-3或V3-5)的测序来定义OTU。细菌16SrDNA的长度为约1500个核苷酸并且用于使用系统发育方法来重建一种细菌分离株与另一种细菌分离株的进化关系和序列相似性。16S序列被用于系统发育重建，因为它们一般是高度保守的，但含有具有足够核苷酸多样性以区分大多数微生物的属和种的特定高变区。
使用众所周知的技术，为了测定完全16S序列或16S序列的任何高变区的序列，从细菌样品提取基因组DNA，使用聚合酶链反应(PCR)扩增16SrDNA(完全区域或特定高变区)，清除PCR产物，并且描绘核苷酸序列以确定16S基因或所述基因的子结构域的遗传组成。如果进行完全16S测序，则所用的测序方法可能是(但不限于)Sanger测序。如果使用一个或多个高变区如V4区域，则测序可能是(但不限于)使用Sanger方法或使用下一代测序方法如使用允许多重反应的条形码引物的Illumina(通过合成测序)方法来进行的。
可通过核苷酸标志物或基因的组合、特别是高保守基因(例如，“管家”基因)或它们的组合来定义OTU，使用扩增的遗传产物或全基因组序列(WGS)来产生全基因组序列或部分基因组序列。使用充分定义的方法，从细菌样品提取的DNA将具有使用PCR扩增的特定基因组区域并测序以确定所扩增产物的核苷酸序列。在全基因组鸟枪(WGS)方法中，所提取的DNA将不经扩增而直接测序。可使用任何测序技术产生序列数据，所述技术包括(但不限于)Sanger、Illumina、454LifeSciences、IonTorrent、ABI、PacificBiosciences和/或OxfordNanopore。
用于制备供施用至受试者的细菌组合物的方法
用于制备细菌组合物的方法可以包括三个主要处理步骤，以及一个或多个混合步骤。所述步骤包括生物体积存(banking)、生物体产生和保存。
对于积存，细菌组合物中包括的菌株可能(1)直接从试样分离或从积存储备物获取，(2)任选地在支持生长的营养琼脂或肉汤上培养以产生活生物质，和(3)将所述生物质任选地长期储存保存在多个等分试样中。
在使用培养步骤的实施方案中，琼脂或肉汤可含有提供能够实现生长的必要元素和特定因子的营养素。实例将为由20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L大豆蛋白胨、2g/L柠檬酸、1.5g/L磷酸二氢钠、100mg/L柠檬酸铁铵、80mg/L硫酸镁、10mg/L氯化血红素、2mg/L氯化钙、1mg/L甲萘醌构成的培养基。多种微生物培养基和变化是本领域中众所周知的(例如R.M.Atlas,微生物培养基手册(HandbookofMicrobiologicalMedia)(2010)CRCPress)。培养基可在最初向培养物中添加，可在培养期间添加，或者可间歇地/连续地流过培养物。细菌组合物中的菌株可单独地、作为细菌组合物的子集或作为包含细菌组合物的完整收集物培养。例如，第一菌株可与第二菌株在混合连续培养物中一起培养，稀释速率低于任一种细胞的最大生长速率以防止培养物从培养中洗出。
将接种培养物在有利条件下温育足以形成生物质的时间。对于供人类使用的细菌组合物，这通常是在具有与正常人类生境类似的值的37℃温度、pH和其他参数下。环境可能主动控制，被动控制(例如，经由缓冲液)或使其逐渐变动。例如，对于厌氧性细菌组合物(例如，肠道微生物群)，可以使用缺氧/还原环境。这可以通过向肉汤添加还原剂如半胱氨酸和/或剥夺氧来实现。例如，细菌组合物的培养物可以在37℃、pH7下，在用1g/L盐酸半胱氨酸预还原的上述培养基中生长。
当培养物已产生足够生物质时，其可以保存用于积存。可以将生物体放置在保护免于冷冻(添加‘冷冻保护剂’)、干燥(‘冻干保护剂’)和/或渗透压休克(‘渗透保护剂’)的化学环境中，分配在多个(任选地相同)容器中以产生均一积存，然后处理培养物以供保存。容器一般是不可渗透的并且具有确保与环境隔离的外壳。冷冻保存处理是通过在超低温度下(例如，处于或低于-80℃下)冷冻液体来实现的。干燥保存通过蒸发(在喷雾干燥或‘冷却干燥’的情况下)或通过升华(例如，对于冷冻干燥、喷雾冷冻干燥)从培养物中除去水。水的去除改进了在高于低温的温度下的长期细菌组合物储存稳定性。如果细菌组合物包含芽孢形成物质并且导致芽孢的产生，则最终组合物可通过其他方式如使用上文所述技术保存的密度梯度离心来纯化。可以通过单独地培养和保存菌株，或通过将菌株混合在一起以产生组合库来进行细菌组合物积存。作为冷冻保存的实例，可以通过离心收集细菌组合物培养物以使细胞从培养基中形成球粒，将上清液倾析并用含有15％甘油的新鲜培养肉汤置换。然后可将培养物等分到1mL冻存管中，密封，并放置在-80℃下以保持长期活力。这个程序在从冷冻储存回收后达到可接受的活力。
可使用与积存类似的培养步骤(包括培养基组成和培养条件)来进行生物体产生。其可以在较大操作规模下进行，尤其是对于临床开发或商业生产。在更大规模下，在最终培养之前可能存在细菌组合物的若干子培养。在培养结束时，收集培养物以使得能够进一步配制成用于施用的剂型。这可能涉及浓缩，去除不合需要的培养基成分，和/或引入保存细菌组合物并使其经由所选途径可接受用于施用的化学环境中。例如，可将细菌组合物培养至1010CFU/mL的浓度，然后通过切向流微滤浓缩20倍；用过的培养基可以通过用由2％明胶、100mM海藻糖和10mM磷酸钠缓冲液组成的防腐培养基渗滤进行交换。
在干燥后，粉末可以共混到适当效能，并与其他培养物和/或填充剂如微晶纤维素混合以实现一致性和容易处理性，并且如本文所提供配制细菌组合物。
细菌组合物的施用
本发明的细菌组合物适于施用至有需要的哺乳动物和非哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物受试者是具有生态失调的一种或多种症状的人类受试者，所述症状包括(但不限于)不希望的病生菌或病原体的过度生长，关键细菌分类单元如拟杆菌或硬壁菌门(Firmicutes)或其属或种的表现降低，或相比于健康个体的微生物物种的多样性降低，或厌氧性细菌的总丰度降低。
当哺乳动物受试者罹患以异常微生物群为特征的疾病、病症或病状时，本文所述的细菌组合物适用于其治疗。在一些实施方案中，在用细菌组合物治疗之前，哺乳动物受试者未接受抗生素。例如，在施用治疗组合物之前的一周内，哺乳动物受试者尚未施用至少两个剂量的万古霉素、甲硝唑和/或类似的抗生素化合物。在其他实施方案中，在施用治疗组合物之前的一个月内，哺乳动物受试者先前未接受抗生素化合物。在其他实施方案中，哺乳动物受试者已接受用一种或多种不同的抗生素化合物进行的一次或多次治疗，并且所述治疗导致症状无改善或导致症状恶化。在一些实施方案中，在抗生素的成功过程后施用芽孢组合物以防止生态失调并增强多样的健康微生物群的恢复。
在一些实施方案中，胃肠疾病、病症或病状是由艰难梭菌造成的腹泻(包括复发性艰难梭菌感染)、溃疡性结肠炎、结肠炎、克罗恩病或肠易激病。有利地，在疾病、病症或病状的改善之前，仅施用一次治疗组合物。在一些实施方案中，以大于两天的时间间隔施用治疗组合物，例如每三天、四天、五天或六天一次、或每周一次或频率小于每周一次。或者，可根据设定时程间歇地施用制剂，例如，每天一次、每周一次或每月一次，或当受试者的原发疾病复发时。在另一个实施方案中，制剂可长期施用至处于感染这些病原体的风险中或可能是这些病原体的载体的个体，包括将进行侵入性医疗程序(例如手术)，将住院治疗，将居住在长期护理或康复机构中，将由于其专业(牲畜和动物加工人员)而暴露于病原体，或可能是病原体的载体(包括医院工作人员如医师、护士和其他医疗专业人员)的个体。
此外提供使用本文提供的治疗组合物来治疗或预防罹患如下代谢性疾病和病症或病状或处于患上如下代谢性疾病和病症或病状的风险中的哺乳动物受试者的方法，所述代谢性疾病和病症或病状选自糖尿病、代谢综合征、肥胖症、心脏疾病、自身免疫疾病、肝脏疾病和自闭症。
在实施方案中，细菌芽孢组合物是经肠施用的。这优先包括口服施用，或通过口或鼻管(包括鼻胃管、鼻空肠、口胃或口空肠)。在其他实施方案中，施用包括直肠施用(包括灌肠剂、栓剂或结肠镜检查)。细菌组合物可施用至胃肠道的至少一个区域，包括口腔、食道、胃、小肠、大肠和直肠。在一些实施方案中，将其施用至胃肠道的所有区域。细菌组合物可以诸如粉末、胶囊、片剂、凝胶或液体等药物形式经口施用。细菌组合物也可以凝胶或液体形式通过口服途径或经由鼻胃管施用，或以凝胶或液体形式通过直肠途径施用，经由结肠镜检查通过灌肠剂或滴注或通过栓剂施用。
如果组合物是通过结肠镜施用的，并且任选地如果细菌组合物是通过其他直肠途径(例如灌肠剂或栓剂)施用或即使受试者具有口服施用，则受试者可使用结肠清洁制剂。所述结肠清洁制剂可以促进结肠镜或其他施用装置的正确使用，但即使当它不提供机械目的时，它也可以最大化细菌组合物相对于受试者的胃肠道中先前驻留的其他生物体的比例。可使用任何通常可接受的结肠清洁制剂，例如当受试者进行结肠镜检查时通常所提供的那些。
为了评估受试者，在纯化芽孢群体施用后的第1天至第6个月，对生态失调的症状进行治疗后评估。在此期间收集粪便材料并且可以通过16SrDNA或宏基因组测序分析或本领域技术人员通常使用的其他分析来评估胃肠道中存在的微生物。随着芽孢群体催化肠道生态重塑为健康生命状态，在此期间将发生由芽孢群体提供的物种的种群恢复以及芽孢群体中不存在的共生微生物的强化。根据本说明书内引用的参考文献的教导，本说明书得到最充分理解。本说明书内的实施方案提供实施方案的说明并且不应被解释为限制范围。本领域技术人员容易认识到，涵盖许多其他实施方案。本公开中引用的所有出版物和专利都以全文引用的方式并入。在以引用的方式并入的材料相矛盾或与本说明书不一致的程度上，本说明书将优先于任何这种材料。本文中任何参考文献的引用并不是承认这些参考文献是现有技术。
治疗受试者的方法
在一些实施方案中，本文公开的组合物被施用至患者或使用者(有时统称为“受试者”)。如本文所用，“施用”涵盖其中一个人指导另一个人以特定方式和/或出于特定目的消耗细菌组合物的实施方案，以及其中使用者独立于从第二个人收到的任何指示或与其有差异地以特定方式和/或出于特定目的使用细菌组合物的情形。其中一个人指导另一个人以特定方式和/或出于特定目的消耗细菌组合物的实施方案的非限制性实例包括当医师规定指导和/或治疗患者的过程时，当父母命令未成年使用者(例如儿童)消费细菌组合物时，当教练建议使用者(例如运动员)遵循特定的指导和/或治疗过程时，以及当制造商、分配商或销售商向最终使用者建议使用条件时，例如经由与产品的销售或营销相关提供的包装上或其他材料上的广告或标签。
细菌组合物提供针对一种或多种相关GI病原体感染的保护性和/或治疗性作用并且可在急性感染情形已经解决后施用以防止复发，如果细菌组合物对于与GI病原体相同的抗生素不敏感，或为了预防感染或降低从疾病载体传播，则在急性感染情形期间施用作为抗生素疗法的补充。
本发明的细菌组合物可用于多种临床情形中。例如，当患者罹患急性感染时，所述细菌组合物可以作为抗生素补充治疗施用，以降低在急性感染已消退后的复发风险，或当患者将与具有或处于严重胃肠道感染风险下的其他人(医师、护士、医院工作人员、生病或住院治疗的那些人的家族成员)密切接近时。
本发明的细菌组合物可以施用至动物，包括人类、实验动物(例如，灵长类动物、大鼠、小鼠)、家畜(例如，牛、绵羊、山羊、猪、火鸡、鸡)，和家养宠物(例如，狗、猫、啮齿动物)。
在本发明方法中，细菌组合物可以经肠施用，换句话说，通过胃肠道接近途径施用。这包括口服施用、直肠施用(包括灌肠剂、栓剂或结肠镜检查)、通过口服或鼻管(鼻胃管、鼻空肠、口胃或口空肠)，如本文更充分详述。
预处理方案
在施用细菌组合物之前，患者可以任选地具有预处理方案以使胃肠道准备接受细菌组合物。在某些实施方案中，预处理方案是可取的，例如当患者具有高反弹病原体的急性感染时。在其他实施方案中，预处理方案完全是可选的，例如当引起感染的病原体没有反弹，或患者具有已经成功治疗的急性感染但医师担心感染可能复发时。在这些情况下，预处理方案可能增强细菌组合物影响患者的微生物组的能力。
作为使患者准备施用微生物生态系统的一种方式，可以施用至少一种抗生素以改变患者中的细菌。作为使患者准备施用微生物生态系统的另一种方式，可以向患者施用标准的结肠清洁制剂以基本上排空结肠内含物，例如用于使患者准备进行结肠镜检查。本申请中的“基本上排空结肠内含物”是指去除结肠内含物的正常体积的内含物的至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或约100％。抗生素治疗可能先于结肠清洁方案。
如果患者已接受抗生素用于治疗感染，或如果患者已接受抗生素作为特定预处理方案的一部分，则在一个实施方案中，抗生素可以在足够时间内终止以允许抗生素在肠道中的浓度大幅降低，随后施用细菌组合物。在一个实施方案中，抗生素可停用1、2或3天，然后施用细菌组合物。在另一个实施方案中，抗生素可停用3、4、5、6或7个抗生素半衰期，随后施用细菌组合物。在另一个实施方案中，可以选择抗生素以使得细菌组合物中的成分具有高于肠道中的抗生素浓度的MIC50。
可通过本领域中众所周知的方法来测定细菌组合物的MIC50或组合物中的元素。Reller等,AntimicrobialSusceptibilityTesting:AReviewofGeneralPrinciplesandContemporaryPractices,临床感染疾病(ClinicalInfectiousDiseases)49(11):1749-1755(2009)。在这种实施方案中，抗生素施用与细菌组合物施用之间的额外时间是没有必要的。如果预处理方案是急性感染的治疗的一部分，则可选择抗生素以使得感染对抗生素敏感，但细菌组合物中的成分对抗生素不敏感。
施用途径
本发明的细菌组合物适合施用至有需要的哺乳动物和非哺乳动物动物。在某些实施方案中，哺乳动物受试者是具有生态失调的一个或多个症状的人类受试者。
当哺乳动物受试者罹患以异常微生物群为特征的疾病、病症或病状时，本文描述的细菌组合物适合其治疗。在一些实施方案中，在用细菌组合物治疗之前，哺乳动物受试者尚未接受抗生素。例如，在施用治疗组合物之前的一周内，哺乳动物受试者未被施用至少两个剂量的万古霉素、甲硝唑和/或类似的抗生素化合物。在其他实施方案中，在施用治疗组合物之前的一个月内，哺乳动物受试者先前未接受抗生素化合物。在其他实施方案中，哺乳动物受试者已接受用一种或多种不同抗生素化合物进行的一种或多种治疗并且所述治疗导致症状无改善或症状恶化。
在一些实施方案中，胃肠疾病、病症或病状由艰难梭菌造成的腹泻(包括复发性艰难梭菌感染)、溃疡性结肠炎、结肠炎、克罗恩病或肠易激病。有利地，在疾病、病症或病状的改善之前，仅施用一次治疗组合物。在一些实施方案中，以大于两天的时间间隔施用治疗组合物，例如每三天、四天、五天或六天一次、或每周一次或频率小于每周一次。在其他实施方案中，可根据设定时程间歇地施用制剂，例如，每天一次、每周一次或每月一次，或当受试者的原发疾病复发时。在另一个实施方案中，制剂可长期施用至处于感染这些病原体的风险中或可能是这些病原体的载体的受试者，包括将进行侵入性医疗程序(例如手术)，将住院治疗，将居住在长期护理或康复机构中，将由于其专业(牲畜和动物加工人员)而暴露于病原体，或可能是病原体的载体(包括医院工作人员如医师、护士和其他健康护理专业人员)的受试者。
在某些实施方案中，细菌组合物是经肠施用的。这优先包括口服施用，或通过口或鼻管(包括鼻胃管、鼻空肠、口胃或口空肠)。在其他实施方案中，施用包括直肠施用(包括灌肠剂、栓剂或结肠镜检查)。细菌组合物可施用至胃肠道的至少一个区域，包括口腔、食道、胃、小肠、大肠和直肠。在一些实施方案中，将其施用至胃肠道的所有区域。细菌组合物可以诸如粉末、胶囊、片剂、凝胶或液体等药物形式经口施用。细菌组合物也可以凝胶或液体形式通过经口途径或经由鼻胃管施用，或以凝胶或液体形式通过直肠途径施用，经由结肠镜检查通过灌肠剂或滴注或通过栓剂施用。
如果组合物是通过结肠镜施用的，并且任选地如果细菌组合物是通过其他直肠途径(例如灌肠剂或栓剂)施用或即使受试者具有口服施用，则受试者可使用结肠清洁制剂。所述结肠清洁制剂可以促进结肠镜或其他施用装置的正确使用，但即使当它不提供机械目的时，它也可以最大化细菌组合物相对于受试者的胃肠道中先前驻留的其他生物体的比例。可使用任何通常可接受的结肠清洁制剂，例如当受试者进行结肠镜检查时通常所提供的那些。
施用剂量和方案
在一些实施方案中，细菌和细菌组合物以剂型提供。在某些实施方案中，所述剂型被设计用于施用本文公开的至少一种OTU或它们的组合，其中所施用的细菌组合物的总量选自0.1ng至10g、10ng至1g、100ng至0.1g、0.1mg至500mg、1mg至100mg、或10-15mg。在其他实施方案中，细菌组合物以每天0.1ng至10g、每天10ng至1g、每天100ng至0.1g、每天0.1mg至500mg、每天1mg至100mg、或每天10-15mg或更大的速率消耗。
在某些实施方案中，治疗期为至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年。在一些实施方案中，治疗期为1天至1周、1周至4周、1个月至3个月、3个月至6个月、6个月至1年、或1年以上。
在一个实施方案中，可以给定剂型向患者施用105和1012微生物总量。在另一个实施方案中，有效量可以1至500ml或1至500克的每ml或每克具有107至1011个细菌的细菌组合物提供，或具有1mg至1000mg的具有107至1011个细菌的冻干粉末的胶囊、片剂或栓剂。接受急性处理者可以相比于接受长期施用者(例如医院工作人员或接触长期护理设施者)接受更高的剂量。
本文所述的任何制剂可以在一个场合或在多个场合施用一次，例如每天一次持续数天或在施用当天每天一次以上(包括每天两次、每天三次、或每天高达五次)。在另一个实施方案中，可根据设定时程间歇地施用制剂，例如，每周一次、每月一次，或当患者的原发疾病复发时。在一个实施方案中，制剂可长期施用至处于感染这些病原体的风险中或可能是这些病原体的载体的个体，包括将进行侵入性医疗程序(例如手术)，将住院治疗，将居住在长期护理或康复机构中，将由于其专业(牲畜和动物加工人员)而暴露于病原体，或可能是病原体的载体(包括医院工作人员如医师、护士和其他医疗专业人员)的个体。
患者选择
特定的细菌组合物可以被选择用于单独的患者或用于具有特定特征的患者。例如，可对给定患者进行16S测序以鉴定他或她的微生物群中存在的细菌。测序可以使用16S测序(科、属或种水平)来分析患者的整个微生物组的特征，使用16S测序来分析患者的微生物组的一部分的特征，或者它可用于检测作为健康或特定疾病状态的生物标志物(例如多重耐药生物体或相关特定属如大肠埃希氏菌的标志物)的特定候选细菌的存在或不存在。基于生物标志物数据，可以选择特定组合物以施用至患者来增补或补充患者的微生物群以恢复健康或者治疗或预防疾病。在另一个实施方案中，可以筛选患者以测定其微生物群的组成来确定成功治疗的可能性。
组合疗法
细菌组合物可以与其他药剂以组合疗法模式施用，包括抗微生物剂和益生元。施用可以在数小时或数天的时期内依序进行或同时进行。
在一个实施方案中，细菌组合物可与一种或多种抗微生物剂一起包括于组合疗法中，所述抗微生物剂包括抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂和抗寄生虫剂。
抗细菌剂可以包括头孢菌素类抗生素(头版氨苄、头孢呋辛、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯和头孢吡普)；氟喹诺酮类抗生素(环丙沙星(cipro)、左氧氟沙星(Levaquin)、氧氟沙星(floxin)、加替沙星(tequin)、莫西沙星(avelox)和诺氟沙星(norflox))；四环素类抗生素(四环素、米诺环素、土霉素和多西环素)；青霉素类抗生素(阿莫西林、氨苄西林、青霉素V、双氯青霉素、羧苄青霉素、万古霉素和甲氧西林)；和碳青霉烯类抗生素(厄他培南、多尼培南、亚胺培南/西司他丁和美罗培南)。
抗病毒剂可以包括阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、安普那韦、阿扎那韦、西多福韦、地瑞那韦、拉韦啶、去羟肌苷、二十二烷醇、依非韦伦、埃替格韦、恩曲他滨、恩夫韦地、依曲韦林、泛昔洛韦、膦甲酸、福米韦生、更昔洛韦、茚地那韦、碘苷、拉米夫定、洛匹那韦、马拉韦罗、MK-2048、奈非那韦、奈韦拉平、喷昔洛韦、雷特格韦、利匹韦林、利托那韦、沙奎那韦、司他夫定、替诺福韦、三氟尿苷、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、阿糖腺苷、伊巴他滨、金刚烷胺、奥司他韦、金刚乙胺、替拉那韦、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。
抗真菌化合物的实例包括(但不限于)多烯抗真菌剂如那他霉素、龟裂杀菌素(rimocidin)、非律平(filipin)、制霉菌素、两性霉素B、杀念菌素(candicin)和哈霉素(hamycin)；咪唑抗真菌剂如咪康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、奥莫康唑、联苯苄唑、布康唑、芬替康唑、益康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑和噻康唑；三唑抗真菌剂如氟康唑、伊曲康唑、艾沙康唑、雷夫康唑、泊沙康唑、伏立康唑、特康唑和阿巴康唑；噻唑抗真菌剂如阿巴芬净；烯丙胺抗真菌剂如特比萘芬、萘替芬和布替萘芬；和棘白菌素类抗真菌剂如阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净。具有抗真菌特性的其他化合物包括(但不限于)水蓼二醛(polygodial)、苯甲酸、环吡酮、托萘酯、十一烯酸、氟胞嘧啶或5-氟胞嘧啶、灰黄霉素(griseofulvin)和卤普罗近(haloprogin)。
在一个实施方案中，细菌组合物与如下包括于组合疗法中：一种或多种皮质类固醇、美沙拉嗪、美沙胺、柳氮磺胺吡啶、柳氮磺胺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢霉素A、巯基嘌呤、硫唑嘌呤、强的松、氨甲蝶呤、抗组胺、糖皮质激素、肾上腺素、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯、用于鼻炎的抗胆碱能药物、抗胆碱能减充血剂、肥大细胞稳定剂、单克隆抗IgE抗体、疫苗和它们的组合。
益生元是选择性发酵成分，其允许胃肠道微生物群的组成和/或活性的特定变化，其赋予宿主安康和健康益处。益生元可以包括复杂的碳水化合物、氨基酸、肽、或用于细菌组合物存活的其他基本营养成分。益生元包括(但不限于)氨基酸、生物素、低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、乳果糖、低聚甘露糖、低聚果糖富集菊粉、低聚果糖、低聚右旋糖、塔格糖、反式低聚半乳糖和低聚木糖。
测试细菌组合物的增殖作用的方法
测定细菌组合物是否在受试者的胃肠道中增殖的体内测定法
为了测定细菌组合物在受试者的胃肠道中增殖，可以使用动物模型如小鼠模型。所述模型可以通过评估小鼠的微生物群来开始。可以在正常小鼠的粪便中使用微生物群落的16S特征分析来实现定性评估。其还可以通过全面基因组测序、全基因组鸟枪测序(WGS)或传统微生物技术来实现。可以使用下文描述的定量PCR(qPCR)或通过使用传统的微生物技术和计数菌落形成来进行定量评估。
