KR20170122835A - 생체활성 동물 사료 중의 고세균, 조성물을 제조하는 방법 및 조성물을 사용하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물 사료용 프로바이오틱 첨가제로서 사용되는 고세균, 특히 메탄생성 고세균을 포함하거나 이것으로 구성된 식품 보충제에 관한 것이다. 상기 보충제는 표준 사료 이외에 또는 식품 조성물로서 예를 들면, 사육된 동물에게 제공될 수 있다. 이러한 보충제는 양식에서 특히 유용하고 동물 성장률을 증가시킬 수 있고/있거나, 기생충 감염에 대한 동물 민감성을 감소시킬 수 있고/있거나 환경에 대한 동물 대변 폐기물의 영향을 개선할 수 있는 것으로 입증된다. 생체활성 식품 보충제를 포함하는 조성물을 제조하는 방법 및 이의 용도도 본 발명에 포함된다.

Description

생체활성 동물 사료 중의 고세균, 조성물을 제조하는 방법 및 조성물을 사용하는 방법

본 발명은 동물 사료 보충제의 분야, 보다 구체적으로 고세균을 포함하는 신규 사료 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

80년대 초반에 상업적 양어의 출현 이후, 양식업은 전세계적으로 매우 중요한 산업이 될 정도로 성장하였고 식품의 공급원으로서 포획 어업을 추월하기 시작한다. 2006년 생산량은 US$ 788억 달러의 가치를 가진 5,170만 톤인 것으로 보고되었고, 거의 7%의 연간 성장률로 성장한다. FAO 예상에 따르면, 1인당 소비의 현재 수준을 유지하기 위해 세계적 양식 생산은 2050년까지 8000만 톤에 도달할 필요가 있을 것으로 추정된다.

양식업의 계속된 성장은 새로운 다양한 해결과제들을 상기 산업에 제공하고 있다. 성장하는 양식업의 영향과 관련된 환경, 보건 및 질 관심사항은 상당한 노력을 들였음에도 불구하고 미해결된 상태로 남아있다. 해양 환경에 대한 위험 및 항생제의 사용을 최소화하는 환경적으로 지속가능한 양식업은 장기간 성장 및 개발을 위한 전제조건이다.

동물, 특히 어류 및 가금류 사육은 감염성 질환과 관련된 해결과제들을 많이 내포하고 있다. 이들 해결과제들은 병원체의 감염성 전염으로 인한 대규모의 동물 수확에 대한 빈번한 손실뿐만 아니라 독한 항생제 유형의 약물의 심각한 의존을 포함한다. 사육된 동물에서의 과도한 항생제 사용이 소비자에게 바람직하지 않거나 건강하지 않음에도 불구하고, 어류, 가금류 및 다른 사육된 동물들은 전형적으로 가축 수율을 증가시키기 위해 항생제 유형의 약물을 투여받는다. 감염성 질환의 발병은 양식업에서 빈번히 발생하고, 질환 전염은 농장에서의 동물의 고밀도로 인해 신속하다. 양식업자들은 질환 전염을 억제하기 위한 수단으로서 항생제 및 다른 항균제 약물을 투여한다. 이 관행은 어류가 항생제 및 약물에 대한 더 강한 내성을 갖게 만들고(과다-의존), 결과적으로 양식업자들은 어쩔 수 없이 시간의 경과에 따라 용량을 증가시킨다. 뿐만 아니라, 항균제의 대량 사용은 미생물에 대한 선택적 압력을 증가시키고 세균 내성의 천연적 출현을 촉진한다. 따라서, 종종 고용량의 항생제조차도 양식장에서 대규모 사망을 방지할 수 없다. 전술된 내용의 결과로서, 치유보다 실제로 더 비용 효과적인 예방을 강조해야 한다는 것은 분명하다. 항균제, 소독제 및 살충제는 문제점의 원인이 아니라 증상을 주로 치료한다. 더욱이, 동물 사육장으로부터의 폐기물도 환경에 강한 영향을 미친다 - 예를 들면, 양식장은 과도한 질산염을 생성함으로써 물 시스템을 오염시킨다. 생성물 수율, 예컨대, 동물 성장률, 예를 들면, 규정식으로부터의 증가된 에너지 수율로 인한 동물 성장률 및 질을 증가시키고 환경적 영향도 감소시킬 수 있는 지속가능한 동물 사육 기술의 개발은 주요한 세계적 해결과제이고, 보다 더 환경적으로 지속가능한 관행을 발생시킬 가능성이 있을 것이다.