任选地，小鼠可以接受抗生素治疗以模拟生态失调状况。抗生素治疗可降低群落的分类学丰富性、多样性和均匀度，包括降低显著数目的细菌类群的丰度。Dethlefsen等,Thepervasiveeffectsofanantibioticonthehumangutmicrobiota,asrevealedbydeep16SrRNAsequencing,PLoS生物学(PLoSBiology)6(11):3280(2008)。可使用至少一种抗生素，并且抗生素是众所周知的。抗生素可包括氨基糖苷类抗生素(阿米卡星、阿贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红链霉素(rhodostreptomycin)、链霉素、妥布霉素和安普霉素)、阿莫西林、氨苄青霉素、奥格门汀(Augmentin)(阿莫西林/克拉维酸钾组合)、头孢菌素(头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢克肟、头孢西丁、头孢丙烯、头孢他啶、头孢呋辛、头孢氨苄)、克拉维酸钾、克林霉素、多粘菌素、庆大霉素、卡那霉素、甲硝唑或万古霉素。作为单独的非限制性具体实例，可向小鼠分别提供含有40mg/kg、4.2mg/kg、3.5mg/kg、21.5mg/kg和4.5mg/kg(每平均小鼠体重的mg数)的抗生素卡那霉素、粘菌素、庆大霉素、甲硝唑和万古霉素的混合物的饮用水，持续7天。可选地，可向小鼠施用剂量为15-20mg/kg(每平均小鼠体重的mg数)的环丙沙星，持续7天。如果向小鼠提供抗生素，则可提供无抗生素治疗和无细菌组合物治疗的一天至三天的清洗期。
随后，通过经口管饲向小鼠施用测试细菌组合物。可施用体积为0.2ml的所述测试细菌组合物，所述细菌组合物中含有104CFU的每种类型的细菌。可通过使用一定范围的剂量来评估剂量范围，包括(但不限于)102、103、104、105、106、107、108、109和/或1010。
可使用16S测序、全面基因组测序、全基因组鸟枪测序(WGS)或传统的微生物技术来评估小鼠以测定测试细菌组合物是否已在小鼠的胃肠道内增殖。仅举例来说，在向小鼠施用细菌组合物后一天、三天、一周、两周和一个月，进行16S特征分析来确定测试细菌组合物是否已在小鼠的胃肠道内增殖。可以在相同的时间间隔下，另外或可选地进行定量评估，包括qPCR和传统的微生物技术如菌落计数。
此外，可以评估确切对应于细菌组合物中随时间的序列计数数目来具体确定细菌组合物的哪些组分在特定时期内驻留在胃肠道中。在一个实施方案中，细菌组合物的菌株持续所需时段。在另一个实施方案中，细菌组合物的组分持续所希望的时段，同时也增加其他微生物(例如环境、食品等中存在的微生物)在胃肠道中增殖的能力，进一步增加总体多样性，如下文所讨论。
细菌组合物在胃肠道的不同区域中增殖的能力
还可以评估本发明细菌组合物在胃肠道上的不同区域中增殖的能力。在一个实施方案中，细菌组合物可关于其在胃肠道的一个或多个一个区域中增殖的能力进行选择，包括(但不限于)胃、小肠(十二指肠、空肠和回肠)、大肠(盲肠、结肠(升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠)和直肠)。
可以进行体内研究以确定给定细菌组合物将在胃肠道的哪些区域中增殖。可实施与上文所述类似的小鼠模型，不同之处在于不是评估由小鼠产生的粪便，而是可以移除胃肠道的特定区域并单独地研究。例如，可以移除胃肠道的至少一个特定区域并且可以对胃肠道的所述区域的内含物进行定性或定量测定。在另一个实施方案中，可以任选地去除内含物并且可以对从小鼠移除的组织进行定性或定量测定。
qPCR
作为用于测定细菌组合物是否在胃肠道中增殖的一种定量方法，可以进行定量PCR(qPCR)。可以遵循标准技术以产生针对相关细菌组合物的标准曲线，对于集合地、单独地或呈子集(如果适用的话)形式的细菌组合物的所有组分。可以根据制造商的说明书使用市售试剂盒从样品中提取基因组DNA，例如MoBio96孔SoilDNA分离试剂盒(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)、MoBioDNA分离试剂盒(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)或QIAampDNA大便微型试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)。
在一些实施方案中，可以使用HotMasterMix(5PRIME,Gaithersburg,MD)和对相关细菌组合物具特异性的引物来进行qPCR，并且其可在具有Barcode(0.1mL)的Fast光学96孔反应板(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)上实施并且在配备有CFX96TM实时系统的BioRadC1000TM热循环仪(BioRad,Hercules,CA)上进行，其中有FAM和ROX通道的荧光读数。FAM通道上的每个孔的Cq值是通过2.1版CFXManagerTM软件测定的。通过将给定样品的Cq值输入到从比较标准曲线孔的Cq值与那些样品的已知log10(cfu/ml)的标准曲线所产生的线性回归模型来计算每个实验样品的log10(cfu/ml)。本领域技术人员可使用替代qPCR模式。
表征细菌组合物的方法
在某些实施方案中，提供用于测试细菌组合物的某些特征的方法。例如，测定细菌组合物对某些环境变量的敏感性，例如，以选择给定组合物中的特定所需特征、制剂和/或用途。例如，可对细菌组合物中的成分测试pH抗性、胆汁酸抗性和/或抗生素敏感性，不同成分之间单独地或以包含多种细菌成分的细菌组合物形式集合地进行(在本章节中统称为细菌组合物)。
pH敏感性测试
如果细菌组合物将施用至除结肠或直肠之外的地方(即，例如，口服途径)，则任选地测试pH抗性会增强将可能通过胃肠道的不同区域的不同pH环境在最高产率下存活的细菌组合物的选择。理解细菌组合物如何针对胃肠道的pH作出反应也有助于配制，因此如果有利的话可增加剂型中的细菌数目和/或因此组合物可于肠溶胶囊或片剂中或利用缓冲或保护性组合物施用。因为在高蛋白膳食后短期内胃的pH可降至1至2的pH，随后生理机制将其调节至3至4的pH并且通常停留在4至5的驻留pH，并且因为小肠的pH可以在6至7.4的pH范围内，所以可制备在这些不同pH范围内存活的细菌组合物(特别是其中至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或多达100％的细菌可以通过不同的pH范围在肠道存活短暂时间)。可通过使细菌组合物暴露于不同pH范围而针对穿过那些pH范围的预期肠道通过时间进行测试。因此，仅作为非限制性实例，细菌组合物的18小时培养物可在标准培养基中生长，例如肠道微生物群培养基(“GMM”，参见Goodman等,Extensivepersonalhumangutmicrobiotaculturecollectionscharacterizedandmanipulatedingnotobioticmice,PNAS108(15):6252-6257(2011))或另一种不含动物产品的培养基，其中pH调节剂的添加，对于1至2的pH持续30分钟，对于3至4的pH持续1小时，对于4至5的pH持续1至2小时，和对于6至7.4的pH持续2.5至3小时。用于测试酸稳定性的替代方法描述于美国专利No.4,839,281中。可通过培养细菌并对适当选择性或非选择性培养基上的菌落进行计数来测定细菌的存活。
胆汁酸敏感性测试
另外，在一些实施方案中，对于胆汁酸抗性的测试增强了将在通过胃肠道期间暴露于胆汁酸时存活的细菌组合物的选择。胆汁酸分泌至小肠中并且可能同pH一样影响细菌组合物的存活。这可以通过使细菌组合物暴露于胆汁酸持续肠道对胆汁酸的预期暴露时间来测试。例如，可使用pH9的0.05mMTris作为溶剂制备所需浓度的胆汁酸溶液。在胆汁酸溶解后，可用10％HCl将溶液的pH调节至7.2。可在2.2ml的模拟患者中的胆汁酸的浓度和类型的胆汁酸组合物、1.0ml的10％无菌过滤粪便培养基和0.1ml的给定细菌菌株的18小时培养物中培养细菌组合物。温育可进行2.5至3小时或更长时间。用于测试胆汁酸稳定性的替代方法描述于美国专利No.4,839,281中。可通过培养细菌并对适当选择性或非选择性培养基上的菌落进行计数来测定细菌的存活。
抗生素敏感性测试
作为另一种可选的敏感性测试，可对细菌组合物测试其对抗生素的敏感性。在一个实施方案中，可选择细菌组合物以使得细菌成分对抗生素敏感，以使得必要时它们可以通过至少一种靶向细菌组合物的抗生素而从患者的胃肠道中消除或基本上减少。
对胃肠道细胞的粘附
可任选地对细菌组合物测试其粘附胃肠道细胞的能力。用于测试对胃肠道细胞的粘附的方法描述于美国专利No.4,839,281中。
用于纯化芽孢的方法
溶剂处理
为了纯化细菌芽孢，对粪便材料进行一次或多次溶剂处理。溶剂处理是可混溶溶剂处理(部分可混溶或完全可混溶)或不可混溶的溶剂处理。混溶性是两种液体彼此混合以形成均质溶液的能力。水和乙醇例如完全可混溶以使得含有任何比率的水和乙醇的混合物将显示仅单相。混溶性以重量/重量％或一种溶剂于100g最终溶液中的重量提供。如果两种溶剂以所有比例完全可混溶，则其混溶性是100％。以与水的完全可混溶溶液形式提供的是醇类，例如，甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等。醇类可与水组合提供；例如，含有10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、89％、85％、90％、95％或大于95％的溶液。其他溶剂仅部分可混溶，这是指仅一些部分将溶解在水中。二乙醚例如与水部分混溶。至多7克二乙醚将溶解在93g水中以得到7％(重量/重量％)溶液。如果添加更多二乙醚，则将产生两相溶液，其中不同的二乙醚层在水上方。其他可混溶材料包括醚、二甲氧基乙烷或四氢呋喃。相比之下，油如烷烃和水是不可混溶的并形成两相。此外，不可混溶的处理任选地与洗涤剂(离子型洗涤剂或非离子型洗涤剂)组合。示例性洗涤剂包括TritonX-100、Tween20、Tween80、NonidetP40、pluronic或多元醇。
色谱处理
为了纯化芽孢群体，依序或并行地对粪便材料进行一次或多次色谱处理。在色谱处理中，使含有粪便材料的溶液与含有疏水相互作用色谱(HIC)介质或亲和色谱介质的固体介质接触。在一个替代实施方案中，使能够吸收粪便材料中存在的残栖产物的固体介质与吸附残栖产物的固体介质接触。在某些实施方案中，HIC介质含有琼脂糖或衍生化琼脂糖，例如丁基琼脂糖、辛基琼脂糖、苯基琼脂糖或丁基-s琼脂糖。在其他实施方案中，亲和色谱介质含有用I、II、III、IV、V或VI型粘蛋白衍生的材料，或从I、II、III、IV、V或VI型粘蛋白衍生或与其类似的低聚糖。可选地，亲和色谱介质含有用识别芽孢形成细菌的抗体衍生的材料。
机械处理
本文提供粪便材料的物理破坏，特别是通过一种或多种机械处理如共混、混合、摇荡、涡旋、冲击粉碎和超声处理。如本文所提供，机械破坏处理基本上破坏粪便材料中存在的非芽孢材料并且基本上不破坏粪便材料中存在的芽孢。机械处理任选地包括过滤处理，其中所需要的芽孢群体被保留在过滤器上，而不合需要的(非芽孢)粪便成分通过，并且然后从过滤介质中回收芽孢级分。可选地，不合需要的颗粒和真核细胞可以被保留在过滤器上，而包括芽孢的细菌细胞通过。在一些实施方案中，保留在过滤介质上的芽孢级分进行渗滤步骤，其中使保留的芽孢与洗涤液接触，所述洗涤液通常是含无菌盐水的溶液或其他稀释剂，以进一步降低或去除不合需要的粪便成分。
热处理
本文提供粪便材料的热破坏。通常，将粪便材料混合在含盐水溶液如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并经受受热环境如温室、培养箱、水浴等，以使得在受热环境与粪便材料之间发生有效的热传递。优选地，粪便材料溶液在温育期间混合以增强热导率并破坏颗粒聚集体。可通过环境温度和/或热处理的持续时间来调节热处理。例如，粪便材料或包含粪便材料的液体经受受热环境，例如，至少约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或大于100℃的热水浴，持续至少约1、5、10、15、20、30、45秒、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50分钟、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时或10小时以上。在某些实施方案中，在两种不同温度下进行热处理，例如在100℃环境中30秒，接着在50℃环境中10分钟。在优选实施方案中，热处理的温度和持续时间足以杀死或去除致病物质，而基本上不破坏或降低芽孢的萌发能力。
辐照处理
提供用在足以杀死致病物质而基本上不破坏所需芽孢群体的能级下提供的电离辐射(通常是γ辐照、紫外辐照或电子束辐照)处理粪便材料或粪便材料的分离内含物的方法。例如，在低于约22,000微瓦秒/平方厘米的能级下提供的254nm紫外辐射通常不会破坏所需芽孢。
离心和密度分离处理
提供通过离心使所需芽孢群体与粪便材料的其他成分分离的方法。对含有粪便材料的溶液进行一次或多次离心处理，例如，在约1000×g、2000×g、3000×g、4000×g、5000×g、6000×g、7000×g、8000×g或大于8000×g下。差速离心将所需芽孢与不合需要的非芽孢材料分离；在较低的力下，芽孢保留在溶液中，而在较高的力下，芽孢形成球粒，而较小的杂质(例如，病毒粒子、噬菌体)保留在溶液中。例如，第一低力离心使纤维材料形成球粒；第二较高的力离心使不合需要的真核细胞形成球粒，并且第三更高的力离心使所需芽孢形成球粒，而较小的污染物留在悬浮液中。在一些实施方案中，使用密度或迁移率梯度或衬垫(例如，梯级衬垫)如Percoll、Ficoll、Nycodenz、Histodenz或蔗糖梯度将所需芽孢群体与粪便材料中的其他材料分离。
本文还提供制造芽孢群体的方法，其将本文所述的两种或更多种处理组合以协同纯化所需芽孢，同时从所述芽孢群体杀死或去除不合需要的材料和/或活性。通常希望在非萌发和非生长促进条件和介质下保留芽孢群体，以将芽孢群体中存在的致病细菌的生长降至最低并且将芽孢萌发为营养期细菌细胞降至最低。
本发明的药物组合物和制剂
制剂
提供用于施用至有需要的人类和其他受试者的制剂。通常，将细菌组合物与另外的活性和/或非活性材料组合以制造最初产品，其可为单剂量单位或多剂量形式。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种碳水化合物。“碳水化合物”是指糖或糖聚合物。术语“糖”、“多糖”、“碳水化合物”和“低聚糖”可互换使用。大多数碳水化合物是具有许多羟基的醛或酮，通常在分子的每个碳原子上有一个羟基。碳水化合物通常具有分子式CnH2nOn。碳水化合物可为单糖、二糖、三糖、低聚糖或多聚糖。最基本的碳水化合物是单糖，例如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖和果糖。二糖是两个接合的单糖。示例性二糖包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和乳糖。通常，低聚糖包括三至六个单糖单元(例如，棉子糖、水苏糖)，并且多糖包括六个或更多个单糖单元。示例性多糖包括淀粉、糖原和纤维素。碳水化合物可含有修饰的糖单元，例如其中去除羟基的2'-脱氧核糖，其中羟基被氟代替的2'-氟核糖，或N-乙酰基葡糖胺，葡萄糖的含氮形式(例如，2'-氟核糖、脱氧核糖和己糖)。碳水化合物可以许多不同形式存在，例如，构象异构体、环状形式、非环状形式、立体异构体、互变异构体、端基异构体和异构体。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种脂质。如本文所用，“脂质”包括脂肪、油、甘油三酯、胆固醇、磷脂、呈任何形式的脂肪酸包括游离脂肪酸。脂肪、油和脂肪酸可以是饱和、不饱和(顺式或反式)或部分不饱和的(顺式或反式)。在一些实施方案中，脂质包含至少一种选自以下的脂肪酸：月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、十七烷酸(17:0)、十七碳烯酸(17:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、亚麻酸(18:3)、十八碳四烯酸(18:4)、花生酸(20:0)、二十碳烯酸(20:1)、二十碳二烯酸(20:2)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5)(EPA)、二十二烷酸(22:0)、二十二碳烯酸(22:1)、二十二碳五烯酸(22:5)、二十二碳六烯酸(22:6)(DHA)和二十四烷酸(24:0)。在其他实施方案中，所述组合物包含至少一种改性的脂质，例如，已经通过烹饪改性的脂质。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种补充矿物或矿物源。矿物的实例包括(但不限于)：氯化物、钠、钙、铁、铬、铜、碘、锌、镁、锰、钼、磷、钾和硒。任何前述矿物的合适形式包括可溶性矿物盐、微溶性矿物盐、不溶性矿物油、螯合矿物、矿物复合物、非反应性矿物如羰基矿物，和还原矿物，和它们的组合。
在某些实施方案中，所述组合物包含至少一种补充维生素。所述至少一种维生素可以是脂溶性或水溶性维生素。合适的维生素包括(但不限于)维生素C、维生素A、维生素E、维生素B12、维生素K、核黄素、烟酸、维生素D、维生素B6、叶酸、吡哆醇、硫胺素、泛酸和生物素。任何前述物的合适形式是维生素的盐、维生素的衍生物、具有维生素的相同或类似活性的化合物，和维生素的代谢物。
在其他实施方案中，所述组合物包含赋形剂。合适的赋形剂的非限制性实例包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂和着色剂。
在另一个实施方案中，所述赋形剂是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。
在一些实施方案中，所述赋形剂包含防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂如α-生育酚和抗坏血酸盐，和抗微生物剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。
在其他实施方案中，所述组合物包含粘合剂作为赋形剂。合适的粘合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶凝化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖类、低聚糖和它们的组合。
在另一个实施方案中，所述组合物包含润滑剂作为赋形剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁和轻质矿物油。
在其他实施方案中，所述组合物包含分散增强剂作为赋形剂。合适的分散剂的非限制性实例包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化的木质纤维素、羟乙酸淀粉钠、异无定形硅酸盐和微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。
在一些实施方案中，所述组合物包含崩解剂作为赋形剂。在其他实施方案中，所述崩解剂是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例包括淀粉如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶凝化和改性淀粉，甜味剂，粘土如膨润土，微晶纤维素，海藻酸盐，羟乙酸淀粉钠，树胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶和黄蓍胶。在另一个实施方案中，崩解剂是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合，和碳酸氢钠与酒石酸的组合。
在另一个实施方案中，赋形剂包含调味剂。调味剂可选自合成调味油和调味芳族化合物；天然油；来自植物、叶子、花和果实的提取物；和它们的组合。在一些实施方案中，调味剂选自肉桂油；冬青油、薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉树；香草；柑橘油如柠檬油、橙油、葡萄和柚子油；和水果香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和杏。
在其他实施方案中，赋形剂包含甜味剂。合适的甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖和它们的混合物(当不用作载体时)；糖精和其各种盐如钠盐；二肽甜味剂如阿斯巴甜；二氢查耳酮化合物、甘草甜素；甜叶菊(甜菊)；蔗糖的氯衍生物如三氯蔗糖；和糖醇如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等。还涵盖氢化淀粉水解产物和合成甜味剂3,6-二氢-6-甲基-1,2,3-噁噻嗪-4-酮-2,2-二氧化物，特别是其钾盐(乙酰磺胺酸钾)，和钠盐和钙盐。
在其他实施方案中，所述组合物包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例包括食品、药品和化妆品色料(FD&C)，药品和化妆品色料(D&C)，和外部药品和化妆品色料(Ext.D&C)。着色剂可以染料或其相应色淀形式使用。
制剂中的赋形剂或赋形剂组合的重量分数通常为组合物总重量的约99％或更少，例如约95％或更少、约90％或更少、约85％或更少、约80％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2％或更少、或约1％或更少。
本文公开的细菌组合物可以配制成多种形式并且通过多种不同方式施用。所述组合物可以含有常规可接受的载体、佐剂和所需媒介物的制剂形式经口、经直肠或经肠胃外施用。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内或胸骨内注射和输注技术。在一个示例性实施方案中，所述细菌组合物是经口施用的。
用于经口施用的固体剂型包括胶囊、片剂、囊片、丸剂、锭剂、糖锭、散剂和颗粒剂。胶囊通常包含含有细菌组合物的芯材料和囊封所述芯材料的壳壁。在一些实施方案中，所述芯材料包含固体、液体和乳液中的至少一种。在其他实施方案中，所述壳壁材料包含软明胶、硬明胶和聚合物中的至少一种。合适的聚合物包括(但不限于)：纤维素聚合物如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、乙酸偏苯三酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、琥珀酸羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物如由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸铵、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯形成的那些(例如，以商品名“Eudragit”销售的那些共聚物)；乙烯聚合物和共聚物如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚邻苯二甲酸乙烯乙酸酯、乙酸乙烯酯丁烯酸共聚物，和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；和虫胶(纯化lac)。在其他实施方案中，至少一种聚合物充当掩味剂。
片剂、丸剂等可以被压缩，多重压缩，多重分层和/或涂覆。涂层可以是单个或多个。在一个实施方案中，涂层材料包含从植物、真菌和微生物中的至少一种提取的糖、多糖和糖蛋白中的至少一种。非限制性实例包括玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、纤维素、半纤维素、葡聚糖、麦芽糊精、环糊精、菊粉、果胶、甘露聚糖、阿拉伯胶、刺槐豆胶、牧豆胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶、茄替胶、黄蓍胶、海萝胶(funori)、角叉菜胶、琼脂、海藻酸盐、脱乙酰壳多糖或结冷胶。在一些实施方案中，涂层材料包含蛋白质。在另一个实施方案中，涂层材料包含脂肪和油中的至少一种。在其他实施方案中，脂肪和油中的至少一种是高温熔融的。在另一个实施方案中，脂肪和油中的至少一种是氢化或部分氢化的。在一个实施方案中，脂肪和油中的至少一种是源自植物。在其他实施方案中，脂肪和油中的至少一种包含甘油酯、游离脂肪酸和脂肪酸酯中的至少一种。在一些实施方案中，涂层材料包含至少一种可食用蜡。所述可食用蜡可源自动物、昆虫或植物。非限制性实例包括蜂蜡、羊毛脂、杨梅蜡、巴西棕榈蜡和米糠蜡。片剂和丸剂可另外制备具有肠溶衣。
可选地，实施本文公开的细菌组合物的散剂或颗粒剂可以掺入食品中。在一些实施方案中，食品是口服饮料。合适的饮料的非限制性实例包括果汁、果汁饮料、人工调味饮料、人工增甜饮料、碳酸饮料、运动饮料、液体乳制品、奶昔、酒精饮料、含咖啡因饮料、婴幼儿配方奶粉等。用于经口施用的其他合适方式包括水性和非水性溶液、乳液、悬浮液和从非泡腾颗粒重配的溶液和/或悬浮液，其含有合适的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、着色剂和调味剂中的至少一种。
在一些实施方案中，食品可以是固体食物。固体食物的合适实例包括(但不限于)食品棒、点心棒、曲奇、布朗尼、松饼、脆饼、冰淇淋棒、冷冻酸奶棒等。
在其他实施方案中，本文公开的组合物被掺入治疗性食品中。在一些实施方案中，所述治疗性食品是任选地含有一些或所有必需宏量营养素和微量营养素的即用型食品。在另一个实施方案中，本文公开的组合物被掺入到设计用于共混到现有膳食中的补充食品中。在一个实施方案中，所述补充食品含有一些或所有的必需宏量营养素和微量营养素。在另一个实施方案中，本文公开的细菌组合物与现有食品共混或添加至现有食品中以强化食品的蛋白质营养。实例包括主食(粮食、盐、糖、食用油、人造黄油)、饮料(咖啡、茶、苏打水、啤酒、白酒、运动饮料)、点心、糖果和其他食品。
在一个实施方案中，将制剂填充至用于经口施用的明胶胶囊中。适当的胶囊的实例是含有10(至多100mg)的冻干粉末(108至1011个细菌)、160mg微晶纤维素、77.5mg明胶和2.5mg硬脂酸镁的250mg明胶胶囊。在一个替代实施方案中，可使用105至1012、105至107、106至107、或108至1010个细菌，必要时伴随用赋形剂进行调节。在一个替代实施方案中，可使用具有缓冲或保护性组合物的肠溶胶囊或片剂。
实施例
下面是用于实施本发明的特定实施方案的实施例。所述实施例仅出于说明目的提供，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。已努力确保关于所用数字(例如，量、温度等)的精确度，但当然应当允许一些实验误差和偏差。
除非另外说明，否则本发明的实施将使用在本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这些技术在文献中得到充分解释。参见例如T.E.Creighton,Proteins:StructuresandMolecularProperties(W.H.FreemanandCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(WorthPublishers,Inc.,当前版本)；Sambrook等,分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第2版,1989)；MethodsInEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,AcademicPress,Inc.)；Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版(Easton,Pennsylvania:MackPublishingCompany,1990)；Carey和SundbergAdvancedOrganicChemistry第3版(PlenumPress)第A卷和第B卷(1992)。
实施例1.粪便材料的提供
新鲜的粪便样品获自健康的人类供体，所述供体已经针对一般良好健康状况和不存在感染性疾病进行筛选，并且满足纳入和排除标准，纳入标准包括处于良好的一般健康状况，没有明显的病史、体格检查研究结果或临床实验室异常，定期排便，大便外观在Bristol大便量表上通常为2、3、4、5或6型，并具有BMI≥18kg/m2且≤25kg/m2。排除标准一般包括重大的慢性或急性医学病状，包括肾脏、肝脏、肺、胃肠、心血管、泌尿生殖系统、内分泌、免疫、代谢、神经或血液疾病，炎症性肠病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎、肠易激综合征、结肠、胃或其他胃肠恶性疾病或者胃肠道息肉综合征的家族史，或最近使用过其中生物体是主要组分的酸奶或商业益生菌材料。使用马桶标本收集系统直接收集样品，所述系统含有放置在马桶座上的塑料支撑物和搁在所述支撑物上的收集容器。粪便沉积在容器中，然后将盖子放置在容器上并紧密密封。然后在1-4小时内将样品递送在冰上用于加工。将样品与无菌一次性工具混合，并且对2-4g等分试样称重并放置在管中并在干冰/乙醇浴中急速冷冻。将等分试样冷冻在-80℃下直至使用。
任选地，将粪便材料悬浮在溶液中，和/或去除纤维状和/或颗粒状材料。使含有已知重量粪便的冷冻等分试样从-80℃储存中移出并使其在室温下解冻。添加无菌1xPBS以产生10％w/v悬浮液，并且进行剧烈涡旋以悬浮粪便材料直至材料看起来是均质的。然后使材料在室温下静置10分钟以沉降纤维状和颗粒状物质。然后将沉积物上方的悬浮液小心地移入新管中并含有纯化的芽孢群体。任选地，然后将悬浮液在低速(例如1000×g)下离心5分钟以使包括纤维的颗粒状物质形成球粒。弃去球粒并且将含有营养期生物体和芽孢的上清液移入新管中。然后将上清液在6000×g下离心10分钟以使营养期生物体和芽孢形成球粒。然后在剧烈涡旋下将球粒再次悬浮在1×PBS中直至材料看起来是均质的。
实施例2.来自粪便材料的醇处理的芽孢纯化
将人类粪便材料于PBS中的10％w/v悬浮液与无水乙醇以1:1比率混合并且涡旋以混合1分钟。将悬浮液在37℃下温育1小时。在温育后，将悬浮液在13,000rpm下离心5分钟以使芽孢形成球粒。弃去上清液并且将球粒再次悬浮在相等体积的PBS中。添加甘油至最终浓度为15％并且然后将纯化的芽孢级分储存在-80℃下。
实施例2A.从粪便材料的醇处理产生芽孢制剂
将人类粪便材料于PBS中的10％w/v悬浮液与无水乙醇以1:1比率混合并且涡旋以混合1分钟。将悬浮液在37℃下温育1小时。在温育后，将悬浮液在13,000rpm下离心5分钟以将芽孢浓缩成含有含纯化芽孢制剂的球粒。弃去上清液并且将球粒再次悬浮在相等体积的PBS中。添加甘油至最终浓度为15％并且然后将纯化的芽孢制剂储存在-80℃下。
实施例3.来自粪便材料的热处理的芽孢纯化
将人类粪便材料于PBS中的10％w/v悬浮液在80℃的水浴中温育30分钟。添加甘油至最终浓度为15％并且然后将含富集芽孢的物质储存在-80℃下。
实施例4.来自粪便材料的醇处理和热处理的芽孢纯化
将人类粪便于PBS中的10％w/v悬浮液与无水乙醇以1:1比率混合并且涡旋以混合1分钟。将悬浮液在水浴中在需氧条件下在37℃下温育1小时。在温育后，将悬浮液在13,000rpm下离心5分钟以使芽孢形成球粒。弃去上清液并且将球粒再次悬浮在相等体积的PBS中。然后将乙醇处理的芽孢群体在80℃的水浴中温育30分钟。添加甘油至最终浓度为15％并且然后将纯化的芽孢级分储存在-80℃下。
实施例5.来自粪便材料的洗涤剂处理的芽孢纯化
制备人类粪便于PBS中的10％w/v悬浮液以含有最终浓度为0.5％至2％的TritonX-100。在25至37℃下振荡温育30分钟后，使样品在1000g下离心5-10分钟以使颗粒状物质和大细胞形成球粒。将细菌芽孢回收在上清液级分中，其中任选地例如在实施例4中进一步处理纯化的芽孢群体。不受理论束缚，向粪便混合物添加洗涤剂至少部分地通过增强芽孢与颗粒的分离产生更好的芽孢群体，从而导致更高的芽孢产率。
实施例6.通过粪便材料的色谱分离进行芽孢纯化
将诸如获自上文实施例1-5的芽孢富集群体与NaCl混合至最终浓度为4M的总盐并与辛基Sepharose4FastFlow接触以结合疏水性芽孢级分。将树脂用4MNaCl洗涤以去除疏水性较小的组分，并且用蒸馏水洗脱芽孢，并且经由UV吸光度收集所需的富集芽孢级分。
实施例7.通过过滤粪便材料进行芽孢纯化
将诸如获自上文实施例1-6的芽孢富集群体与PBS以1:10稀释，并且放置在切向流微滤系统的储集容器中。将0.2μm孔径混合纤维素酯亲水性切向流过滤器诸如通过管道回路连接至储集器。将稀释的芽孢制剂通过泵送再循环通过回路，并且在微滤器的壁上的压力梯度推动上清液液体通过过滤器孔。通过适当选择过滤器孔径，所需的细菌芽孢得到保留，而较小的污染物如细胞碎片和粪便中的其他污染物如噬菌体穿过过滤器。向储集器中周期性添加新鲜的PBS缓冲液以增强污染物的洗出。在渗滤结束时，将芽孢浓缩为原始浓度的约十倍。从储集器收集纯化芽孢并如本文所提供储存。
实施例8.纯化芽孢群体的表征
通过用PBS进行10倍连续稀释并平板接种到布鲁氏血琼脂(BrucellaBloodAgar)Petri板或适用的固体培养基来测定活芽孢计数。将板在37℃下温育2天。从具有50-400个菌落的稀释板对菌落进行计数并将其用于反向计算群体中的活芽孢数目。还显示了萌发成营养期细菌的能力。通过相差显微镜测定目测计数。将芽孢制剂稀释于PBS中或通过离心浓缩，并且将5微升等分试样放置在PetroffHauser计数室中用于在400倍放大倍率下可视化。在十个0.05mm×0.05mm栅格内计数芽孢并且测定每个栅格的平均芽孢计数并用于计算每毫升制剂的芽孢计数。使用鲎变形细胞溶解物(LAL)测定法如市售ToxinSensorTM生色LAL内毒素测定法试剂盒(GenScript,Piscataway,NJ)或本领域技术人员已知的其他标准方法测量纯化芽孢群体中的脂多糖(LPS)降低。
实施例9.测定纯化芽孢群体中的细菌病原体
使用如下特定寡核苷酸引物通过qPCR测定纯化芽孢群体中存在的细菌病原体。
标准曲线制备。从含有已知浓度的相关病原体的孔产生标准曲线或通过选择性点板同时定量。在无菌磷酸盐缓冲盐水中进行一式两份培养物的连续稀释。然后从标准曲线样品以及其他样品中提取基因组DNA。
基因组DNA提取
使用MoBio96孔SoilDNA分离试剂盒(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)根据制造商的说明书从100μl粪便样品、粪便源样品或纯化芽孢制剂中提取基因组DNA，其中有两个例外：使用BioSpecMini-Beadbeater-96(BioSpecProducts,Bartlesville,OK)进行打珠(beadbeating)持续2×4:40分钟并且在50μl溶液C6中洗脱DNA。可选地，可使用MoBioDNA分离试剂盒(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)、Sigma-AldrichExtract-N-AmpTMPlantPCR试剂盒、QIAampDNA大便微型试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)根据制造商的说明书分离基因组DNA。
qPCR组合物和条件
检测艰难梭菌的qPCR反应物含有1xHotMasterMix(5PRIME,Gaithersburg,MD)、900nM的Wr-tcdB-F(AGCAGTTGAATATAGTGGTTTAGTTAGAGTTG,IDT,Coralville,IA)、900nM的Wr-tcdB-R(CATGCTTTTTTAGTTTCTGGATTGAA,IDT,Coralville,IA)、250nM的We-tcdB-P(6FAM-CATCCAGTCTCAATTGTATATGTTTCTCCA-MGB,LifeTechnologies,GrandIsland,NY)和PCR水(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)补足至18μl(引物改编自：Wroblewski,D.等,RapidMolecularCharacterizationofClostridiumdifficileandAssessmentofPopulationsofC.difficileinStoolSpecimens.临床微生物学杂志(JournalofClinicalMicrobiology)47:2142-2148(2009))。将这种反应混合物等分至具有条形码(Barcode)(0.1mL)的Fast光学96孔反应板的孔中(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)。向这种反应混合物中添加2μl提取基因组DNA。在配备有CFX96TM实时系统的BioRadC1000TM热循环仪(BioRad,Hercules,CA)上进行qPCR。热循环条件为95℃持续2分钟，接着进行45个如下循环：95℃持续3秒，60℃持续30秒，和FAM和ROX通道的荧光读数。可通过使用对相关病原体具特异性的引物和探针来检测其他细菌病原体。
数据分析
通过2.1版CFXManagerTM软件测定FAM通道上的每个孔的Cq值。通过将给定样品的Cq值输入到从比较标准曲线孔的Cq值与那些样品的已知log10(cfu/ml)的标准曲线所产生的线性回归模型来计算每个实验样品的log10(cfu/ml)。
通过如本文所述和本领域中以其他方式已知的qPCR测定纯化芽孢群体中存在的病毒病原体。
实施例10：物种鉴定
可以多种方式测定从复杂级分生长的芽孢形成物种的身份。首先，可以96孔格式将单独的菌落采集到液体培养基中，生长并以15％甘油储备液形式储存在-80℃下。可以将培养物的等分试样放置在细胞溶解缓冲液中并且可使用菌落PCR方法来对16SrDNA基因进行扩增和测序(实施例2)。可选地，可对菌落划线接种以在固体培养基上的若干通道中纯化。将孔分离菌落划线接种在相同种类的新鲜板上并在37℃下温育48-72小时。将所述过程重复多次以确保纯度。可通过基于表型或基于序列的方法(包括如实施例11和12中所述的16SrDNA扩增和测序)来分析纯培养物。纯分离株或混合群落例如板刮落物和芽孢级分的序列表征还可以包括全基因组鸟枪测序。后者对于测定与芽孢形成相关的基因的存在、抗生素抗性、病原性和毒性是有价值的。还可以从板上整体刮落菌落并使用如实施例11和12中所述的大规模平行测序方法进行测序，以使得可以鉴定复杂混合物中的单独的16S标记。任选地，可在萌发前对样品测序(适当时使用DNA分离程序从芽孢溶解和释放DNA)以比较可萌发物种的多样性与芽孢样品中的物种总数。作为16S分析的替代或补充方法，还可以使用MALDI-TOF质谱来进行物种鉴定(如Anaerobe22:123中所评述)。
实施例11：测定操作分类单元(OTU)的16s测序
用于测定16S序列的方法
通过rRNA基因的完全16S测序，通过这个基团的特定高变区(即V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8或V9)的测序，或通过来自这个基因的高变区的任何组合(例如V1-3或V3-5)的测序来定义OTU。细菌16SrDNA的长度为约1500个核苷酸并且用于使用系统发育方法来重建一种细菌分离株与另一种细菌分离株的进化关系和序列相似性。16S序列被用于系统发育重建，因为它们一般是高度保守的，但含有具有足够核苷酸多样性以区分大多数微生物的属和种的特定高变区。
使用众所周知的技术，为了测定完全16S序列或16S序列的任何高变区的序列，从细菌样品提取基因组DNA，使用聚合酶链反应(PCR)扩增16SrDNA(完全区域或特定高变区)，清除PCR产物，并且描绘核苷酸序列以确定16S基因或所述基因的子结构域的遗传组成。如果进行完全16S测序，则所用的测序方法可能是(但不限于)Sanger测序。如果使用一个或多个高变区如V4区域，则测序可能是(但不限于)使用Sanger方法或使用下一代测序方法如使用允许多重反应的条形码引物的Illumina(通过合成测序)方法来进行的。
除了16SrRNA基因之外，可通过对已知是给定物种或OTU分类组的标志物基因的选定组基因进行测序来定义OTU。这些基因可能可选地使用基于PCR的筛选策略进行测定。例如，可使用来自编码热不稳定(LTI、LTIIa和LTIIb)和热稳定(STI和STII)毒素、1、2和2e型志贺样毒素(分别是VT1、VT2和VT2e)、细胞毒性坏死因子(CNF1和CNF2)、连接和抹消机制(eaeA)、肠聚集机制(Eagg)和肠侵袭性机制(Einv)的基因的DNA区分致病性大肠埃希氏菌的各种菌株。通过使用标志物基因用于OTU分类分配的最佳基因将是基于序列的分类学鉴定领域的普通技术人员所熟知的。
基因组DNA提取
使用热碱性溶解方法从纯微生物培养物中提取基因组DNA。将1μl微生物培养物添加至9μl溶解缓冲液(25mMNaOH、0.2mMEDTA)并且将混合物在95℃下温育30分钟。随后，将样品冷却至4℃并且通过添加10μl中和缓冲液(40mMTris-HCl)中和，然后在洗脱缓冲液(10mMTris-HCl)中稀释10倍。可选地，使用市售试剂盒如MoBio微生物DNA分离试剂盒(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)或通过本领域技术人员已知的标准方法从纯微生物培养物提取基因组DNA。
用于下游Sanger测序的16S序列的扩增
为了扩增细菌16SrDNA(图1A)，将2μl提取gDNA添加至20μl最终体积PCR反应物。对于全长16测序，PCR反应物也含有1xHotMasterMix(5PRIME,Gaithersburg,MD)、250nM的27f(AGRGTTTGATCMTGGCTCAG,IDT,Coralville,IA)和250nM的1492r(TACGGYTACCTTGTTAYGACTT,IDT,Coralville,IA)，用PCRWater(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)补足体积。可选地，使用本领域技术人员已知的其他通用细菌引物或热稳定性聚合酶。例如，引物可为本领域技术人员用于16SrRNA的“V1-V9区域”的测序(图1A)。这些区域是指用于对细菌样品进行基因分型的16SrRNA基因的第一至第九高变区。使用基于命名法的大肠埃希氏菌系统的编号，细菌中的这些区域分别由核苷酸69-99、137-242、433-497、576-682、822-879、986-1043、1117-1173、1243-1294和1435-1465限定。Brosius等,Completenucleotidesequenceofa16SribosomalRNAgenefromEscherichiacoli,PNAS75(10):4801-4805(1978)。在一些实施方案中，V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8和V9区域中的至少一个用于表征OTU。在一个实施方案中，V1、V2和V3区域用于表征OTU。在另一个实施方案中，V3、V4和V5区域用于表征OTU。在另一个实施方案中，V4区域用于表征OTU。本领域普通技术人员可以通过比较所讨论的候选序列与参考序列(图1B)并基于与参考高变区的类似性以鉴定高变区来鉴定候选16SrRNA的特定高变区(图1A中)。
在市售热循环仪如BioRadMyCyclerTM热循环仪(BioRad,Hercules,CA)上进行PCR。反应在94℃下进行2分钟，接着进行30个如下循环：94℃持续30秒，51℃持续30秒，和68℃持续1分钟30秒，接着在72℃下延长7分钟并且在4℃下无限期保持。在PCR后，使用一部分反应产物的凝胶电泳证实约1.5kb产物的成功扩增。
为了从PCR产物中去除核苷酸和寡核苷酸，将2μl的HTExoSap-IT(Affymetrix,SantaClara,CA)添加至5μlPCR产物中，接着在37℃下温育15分钟，然后在80℃下灭活15分钟。
通过大规模平行测序技术用于下游表征的16S序列的扩增
通过短读数技术如Illumina为下游测序进行的扩增需要使用本领域技术人员已知另外包括基于序列的条形码标签的引物进行的扩增。作为实例，为了扩增细菌16SrDNA的16s高变区V4区域，将2μl的提取gDNA添加至20μl最终体积PCR反应物。所述PCR反应物还含有1xHotMasterMix(5PRIME,Gaithersburg,MD)、200nM的V4_515f_adapt(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA,IDT,Coralville,IA)和200nM的条形码806rbc
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT_12bpGolayBarcode_AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT,IDT,Coralville,IA)，用PCR水(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)补足体积。这些引物掺有条形码适配子用于通过合成进行Illumina测序。任选地，可进行相同的一式两份、一式三份或一式四份反应。可选地，使用本领域技术人员已知的其他通用细菌引物或热稳定性聚合酶来获得不同扩增和测序误差率以及关于替代测序技术的结果。
在市售热循环仪如BioRadMyCyclerTM热循环仪(BioRad,Hercules,CA)上进行PCR扩增。反应在94℃下进行3分钟，接着进行25个如下循环：94℃持续45秒，50℃持续1分钟，和72℃持续1分钟30秒，接着在72℃下延长10分钟并且在4℃下无限期保持。在PCR后，使用一部分反应产物的凝胶电泳证实约1.5kb产物的成功扩增。如先前实施例中所说明来进行PCR提纯。
来自纯均质样品的目标扩增子的Sanger测序
为了检测每个样品的核酸，进行两个测序反应来产生正向和反向测序读数。对于全长16s测序，使用引物27f和1492r。将40ng的ExoSap-IT清洁的PCR产物与25pmol测序引物和MoBio分子生物级水(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)混合至15μl总体积。这种反应物被提交至商业测序组织如Genewiz(SouthPlainfield,NJ)用于Sanger测序。
来自非均质样品的目标扩增子的大规模平行测序
DNA定量和文库构建。使用Quant-iTTM dsDNA测定试剂盒(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)根据制造商的说明书来定量清洁的PCR扩增产物。在定量后，将条形码标记的清洁PCR产物组合以使得每种不同的PCR产物处于等摩尔比率以产生制备的Illumina文库。
核酸检测。所制备的文库是在根据制造商的说明书进行的具有簇生成、模板杂交、等温扩增、线性化、测序引物的阻断和变性和杂交的IlluminaHiSeq或MiSeq测序仪(Illumina,SanDiego,CA)上进行测序。将16SV4SeqFw(TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA)、16SV4SeqRev(AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT)和16SV4Index(ATTAGAWACCCBDGTAGTCCGGCTGACTGACT)(IDT,Coralville,IA)用于测序。可以使用其他测序技术，例如(但不限于)454、PacificBiosciences、Helicos、IonTorrent和Nanopore，其使用基因组测序领域的技术人员的标准方案。