소화관 미생물총(microbiota)은 인간 및 동물의 장에서 콜로니를 형성하는 미생물 집단을 지칭한다(Eckburg et al, Science 308: 1635-1638, 2005). 이것은 (인간 유전자보다 150배 더 많은) 3백만 개 초과의 유전자들을 가진 적어도 1000종의 상이한 공지된 세균들을 포함하는 수십조의 미생물들을 함유하고, 인간에서 소화관 미생물총은 최대 2 kg의 중량을 가질 수 있다. 동물에서 소화관 미생물총의 역할은 중요하고 소화관 미생물총이 건강에 직접적으로 영향을 미치는 많은 생리학적 기능들에 영향을 미친다는 것은 최근의 과학 공개문헌들에서 강조되어 있다(Chervonsky, Immunological reviews 245: 7-12, 2012; Geuking et al, Gut microbes 5: 411-418, 2014; Hooper et al, Science 336: 1268-1273, 2012). 이들 이점들은 무엇보다도 일부 영양분들을 소화하는 것을 돕는 것, 병원성 미생물에 의한 감염을 예방하는 것을 돕는 것, 또는 면역 시스템의 발생 및 유지에 있어서 중요한 역할을 수행하는 것을 포함한다.

소화관 미생물총이 성장 및 건강 능력에 미치는 영향을 고려하는 것은 양식업에서 보다 더 우수한 성장 및 감염에 대한 개선된 내성에 유리하면서 어류의 소화관 미생물총 조성을 조절하는 새로운 방법을 착수시켰다(Nayak, Fish & shellfish immunology 29: 2-14, 2010). 많은 경우들에서 필수적이지만 축산업에서의 광범위 항생제의 통상적인 사용은 토착 소화관 미생물총을 파괴하여, 동물을 항생제 내성 병원체에 더 민감하게 만들 수 있다. 포유동물에서, 소화관 미생물총에는 모든 계통발생적 유형(계통형)의 90%를 함께 포괄하는 두 부류의 세균들, 즉 박테로이데테스(Bacteroidetes) 및 퍼미큐테스(Firmicutes)가 우세하다. 고세균, 가장 현저하게는 건강한 성인의 결장에서 모든 혐기성균들의 최대 10%를 차지하는 메탄생성 유리아캐오테(Euryarchaeote)인 메타노브레비박터 스미씨이(Methanobrevibacter smithii)도 소화관 미생물총에 존재하지만(Eckburg et al, 2005; Miller et al, Applied and environmental microbiology 51: 201-202, 1986), 메타노스패라 스타츠마내(Methanosphaera stadtmanae)는 덜 우세하고 소수 구성원이다(Rieu-Lesme et al, Current microbiology 51: 317-321, 2005). 고세균은 소화를 돕는 건강한 소화관 미생물총의 대사 활성을 촉진할 수 있는 단세포 미생물이다(Dridi et al, PloS one 4: e70632009; Samuel et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104: 10643-10648, 2007).

현재까지, 어류 펠렛 생성 내로 도입되는 주요 생체활성 성분은 PUFA(다불포화된 지방산), 오일, 인지질, 단백질 및 펩티드, 섬유, 탄수화물, 키토산, 비타민 및 미네랄, 푸코잔틴, 폴리페놀, 파이토스테롤 및 타우린을 포함한다. 이들 성분들은 고혈압, 산화적 스트레스, 염증, 심혈관 질환, 암 및 다른 질환에 대한 내성을 개선하는 것으로 입증되었다. 그러나, 80년대 초반 이후, 프로바이오틱(probiotics)의 사용은 생물학적 조절제로서뿐만 아니라 식품 공급원으로서도 제안되었다. 프로바이오틱은 적절한 양으로 투여될 때 숙주에게 건강 이익을 부여하는 살아있는 미생물 식품 보충제이다. 이 개념은 장내 미생물을 식품에 의존하는 것이 동물 체내에서 식물상을 변경시키고 유해한 미생물을 유용한 미생물로 대체하기 위한 조치를 채택하는 것을 가능하게 한다고 주장함으로써 지난 세기 초반에 도입되었다. 프로바이오틱의 통상적으로 주장된 이익은 잠재적으로 병원성을 가진 위장 미생물의 감소, 위장 불편함의 감소, 면역 시스템의 강화, 피부 기능의 개선, 장 규칙성의 개선, 삼나무 꽃가루 알레르겐에 대한 내성의 강화, 체내 병원체의 감소, 고창 및 팽만감의 감소, DNA의 보호, 산화적 손상으로부터의 단백질 및 지질의 보호, 및 항생제 치료를 받은 대상체에서의 개별 장내 미생물총의 유지를 포함한다.