实施例12：序列读数注释
主要读数注释
分析核酸序列并且注释是使用序列相似性和系统发育安置方法或两种策略的组合来定义分类分配性。可使用类似的方法来注释蛋白质名称、转录因子名称和核酸序列的任何其他分类模式。基于序列相似性的方法包括本领域技术人员所熟知的那些，包括(但不限于)BLAST、BLASTx、tBLASTn、tBLASTx、RDP-classifier、DNAclust，和这些算法的各种实施方式如Qiime或Mothur。这些方法依赖于针对参考数据库定位序列读数并选择与最好评分和e值的匹配。常用数据库包括(但不限于)HumanMicrobiomeProject、NCBI非冗余数据库、Greengenes、RDP和Silva。系统发育方法可与序列相似性方法组合使用以改进注释或分类分配性的呼叫准确性。此处使用树形拓扑结构和节点结构来提高分析的分辨率。在这种方法中，我们使用本领域技术人员众所周知的众多序列相似性方法之一和杠杆系统发育方法，包括(但不限于)最大似然系统发育重构，来分析核酸序列(参见例如LiuK,LinderCR和WarnowT.2011.RAxMLandFastTree:ComparingTwoMethodsforLarge-ScaleMaximumLikelihoodPhylogenyEstimation.PLoSONE6:e27731；McGuireG,DenhamMC和BaldingDJ.2001.ModelsofsequenceevolutionforDNAsequencescontaininggaps.分子生物与进化(Mol.Biol.Evol)18:481-490；WróbelB.2008.Statisticalmeasuresofuncertaintyforbranchesinphylogenetictreesinferredfrommolecularsequencesbyusingmodel-basedmethods.应用遗传学杂志(J.Appl.Genet.)49:49-67。)将序列读数放置在由适当参考序列构成的参考系统发育中。基于系统发育树中的读数的安置来进行注释。OTU注释的确定性或意义是基于OTU与参考核酸序列的序列相似性和OTU序列相对于系统发育中的一种或多种参考序列的接近性来定义。作为实例，在科、属、种或菌株水平下的置信度下定义分类分配性的特异性，其中置信度是基于参考系统发育树中的引导程序支持分支相对于所注释的OTU序列安置的位置确定的。
分支分配
16S-V4OTU鉴定分配OTU作为特定物种的能力部分取决于16S基因的16S-V4区域对于特定物种或物种群的解析力。树的不同区域的可用参考16S序列的密度以及不同物种之间的16S基因中的固有可变性将决定分类注释的确定性。考虑到系统发育树的拓扑性质和如下事实：树基于其序列相似性和潜在的进化模型表示OTU彼此的层次关系，可使用基于分支的分配程序将读数的分类注释卷绕至更高水平(表1)。使用这种方法，分支是基于使用具有系统发育领域中的普通技术的个体所熟知的最大似然或其他系统发育模型从全长16S序列构建的系统发育树的拓扑结构定义的。构建分支以确保给定分支中的所有OTU是：(i)在彼此指定数目的引导程序支持的节点内(通常，1-5个引导程序)，和(ii)在5％遗传相似性内。在相同分支内的OTU可以基于16S-V4序列数据区分为与不同分支中的OTU在遗传上和系统发育上不同。处于相同分支内的OTU在进化上密切相关并且可能会或可能不会使用16S-V4序列数据彼此区分。基于分支的分析的强大之处在于，相同分支的成员，由于其进化相关性，而可能在微生物生态如人类肠道中存在的生态中发挥类似的功能作用。一种物种被来自相同分支的另一种物种取代的组合物可能具有保守的生态功能并且因此可用于本发明中。
值得注意的是，给定OTU的分离株的16S序列在系统发育上安置在其各自分支内，有时与可能优先于基于16S的分配的种和属的基于微生物的分配相冲突。根据文献，知道基于微生物特性的分类分配相对于基因测序之间存在差异。
实施例13：萌发的芽孢
使芽孢级分萌发增加了将在各种培养基类型上生长的活芽孢的数目。为了使芽孢群体萌发，将样品移动到厌氧室中，再次悬浮在预还原的PBS中，混合并在37℃下温育1小时以允许萌发。萌发剂可包括氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸)、糖(例如，果糖)、核苷(例如，肌苷)、胆汁盐(例如，胆酸盐和牛磺胆酸盐)、金属阳离子(例如，Mg2+、Ca2+)、脂肪酸和长链烷基胺(例如，十二烷基胺，Germinationofbacterialsporeswithalkylprimaryamines”细菌学杂志(J.Bacteriology),1961)。这些物质的混合物或更复杂的天然混合物，例如瘤胃液或牛胆汁(Oxgall)，可用于诱导萌发。牛胆汁是由脂肪酸、胆汁酸、无机盐、硫酸盐、胆色素、胆固醇、粘蛋白、卵磷脂、葡萄糖醛酸、卟啉和尿素构成的脱水牛胆汁。萌发也可以在生长培养基如预还原BHIS/牛胆汁萌发培养基中进行，其中BHIS(脑心浸液粉末(37g/L)、酵母提取物(5g/L)、L-半胱氨酸HCl(1g/L))提供复杂BHI和酵母提取物混合物中的肽、氨基酸、无机离子和糖，并且牛胆汁提供另外的胆汁酸萌发剂。
另外，可使用压力使芽孢萌发。萌发剂的选择可随着所寻求的微生物而改变。不同的物种需要不同的萌发剂并且相同物种的不同分离株可能需要不同萌发剂以用于最佳萌发。最后，重要的是稀释混合物，随后平板接种，因为一些萌发剂抑制营养状态微生物的生长。例如，已显示烷基胺必须用阴离子亲脂体中和以促进最佳生长。胆汁酸尽管促进其萌发，但也可能抑制一些生物体的生长，并且必须在对活细胞平板接种之前进行稀释。
例如，使用BHIS/牛胆汁溶液作为萌发剂并且含有具有0.25％牛胆汁(脱水牛胆汁)的0.5XBHIS培养基，其中1xBHIS培养基中每L溶液含有以下：6g来自固体的脑心浸液、7g动物组织的肽消化物、14.5g酪蛋白的胰腺消化物、5g酵母提取物、5g氯化钠、2g葡萄糖、2.5g磷酸二钠和1g半胱氨酸。另外，Ca-DPA是萌发剂并含有40mMCaCl2和40mM二吡啶甲酸(DPA)。瘤胃液(BarDiamond,Inc.)也是萌发剂。模拟胃液(RiccaChemical)是萌发剂并且是于0.7％(v/v)盐酸中的0.2％(w/v)氯化钠。粘蛋白培养基是萌发剂并且通过将以下各项添加至1L蒸馏无菌水中来制备：0.4gKH2PO4、0.53gNa2HPO4、0.3gNH4Cl、0.3gNaCl、0.1gMgCl2×6H2O、0.11gCaCl2、1ml碱性微量元素溶液、1ml酸微量元素溶液、1ml维生素溶液、0.5mg刃天青、4gNaHCO3、0.25gNa2S×9H2O。如先前所述(Stams等,1993)制备微量元素和维生素溶液。对所有化合物进行高压灭菌，维生素除外，对其过滤灭菌。基础培养基补充有0.7％(v/v)澄清的无菌瘤胃流体和0.25％(v/v)商业猪胃粘蛋白(III型；Sigma)，如先前(Miller&Hoskins,1981)所述通过乙醇沉淀纯化。这种培养基在本文被称为粘蛋白培养基。
胎牛血清(Gibco)可用作萌发剂并且含有在含有0.137M氯化钠、0.0027M氯化钾、0.0119M磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲盐水(PBS,FisherScientific)中热灭活的5％FBS。巯基乙酸盐是如先前(Kamiya等,医学微生物学杂志(JournalofMedicalMicrobiology)1989)所述的萌发剂并含有0.25M(pH10)巯基乙酸钠。在PBS中含有1mM十二烷基胺的十二烷基胺溶液是萌发剂。糖溶液可用作萌发剂并含有0.2％果糖、0.2％葡萄糖和0.2％甘露糖醇。氨基酸溶液也可以用作萌发剂并含有5mM丙氨酸、1mM精氨酸、1mM组氨酸、1mM赖氨酸、1mM脯氨酸、1mM天冬酰胺、1mM天冬氨酸、1mM苯丙氨酸。在本文称为Germix3的萌发剂混合物可以是萌发剂并含有5mM丙氨酸、1mM精氨酸、1mM组氨酸、1mM赖氨酸、1mM脯氨酸、1mM天冬酰胺、1mM天冬氨酸、1mM苯丙氨酸、0.2％牛磺胆酸盐、0.2％果糖、0.2％甘露糖醇、0.2％葡萄糖、1mM肌苷、2.5mMCa-DPA和5mMKCl。BHIS培养基+DPA是萌发剂混合物并含有BHIS培养基和2mMCa-DPA。在本文称为EcSN的大肠埃希氏菌消耗培养基上清液是萌发剂并且是通过如下制备：使大肠埃希氏菌MG1655在SweetB/Fos菊粉培养基中厌氧生长48小时，使细胞在20,000rcf下短暂离心20分钟，收集上清液并加热至60℃持续40分钟。最后，将溶液过滤灭菌并用作萌发剂溶液。
实施例14：生长培养基的选择
重要的是选择适当的培养基来支持生长，包括优选的碳源。例如，一些生物体喜爱复合糖如纤维二糖胜于单糖。在孢子化生物体的分离中使用的培养基的实例包括EYA、BHI、BHIS和GAM(关于完整的名称和参考，参见下文)。将多种稀释液平板接种以确保一些板将在其上具有充分分离的菌落以进行分析，或可选地具有致密菌落的板可刮落并悬浮在PBS中以产生混合多样群落。
将板在37℃下厌氧或需氧温育48-72小时或更长时间，分别靶向厌氧或需氧芽孢形成剂。
固体板培养基包括：
·补充有低聚果糖/菊粉(0.4％)、甘露糖醇(0.4％)、菊粉(0.4％)或果糖(0.4％)或者它们的组合的不含右旋糖的Gifu厌氧培养基(GAM,Nissui)
·补充有葡萄糖、纤维二糖、麦芽糖、L-阿拉伯糖、果糖、低聚果糖/菊粉、甘露糖醇和乳酸钠的改性SweetGAM[GifuAnaerobicMedium(GAM,Nissui)]
·布鲁氏血琼脂(BBA,Atlas,微生物培养基手册(HandbookofMicrobiologicalMedia),第4版,ASMPress,2010)
·PEA绵羊血(AnaerobeSystems；具有苯基乙醇的5％绵羊血琼脂)
·蛋黄琼脂(EYA)(Atlas,微生物培养基手册,第4版,ASMPress,2010)
·亚硫酸盐多粘菌素乳琼脂(Mevissen-Verhage等,临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)25:285-289(1987))
·粘蛋白琼脂(Derrien等,IJSEM54:1469-1476(2004))
·多聚半乳糖醛酸琼脂(Jensen和Canale-Parola,应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)52:880-997(1986))
·M2GSC(Atlas,微生物培养基手册,第4版,ASMPress,2010)
·补充有淀粉(1％)、甘露糖醇(0.4％)、乳酸盐(1.5g/L)或乳糖(0.4％)的M2琼脂(Atlas,微生物培养基手册,第4版,ASMPress,2010)
·补充有酵母提取物(0.5％)、氯化血红素、半胱氨酸(0.1％)、麦芽糖(0.1％)、纤维二糖(0.1％)、可溶性淀粉(sigma，1％)、MOPS(50mM，pH7)的SweetB-脑心浸液琼脂(Atlas,微生物培养基手册,第4版,ASMPress,2010)
·PY-水杨苷(补充有水杨苷的蛋白胨-酵母提取物)(Atlas,微生物培养基手册,第4版,ASMPress,2010)
·改性脑心浸液(M-BHI)[[甜味和酸味]]中每L含有以下：37.5g脑心浸液粉末(Remel)、5g酵母提取物、2.2g肉提取物、1.2g肝脏提取物、1g盐酸半胱氨酸、0.3g巯基乙酸钠、10mg氯化血红素、2g可溶性淀粉、2gFOS/菊粉、1g纤维二糖、1gL-阿拉伯糖、1g甘露糖醇、1g乳酸钠、1mLTween80、0.6gMgSO4x7H2O、0.6gCaCl2、6g(NH4)2SO4、3gKH2PO4、0.5gK2HPO4、33mM乙酸、9mM丙酸、1mM异丁酸、1mM异戊酸、15g琼脂，和在高压灭菌后添加50mL的8％NaHCO3溶液和50mL1MMOPS-KOH(pH7)
·Noack-Blaut真杆菌琼脂(参见Noack等,营养学杂志(J.Nutr.)(1998)128:1385-1391)
·BHISaz1/ge2-BHISaz/ge琼脂(Reeves等,传染与免疫(Infect.Immun.)80:3786-3794(2012))[脑心浸液琼脂(Atlas,微生物培养基手册,第4版,ASMPress,2010)，补充有酵母提取物0.5％、半胱氨酸0.1％、0.1％纤维二糖、0.1％菊粉、0.1％麦芽糖、氨曲南1mg/L、庆大霉素2mg/L]
·BHISCInMaz1/ge2-BHISCInM[脑心浸液琼脂(Atlas,微生物培养基手册,第4版,ASMPress,2010)，补充有酵母提取物0.5％、半胱氨酸0.1％、0.1％纤维二糖、0.1％菊粉、0.1％麦芽糖、氨曲南1mg/L、庆大霉素2mg/L]
实施例15：芽孢形成级分从粪便中的纯化和分离
为了从粪便材料纯化和选择性分离有效的芽孢，首先使用均质化装置(例如，实验室共混机)将捐献物与盐水共混以产生20％浆液(w/v)。添加100％乙醇以进行灭活处理，其持续10秒至1小时。最终醇浓度可在30-90％、优选50-70％范围内。进行高速离心(3200rcf持续10分钟)以去除溶剂并且球粒被保留并洗涤。随后，一旦经洗涤球粒再次悬浮，则进行低速离心步骤(200rcf持续4分钟)以去除大颗粒营养物质并且含有芽孢的上清液得到保留。对上清液进行高速离心(3200rcf持续10分钟)以浓缩芽孢材料。然后将球粒洗涤并再次悬浮以产生20％浆液。这是乙醇处理的芽孢制剂。然后用基于密度的梯度(例如CsCl梯度、蔗糖梯度或两者的组合)分离浓缩浆液，产生乙醇处理、梯度纯化的芽孢制剂。例如，通过在80体积％的含有64％、50％、40％CsCl(w/v)梯级的逐步CsCl梯度(w/v)顶部装载20体积％的芽孢悬浮液并在3200rcf下离心20分钟来进行CsCl梯度。然后利用具有67％、50％、40％和30％(w/v)梯级的蔗糖梯级梯度操作芽孢级分。当在吊桶式转子中离心时，在3200rcf下持续10分钟。芽孢大致在30％和40％蔗糖级分中操作。然后去除较低芽孢级分(图2)并洗涤以产生浓缩乙醇处理、梯度纯化的芽孢制剂。利用通过相差显微镜观察到的芽孢的折射特性(芽孢是明亮和折射的，而萌发的芽孢和营养期细胞是黑暗的)，可见相比于乙醇处理、CsCl梯度纯化的芽孢制剂(图3，中间)和乙醇处理、CsCl梯度纯化、蔗糖梯度纯化的芽孢制剂(图3，右侧)，芽孢级分从粪便细菌细胞悬浮液富集(图3，左侧)。
此外，在用萌发剂处理后的芽孢的生长也可用于定量活芽孢群体。简言之，将样品与萌发剂(牛胆汁，0.25％，高达1小时)一起温育，稀释并在厌氧条件下平板接种在BBA(布鲁氏血琼脂)或类似培养基(例如参见实施例4和5)上。挑取单独的菌落并且对于全长16S测序分离DNA以鉴定物种组合物(例如参见实施例2和3)。分析揭示总共观察到22个物种(表2)，其中绝大多数存在于利用梯度和未利用梯度纯化的材料中，这表示由于梯度纯化而在生态中不存在偏移或存在无关紧要的偏移。芽孢产率计算证实，如通过芽孢在BBA上的萌发和平板接种或测量样品中的DPA计数所测量，从起始粪便材料的芽孢的有效回收率为38％。
实施例16：细菌组合物预防小鼠模型中的艰难梭菌感染
为了测试细菌组合物的治疗潜力，使用艰难梭菌感染的预防性小鼠模型(基于Chen等,AmousemodelofClostridiumdifficileassociateddisease,胃肠病学(Gastroenterology)135(6):1984-1992的模型)。对于每组实验，测试两个笼子的各五只小鼠。所有小鼠在第-14天至第-5天接受由10％葡萄糖、卡那霉素(0.5mg/ml)、庆大霉素(0.044mg/ml)、粘菌素(1062.5U/ml)、甲硝唑(0.269mg/ml)、环丙沙星(0.156mg/ml)、氨苄青霉素(0.1mg/ml)和万古霉素(0.056mg/ml)在其饮用水中组成的抗生素混合液，并且在第-3天通过经口管饲接受剂量为10mg/kg的克林霉素。在第-1天，它们通过经口管饲接受测试物品或媒介物对照。在第0天，通过经口管饲施用约4.5log10cfu的艰难梭菌(ATCC43255)对其攻毒。任选地，除了上文指定的抗生素方案和艰难梭菌攻毒之外，阳性对照组从第-1天至第3天接受万古霉素。从笼子中收集粪便以用于分析细菌携带，从第0天至第6天每天评估死亡率并且评估动物的体重和后续体重变化，其中体重减轻与艰难梭菌感染相关。使用测试物品相比于媒介物得到的死亡率和降低的体重减轻来评估测试物品的成功。另外，从第-1天至第6天每天进行艰难梭菌症状评分。临床评分是基于通过组合外观评分(根据正常、弯腰驼背、立毛或嗜睡为0-2分)和临床征象(根据正常、湿尾、触摸冰冷或与其他动物隔离为0-2分)的0-4量表。
在天然对照组中，用艰难梭菌对动物进行攻毒。在万古霉素阳性对照组中，从第-1天至第3天对动物给予艰难梭菌并用万古霉素治疗。阴性对照组仅用PBS管饲且无细菌。实验测试组测试源自乙醇处理芽孢的单一供体制剂的1倍、0.1倍、0.01倍稀释液(例如参见实施例6)或通过在80℃下处理20％浆液30分钟所制备的热处理粪便。从最终乙醇处理的芽孢测定CFU计数的定量并且对于乙醇处理的级分以1x、0.1x、0.01x的芽孢混合物和对于热处理级分以1x剂量施用总芽孢稀释液。
在第3天评估体重减轻和死亡率。仅用艰难梭菌处理的阴性对照在第3天展现20％死亡率和体重减轻，而10％人类粪便悬浮液的阳性对照在第3天显示无死亡率或体重减轻(表3)。EtOH处理的粪便在三个稀释率下预防死亡率和体重减轻，而热处理级分仅在所测试剂量下具保护性。这些数据表明，芽孢级分对于预防小鼠中的艰难梭菌感染是有效的。
实施例17：预防性和复发预防仓鼠模型
使用产毒素和不产毒素的艰难梭菌菌株对仓鼠进行的先前研究表明，将仓鼠模型用于研究抗生素治疗后复发和用盲肠菌群进行预防治疗在艰难梭菌感染(Wilson等,1981；Wilson等,1983；Borriello等,1985)和更广泛胃肠道感染疾病中的作用。为了证实测试物品改善艰难梭菌感染的预防用途，使用以下仓鼠模型。在预防性模型中，在第-5天给与克林霉素(10mg/kg皮下)，第-3天施用测试物品或对照，并且在第0天进行艰难梭菌攻毒。在阳性对照组中，然后在第1-5天施用万古霉素(并且在第-3天递送媒介物对照)。在第-5、-4、-1、1、3、5、7、9天收集粪便并且通过微生物方法、16S测序方法或本领域技术人员利用的其他方法对粪便样品评估病原体携带和减少。在艰难梭菌攻毒后至21天的整个实验中评估死亡率。存活百分比曲线显示，相比于万古霉素对照和媒介物对照，乙醇处理的芽孢和乙醇处理、梯度纯化的芽孢更好地保护仓鼠。
参见图4：利用乙醇处理的芽孢制剂和乙醇处理、梯度纯化的芽孢制剂的预防模型。
在复发预防模型中，在第0天用产毒艰难梭菌菌株对仓鼠进行攻毒，并且在第1天通过经口管饲用克林霉素处理，并且在第2-6天给与万古霉素。然后在第7、8和9天施用测试或对照处理。每组的仓鼠群组由每组8只仓鼠组成。在第-1、1、3、5、7、10和13天收集粪便材料并且在期间评估仓鼠死亡率。使用存活曲线来评估测试物品例如乙醇处理或乙醇处理、梯度纯化的芽孢相对于对照处理在预防仓鼠死亡中的成功。所述存活曲线显示对于乙醇处理、梯度纯化的芽孢和接着是乙醇处理的芽孢的最大功效。两种处理相比于单独万古霉素处理改进存活百分比。
参见图5：利用乙醇处理的芽孢和乙醇处理、梯度纯化的芽孢的复发预防模型
实施例18：复发性艰难梭菌在患者中的临床处理
为了评估测试物品(例如，乙醇处理的芽孢制剂，参见实施例15)在人类患者中治疗复发性艰难梭菌的功效，进行以下程序以从健康供体获取粪便，经由下文描述的乙醇处理的芽孢制剂方案灭活，并且在呈现这种适应症的患者中治疗复发性艰难梭菌。对非亲缘供体进行如下筛选：一般健康史，无慢性医学病状(包括炎症性肠病；肠易激综合征；乳糜泻；或任何胃肠恶性疾病或息肉病史)，无传播性感染的风险因子，在过去6个月内未使用抗生素，和在大便捐献前对于血源性病原体(HIV、HTLV、HCV、HBV、CMV、HAV和梅毒螺旋体)和粪便细菌病原体(沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌、空肠弯曲杆菌、大肠埃希氏菌0157)、虫卵和寄生虫以及其他传染性病原体(贾第虫、隐孢子虫、环孢子虫、等孢球虫)的实验室测定的结果呈阴性。
在捐献和采样用于测试后不久将供体大便冷冻。在使用时，将约75g供体大便解冻并且再次悬浮在500mL非抑菌生理盐水中并混合在单次使用玻璃或塑料共混机中。使所得浆液依次通过去除600、300和200微米尺寸粒子的无菌一次性筛网。然后将浆液短暂离心(200rcf持续4分钟)以分离纤维状和颗粒状材料，并且将上清液(含有细菌细胞和芽孢)转移至新鲜的容器。添加乙醇至最终浓度为50％并且将所得约1500ml浆液在室温下温育1小时，其中连续混合以将营养期细菌细胞灭活。在灭活中途，将浆液转移至新瓶以确保与乙醇完全接触。使固体物质在离心机中形成球粒并用生理盐水洗涤3次以去除残余的乙醇。将最终球粒再次悬浮在最小体积的100％无菌USP甘油中，并且以每个0.65mL悬浮液填充到约30个0号延迟释放胶囊(hypromelloseDRcaps,Capsugel,Inc.)中。将胶囊立即封盖并放置在经由干冰保持在-80℃下的铝冷冻块上以冷冻。冷冻胶囊又用00号DR盖封装以增强胶囊稳定性，进行标记，并立即放置在-65℃储存中。将最终产物储存在<-65℃下直至使用当天和当时。封装产品可在<-65℃下无限期地储存。在给药当天将胶囊在湿冰上加温1至2天以改进耐受性，并且然后随意给水。
患者1是在治疗前具有艰难梭菌感染和腹泻史至少1年的45岁女性。她先前已经用多个抗生素疗程治疗，接着每次艰难梭菌相关腹泻复发。
患者2是在治疗之前已经历复发性艰难梭菌感染6个月的81岁女性，但在每次复发后进行充分抗生素治疗。
在开始口服治疗前24小时，停止CDAD抗生素治疗。每个患者接受旨在降低胃肠道中的竞争微生物负担并促进研究产品中的芽孢形成生物体恢复种群的结肠制剂程序。
在第一个治疗日的早上，患者接受一定剂量的含有研究产品的延迟释放胶囊，随意给水。要求患者在其后1小时禁食。第二天，患者返回诊所接受另一个剂量。要求患者禁食4小时，然后接受其第二剂量，并且在给药后禁食1小时。
对两名患者密切随访在治疗后的复发或不良症状的迹象。在第2天、第4天、和第1周、第2周和第4周通过电话联系患者并且询问其一般状态和CDAD状况和相关症状。在基线下和治疗后第1周、第2周、第4周和第8周收集大便样品以利用先前解释的方法经由16S测序和芽孢计数评估肠道微生物群的变化(例如参见实施例11和12)。到治疗后第4周，每个患者已逐渐改善，其中无艰难梭菌复发迹象。
以类似方式治疗六个其他具有复发性艰难梭菌相关腹泻的患者，其中无CDI复发并且不要求恢复抗生素(总共8个患者)。另外，不存在治疗相关的严重不良事件。
实施例19：用乙醇或热处理粪便悬浮液急剧降低营养期细胞数目并导致芽孢形成 物质富集
以灭活或杀死样品中存在的基本上所有营养形式的细菌的方式处理样品，优选是人类粪便样品，这导致芽孢级分的选择和富集。灭活方法可包括加热、超声处理、洗涤剂溶解、酶促消化(例如溶菌酶和/或蛋白酶K)、乙醇或酸处理、溶剂(四氢呋喃、1-丁醇、2-丁醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、丁酸酯、丙酸酯、氯仿、二甲醚和洗涤剂如tritonX-100、二乙醚)暴露，或这些方法的组合。为了证实乙醇诱导营养期细胞失活的功效，将10％粪便悬浮液与无水乙醇以1:1比率混合并涡旋以混合1分钟。将悬浮液在室温下温育30分钟、1小时、4小时或24小时。在温育后，将悬浮液在13,000rpm下离心5分钟以使芽孢形成球粒。弃去上清液并且将球粒再次悬浮在相等体积的PBS中。如下文所述测量活细胞。
为了证明热处理对营养期细胞失活的功效，将10-20％粪便悬浮液在70℃、80℃、90℃或100℃下温育10分钟或1小时。
在乙醇或热处理后，在平板上温育24小时后，通过测定布鲁氏血琼脂(BBA)上的细菌滴度随处理和时间的变化来测量剩余的活细胞(参见图6)。乙醇处理1小时和25小时具有类似的效果，将活细胞数目降低约4log，同时增加温度和高温下的时间导致活细胞数目更高的损失，在100℃下在10分钟或1小时下不可检测到菌落。在这个实验中未使用萌发剂。在平板上另外生长若干天后，从这些处理过的样品中挑取多个菌落并通过16SrDNA分析鉴定(例如参见实施例11和12)。这些包括先前未报道为芽孢形成剂的已知芽孢形成梭菌属以及物种，包括布氏瘤胃球菌、和科利霍米尼斯厌氧干菌(Anaerotruncuscolihominis)(Lawson等,2004)和真杆菌属(表4)。参见图6：加热和乙醇处理降低细胞活力。
为了证明营养期细胞通过乙醇处理极大地减少，对已知的非芽孢形成细菌进行如先前所述的乙醇处理(例如参见实施例15)并且通过在厌氧条件下平板接种在BBA上来测定存活力(例如参见实施例14)。使来自四个独立供体的粪便材料暴露于60℃持续5分钟并且随后在需氧(+O2)或厌氧条件(-O2)下平板接种在三种类型的选择性培养基(BBA+需氧、MacConkey乳糖+需氧、拟杆菌胆汁七叶苷+厌氧)上以鉴定已知的非芽孢形成肠杆菌(MacConkey琼脂上的幸存者)和脆弱拟杆菌群物种(拟杆菌胆汁七叶苷板上的幸存者)。这些测定法的检测限为大约20cfu/mL。在这个实验中未使用萌发剂(图7)。在使用MacConkey乳糖琼脂和BBE琼脂下，乙醇和热灭活将来自粪便材料的细胞活力极大地降至检测限。在厌氧条件中生长的BBA培养基上鉴定的剩余细胞包含非萌发剂依赖性芽孢形成物质。参见图7：通过在60℃下处理5分钟使非芽孢形成营养期细胞减少。
另外，如通过平板接种在富(BBA)培养基上所测定，乙醇处理显示在10％粪便悬浮液中快速杀死需氧和非芽孢形成厌氧菌落形成单位。所接种CFU的减少在数秒内降低四个数量级，如图8中所示。
参见图8：时间过程显示，乙醇降低厌氧和需氧细菌CFU。
实施例20：通过乙醇处理作为芽孢形成剂鉴定和分离的物种
为了证明芽孢形成物质通过加热或乙醇处理方法富集，进行>7000个菌落分离株的比较而以可重复方式鉴定仅从用50％乙醇处理或热处理的粪便悬浮液分离而非从未被处理的粪便悬浮液分离的物种(例如，在多个制剂中独立地鉴定，参见实施例1、2和3)(表5)。这些数据表明选择来自粪便材料的芽孢形成物质并鉴定为如先前在文献中未描述的芽孢形成剂的生物体的能力。在每种情况下，生物体以分离菌落形式挑取，在厌氧条件下生长，然后进行全长16S测序以指定物种身份。
为进一步鉴定芽孢形成剂，将来自供体A、B、C、D、E和F的乙醇处理的粪便样品平板接种至多种固体培养基类型，挑取单个菌落并以96孔格式在肉汤中生长(表6-11)。然后通过PCR扩增16SrRNA基因并且进行直接循环测序(参见实施例11和12)。ID是基于来自16SrRNA基因的直接循环测序的正向读数。
在微生物组中的不同个体之间存在令人惊讶的异质性(Clemente等,2012)并且这具有用于测定各种供体生成有用的芽孢组合物的潜在功效的结果。当在抗生素治疗或治疗特定疾病或病状后，例如特定量或多样性的芽孢形成生物体可用于重建微生物组或为重建微生物组所需时，下文描述的方法可用于筛选供体。此外，当出于分离能够芽孢形成的微生物而需要筛选供体时，或当需要来自特定供体的芽孢形成生物体的纯化制剂时，这种筛选是有用的。
总芽孢计数也是特定捐献物或纯化芽孢制剂的效能的量度并且对于测定达到所需剂量水平所需的材料量是重要的。为了理解总芽孢计数中的可变性，收集供体样品并且如先前实施例中所述进行处理。然后通过在各种滴定下在培养基板上生长以测定捐献物的芽孢计数来测定供体芽孢计数(CFU/g)。此外，使用DPA测定法来评估芽孢含量(以芽孢当量表示)，如实施例21中所述。如图9中可见，在单独的供体中随时间存在多达2log差异并且供体之间可能高达3log差异。芽孢含量量度中的差异的一个可能原因在于，通过平板接种不会观察到非活芽孢和非可萌发芽孢，但将具有可测量的DPA含量。另一种可能性是芽孢中的DPA含量的物种之间的可变性，产生含有高DPA芽孢的一些复杂混合物，而其他混合物含有低DPA含量芽孢。通过鉴定优选的供体，选择具有高芽孢计数的供体对于测定从粪便捐献物中分离芽孢的生产率是重要的。
参见图9：来自临床供体的捐献物芽孢浓度
如实施例15中所述处理来自供体F的新鲜粪便样品以产生乙醇处理的芽孢级分，如所述用BHIS/牛胆汁萌发1小时(例如参见实施例13)，然后平板接种至多种培养基(例如参见实施例14)。通过重点挑取每个板上的若干个每种类型的形态不同菌落来挑取菌落以尽可能多地多样性捕捉。在具有孔分离菌落的每种培养基类型的平板上计数菌落，以使得可以计算每ml的菌落形成单位数目(表12)。将菌落挑取至若干种液体培养基之一中并且如上文所述测定并分析16SrDNA序列(例如参见实施例11和12)。下文示出每种培养基类型的独特OTU数目，其中具有最独特OTU的培养基在顶部(表12)。前5种培养基类型的3至5种的组合捕捉多样性，并且可以选择一些其他的来靶向特定相关物种。可以使用16S数据对于给定物种计算菌落形成单位，并且其可用于测定是否存在足够水平的给定生物体。如在这个实验中测定的来自供体F的芽孢补体包括如通过16S测序测定的这52种物种(表12)。
为了关于芽孢形成细菌的多样性的存在和/或特定芽孢形成细菌筛选人类供体，使用萌发剂和选择性平板接种条件制备粪便样品并且挑取菌落(例如参见实施例13和14)并且如先前所述分析16S多样性(参见实施例11和12)。供体多样性的评估可包括在给定培养基类型上的乙醇抗性细胞的cfu/ml，或使用从所述培养基挑取的菌落的16S分析来测定给定相关物种的芽孢水平的给定物种的cfu/ml。这种类型的基于培养物的分析可通过独立于培养的方法来补充，例如利用对相关种或属具特异性的探针或芽孢制剂的宏基因组测序的qPCR，或使用Illumina16S可变区测序方法的芽孢制剂的16S特征分析(例如参见实施例11和12)。
实施例21：使用DPA测定法来定量芽孢浓度
评估复杂混合物中的芽孢浓度的方法通常需要分离和选择芽孢以及单独的物种的后续生长以测定菌落形成单位。本领域未教导如何定量萌发复杂混合物中的所有芽孢，因为存在许多尚未鉴定适当萌发剂的物种。此外，认为芽孢形成是由于进化选择的随机过程，这意味着并非所有来自单一物种的芽孢在对萌发剂浓度、时间和其他环境条件相同的反应下萌发。可选地，已开发了细菌芽孢的关键代谢物二吡啶甲酸(DPA)来定量样品中的芽孢粒子并避免来自粪便污染物的干扰。测定法利用如下事实：DPA螯合铽3+以形成发光复合物(Fichtel等,FEMS微生物生态学(FEMSMicrobiologyEcology),2007；Kort等,应用与环境微生物学(AppliedandEnvironmentalMicrobiology),2005；Shafaat和Ponce,应用与环境微生物学(AppliedandEnvironmentalMicrobiology),2006；Yang和Ponce,国际食品微生物学杂志(InternationalJournalofFoodMicrobiology),2009；Hindle和Hall,分析家(Analyst),1999)。时间分辨荧光测定法检测在DPA存在下的铽发光，得到溶液中DPA浓度的定量测量。
为了进行测定法，将1mL待测量的芽孢标准物转移至2mL微量离心管。将样品在13000RCF下离心10分钟并且在1mL无菌去离子H2O中洗涤样品。通过重复离心洗涤另外一段时间。将1mL溶液转移至亨氏管(hungatetube)并且高压釜样品在蒸汽上在250℃下循环30分钟。向样品中添加100μL的30μMTbCl3溶液(400mM乙酸钠，pH5.0，30μMTbCl3)。制备高压灭菌材料的连续稀释液并通过用275nm光激发并关于1.25ms积分时间和0.1ms延迟测量543nm的发射波长来测量每个样品的荧光。
如先前所述产生纯化芽孢(例如参见http://www.epa.gov/pesticides/methods/ MB-28-00.pdf)。制备来自双酶梭菌、生孢梭菌和丁酸梭菌培养物的纯化芽孢的连续稀释液并通过平板接种在BBA培养基上并在37℃下温育过夜以测定CFU/ml来测量。图10示出不同芽孢产生细菌在若干log上的线性对应关系，证实DPA测定法作为评估芽孢含量的方式。
参见图10：DPA测定法相比于CFU计数/ml的线性范围
通过可萌发芽孢CFU并通过DPA测量的芽孢计数之间的复杂芽孢群体的差异具有测定乙醇处理的芽孢制剂用于临床使用的效能的重要意义。表AC示出用于成功治疗3名罹患复发性艰难梭菌感染的患者的3种不同乙醇处理的芽孢制剂的芽孢含量数据。使用两种所述方法表征每种芽孢制剂的芽孢含量。
表AC.使用芽孢CFU(SCFU)测定法和DPA测定法对乙醇处理的芽孢制剂进行芽孢定 量
立即显而易见的是，每30个胶囊的芽孢含量极大地改变。如通过可萌发SCFU所测量，芽孢含量改变10,000倍以上。如通过DPA所测量，芽孢含量改变100倍以上。在不存在DPA测定法的情况下，将难以设定用于施用至患者的最小剂量。例如，在不存在来自DPA测定法的数据的情况下，可以得出结论，使用SCFU测定法，芽孢的最小有效剂量为4×105或更小(例如制剂1，表AC)。然而，如果SCFU剂量用于标准化临床环境中的给药，则给与患者的实际芽孢剂量将远低于如通过DPA测定法所测量的其他乙醇处理的芽孢制剂(表AD)。
表AD.当相对于每剂4×10 5 SCFU标准化的表AC中的DPA剂量
根据各种捐献物之间的SCFU和DPA计数的可变性，显而易见的是，使用SCFU作为效能量度将导致在某些情况下显著剂量不足。例如，对于产品制剂3设定4×105SCFU的剂量规格(来自供体制剂1的表观有效剂量)将导致大于100倍的潜在剂量不足。这可以只通过设定基于DPA测定法的效能规格来调整，其更好地反映乙醇处理的芽孢制剂中的总芽孢计数。这项工作的出乎意料的研究结果是，DPA测定法独特地适于设定效能并确定乙醇处理的芽孢制剂的剂量。
实施例22：利用萌发剂增强生长的证明
为了增强乙醇处理的芽孢萌发能力并证明芽孢活力，通过各种处理使来自三种不同供体的芽孢萌发并平板接种在各种培养基上。如先前所述(例如参见实施例13和14)在厌氧条件下在37℃下用BHIS/牛胆汁(BHISox)、Ca-DPA、瘤胃流体(RF)、模拟胃液(SGF)、粘蛋白培养基(Muc)、胎牛血清(FBS)或巯基乙酸盐(Thi)萌发1小时，其中样品源自两个独立供体(图11)。如先前所述(例如参见实施例13和14)将芽孢-萌发剂混合物连续稀释并接种在包括BBA、SweetB、SweetB+溶菌酶(2μg/ml)、M2GSC和M2GSC+溶菌酶(2μg/ml)的不同平板培养基上以测定芽孢萌发。计算菌落形成单位并由本领域技术人员使用标准技术测定滴度。如图11所示，最大菌落形成单位源自BHI-牛胆汁处理。相比于无萌发步骤的平板接种(图12)，这种萌发处理也极大地增加了如通过当对样品进行16S测序(例如参见实施例11和12)时所鉴定的OTU数目所测量的多样性。如图11中所示：不同萌发剂处理对来自供体A(左上)和供体B(右下)的CFU计数具有不同影响。Y-Axes是每ml的芽孢CFU。如图12中所示：萌发剂极大地增加了所培养芽孢形成OTU的多样性。
为了测试热活化促进萌发的作用，如先前所述(例如参见实施例13和14)，在室温、55℃、65℃、75℃或85℃下将来自三个不同供体的乙醇处理的粪便样品处理15分钟并且随后在37℃下用BHIS+牛胆汁萌发1小时，然后平板接种在BBA培养基上(图13)。在所有三种供体中，在室温下预处理相比于高温产生相同甚至更多芽孢。此外通过在厌氧条件下在室温或37℃下温育样品1小时，随后平板接种在BBA上来研究萌发温度。在两种条件之间未观测到CFU数目差异。此外通过测试各种活化温度，接着在存在或不存在溶菌酶的情况下温育，在单个供体样品上测试溶菌酶向平板的添加(2μg/ml)。当平板接种在SweetB或M2GSC培养基上时，溶菌酶的添加相比于用不具有溶菌酶的BHIS牛胆汁处理1小时具有较小作用(图14)。
如图13中所示：作为用BHIS+牛胆汁萌发处理的热活化。如图14中所示：溶菌酶的作用轻微地增强萌发。
此外通过处理在BHIS、牛磺胆酸盐、牛胆汁或germix中温育0、15、30或60分钟的单一供体乙醇处理的粪便的10％悬浮液(例如参见实施例15)来测试萌发时间并且随后平板接种在BHIS、EYA或BBA培养基上(例如参见实施例13和14)。60分钟导致所有各种组合上的大多数CFU单元萌发并测试板培养基。
实施例23：证明乙醇处理芽孢的可萌发和可孢子化级分的功效
为了限定表征和纯化方法，并且为了改进(例如，诸如通过调节组合物的多样性)源自粪便捐献物的活性芽孢形成生态，将乙醇处理的芽孢群体(如实施例15中所述)进一步分级。“可萌发级分”是通过如下获得：用牛胆汁处理乙醇处理的芽孢制剂，平板接种至各种固体培养基，然后在生长2天或7天后，将从板生长的所有细菌刮落到每个板5mLPBS中以产生细菌悬浮液。如上文获得“可孢子化级分”，不同之处在于使细胞在固体培养基上生长2天或7天(延长时间以允许芽孢形成，如在芽孢形成方案中的典型情况)，并且用50％乙醇处理所得细菌悬浮液以获得“可孢子化”芽孢群体，或能够形成芽孢的物种。在制备这些级分时，如先前在实施例15中所述使用来自供体A的粪便材料来产生乙醇处理的芽孢制剂；然后如先前所述(参见实施例21)通过DPA测定法和在各种培养基上生长的CFU/ml来测定芽孢含量(图15)。参见图15：如通过DPA和在指定培养基上生长的CFU/ml所测量的最初在乙醇处理的芽孢制剂中存在的芽孢。
为了表征可孢子化的级分，对于第2天和第7天“可萌发”级分评估在乙醇处理之前和之后的CFU和DPA含量以产生芽孢级分。将细菌悬浮液用乙醇处理，用牛胆汁萌发，并平板接种在与“可萌发”级分生长相同类型的培养基上。DPA数据显示，在板上生长2天和7天产生相同量的总芽孢。挑取在若干类型培养基上的菌落用于16S序列分析以鉴定所存在的芽孢形成细菌(表13)。
如所述(例如参见实施例16)在小鼠预防测定法中将2天“可萌发”级分和7天“可孢子化”级分用作处理。作为对照，也将从供体(供体B)制备的10％粪便悬浮液施用至小鼠以模拟粪便微生物群移植(FMT)。研究的各种测试和对照组的体重减轻和死亡率绘制于图17中并总结于表15中，其还包含给药信息。数据明确显示，“可萌发”和“可孢子化”级分在预防小鼠模型中有效提供针对艰难梭菌攻毒的保护(例如参见实施例16)。这些级分的功效进一步证实所存在的物种负责芽孢级分的功效，因为分级进一步稀释来自原始芽孢制剂的任何潜在污染物。
参见图16：根据DPA和CFU/ml的2天后的“可萌发”级分(左)和可孢子化级分(右)的滴度。如先前所述使用萌发和生长测定法或如先前所述的DPA含量来测量在生长7天后制成的“可孢子化”级分(参见实施例21)。
通过菌落挑取的全长16S测序并通过级分自身的16SNGS测序来测定在“可萌发”和“可孢子化”级分中存在的物种。菌落挑取数据表明在两种级分中梭菌物种非常丰富，而NGS数据揭示存在通常见于乙醇处理的芽孢制剂中的其他芽孢形成生物体。
结果示于以下：参见表13。通过菌落挑取方法鉴定为“可萌发”和“可孢子化”的物种。参见表YYY。使用16S-V4NGS方法鉴定为“可萌发”的物种。参见表ZZZ。使用16s-V4NGS方法鉴定为“可孢子化”的物种。参见图17：小鼠预防模型证实“可萌发”和“可孢子化”制剂针对艰难梭菌攻毒具保护性。每个曲线图记录了在实验过程中单独的小鼠的体重相对于第-1天的变化。在实验过程中的死亡数目表示在图表顶部并且由第6天之前的线终止显示。顶部图(从左至右)是媒介物对照组、粪便悬浮液组和未处理的天然对照组，而底部图是乙醇处理、梯度纯化的芽孢制剂；乙醇处理、梯度纯化的“可萌发”制剂和乙醇处理、梯度纯化的“可孢子化”制剂。参见表15：预防小鼠模型的结果和给药信息。
实施例24：在预防小鼠中的供体汇集功效
为了测试汇集供体样品的功效和给药，将艰难梭菌预防小鼠模型(例如，参见实施例16)用于从如先前所述的两种或更多种供体样品混合的捐献物。在混合芽孢产物下相对于从单一供体在不同剂量下获得的芽孢产物下的体重减轻和死亡率决定两种治疗方案是否等效或者一种治疗方案是否显著优于另一种。
源自单一或多个供体的芽孢产物的剂量为1E4至1E10CFU/ml。将芽孢产物与源自在相等浓度或不同已知浓度下在1-10范围内的任何数目的供体的产物混合。
另外，这种方法可用于出于生产目的扩增芽孢级分。出于生产目的，富集的芽孢级分(例如，粪便样品的纯化的和EtOH处理的级分)以多个等分试样保存以形成活芽孢形成生物体库。这种库的等分试样然后通过萌发剂处理回收，接着在培养基中并且在广泛允许芽孢形成生物体并鼓励芽孢形成的条件下培养。在合适的扩增时间后，收集包括芽孢的扩增细菌，并且对这种制剂进行溶剂或热处理以分离芽孢级分。这种级分可从非芽孢形式和培养成分中进一步纯化。可在增加的规模下重复扩增过程、芽孢分离和可选的纯化以大量产生用于进一步使用。当已经通过扩增积聚足够的可萌发/可孢子化物质时，其可进一步纯化、浓缩或稀释，和/或保存至适于进一步使用(例如临床给药)的状态。
特征可并入上述方法中以使其适合进一步利用，尤其是用于产品应用如临床使用。初始芽孢级分的产生可在受控条件(cGMP)下进行并且证实在高程度上去除非芽孢生物体。可使用相比于天然产物如牛胆汁(例如胆汁盐的合成混合物)更可标准化的试剂下进行萌发。可使用具有对于临床安全性优选的组分(例如，源自合格动物，或非动物源)的培养基进行扩增。可布置条件以确保孢子化生物体的一致组成，不容易污染，并且更适合于扩大规模，例如具有反馈控制回路的密封搅拌发酵罐。可使用严格消除非芽孢和其他过程残余物的单独或组合程序(例如溶剂处理、水性两相萃取和/或60℃长期热处理)从过程中分离孢子化生物体。保存可能涉及添加赋形剂和/或调节条件以实现转化为适合长期货架存储的优选剂型，例如添加海藻糖，接着冻干或喷雾干燥，粉末与微晶纤维素进一步共混，和囊封在明胶胶囊中以形成可经口给与的产品。
实施例25：在用芽孢组合物治疗的患者中植入、强化和降低病原体携带
使用补充基因组和微生物方法来表征在治疗前(处理前)时和在治疗后至多4周时来自患者1、2、3、4、和5、6、7、8、9和10的微生物群组成。
为了确定通过在患者中用乙醇处理的芽孢制剂治疗而植入的OTU以及其微生物组如何回应而改变，在用乙醇处理的芽孢制剂治疗之前(治疗前)以及在接受治疗后至多25天，通过16S-V4测序表征微生物组。例如，用乙醇处理的芽孢制剂治疗患者1导致从芽孢治疗植入OTU和在患者的微生物组中强化(图18和图19)。到治疗后第25天，以下分类学群组的物种在总微生物携带中占优势：拟杆菌、萨特菌、瘤胃球菌、布劳特氏菌、真杆菌、吉米菌/粪杆菌和非芽孢形成乳杆菌(关于特定OTU，参见表16和表2)。前两个属代表不形成芽孢的OTU，而后者分类组代表被认为形成芽孢的OTU。
用乙醇处理的芽孢制剂治疗患者导致相比于治疗之前建立具有更大多样性的微生物生态(图18)。基于基因组的微生物组表征证实在患者治疗前不存在的多种OUT的植入(表16)。这些OTU包含能够和不能够形成芽孢的两种细菌物种，和代表多种系统发育分支的OTU。在患者1治疗前不存在的生物体直接从乙醇处理的芽孢级分植入或通过产生有利于健康的多样微生物群的肠道环境而强化。此外，在患者1和2中脆弱拟杆菌群物种增加4和6log(图20)。
包含强化生态的OTU在治疗之前不存在于患者中和/或以极低频率存在以使得它们不包含显著分率的总微生物携带并且不能通过基因组和/或微生物测定方法检测。作为植入和强化生态的成员的OTU是通过表征如下OUT来鉴定，所述OTU在治疗后的相对丰度增加并且分别是：(i)存在于乙醇处理的芽孢制剂中并且在患者治疗前不存在，或(ii)在乙醇处理的芽孢制剂中不存在，但其相对丰度通过用制剂治疗一段时间后由于通过治疗形成有利的生长条件而增加。值得注意的是，后者OTU可从患者中的低频率储集器生长，或者从外源如饮食引入。包含“核心”强化或植入生态的OTU可由观察到植入和/或强化的总患者百分比定义；这个百分比越大，它们更可能成为负责催化从生态失调的生态中转变的核心生态的一部分。生态中的优势OTU可以使用若干种方法鉴定，包括(但不限于)限定在强化或植入生态中具有最大相对丰度的OTU和限定总相对丰度阈值。例如，患者1的强化生态中的优势OTU是通过限定具有最大相对丰度的OTU来鉴定的，它们共同构成这个患者的强化生态中的微生物携带的60％。
参见图18：在乙醇处理的芽孢处理样品和患者治疗前和治疗后样品中测量的微生物多样性。总微生物多样性是使用Chao1α-多样性指数定义的并且在不同的基因组采样深度下测量以证实足够序列覆盖率来测定目标样品中的微生物组。患者治疗前(紫色)的微生物组相比于乙醇处理的芽孢处理(红色)和患者治疗后第5天(蓝色)、第14天(橙色)和第25天(绿色)具有显著降低的总体多样性。
参见图19：通过用乙醇处理的芽孢处理进行治疗使患者微生物生态从生态失调状态转变为健康状态。基于患者治疗前和治疗后的微生物组(Bray-Curtisβ-多样性)的总体多样性和结构的原理坐标分析描绘出，从芽孢治疗植入OTU和患者微生物生态的强化导致微生物生态不同于治疗前微生物组和乙醇处理的芽孢处理的生态(表16)。
参见图20：患者中的拟杆菌物种的强化。比较治疗前和治疗后4周内每cfu/g粪便的脆弱拟杆菌群物种的数目，揭示出4log或更大的增加。16S-V4OTU鉴定分配OTU作为特定物种的能力部分取决于16S基因的16S-V4区域对于特定物种或物种群的解析。树的不同区域的可用参考16S序列的密度以及不同物种之间的16S基因的固有可变性将决定分类注释对于给定序列读数的确定性。考虑到系统发育树的拓扑性质和如下事实：树基于其序列相似性和潜在的进化模型表示OTU彼此的层次关系，可使用基于分支的分配程序将读数的分类注释卷绕至更高水平(表1)。使用这种方法，分支是基于使用具有系统发育领域中的普通技术的个体所熟知的最大似然或其他系统发育模型从全长16S序列构建的系统发育树的拓扑结构定义的。构建分支以确保给定分支中的所有OTU是：(i)在彼此指定数目的引导程序支持的节点内(通常，1-5个引导程序)，和(ii)在5％遗传相似性内。在相同分支内的OTU可以基于16S-V4序列数据区分为与不同分支中的OTU在遗传上和系统发育上不同。处于相同分支内的OTU在进化上密切相关并且可能会或可能不会使用16S-V4序列数据彼此区分。基于分支的分析的强大之处在于，相同分支的成员，由于其进化相关性，而可能在微生物生态如人类肠道中存在的生态中发挥类似的功能作用。一种物种被来自相同分支的另一种物种取代的组合物可能具有保守的生态功能并且因此可用于本发明中。
将大便样品等分并以10×体积/重量再次悬浮在100％乙醇(对于基因组表征)或含有15％甘油的PBS(对于微生物的分离)中，然后储存在-80℃下直至需要使用。对于基因组16S序列分析，从板分离株挑取的菌落具有如实施例11和12中所述表征的全长16S序列，并且使用关于实施例10中的异源样品的方法制备靶向16S-V4区域的主要大便样品。
值得注意的是，给定OTU的分离株的16S序列系统发育性地置于其相应分支内，但物种和属的实际分类分配性可表明它们在分类学上不同于其所处分支的其他成员。给予OTU的分类名称之间的差异是基于微生物特性，相比之下基因测序根据文献是已知存在的。在此表中脚注的OTU已知在用于分配分类名称的不同方法之间是有差异的。
从乙醇处理的芽孢制剂治疗可植入OTU到患者中以及驻留微生物组的所得强化导致患者中除艰难梭菌之外的致病物种的携带显著降低和消除。主要大便样品的16S-V4测序表明，在治疗前，20％的读数来自克雷伯氏菌属并且另外19％被分配到梭杆菌属。这些惊人的数据是与复发性艰难梭菌感染和长期抗生素使用相关的深度生态失调的微生物群的证据。在健康的个体中，基于HMP数据库的分析(www.hmpdacc.org)，克雷伯氏菌是仅约2％的受试者中的人类微生物组的驻留物，并且在这些人的大便中，克雷伯氏菌的平均相对丰度仅为约0.09％。其令人惊讶地以20％相对丰度在治疗前患者1中的存在指示，促炎性肠道环境能够使“病生菌”过度生长并与肠道中通常存在的共生生物体过度竞争。类似地，梭杆菌的惊人过度生长指示深度生态失调的肠道微生物群。梭杆菌的一个物种具核梭杆菌(基于16S-V4与梭杆菌属3_1_33在系统发育上不可区分的OTU)已基于其与人类中的IBD、克罗恩病和结肠直肠癌的相关性和其在动物模型中的结肠直肠癌发展中表现出的致病作用而被称为“新兴的肠道病原体”[Allen-Vercoe,肠道微生物(GutMicrobes)(2011)2:294-8]。重要的是，到第25天时在16S-V4读数中未检测到克雷伯氏菌和梭杆菌(表18)。
为了进一步表征克雷伯氏菌和其他肠杆菌科在肠道的定殖并且为了使这些生物体形成物种，将以PBS-甘油悬浮液形式储存在-80℃下的治疗前和第25天粪便样品平板接种在多种选择性培养基上，包括MacConkey乳糖培养基(对于革兰氏阴性肠杆菌具选择性)和西蒙斯(Simmons)柠檬酸盐肌醇培养基(对于克雷伯氏菌属具选择性)[VanCregten等,临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)(1984)20:936-41]。在患者样品中鉴定的肠杆菌包括肺炎克雷伯氏菌、克雷伯氏菌属Co_9935和大肠埃希氏菌。引人注目的是，每种克雷伯氏菌物种减少2-4log，而在健康的微生物群中存在的常见共生生物体大肠埃希氏菌降低小于1log(表19)。在多个患者之间，克雷伯氏菌属携带的这种降低是一致的(表19)。在治疗前和治疗后的4周，对四个独立的患者评估克雷伯氏菌的存在。如先前所述通过在选择性西蒙斯柠檬酸盐肌醇培养基上生长来检测克雷伯氏菌。连续稀释和平板接种，接着测定形态上不同的物种的cfu/mL滴度和那些不同形态类别的代表物的16S全长序列鉴定，允许计算特定物种的滴度。
拟杆菌属是胃肠道微生物群的重要成员；来自人类微生物组计划(HumanMicrobiomeProject)的100％大便样品含有至少一个拟杆菌物种，其中这些样品中的总相对丰度在0.96％至93.92％范围内，其中中位相对丰度为52.67％(www.hmpdacc.org，参考数据集HMSMCP)。肠道中的拟杆菌与氨基酸发酵和复杂多糖的降解相关。其在肠道中的存在通过富含如典型西方饮食中存在的动物源产品的饮食而增强[David,L.A.等,自然(Nature)(2013)doi:10.1038/nature12820]。引人注目的是，在治疗之前，定位至拟杆菌属的来自患者1的不到0.008％的16S-V4读数强烈表明，拟杆菌物种不存在或者活拟杆菌减少至患者的肠道微生物组的极其微量成分。在治疗后，≥42％的16S-V4读数在治疗5天内可分配至拟杆菌属，并且到治疗后第25天，59.48％的患者肠道微生物组包含拟杆菌。这些结果在微生物学上通过在平板接种在如下两种不同拟杆菌选择性培养基上的治疗前样品中的可检测拟杆菌的不存在得到证实：拟杆菌胆汁七叶苷(BBE)琼脂，其对脆弱拟杆菌组物种具选择性[Livingston,S.J.等,临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol)(1978).7:448-453]和不含多胺的阿拉伯糖(PFA)琼脂[Noack等,营养学杂志(J.Nutr.)(1998)128:1385-1391；通过用阿拉伯糖代替葡萄糖来改性]。高选择性BBE琼脂具有<2×103cfu/g的检测限，而由于多种非拟杆菌物种在所述培养基上的治疗前样品中的生长，拟杆菌在PFA琼脂上的检测限约为2×107cfu/g。在第25天的拟杆菌物种的菌落计数高达2×1010cfu/g，与16S-V4测序一致，这表明肠道微生物群在患者1中的深度重构(表20)。
在第25天(和早至第5天，如通过16S-V4测序所示)患者1中的拟杆菌的显著丰度是值得注意的。基于微生物平板接种，在乙醇处理的芽孢群体中不存在活的脆弱拟杆菌群物种(检测限为10cfu/ml)。因此，向患者1施用乙醇处理的芽孢群体不仅导致芽孢形成物质的植入，而且通过产生允许拟杆菌物种恢复种群的生境而导致在健康个体中通常存在的高水平非芽孢形成物质的恢复。这些生物体最有可能以极低丰度存在于患者1的胃肠道中，或存在于可使它们反弹到高滴度的胃肠道中的储集器中。这些物种也可以在治疗后经由从食物口服摄取而再接种。我们将在乙醇处理的芽孢群体中不存在的OTU在肠道中的这种健康的种群恢复称为“强化”。强化是一个重要的现象，原因在于它显示使用乙醇处理的芽孢生态来恢复健康的微生物群的能力，它是通过接种多样阵列或共生生物体超过乙醇处理的芽孢群体自身中的实际组分生物体来实现的；具体地，芽孢处理自身和从芽孢组合物植入OTU产生能够实现OTU出芽的生境，这是将生态失调的微生物组转变为与健康相关的微生物生态所需的。拟杆菌物种的多样性和其在患者1的肠道中的近似相对丰度示于表21中，其包含至少8个不同物种。
参见图21：在用乙醇处理的芽孢群体治疗后，患者微生物组中的物种植入对物种强化。如所述植入或强化的物种的相对丰度是基于16S序列读数的数目测定的。每个曲线图是来自对于复发性艰难梭菌用乙醇处理的芽孢群体处理的不同患者。
通过将来自患者2、4和5的治疗前和第28天临床样品平板接种在MacConkey乳糖+1μg/mL亚胺培南上来评估乙醇处理的芽孢群体治疗对耐亚胺培南肠杆菌携带的影响。通过形态对抗性生物体评分，列举并如上文所述提交DNA用于全长16SrDNA测序。分离株被鉴定为摩氏摩根菌(Morganellamorganii)、雷氏普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)和彭氏变形杆菌(Proteuspennerii)。这些中的每个是肠道共生生物体；过度生长可能导致菌血症和/或尿路感染，其需要积极抗生素治疗并且在一些情况下需要住院治疗[Kim,B-N等,斯堪的纳维亚传染病杂志(ScanJ.InfDis)(2003)35:98-103；Lee,I-K和Liu,J-W,微生物免疫与感染杂志(J.MicrobiolImmunolInfect)(2006)39:328-334；O'Hara等,临床微生物学评论(ClinMicrobiolRev)(2000)13:534]。患者在治疗前和第28天的生物体滴度示于表22中。重要的是，在5个具有多个耐亚胺培南生物体的肠杆菌携带病例中的4个中，施用乙醇处理的芽孢制剂导致降低100倍以上(表22)。
除了物种形成和计数之外，使来自患者4的每个生物体的多种分离株在含有亚胺培南的2倍连续稀释液的96孔托盘中生长过夜以定量测定抗生素的最小抑制浓度(MIC)。通过在SpectraMaxM5e板读取器上在600nm下光散射来检测生物体的生长。在临床环境中，这些物种如果具有1μg/mL或更大的MIC，则它们被视为耐亚胺培南。来自患者D的治疗前样品的摩氏摩根菌分离株具有2-4μg/mL的MIC并且彭氏变形杆菌分离株具有4-8μg/mL的MIC。因此，施用至患者4的乙醇处理的芽孢群体造成2种耐亚胺培南生物体的清除(表16)。
实施例26.细菌的富集和纯化
为了纯化单独的细菌菌株，选择稀释平板，其中密度能够实现单个菌落的不同分离。利用无菌器具(无菌环或牙签)挑取菌落并且重新划线接种至BBA或其他固体培养基。将平板在37℃下温育3-7天。将主要形态类型的一个或多个充分分离的单菌落重新划线接种。将这个过程重复至少三次，直至观察到单一、稳定的菌落形态。然后将分离的微生物在厌氧条件下在液体培养基中培养24小时或更长时间以获得106-1010cfu/ml的纯培养物。液体生长培养基可包括补充有酵母提取物、氯化血红素、半胱氨酸和碳水化合物(例如，麦芽糖、纤维二糖、可溶性淀粉)或先前所述的其他培养基的基于脑心浸液的培养基(Atlas,微生物培养基手册,第4版,ASMPress,2010)(例如参见实施例14)。将培养物在10,000×g下离心5分钟以使细菌形成球粒，去除用过的培养基，并且将细菌再次悬浮在无菌PBS中。添加无菌75％甘油至最终浓度为20％。通过连续稀释和平板接种来滴定甘油储备液的等分试样。将剩余储备液在干冰上冷冻10-15分钟，然后放置在-80℃下进行长期储存。
实施例27.细胞库制备
如下制备细菌菌株的细胞库(RCB)。将细菌菌株从-80℃冷冻甘油储备液刮板至具有氯化血红素或维生素K的布鲁氏血琼脂(Atlas,微生物培养基手册,第4版,ASMPress,2010)、M2GSC(Atlas,微生物培养基手册,第4版,ASMPress,2010)或其他固体生长培养基并在具有10:10:80的H2:CO2:N2的气体混合物的厌氧腔中在37℃下温育24至48小时。然后挑取单个菌落并用于将250ml接种至1LWilkins-Chalgren肉汤、脑心浸液肉汤、M2GSC肉汤或其他生长培养基，并生长至中期至后期指数阶段或进入固定生长相。可选地，可使用单菌落来接种10ml初步培养物，然后将其用于接种大体积培养物。选择生长培养基和收集时的生长阶段以增强细胞滴度、芽孢形成(如果需要的话)和在体外或体内需要的可能相关的表型。任选地，使培养物静态或晃动生长，取决于哪种产生最大细胞滴度。然后通过在5000rpm下离心20分钟将培养物浓缩10倍以上，并且再次悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)+15％甘油中。将1ml等分试样转移至1.8ml冷冻管中，然后在干冰上冷冻并储存在-80℃下。通过16SrDNA基因的PCR扩增，接着Sanger直接循环测序，和与策划的rDNA数据库比较以测定分类ID，来确认给定细胞库的身份。每个库在划线接种至布鲁氏血琼脂或M2GSC琼脂后证实产生单一形态的菌落。当观察到一种以上形态时，通过PCR和16SrDNA基因的测序分析证实菌落为预期物种。可在纯培养物内观察变体菌落形态，并且在多种细菌中已充分描述不同菌落形态的机制(vanderWoude,临床微生物学评论(ClinicalMicrobiologyReviews),17:518,2004)，包括梭菌物种(Wadsworth-KTL厌氧细菌学手册(Wadsworth-KTLAnaerobicBacteriologyManual),第6版,Jousimie-Somer等,2002)。对于专性厌氧菌，证实RCB在10cfu/ml的检测限下缺乏需氧菌落形成单位。
实施例28.滴度测定
通过将RCB连续稀释液平板接种至布鲁氏血琼脂或其他固体培养基来测定在新鲜收集、洗涤和浓缩的培养物上的每ml活细胞数目，并且其在106至1010cfu/ml范围内改变。通过在一个或两个冷冻-解冻循环后在干冰上或在-80℃下滴定库，接着在厌氧腔中在室温下解冻来测定冷冻对活力的影响。一些菌株在第1次和/或第2次冷冻解冻后显示1-3log的活性cfu/ml降低，而其他菌株的活力不受影响。
实施例29.细菌组合物的制备
单独的菌株通常在冰上解冻并在厌氧腔中组合以产生混合物，接着在-80℃下第二次冷冻以保存混合样品。当制造菌株组合用于体外或体内测定法时，基于单独菌株的第二次冷冻-解冻滴度来估算最终混合物中的cfu。对于在啮齿动物中的实验，菌株可以相等计数组合以递送每菌株1e4至1e10。另外，一些细菌可能不会生长至足够滴度以产生允许制备其中所有细菌以1e10存在的组合物的细胞库。
实施例30.关键OTU和功能的鉴定
人体是微生物群和微生物组在人类系统(例如代谢、免疫和神经系统)的基本健康功能中发挥重要作用的生态系统。微生物群和所得微生物组包含在彼此相互作用的单个受试者和其宿主(即哺乳动物受试者)内共存以形成具有固有生物多样性和功能特性的动态单元的微生物生态。在相互作用的微生物的这些网络(即生态)中，特定成员相比于其他成员可能具有更显著贡献；因此这些成员也存在于许多不同生态中，并且这些微生物从生态上的损失可能对特定生态的功能能力具有显著影响。RobertPaine在1969年创造了“关键物种”概念(参见PaineRT.1969.Anoteontrophiccomplexityandcommunitystability.美国博物学家(TheAmericanNaturalist)103:91-93)以描述使给定生态系统成为一体的这些关键物种的存在而不考虑其在生态群落中的丰度。Paine最初描述了赭色海星(starfishPisasterochraceus)在海洋系统中的作用并且后来所述概念已在众多生态系统中得到实验验证。
通过分析从共有特定表型的限定组的样品阐明的网络生态而计算获得的关键OTU和/或功能。关键OTU和/或功能限定为满足两个或更多个下列标准的限定组的网络内的所有节点。使用标准1，在网络中经常观察到节点，并且在大量单独的受试者中存在观察到节点的网络；这些节点在网络中的出现频率和所述网络在个体中的普遍性表明，这些节点在许多个体中发挥重要的生物功能。使用标准2，在网络中经常观察到节点，并且观察到节点的每个网络含有大量的节点，这些节点因此是“超连接体”，这意味着它们形成大多数网络的核心并且因此在其对于给定生态的功能贡献方面具有高的生物学意义。使用标准3，节点存在于含有大量节点的网络中(即它们是大网络)，并且其中发现节点的网络存在于大量受试者中；这些网络可能具有高重要性，因为在许多个体中存在的大网络不可能随机单独地出现，这强烈地表明生物相关性。任选地，在网络生态中观察到节点的频率所需的阈值、在不同受试者样品中观察到给定网络的频率，和视为关键节点的给定网络的尺寸是由这些变量的分布的第50、第70、第80或第90百分位数定义的。任选地，使用统计学显著性的标准参数或非参数量度，通过显著不同于给定变量的平均或中位值的给定变量值来定义所需阈值。在另一个实施方案中，关键节点定义为在相关样品表型中所存在者，例如但不限于“健康”，并且同时在非相关样品表型中不存在，例如但不限于“疾病”。任选地，关键节点定义为显示为显著不同于使用置换测试数据集以测量显著性所观察者。
实施例31.鉴定来自乙醇处理的芽孢制剂的核心生态
从6个不同供体制得十个不同的乙醇处理的芽孢制剂(如实施例15中所述)。使用所述芽孢制剂来治疗10个患者，每个罹患复发性艰难梭菌感染。使用实施例18中所述的纳入/排除标准鉴定患者，并且使用实施例1中所述的标准鉴定供体。所述患者在治疗后的4周随访期内都未经历艰难梭菌复发，而文献将预测70-80％的受试者将在抗生素停用后经历复发[VanNood等,NEJM(2013)]。因此，乙醇处理的从多个不同供体和捐献物获得的芽孢制剂显示显著的临床功效。
为了定义乙醇处理的芽孢制剂的显著临床功效背后的核心生态，进行以下分析。通过16S-V4rDNA测序和按照实施例12的OTU的计算分配来测定芽孢制剂的OTU组合物。在乙醇处理的芽孢制剂中检测至少十个序列读数的要求被设定为保守阈值以仅限定在扩增或测序期间非常不可能从误差产生的OTU。熟悉基于基因组的微生物组表征领域的技术人员通常使用的方法使用0.005％的读数相对丰度阈值(参见例如Bokulich,A.等,2013.Quality-filteringvastlyimprovesdiversityestimatesfromIlluminaampliconsequencing.自然方法(NatureMethods)10:57-59)，考虑到对于在这个实施例中分析的样品获得的测序深度，其将等同于≥2个读数，作为截止，其基本上低于在这个分析中使用的≥10个读数。对于如实施例12中所述的每个OTU进行所有分类和分支分配。所得OTU列表、分支分配和芽孢制剂中的检测频率示于表GB中。与分支、芽孢形成状态和关键OTU状态一样，指示植入所治疗患者中的OTU和它们所植入的患者百分比。星形OTU存在于≥80％的乙醇制剂中并且植入≥50％的所治疗患者中。
表GB.在至少一种乙醇处理的芽孢制剂中通过最少十个16S-V4序列读数检测的OTU(全微生物组)
接着，据推论，对于视为芽孢制剂的核心生态的成员的OTU，所述OTU必须显示植入患者中。出于两个原因，植入是重要的。首先，植入是重塑微生物组并消除艰难梭菌定殖的机制的一个必要条件。以更高频率植入的OTU很可能是芽孢制剂的核心生态的成分。其次，通过对芽孢制剂测序而检测的OTU(如在表GB中)可包括与芽孢无关的非活芽孢或其他污染DNA分子。OTU必须显示植入患者中的要求消除了代表非活芽孢或污染序列的OTU。表GB还鉴定了在芽孢制剂中检测的所有OTU，其还显示植入至少一个治疗后患者中。以乙醇芽孢制剂的较大百分比存在并且植入大量患者中的OTU代表很有可能催化从生态失调疾病生态转变为健康的微生物组的核心生态的子集。
应用第三透镜来进一步完善对芽孢制剂的核心生态的见解。基于计算的网络分析能够实现在健康个体的广泛群体的微生物群中存在的微生物生态的描述。这些网络生态包含多个OTU，其中的一些被定义为关键OTU。如实施例30中所述对关键OTU进行计算定义。关键OTU构成微生物生态的基础，因为它们被发现并且因此对于健康受试者中的网络生态的功能是重要的。与健康受试者相关的微生物生态相关的关键OTU通常缺失或以降低水平存在于具有疾病的受试者中。关键OTU可以低、中等或高丰度存在于受试者中。表GB还指出，芽孢制剂中的OTU是仅与健康并且不带有疾病的个体相关的关键OTU。
根据这个数据存在若干重要的研究结果。在来自6个供体和10种捐献物的所有芽孢制剂中检测到相对较小数目的物种(总共16个)。这是令人惊讶的，因为HMP数据库(www.hmpdacc.org)描述不同健康个体之间的共生物种的巨大可变性。较小数目的一致OTU的存在对核心生态的概念提供支持。植入数据进一步支持这个结论。回归分析显示芽孢制剂中的检测频率与供体中的植入频率之间的显著相关性：R＝0.43(p<0.001)。不存在如下先验要求：将会或应该植入在芽孢制剂中通常检测的OTU。例如，在所有十个芽孢制剂中存在的芽孢形成剂嗜热鲁替孢菌不会植入任何患者中。沃氏嗜胆菌(Bilophilawadsworthia)(革兰氏阴性厌氧菌)存在于10个捐献物中的9个中，但它不植入任何患者中，这表明它可能是乙醇处理的芽孢制剂中的非活性污染物。最后，值得注意的是先前定义的关键OTU在芽孢制剂中的最常见OTU中的高优势。
这三种因素(在芽孢制剂中的普遍率、植入频率和作为关键OTU的指定)能够产生“核心生态评分”(CES)以评定单独的OTU。CES定义如下：
·对于芽孢制剂中的OTU的存在，加权40％
·对于在1-3个芽孢制剂中的存在，乘数为1
·对于在4-8个芽孢制剂中的存在，乘数为2.5
·对于在≥9个芽孢制剂中的存在，乘数为5
·对于植入患者中，加权40％
·对于植入1-4个患者中，乘数为1
·对于植入5-6个患者中，乘数为2.5
·对于植入≥7个患者中，乘数为5
·对于关键OTU，加权20％
·对于关键OTU，乘数为1
·对于非关键OTU，乘数为0
使用本指南，CES具有最大可能评分5和最小可能评分0.8。作为实例，在植入3个患者中并且是关键OTU的10个芽孢制剂中的8个中存在的OTU将被分配以下CES：
CES＝(0.4×2.5)+(0.4×1)+(0.2×1)＝1.6
表GC通过CES评定前20个OTU，其中进一步要求：OTU必须显示植入以视为核心生态的要素。
表GC.由CES评定的前20个OTU
实施例32.限定核心生态的有效子集
人类胃肠道中的生物体的数目以及健康个体之间的多样性指示健康肠道微生物组生态的功能冗余度(参见TheHumanMicrobiomeConsortia.2012.Structure,functionanddiversityofthehealthyhumanmicrobiome.自然(Nature)486:207-214)。这种冗余使得核心生态的子集极有可能描述乙醇处理的芽孢制剂的治疗有益成分并且这些子集本身可为用于治疗艰难梭菌感染的有用组合物，提供生态功能特征。使用CES，单独的OTU可优选提供用于评估为核心生态的有效子集。
功能冗余的另一个方面是，进化上相关的生物体(即在系统发育树上彼此接近的那些，例如分组到单个分支中的那些)还将是核心生态或其子集中用于治疗艰难梭菌的有效成分。
用于在体外(例如参见下文实施例33)或在体内(例如参见实施例16或17)测试的适当OTU子集的选择对于本领域技术人员是简单的。可通过从表GB挑选任何2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个OTU来选择子集，其中特别强调具有更高CES的那些，例如表GC中所述的OTU。另外，使用上文在实施例12和表1中定义的分支关系，可选择相关OTU作为具有可接受的CES值的OTU的替代物。可使用适当培养基(选自上文实施例14中所述的那些)在厌氧条件下体外培养这些生物体，然后以所需比率组合。小鼠艰难梭菌模型中的典型实验在组合物中利用至少104并且优选至少105、106、107、108、109或大于109个菌落形成单位的每种微生物。培养产率的变化有时可能是指以不等比率组合的生物体，例如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000、1:100,000或大于1:100,000。在这些组合物中重要的是，每种菌株以最小量提供，以便可测量所述菌株对核心生态子集的功效的贡献。使用本文描述的原理和说明，本领域技术人员作出基于分支的取代来测试核心生态的子集的功效是简单的。表GB描述芽孢制剂中检测的每种OTU的分支并且表1描述可用于基于分支关系的取代的OTU。
实施例33.在小鼠模型中测试核心生态的子集
在艰难梭菌小鼠模型中测试核心生态的若干子集。阴性对照是磷酸盐缓冲盐水并且阳性对照是10％人类粪便悬浮液。所述子集描述于表GD中。
表GD：在艰难梭菌小鼠模型中测试的核心生态的子集
对于每组实验，测试两个笼子的各五只小鼠。所有小鼠在第-14天至第-5天接受由10％葡萄糖、卡那霉素(0.5mg/ml)、庆大霉素(0.044mg/ml)、粘菌素(1062.5U/ml)、甲硝唑(0.269mg/ml)、环丙沙星(0.156mg/ml)、氨苄青霉素(0.1mg/ml)和万古霉素(0.056mg/ml)在其饮用水中组成的抗生素混合液，并且在第-3天通过经口管饲接受剂量为10mg/kg的克林霉素。在第-1天，它们通过经口管饲接受测试物品或媒介物对照。在第0天，通过经口管饲施用约4.5log10cfu的艰难梭菌(ATCC43255)对其攻毒。从第0天至第6天每天评估死亡率并且评估动物的体重和后续体重变化，其中体重减轻与艰难梭菌感染相关。使用测试物品相比于空媒介物的死亡率和降低的体重减轻来评估测试物品的成功。另外，从第-1天至第6天每天进行艰难梭菌症状评分。症状评分是基于外观(根据正常、弯腰驼背、立毛或嗜睡为0-2分)、呼吸(根据正常、快速或浅，配有腹式呼吸为0-2分)、临床征象(根据正常、湿尾、触摸冰冷或与其他动物隔离为0-2分)。
除了汇编每组的累积死亡率，计算平均最小相对体重作为每只小鼠相对于第-1天的最小体重的平均值并且计算平均最大临床评分作为每只小鼠的最大组合临床评分的平均值，在死亡的情况下指定评分为4。结果报道于表GE中。
表GE：在艰难梭菌小鼠模型中测试的细菌组合物的结果
实施例34.限定体外艰难梭菌抑制测定法中的核心生态的子集
将-80℃甘油储备库的小瓶解冻并稀释至1e8CFU/mL。所选菌株和其分支分配提供于表GF中。然后将每种菌株在96孔板的孔中10倍稀释(至每种菌株的最终浓度为1e7CFU/mL)于200μLPBS+15％甘油中。然后将平板在-80℃下解冻。当测定法需要时，当在体外艰难梭菌抑制测定法(CivSim)中测试时，将平板从-80℃中移出并在室温下在厌氧条件下解冻。
艰难梭菌的过夜培养物在厌氧条件下在SweetB-FosIn或其他合适培养基中生长以使艰难梭菌生长。SweetB-FosIn是由脑心浸液、酵母提取物、半胱氨酸、纤维二糖、麦芽糖、可溶性淀粉和低聚果糖/菊粉和氯化血红素构成并用MOPs缓冲的复杂培养基。在生长24小时后，将培养物在诸如SweetB-FosIn的复杂培养基中稀释100,000倍，所述培养基适于多种厌氧细菌物种的生长。然后将稀释的艰难梭菌混合物等分至96孔板的孔中(每孔180μL)。然后向每孔中添加20μL的子集核心生态，最终浓度为1e6CFU/mL的每种物种。可选地，可在不同的初始浓度(1e9CFU/mL、1e8CFU/mL、1e7CFU/mL、1e5CFU/mL、1e4CFU/mL、1e3CFU/mL、1e2CFU/mL)下对每种物种测试测定法。对于与无抑制下的艰难梭菌生长的比较，包括仅接种有艰难梭菌的对照孔。另外的孔用于对照，其抑制或不抑制艰难梭菌的生长。抑制生长的阳性对照的一个实例是产生布劳特氏菌、双酶梭菌和大肠埃希氏菌的组合。显示艰难梭菌生长抑制降低的对照的一个实例是多形拟杆菌、卵形拟杆菌和普通拟杆菌的组合。将平板用封口膜包裹并在厌氧条件下在37℃下温育24小时。在24小时后，将仅含有艰难梭菌的孔连续稀释并平板接种以测定滴度。然后将96孔板冷冻在-80℃下，然后通过qPCR测定法定量艰难梭菌。
从仅含有在SweetB+FosIn培养基中生长并通过选择性点板定量的致病性艰难梭菌的每个测定板上的孔生成标准曲线。在无菌磷酸盐缓冲盐水中进行培养物的连续稀释。从标准曲线样品以及其他孔提取基因组DNA。
使用稀释、冷冻/解冻和热溶解方案从5μl的每个样品提取基因组DNA。将5μL解冻样品添加至45μL的UltraPure水(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)并通过抽吸混合。将具有稀释样品的板冷冻在-20℃下直至供qPCR使用，其包括加热溶解步骤，然后扩增。可选地，使用MoBio-htp96孔SoilDNA分离试剂盒(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)、MoBioDNA分离试剂盒(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)或QIAampDNA大便微型试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)根据制造商的说明书分离基因组DNA。
qPCR反应混合物含有1xSsoAdvancedUniversalProbesSupermix、900nM的Wr-tcdB-F引物(AGCAGTTGAATATAGTGGTTTAGTTAGAGTTG，IDT,Coralville,IA)、900nM的Wr-tcdB-R引物(CATGCTTTTTTAGTTTCTGGATTGAA，IDT,Coralville,IA)、250nM的Wr-tcdB-P探针(6FAM-CATCCAGTCTCAATTGTATATGTTTCTCCA-MGB，LifeTechnologies,GrandIsland,NY)和分子生物级水(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)补足至18μl(引物改编自：Wroblewski,D.等,RapidMolecularCharacterizationofClostridiumdifficileandAssessmentofPopulationsofC.difficileinStoolSpecimens,临床微生物学杂志(JournalofClinicalMicrobiology)47:2142-2148(2009))。将这种反应混合物等分至硬壳小尺寸薄壁96孔裙边PCR板(BioRad,Hercules,CA)的孔中。向这种反应混合物中添加2μl的稀释、冷冻和解冻样品并且用Microseal‘B’粘合密封剂(BioRad,Hercules,CA)将板密封。在配备有CFX96TM实时系统的BioRadC1000TM热循环仪(BioRad,Hercules,CA)上进行qPCR。热循环条件为95℃持续15分钟，接着45个如下循环：95℃持续5秒，60℃持续30秒，和FAM通道的荧光读数。可选地，用本领域技术人员已知的其他标准方法进行qPCR。
通过CFXManagerTM3.0软件测定FAM通道上的每个孔的Cq值。通过将给定样品的Cq值输入到从比较标准曲线孔的Cq值与那些样品的已知log10(cfu/mL)的标准曲线所产生的线性回归模型来计算每个实验样品的艰难梭菌的log10(cfu/mL)。通过从未添加额外细菌的用于生成标准曲线的每个测定板上的样品中的艰难梭菌的log10(cfu/mL)减去样品中的艰难梭菌的log10(cfu/mL)来计算每个样品的log抑制。对于每种组合物的所有重复实验来计算平均log抑制。
绘制每种组合物的范围和标准偏差的直方图。研究不同于总体分布的log抑制的范围或标准偏差作为可能的逸出值。如果从在直方图中鉴定的二元对之一去除单个log抑制数据将产生与来自大多数样品的范围或标准偏差一致的范围或标准偏差，则去除作为逸出值的所述数据，并且再次计算平均log抑制。
在测定法中评估的所有样品的合并方差估算为通过样品的自由度加权的样品方差的平均值。然后计算合并的标准误差作为合并方差的平方根除以样品数目的平方根。通过合并标准误差乘以对应于给定百分比阈值的z评分来确定零假设的置信区间。置信区间外部的平均log抑制被认为是抑制性的(如果阳性)或刺激性的(如果阴性)，其中置信百分比对应于所用的间隔。具有大于0.312的平均log抑制的三元组合被报道为++++(零假设的置信区间(C.I.)≥99％)，具有0.221至0.312的平均log抑制的三元组合被报道为+++(95％<C.I.<99％)，具有0.171至0.221的平均log抑制的三元组合被报道为++(90％<C.I.<95％)，具有0.113至0.171的平均log抑制的三元组合被报道为+(80％<C.I.<90％)，具有-0.113至-0.171的平均log抑制的三元组合被报道为-(80％<C.I.<90％)，具有-0.171至-0.221的平均log抑制的三元组合被报道为--(90％<C.I.<95％)，具有-0.221至-0.312的平均log抑制的三元组合被报道为---(95％<C.I.<99％)，以及具有小于-0.312的平均log抑制的三元组合被报道为----(99％<C.I.)。
表GF.在具有体外抑制测定法结果的三元组合中测试的OTU和其分支分配
CivSim显示许多三元组合抑制艰难梭菌。56个组合中有39个显示具有置信区间>80％的抑制作用；56个组合中有36个具有C.I.>90％；56个组合中有36个具有C.I.>95％；56个组合中有29个具有C.I.>99％。非限制性但示例性的三元组合包括具有大于0.171的平均log降低的那些，例如表6中所示具有++++的评分的任何组合，例如产气柯林斯菌(Colinsellaaerofaciens)、陪伴粪球菌和产生布劳特氏菌。同样重要的是，CivSim测定法描述不会有效抑制艰难梭菌的三元组合。56个组合中有5个在>80％置信度下促进生长；56个组合中有2个在>90％置信度下促进生长；56个组合中有1个，陪伴粪球菌、共生梭菌和直肠真杆菌，在>95％置信度下促进生长；56个组合中有12个在测定法中是中性的，意味着它们既不促进也不抑制艰难梭菌生长至测量限。
本领域技术人员使用CivSim方法来测定显示在人类中治疗艰难梭菌有效的乙醇处理的芽孢级分所产生的核心生态的有效子集是简单的。
实施例AAZA：在小鼠模型中的肠道中增殖的细菌组合物
在小鼠模型中评估两种细菌组合物以证实在胃肠道中增殖的能力。细菌如***实施例14中所述生长。在厌氧条件下预制组合物并且悬浮在PBS+15％甘油中并储存在≥-70℃下。
在第-14天至第-5天用由10％葡萄糖、卡那霉素(0.5mg/ml)、庆大霉素(0.044mg/ml)、粘菌素(1062.5U/ml)、甲硝唑(0.269mg/ml)、环丙沙星(0.156mg/ml)、氨苄青霉素(0.1mg/ml)和万古霉素(0.056mg/ml)在其饮用水中组成的抗生素混合液预处理小鼠群组(10只雌性/组；每笼5只)。在第-3天，它们通过经口管饲接受10mg/kg克林霉素。在第-1天，它们通过经口管饲给与0.2mL体积的微生物组合物(表ZA)。微生物组合物包含大约相等数目的每种OTU并且对于每种组合物以每OTU约1×109、1×108和1×107的量给与(例如包含15种菌株的微生物组合物1以大约1.5×1010、1.5×109和1.5×108总CFU给与)。在第-1天(在给药前约1小时)和在给药后第2、3和4天从每个笼子中收集粪便样品。将粪便冷冻储存，随后加工并测序。用任一种微生物组合物治疗的小鼠的体重增加与天然对照小鼠类似。
平行地，在第0天经由经口管饲用大约104.5个艰难梭菌芽孢(ATCC43255)对在第-1天用相同微生物组合物治疗的动物群组进行攻毒。从第0天至第6天每天评估艰难梭菌攻毒动物的死亡率并且评估动物的体重和后续体重变化，其中体重减轻与艰难梭菌感染相关。使用测试物品相比于空媒介物的死亡率和降低的体重减轻来评估测试物品的成功。
表ZA.在第-1天通过经口管饲施用的微生物组合物
根据***实施例11和12通过对DNA分离和测序来处理粪便样品。通过如***实施例11中所述分析16S-V4序列读数和分配OTU来确定来自第-1、2、3和4天的粪便样品的OTU分配。如***实施例11中所述分配分支。通过将来自相同实验组的笼子的结果加和，对每个OTU或每个分支测定总读数计数。对于给定OTU或分支具有10个或更少个序列读数的样品被视为低于背景并且不包括在求和过程中。结果通过OTU(表TAB)和分支(表TAC)显示。
表TAB.在给与微生物组合物后的第2、3和4天的OTU群体
表TAC.在给与微生物组合物后第2、3和4天的分支群体
在研究了表TAB中的OTU数据后，出现若干模式。首先，存在在第-1天不具有序列读数的OTU群组，其显示在第2、3或4天的后续和大量序列读数；这个群组包括丁酸梭菌、海氏梭菌、球状闪烁梭菌、共生梭菌和毛螺菌科细菌_5_1_57FAA。双孢梭菌与这个群组类似，因为它在第-1天具有与背景非常接近的序列读数(组合物1和2中分别为10个和29个)，其随后在第2、3或4天增加多达1000倍。其次，存在OTU如产气柯林斯菌、陪伴粪球菌、恶臭瘤胃球菌(R.bromii)、产生布劳特氏菌、鲍氏梭菌、马犹姆贝梭菌、无害梭菌、第三梭菌和活泼瘤胃球菌，其在第-1天样品中或在后续样品中在OTU水平下不可检测。在组合物2中，在第2天在1×108和1×107剂量组中短暂地检测到产气柯林斯菌；在第3天检测到在相同实验组中的直肠真杆菌，这表明在这些小鼠群组中产气柯林斯菌和接着直肠真杆菌的短暂群体之间的可能关系。惊人的观察结果是所观察数目的OTU序列读数不具高度剂量依赖性。总体来说，数据与模型一致，由此在经口施用后OTU快速地增殖。
进行表TAC中的基于分支的分析以更充分地评估胃肠道的群体。基于分支的分析遮蔽了由OTU分析提供的一些细节。例如，第三梭菌和丁酸梭菌是相同分支的成员并且因此基于分支的分析不能区分这些单独的OTU的动力学。然而，基于分支的分析具有如下补偿益处：它对于测量可能被基于OTU的分析错过的群体变化是敏感的。16S-V4OTU鉴定分配OTU作为特定物种的能力部分地取决于特定物种或物种群体的16S-V4区域的解析力。树的不同区域的可用参考16S序列的密度以及不同物种之间的16S基因中的固有可变性将决定分类注释的确定性。因此在一些情况下，当基于OTU的检测在复杂群体中不敏感时，可使用基于分支的分配追踪物种群体。例如，表2B中的基于分支的分析支持如下情况：恶臭瘤胃球菌、产生布劳特氏菌、无害梭菌和活泼瘤胃球菌能够增殖，因为每种OTU是微生物组合物中的分支的唯一成员并且序列读数从第-1天的不可检测变为第2、3或4天的充分高于背景。16SV4测序和基于分支的分析不能确定第三梭菌或鲍氏梭菌是否由于存在其分支的其他成员(分别是丁酸梭菌和共生梭菌)并显示在小鼠中在OTU水平下增殖而增殖。
在用艰难梭菌平行攻毒的小鼠中，如表TAD中所示显著保护动物。用媒介物(磷酸盐缓冲盐水)管饲的小鼠经历100％死亡率，而微生物组合物1和2到第6天(实验最后一天)在所有剂量水平下得到保护，死亡率为0至10％。另外，相比于接受媒介物管饲的动物，用微生物组合物1和2治疗的动物中的体重减轻是最低限度的。这些数据证实，具有微生物组合物的胃肠道群体通过恢复生态失调状态而赋予临床益处，以使得动物可抵抗病原体感染。
表TAD.在第0天用10 4.5 个艰难梭菌芽孢攻毒的小鼠中的实验组死亡率
实施例36：在耐万古霉素肠球菌(VRE)定殖的小鼠模型中的预防用途和治疗
高度耐抗生素细菌的出现和蔓延代表着一个重大的临床挑战(Snitkin等,科学转化医学(ScienceTranslationalMedicine),2012)。近年来，由诸如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐碳青霉烯肠杆菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)和艰难梭菌等生物体造成的感染数已经显著增加，并且这些菌株中的许多获得对少数剩余活性抗生素的抗性。在住院治疗期间获得由高度耐抗生素细菌产生的大多数感染，并且预防这些病原体在不同患者间传播是医院和诊所所面临的主要挑战之一。大多数高度耐抗生素细菌菌株属于通常在低密度下定殖在粘膜表面的属。通常定殖在粘膜表面的高度复杂微生物群抑制诸如肠杆菌科和肠球菌科等细菌的扩张和统治地位。然而，通过抗生素施用对正常菌群的破坏，对于这些细菌家族的耐抗生素成员的去抑制，导致其扩张至非常高的密度(Ubeda等,临床研究杂志(JournalofClinicalInvestigation)2010)。这些生物体的高密度定殖对于易感患者可能是灾难性的，导致菌血症和败血症(Taur等,临床传染病(ClinicalInfectiousDisease),2012)。
为了测试细菌组合物测试物品例如芽孢群体的预防用途和治疗，如先前所述使用VRE感染小鼠模型(Ubeda等,感染免疫(InfectiousImmunity)2013；Ubeda等,临床研究杂志(Journalofclinicalinvestigation),2010)。简言之，用购自JacksonLaboratory的7周龄C57BL/6J雌性小鼠进行实验，用辐照食物圈养，并提供酸化水。将小鼠单独圈养以避免小鼠之间由于食粪而污染。对于VRE实验性感染，用含氨苄青霉素(0.5克/升)的饮用水处理小鼠，其每3天更换。
在治疗模型中，在第1天，借助于经口管饲用108CFU的购自ATCC的耐万古霉素屎肠球菌菌株(ATCC700221)感染小鼠。在感染后第一天(第1天)，停止抗生素治疗并且在不同时间点通过将粪便球粒的连续稀释液平板接种在具有万古霉素(8μg/ml；Sigma)的Enterococcosel琼脂板(Difco)上来测定VRE水平。通过外观鉴定VRE菌落并通过革兰氏染色或先前描述的其他方法证实(例如参见实施例1、2和3)。另外，如先前所述(Ubeda等,临床研究杂志(JournalofClinicalInvestigation)2010)，vanA基因的PCR赋予耐万古霉素性，其证实在感染小鼠中存在VRE。在第1-3天在PBS中递送测试物品例如细菌组合物，或乙醇处理、梯度纯化的芽孢制剂(如本文所述)，粪便悬浮液或抗生素治疗，而阴性对照仅含有PBS并且也在第1-3天通过经口管饲递送。对于从第-7天至第10天的实验持续时间，每天获得新鲜的粪便大便球粒。将样品立即冷冻并储存在-80℃下。使用标准技术提取DNA并用16S或类似方法分析(例如参见实施例2和3)。
在定殖模型中，如上文所述在第-7天至第1天施用苄青霉素，在第0-2天施用测试物品或媒介物对照处理，并且在第14天施用108CFU的耐VRE细菌。在整个实验中从第-7天至第21天每天获取粪便样品并且如先前所述提交用于16S测序(例如参见实施例2和3)。
在两种模型中，使用粪便中的VRE滴度来评估测试物品相对于阴性对照的成功。此外，对微生物群组合物评估测试物品诱导健康微生物组的能力。
实施例37：耐碳青霉烯克雷伯氏菌(CRKB)定殖的小鼠模型的预防用途和治疗
对于碳青霉烯敏感性降低的肺炎克雷伯氏菌菌株的出现对于住院治疗的患者是一个显著的威胁。这些生物体中对碳青霉烯类的耐药性最通常由肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)介导，所述酶是也赋予对广谱头孢菌素和市售β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的抗性的A类β-内酰胺酶(Queenan等,临床微生物学评论(ClinicalMicrobiologyReview),2007)。产生KPC的肺炎克雷伯氏菌(KPC-Kp)菌株通常带有针对若干其他类别的抗微生物剂(包括氨基糖苷和氟喹诺酮)的抗性决定因素，从而产生真正的多药耐药性(MDR)生物体(Hirsch等,抗微生物化学疗法杂志(JournalofAntimicrobialChemotherapy),2009)。考虑到有限的抗微生物选项，由KPC-Kp引起的感染造成了巨大的治疗性挑战并且与不良临床结果相关。
使用如先前所述的小鼠模型中的治疗方案(例如Perez等,抗微生物剂化学疗法(AntimicrobialAgentsChemotherapy),2011)来评估测试物品，例如用于治疗耐碳青霉烯克雷伯氏菌和降低胃肠道中的携带的细菌组合物。使用雌性CF1小鼠(HarlanSprague-Dawley,Indianapolis,IN)并且将其单独圈养并称重为25至30g。
在这项研究中使用充分表征的肺炎克雷伯氏菌菌株VA-367(8、9、25)。这种临床分离株在遗传学上与在美国东部流传的KPC-Kp菌株有关。利用PCR和DNA序列分析对肺炎克雷伯氏菌VA-367中的抗性机制的表征揭示blaKPC-3、blaTEM-1、blaSHV-11和blaSHV-12以及qnrB19和aac(6')-lb的存在。另外，PCR和DNA测序揭示以下外膜蛋白基因的编码序列中的破坏：ompK35、ompK36和ompK37。利用琼脂稀释方法进行抗生素敏感性测试(AST)并根据来自临床和实验室标准化研究所(CLSI)的当前建议进行解释。根据先前所述的方法(例如参见Anderson等,临床微生物学杂志(JournalofClinicalMicrobiology),2007)利用厄他培南、美罗培南和亚胺培南进行改良Hodge试验。通过Etest敏感性测定法评估替加环素和多粘菌素E(ABbioM′erieux，Solna，Sweden)。如通过美国食品和药物管理局(FDA)所建议并根据CLSI关于多粘菌素E的建议(关于假单胞菌的标准)来理解替加环素的结果。
向小鼠(每组10只)分配测试物品，例如细菌组合物、乙醇处理的芽孢制剂(例如参见实施例6)、抗生素克林霉素、哌拉西林-他唑巴坦、替加环素、厄他培南、头孢吡肟、环丙沙星或它们的组合，或仅接受媒介物的对照组。从第-10天至第0天每天向其施用测试物品。在第0天，使用不锈钢进料管(Perfektum；Popper&Sons,NewHydePark,NY)通过经口管饲施用稀释在0.5ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的103CFU的KPC-KpVA-367。在施用KPC-Kp后第1天、第4天、第6天和第11天收集大便样品以测量耐碳青霉烯肺炎克雷伯氏菌的浓度。将大便样品(100mg，稀释在800mlPBS中)平板接种在具有和不具有0.5μg/ml亚胺培南的MacConkey琼脂上，并且测定每克大便的CFU数。可选地，可使用其他方法来测量耐碳青霉烯肺炎克雷伯氏菌的的水平，例如如本领域技术人员可进行的pcr、抗原测试。
在治疗5天后收集大便样品以评估抗生素对大便微生物菌群的影响并测量大便中的抗生素水平。为了评估对微生物菌群的影响，如先前所述的新鲜大便样品(例如参见实施例2和3)。进行其他实验来研究施用测试物品例如细菌组合物是否导致KPC-KpVA-367定殖的消除或持续。
用皮下克林霉素处理小鼠以减少正常肠道菌群，1天后通过经口管饲接受104CFU的KPC-KpVA-367，并且小鼠每隔一天持续接受皮下克林霉素，持续7天。同时，在KPC-Kp经口管饲后7天，小鼠接受生理盐水的经口管饲(对照组)，或如所指定的细菌组合物。在施用KPC-KpVA-367后20天施用另一剂量的皮下克林霉素以评估是否存在可通过消除厌氧微生物菌群而增加的低水平的耐碳青霉烯肺炎克雷伯氏菌。在基线下和在通过管饲给与KPC-KpVA-367后第3、6、8、11、16和21天收集大便样品。将通过粪便中CRKB的减少来研究细菌组合物。
除非另外说明，否则本说明书(包括权利要求书)中使用的所有表示成分、反应条件等的量的数字应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非另外相反说明，否则数值参数是近似值并且可根据寻求获得的所需特性而改变。最起码以及并非试图限制将等同原则应用于权利要求书的范围，每个数值参数应根据有效数字和普通的舍入技术进行理解。
除非另外说明，否则在一系列要素前面的术语“至少”应理解为是指所述系列中的每个要素。
虽然本发明已特别示出并参考优选实施方案和各种替代实施方案进行描述，但相关领域的技术人员应理解，可在不偏离本发明的精神和范围的情况下在其中作出形式和细节的各种变化。
在本说明书主体内引用的所有参考文献、授权专利和专利申请特此出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
其他表格
表1：对属、种和系统发育分支作出分类分配的操作分类单元(OTU)列表
细菌OTU的分支成员是基于16S序列数据。分支是基于使用具有系统发育学领域的普通技术的个体所熟知的最大似然法由全长16S序列构建的系统发育树的拓扑结构进行定义。构建分支以确保给定分支中的所有OTU是：(i)彼此在指定数目的引导程序支持节点内，和(ii)在5％遗传相似性内。在相同分支内的OTU可以区分为在遗传上和系统发育上不同于在基于16S-V4序列数据的不同分支内的OTU，而处于相同分支内的OTU密切相关。处于相同分支内的OTU在进化上密切相关并且使用16S-V4序列数据可能或可能不可彼此区分。相同分支的成员由于其进化相关性而在例如人类肠道中所存在的微生物生态中发挥类似的功能作用。用来自相同分支的另一个物种代替一种物种的组合物可能具有保守生态功能并且因此可用于本发明中。所有OTU都关于其形成芽孢的假定能力和其是否是病原体或病生菌进行指示(关于“病生菌”的描述，参见定义)。NIAID优先病原体以‘A类’、‘B类’或‘C类’表示，并且机会病原体以‘OP’表示。不具致病性或未知其以病原体形式存在的能力的OTU以‘N’表示。‘SEQID编号’表示序列表文件中的OTU的标识符并且‘公共DB保藏’表示公共序列库中的OTU的标识符。
表X4.芽孢形成细菌物质
表2：从CsCl梯度步骤之前(左)和之后(右)的乙醇处理的芽孢制剂制备中分离的物种
表3在存在或不存在乙醇处理的芽胞产品治疗下用艰难梭菌攻毒的小鼠中的死亡率和体重变化
表4：16SrDNA鉴定的来自挑取菌落板的芽孢形成物质
表5：在乙醇处理或热处理的样品中鉴定而在未被处理的样品中未鉴定的芽胞形成物质
表6.供体A，所测序的374种耐EtOH菌落中的45个物种
OTU
厌氧棒状菌_sp_3_2_56FAA
炭疽芽孢杆菌
蜡状芽孢杆菌
苏云金芽孢杆菌
产生布劳特氏菌
布劳特氏菌_sp_M25
梭菌目_sp_SSC_2
奥登尼斯梭菌
巴氏梭菌
鲍氏梭菌
隐藏梭菌
双孢梭菌
戈氏梭菌
哈氏梭菌
乳酸发酵类梭菌
马犹姆贝梭菌
球状闪烁梭菌
类腐败梭菌
产气荚膜梭菌
索氏梭菌
粪堆梭菌
溶稻草梭菌
第三梭菌
粪芽孢菌_sp_D7
灵巧粪球菌
脱铁杆菌门_sp_oral_clone_JV006
产甲酸多利菌
直肠真杆菌
惰性真杆菌288 -->
真杆菌_sp_WAL_14571
凸腹真杆菌
红海曲揉杆菌
黄单胞菌_sp_NML_060897
毛螺菌科_细菌_2_1_58FAA
毛螺菌科_细菌_3_1_57FAA
毛螺菌科_细菌_A4
毛螺菌科_细菌_oral_taxon_F15
热醋穆尔氏菌
粪罗斯氏菌
人罗斯氏菌
白色瘤胃球菌
布氏瘤胃球菌
活泼瘤胃球菌
瘤胃球菌_sp_5_1_39BFAA
扭链瘤胃球菌
表7供体B，所测序的195种耐EtOH菌落中的26个物种
OTU
花园芽孢杆菌
威氏布劳特氏菌
衣原体目_细菌_NS11
梭菌目_sp_SSC_2
巴氏梭菌
隐藏梭菌
双孢梭菌
戈氏梭菌
乳清酸梭菌
类腐败梭菌
产气荚膜梭菌
索氏梭菌
梭菌_sp_L2_50
梭菌_sp_MT4_E
溶稻草梭菌
粪球菌_sp_ART55_1
青年真杆菌
直肠真杆菌289 -->
反刍真杆菌
甲酸芽殖菌
裂果胶毛螺菌
白色瘤胃球菌
活泼瘤胃球菌
卵形瘤胃球菌
瘤胃球菌_sp_5_1_39BFAA
瘤胃球菌_sp_K_1
表8供体C，所测序的416种耐EtOH菌落中的39个物种
OTU
半乳糖醛酸拟杆菌
嗜果胶拟杆菌
产生布劳特氏菌
布劳特氏菌_sp_M25
威氏布劳特氏菌
梭菌目_sp_SS3_4
梭菌目_sp_SSC_2
巴氏梭菌
柠檬梭菌
双孢梭菌
吲哚梭菌
球状闪烁梭菌
类腐败梭菌
索氏梭菌
梭菌_sp_NML_04A032
梭菌_sp_SS2_1
溶稻草梭菌
绿色梭菌
解木素梭菌
粪芽孢菌_sp_D7
长链多利菌
直肠真杆菌
凸腹真杆菌
食糖产氢厌氧杆菌
多对毛螺菌
裂果胶毛螺菌
毛螺菌科_细菌_A4290 -->
颤杆菌_sp_G2
多毛假黄杆菌
人罗斯氏菌
肠道罗斯氏菌
白色瘤胃球菌
酸奶瘤胃球菌
卵形瘤胃球菌
瘤胃球菌_sp_5_1_39BFAA
瘤胃球菌_sp_K_1
扭链瘤胃球菌
糖变互营球菌
表9供体D，所测序的118种耐EtOH菌落中的12个物种
OTU
鲁替布劳特氏菌
威氏布劳特氏菌
毛螺旋短杆菌
类腐败梭菌
产气柯林斯菌
粪芽孢菌_sp_D7
弗拉匹瑞脱亚硫酸菌
直肠真杆菌
热醋穆尔氏菌
活泼瘤胃球菌
卵形瘤胃球菌
瘤胃球菌_sp_K_1
表10供体E，所测序的118种耐EtOH菌落中的11个物种
OTU
鲁替布劳特氏菌
威氏布劳特氏菌
毛螺旋短杆菌
类腐败梭菌
粪芽孢菌_sp_D7
弗拉匹瑞脱亚硫酸菌
直肠真杆菌
热醋穆尔氏菌291 -->
活泼瘤胃球菌
卵形瘤胃球菌
瘤胃球菌_sp_K_1
表11供体F，所测序的768种耐EtOH菌落中的54种OTU
表12在各种培养基上从乙醇处理的芽孢群体生长的生物体(关于完整培养基名称和参考文献，参见实施例5)
表13：通过菌落挑取鉴定为可萌发和可孢子化的物种
表15：关于可萌发和可孢子化级分的预防小鼠模型和给药信息的结果
临床评分是基于小鼠健康状况在包括如下的若干领域中的0-4量表上的组合表型评估：外观(根据正常、弯腰驼背、立毛或嗜睡为0-2分)和临床征象(根据正常、湿尾、触摸冰冷或与其他动物隔离为0-2分)。
表16.在用乙醇处理的芽孢制剂治疗的患者中与更多样化微生物生态的植入和生态强化和建立相关的细菌OTU
表18.乙醇处理的芽胞对机会病原体或病生菌载量的降低
表19.在西蒙斯柠檬酸盐琼脂上测量的肠杆菌随着治疗的变化
表20患者1的拟杆菌随着细菌组合物治疗变化的强化
表21.用基于分离菌株的全长16SrDNA序列的乙醇处理的芽孢制剂治疗后的拟杆菌物种
物种 ％总拟杆菌cfu(1.58E10cfu/g)
拟杆菌属4_1_36 63％
解纤维素拟杆菌 14％
拟杆菌属1_1_30 14％
单形拟杆菌 4.8％
卵形拟杆菌 1.7％
多氏拟杆菌 0.91％
解木聚糖拟杆菌 0.83％
拟杆菌属3_1_19 0.23％
表22.来自患者B、D和E的耐亚胺培南摩氏摩根菌、雷氏普罗威登斯菌和彭氏变形杆菌的滴度(cfu/g)
患者 生物体 治疗前滴度 第28天滴度*
患者2 摩氏摩根菌 1×104 6×102
患者2 雷氏普罗威登 9×103 <5×101
斯菌
患者4 摩氏摩根菌 2×104 <5×101
患者4 彭氏变形杆菌 2×104 <5×101
患者5 摩氏摩根菌 5×103 <5×101
*基于平板接种200μL的10重量/体积％悬浮液的检测限为5×101
表YYY.通过16S菌落拾取方法鉴定为可萌发的物种
类腐败梭菌
双孢梭菌
乙二醇梭菌
巴氏梭菌
丁酸梭菌306 -->
布氏瘤胃球菌
毛螺菌科_细菌_2_1_58FAA
庞大真杆菌
血图利杆菌
毛螺菌科_细菌_oral_taxon_F15
产气荚膜梭菌
双酶梭菌
罗斯氏菌_sp_11SE37
奎氏梭菌
酸奶瘤胃球菌
肉毒梭菌
酪丁酸梭菌
汉逊氏布劳特氏菌
克氏梭菌
梭菌_sp_JC122
海氏梭菌
隐藏梭菌
溶稻草梭菌
球状闪烁梭菌
盲肠罗斯氏菌
纤细真杆菌
梭菌_sp_7_2_43FAA
毛螺菌科_细菌_4_1_37FAA
直肠真杆菌
绿色梭菌
瘤胃球菌_sp_K_1
共生梭菌
扭链瘤胃球菌
寒冷梭菌
表ZZZ.通过16SNGS方法鉴定为可孢子化的物种
类腐败梭菌
巴氏梭菌
毛螺菌科_细菌_2_1_58FAA
双孢梭菌
布氏瘤胃球菌
庞大真杆菌307 -->
丁酸梭菌
罗斯氏菌_sp_11SE37
产气荚膜梭菌
乙二醇梭菌
海氏梭菌
球状闪烁梭菌
酸奶瘤胃球菌
共生梭菌
毛螺菌科_细菌_oral_taxon_F15
汉逊氏布劳特氏菌
血图利杆菌
溶稻草梭菌
肉毒梭菌
毛螺菌科_细菌_4_1_37FAA
盲肠罗斯氏菌
瘤胃球菌_sp_K_1
双酶梭菌
直肠真杆菌
奎氏梭菌
绿色梭菌
克氏梭菌
酪丁酸梭菌
颤杆菌_sp_G2
梭菌_sp_JC122
毛螺菌科_细菌_3_1_57FAA
奥登尼斯梭菌
扭链瘤胃球菌
梭菌_sp_7_2_43FAA
隐藏梭菌
真杆菌_sp_WAL_14571
纤细真杆菌
毛螺菌科_细菌_5_1_57FAA
梭状梭菌
梭菌_sp_YIT_12070
布劳特氏菌_sp_M25
粪厌氧棒状菌
食葡糖罗斯氏菌308 -->
梭菌_sp_D5
天冬酰胺形梭菌
粪芽孢菌_sp_D7
梭菌_sp_HGF2
柠檬梭菌
艰难梭菌
产戊酸颤杆菌
寒冷梭菌

Claims (99)

1.一种治疗组合物，其包含通过如下步骤制造的芽孢形成细菌的纯化群体：a)提供粪便材料和b)对所述材料进行处理步骤，导致芽孢形成细菌的纯化，其中所述纯化群体以可有效在胃肠道中植入和/或强化的量存在以治疗或预防施用所述治疗组合物的哺乳动物受体受试者中的生态失调。
2.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述群体可有效治疗胃肠生态失调。
3.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述群体可有效降低胃肠生态失调的至少一种症状的严重程度。
4.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述群体可有效调节所述哺乳动物受体中存在的微生物群多样性。
5.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述群体包含细菌芽孢群体。
6.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述粪便材料是获自健康的哺乳动物供体受试者或多个哺乳动物供体受试者。
7.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述处理步骤包括将所述材料加热至高于25℃持续至少30秒。
8.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述处理步骤包括使所述材料与溶剂接触。
9.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述处理步骤包括接触所述材料的化学或物理操作。
10.根据权利要求1所述的治疗组合物，其包括去除所述粪便材料的非细胞组分的至少一部分，从而将芽孢形成细菌与非细胞材料分离。
11.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述群体包含单一细菌芽孢制剂或细菌芽孢制剂的组合，其中每种细菌芽孢制剂是从获自单一哺乳动物供体受试者的粪便材料纯化的。
12.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述群体包含单一细菌芽孢制剂或细菌芽孢制剂的组合，其中每种细菌芽孢制剂是从获自哺乳动物供体受试者的粪便材料纯化的。
13.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述生态失调包含选自艰难梭菌诱导的腹泻、肠易激综合征(IBS)、病原体或病生菌定殖、耐药性病原体或病生菌感染、结肠炎和克罗恩病的胃肠疾病、病症或病状。
14.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述处理步骤包括耗尽或灭活致病物质。
15.根据权利要求14所述的治疗组合物，其中所述纯化群体基本上不含可检测水平的第一致病物质。
16.根据权利要求15所述的治疗组合物，其中所述第一致病物质选自病毒、细菌、真核寄生虫、蠕虫、噬菌体、支原体、弓形虫和真菌。
17.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述纯化群体基本上不含残栖产物。
18.根据权利要求17所述的治疗组合物，其中所述残栖产物包含非细胞材料。
19.根据权利要求18所述的治疗组合物，其中所述非细胞材料包含残余纤维、DNA、病毒涂层材料，或非活材料，或来自所述哺乳动物供体受试者的真核细胞。
20.根据权利要求1所述的治疗组合物，其包含基本上由芽孢组成的芽孢群体和基本上由营养期细胞组成的芽孢形成剂群体。
21.一种治疗组合物，其包含芽孢形成细菌的纯化群体，其量可有效用于i)治疗或预防生态失调，和/或ii)强化施用所述治疗组合物的哺乳动物受体受试者中的所述治疗组合物中不存在的至少一种类型的细菌，和/或iii)植入在所述治疗组合物中存在但在治疗前在哺乳动物受试者不存在的至少一种类型的细菌。
22.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述群体可有效治疗胃肠生态失调。
23.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述群体可有效降低胃肠生态失调的至少一种症状的严重程度。
24.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述群体可有效强化所述哺乳动物受体中存在的微生物群多样性。
25.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述群体包含细菌芽孢群体。
26.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述群体是从获自哺乳动物供体受试者的粪便材料纯化的。
27.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述群体是从获自多个哺乳动物供体受试者的粪便材料纯化的。
28.根据权利要求27所述的治疗组合物，其中所述多个哺乳动物供体受试者包含至少2个单独地具有低于约25、26、27、28、29或30的身体质量指数(BMI)的健康人类受试者。
29.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述群体包含细菌芽孢制剂的组合，其中每种细菌芽孢制剂是独立地从获自哺乳动物供体受试者的粪便材料纯化的。
30.根据权利要求26所述的治疗组合物，其中所述哺乳动物供体受试者被证实为在产生所述粪便材料之前不具有可检测水平的病原体或病生菌。
31.根据权利要求30所述的治疗组合物，其中所述哺乳动物供体受试者在产生所述粪便材料之前至少1小时得到证实。
32.根据权利要求30所述的治疗组合物，其中所述哺乳动物供体受试者被证实为在产生所述粪便材料之后不具有可检测水平的病原体或病生菌。
33.根据权利要求30所述的治疗组合物，其中所述哺乳动物供体受试者在产生所述粪便材料之后至少1小时得到证实。
34.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述生态失调包含选自艰难梭菌诱导的腹泻、肠易激综合征(IBS)、病原体或病生菌定殖、耐药性病原体或病生菌感染、结肠炎和克罗恩病的胃肠疾病、病症或病状。
35.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述纯化群体基本上不含可检测水平的第一致病物质。
36.根据权利要求35所述的治疗组合物，其中所述第一致病物质选自病毒、细菌、真核寄生虫、蠕虫、噬菌体、支原体、弓形虫和真菌。
37.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述纯化群体基本上不含残栖产物。
38.根据权利要求37所述的治疗组合物，其中所述残栖产物包含非细胞材料。
39.根据权利要求38所述的治疗组合物，其中所述非细胞材料包含DNA、病毒涂层材料或非活细菌材料。
40.根据权利要求38所述的治疗组合物，其中所述残栖产物包含来自所述哺乳动物供体受试者的真核细胞。
41.根据权利要求38所述的治疗组合物，其中所述残栖产物从获自所述哺乳动物供体受试者的粪便材料中减少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99％以上。
42.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述纯化群体基本上不含可检测水平的致病活性的第一致病物质。
43.根据权利要求42所述的治疗组合物，其中所述第一致病物质选自病毒、细菌、真核寄生虫、蠕虫、噬菌体、支原体、弓形虫和真菌，并且其中所述致病活性选自所述致病剂的活力滴度、所述哺乳动物受体受试者的感染、免疫调节活性、自身免疫反应和炎症反应。
44.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述纯化群体具有基本上降低水平的致病活性的第一致病物质。
45.根据权利要求21所述的治疗组合物，其包含以相比于所述粪便材料中存在的所述细胞芽孢的浓度大至少10％的浓度存在的纯化细菌芽孢群体。
46.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述纯化群体可获自所述粪便材料的可混溶或部分可混溶溶剂处理。
47.根据权利要求46所述的治疗组合物，其中所述可混溶溶剂是醇。
48.根据权利要求47所述的治疗组合物，其中所述醇是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇。
49.根据权利要求47所述的治疗组合物，其中所述部分可混溶溶剂是醚、二甲氧基乙烷或四氢呋喃。
50.一种治疗组合物，其包含芽孢形成细菌的纯化群体，其量可有效用于i)强化所述哺乳动物受体中存在的微生物群多样性和/或ii)治疗或预防施用有所述治疗组合物的哺乳动物受体受试者中的生态失调，其中所述纯化群体是通过从获自一个或多个哺乳动物供体受试者的粪便材料中的至少一种残栖产物分离出所述群体而获得的。
51.根据权利要求50所述的治疗组合物，其中所述纯化群体是从所述粪便材料或其级分或衍生物的可混溶溶剂处理获得的。
52.根据权利要求50所述的治疗组合物，其中所述纯化群体包含所述粪便材料中存在的细菌芽孢的大量富集，并且其中所述组合物任选地包含萌发剂。
53.根据权利要求52所述的治疗组合物，其中所述萌发剂选自BHIS牛胆汁、CaDPA、一种或多种氨基酸、糖、核苷、胆汁盐、金属或金属阳离子、脂肪酸，和长链烷基胺，或它们的组合。
54.根据权利要求50所述的治疗组合物，其中所述纯化群体包含i)所述粪便材料中存在的一种或多种非芽孢形成生物体的量和/或活力的大幅降低，或ii)所述粪便材料中存在的病原体活性和/或病生菌活性的大幅降低，或它们的组合。
55.根据权利要求50所述的治疗组合物，其中所述纯化群体是通过使所述粪便材料或包含所述粪便材料的全部或一部分的液体与包含i)约1％、2％、3％、4％、5％和约95％、96％、97％、98％、99％或100％的醇、或ii)酸、或iii)酶的溶液在至少约20℃的温度下接触至少一分钟而获得的。
56.根据权利要求50所述的治疗组合物，其中所述纯化群体是通过使所述粪便材料或包含所述粪便材料的全部或一部分的液体与包含醇的溶液在适于基本上降低i)非芽孢形成细菌和ii)所述粪便材料中存在的病原体活性和/或病生菌活性中的至少一者的条件下接触而获得的。
57.根据权利要求50所述的治疗组合物，其中所述纯化群体是从所述粪便材料或其级分或衍生物的差速离心获得的。
58.根据权利要求57所述的治疗组合物，其中所述差速离心包含速度梯度离心或平衡密度沉降。
59.根据权利要求57所述的治疗组合物，其中所述纯化群体从所述粪便材料中存在的非细胞材料纯化至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99％以上。
60.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述纯化群体可获自吸附至固体培养基的芽孢的洗脱。
61.根据权利要求60所述的治疗组合物，其中所述固体培养基包含疏水性相互作用色谱(HIC)培养基或亲和色谱培养基。
62.根据权利要求60所述的治疗组合物，其中所述纯化群体可通过使所述粪便材料与不同地吸附残栖产物和芽孢群体的固体培养基接触而获得的。
63.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述纯化群体可通过对所述粪便材料进行机械破坏处理而获得。
64.根据权利要求63所述的治疗组合物，其中所述机械破坏处理基本上破坏非芽孢材料并且基本上不破坏芽孢。
65.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述纯化群体可通过对所述粪便材料进行热破坏处理而获得。
66.根据权利要求65所述的治疗组合物，其中所述热破坏处理包括使所述粪便材料或包含所述粪便材料的液体经受至少约30℃的受热环境持续至少约十分钟。
67.一种用于制造包含适于治疗性施用至有需要的哺乳动物受试者的细菌芽孢群体的组合物的方法，其包括以下步骤：(a)提供获自哺乳动物供体受试者的粪便材料；和(b)在一定条件下对所述粪便材料进行至少一个纯化步骤以使得从所述粪便材料产生芽孢形成细菌的纯化群体。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述哺乳动物供体受试者是健康的人类受试者。
69.根据权利要求67所述的方法，其包括使所述粪便材料或其级分或衍生物与可混溶溶剂接触。
70.根据权利要求67所述的方法，其包括可混溶溶剂处理、不可混溶溶剂萃取、从固体培养基洗脱、热破坏处理、辐射处理、过滤处理、色谱分离处理、离心处理、机械破坏处理或它们的组合。
71.一种治疗或预防人类受试者中的生态失调的方法，其包括向所述人类受试者施用根据权利要求21或权利要求50所述的治疗组合物。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述治疗性施用包括经口施用每剂所述组合物包含至少约1×104菌落形成单位的细菌芽孢的组合物。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述细菌芽孢包含来自表1中提供的属的细菌。
74.根据权利要求71所述的方法，其中所述组合物包含以质量计至少约0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或大于50％的芽孢。
75.根据权利要求71所述的方法，其中所述组合物中每克或每剂包含至少约1×104个芽孢。
76.根据权利要求71所述的方法，其中所述组合物中每克或每剂包含至少约1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010或大于1×1010个芽孢。
77.一种治疗组合物，其包含含有至少约1×103、1×104、1×105或1×106个芽孢的纯化细菌芽孢群体，其中所述组合物的重量不超过约1克，被配制用于经口施用以治疗或预防有需要的哺乳动物受体受试者中的生态失调。
78.根据权利要求77所述的治疗组合物，其配制以治疗或预防有需要的哺乳动物受体受试者中的胃肠疾病、病症或病状。
79.根据权利要求77所述的治疗组合物，其中所述细菌芽孢是从获自哺乳动物供体受试者的粪便材料纯化的。
80.根据权利要求77所述的治疗组合物，其量可有效地以单一剂量治疗或预防施用有所述治疗组合物的罹患病症或处于患上病症风险中的哺乳动物受体受试者中的所述病症。
81.根据权利要求80所述的治疗组合物，其中所述细菌芽孢群体是从获自至少一个哺乳动物供体受试者的粪便材料纯化的，其中所述至少一个哺乳动物供体受试者不具有代谢病症临床病史。
82.一种试剂盒，其在一个或多个容器中包含粪便材料收集装置和溶剂溶液，以及其用于产生芽孢形成细菌的纯化群体的使用说明书。
83.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述溶剂溶液包含洗涤剂。
84.根据权利要求83所述的试剂盒，其中所述洗涤剂是Tritonx-100、Tween20、Tween80、NonidetP40、pluronic或多元醇。
85.一种调节人类受试者的胃肠道中的微生物群群体的方法，其包括在使得i)所述胃肠道中存在的微生物群体和/或ii)所述胃肠道外部存在的微生物群体得到调节的条件下，向所述人类受试者施用包含芽孢形成细菌的纯化群体的治疗组合物的步骤。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述调节包括当施用所述治疗组合物时降低或消除所述胃肠道中存在的至少一种病原体和/或病生菌。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述调节包括植入在所述治疗组合物中存在的至少一种类型的芽孢形成细菌。
88.根据权利要求85所述的方法，其中所述调节包括强化在所述治疗组合物中不存在的至少一种类型的细菌。
89.根据权利要求87所述的方法，其中当施用所述治疗组合物时在胃肠道中没有可检测地存在至少一种类型的芽孢形成细菌。
90.根据权利要求85所述的方法，其中所述调节包括强化在所述治疗组合物中不存在的至少一种类型的芽孢形成或非芽孢形成细菌。
91.根据权利要求90所述的方法，其中在施用所述治疗组合物之后，所述至少一种类型的芽孢形成细菌或非芽孢形成细菌增加至少2倍。
92.根据权利要求85所述的方法，其中所述调节包括以下中的至少两项：i)当施用所述治疗组合物时减少或消除所述胃肠道中存在的至少一种病原体和/或病生菌；ii)植入在所述治疗组合物中存在的至少一种类型的芽孢形成细菌；和iii)强化在所述治疗组合物中不存在的至少一种类型的芽孢形成或非芽孢形成细菌。
93.根据权利要求85所述的方法，其中所述调节包括当施用所述治疗组合物时减少或消除所述胃肠道中存在的至少一种病原体和/或病生菌和以下中的至少一项：i)植入在所述治疗组合物中存在的至少一种类型的芽孢形成细菌；和ii)强化在所述治疗组合物中不存在的至少一种类型的细菌。
94.根据权利要求92所述的方法，其中当施用所述组合物时，所述至少一种病原体和/或病生菌以致病量存在于所述胃肠道中。
95.根据权利要求93所述的方法，其中所述哺乳动物受试者罹患细菌过度生长综合征(BOS)或处于患上细菌过度生长综合征(BOS)的风险中。
96.根据权利要求94所述的方法，其中所述调节包括减少或消除与所述BOS相关的至少一种病原体和/或病生菌。
97.根据权利要求85所述的方法，其中所述调节包括减少或消除至少一种耐药性病原体和/或病生菌。
98.一种在人类受试者的胃肠道中诱导细菌群体植入的方法，其包括如下步骤：在使得至少i)芽孢形成细菌的子集持续地植入在所述胃肠道内，或ii)在治疗组合物中不存在的至少一种类型的细菌在所述胃肠道内强化的条件下，向所述人类受试者施用包含所述芽孢形成细菌的纯化群体的所述治疗组合物。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述芽孢形成细菌群体基本上由芽孢组成，并且其中所述芽孢在所述胃肠道内萌发。
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