프로바이오틱의 보다 더 상세한 정의는 숙주 관련 또는 주위 미생물 군집을 변경함으로써, 사료의 개선된 사용을 보장하거나 그의 영양을 향상시킴으로써, 질환에 대한 숙주 반응을 향상시킴으로써, 또는 주위 환경의 질을 개선함으로써 숙주 동물에 유리하게 영향을 미치는 미생물을 의미한다. 이 정의는 양식에 적용될 때 특히 적절하다. 사실상, 소화관이 물-제한된 세계 내의 습한 서식지를 대표하는 육생 환경과 대조적으로, 수생 환경에서 숙주와 미생물은 생태계를 공유한다. 따라서, 수생 동물을 위한 환경은 육생 환경보다 미생물총에 훨씬 더 크게 영향을 미치고, 수생 매질 중의 세균은 숙주의 소화관 미생물총의 조성에 엄청난 영향을 미친다. 수생 동물은 숙주 동물과 무관하게 그의 병원체를 뒷받침하는 환경에 의해 둘러싸여 있으므로, 기회 병원체는 어류 주위에서 고밀도에 도달함으로써, 통상적으로 사료 또는 식수를 통해 섭취될 수 있다. 뿐만 아니라, 모체로부터의 내재하는 콜로니화 세균을 가진 육생 동물과 대조적으로, 수생 동물은 주로 무균 알로서 산란한다. 주위 세균은 알 표면에서 콜로니를 형성하고, 어린 유충은 종종 발생된 소화관을 갖지 않고/않거나(예를 들면, 새우), 소화관, 아가미 또는 피부에서 미생물 군집을 갖지 않는다. 결과적으로, 주위 물에서의 세균의 성질이 매우 중요하기 때문에, 주위 환경의 개선은 사육된 동물의 건강에 중요하다.

많은 종래기술 문헌들이 동물 사료에서의 미생물 첨가제의 사용을 보고한다. CN103783267은 특히 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 효모, 악티노마이세테스(actinomycetes) 및 광합성 세균의 균주들을 하나 이상의 조합물로 포함시킴으로써 프로바이오틱을 사용하여 어분을 제조하는 방법을 제공한다.

유사하게, CN103875977은 염기성 화합물 사료 세균을 1% 내지 10% 물질 중량의 양으로 포함하는, 양식용 혼합 사료를 개시한다. 수생 사료는 수생 생물학적 균형의 장내 콜로니를 조절하고 위장 질환을 예방하고 소화 및 흡수를 돕고 면역 및 질환 내성을 향상시킴으로써, 항생제 및 약물의 사용을 피하는 데 유용할 것이다. 동물 사료의 합성 세균 성분은 5 내지 7:2 ~ 3:1 ~ 2의 몰 비로 바실러스, 젖산 세균 및 클로스트리듐을 포함할 수 있다.

WO 2012/138477은 수탁번호 B-50481을 지정받은 균주 C6-6, 및 수탁번호 B-50482를 지정받은 균주 C6-8 중 어느 하나 또는 둘 다를, 세균에 의해 야기된 질환으로 인한 사망을 감소시키기에 효과적인 양으로 어류에게 투여하는 단계를 포함하는, 세균에 의해 야기된 질환으로 인한 어류의 사망을 감소시키는 방법을 개시한다. 세균 균주 C6-6 및 C6-8 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함하는 어류용 사료도 개시되어 있다. 이들 두 엔테로박터 균주들은 개별적으로, 또는 서로 또는 하나 이상의 다른 세균 균주와 조합될 때 감염성 질환, 예컨대, 연어과 어류의 냉수병의 치료 및 예방 또는 방지를 위한 프로바이오틱으로서 유용하다.

CN102132788은 양식에서 병원성 미생물의 성장을 억제하고 어류에 의한 사료 이용의 효율을 증가시키고 사망률을 감소시키기 위한 프로바이오틱 세균, 특히 믹소코커스 풀부스(Myxococcus fulvus) 균주의 용도에 관한 것이다.

WO 2012105804는 비브리오 종에 대한 생물학적 제어를 위한 프로바이오틱, 특히 병원성 세균 비브리오 종의 쿼럼(quorum)-감지 신호 분자를 분해하고 생체필름 형성을 억제하는 새로 단리된 바실러스 균주를 개시한다. 발명의 목적들 중에는 상기 균주를 포함하는 프로바이오틱 조성물, 사료 첨가제, 항균제 또는 수질 개선제도 청구되어 있다.

WO 2003/038109는 반추 동물에서 사료 효율을 증가시키는 방법뿐만 아니라 메탄생성 고세균의 성장을 억제하는 방법도 개시한다.

사육된 동물의 상태를 개선하고 호전시키기 위한 프로바이오틱 및 동물 사료 보충제의 분야에서의 엄청난 양의 연구에도 불구하고, 특히 양식에서 기생충 유래의 발병을 예방하고 식이 에너지 수율을 향상시키고 대변 폐기물 질을 개선하기 위한 대안적 조성물에 대한 필요성이 여전히 당분야에 존재한다.

본 발명은 고세균 계에 속하는 유기체, 특히 메탄생성 고세균이 특히 사육된 동물을 위한 동물 사료용 천연 생체활성 보충제로서 사용될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 근거한다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 이들 미생물들은 예를 들면, 소, 예컨대, 반추동물의 위장관으로부터 채취될 수 있고, 천연 발생 생물학적 경로를 활용하고 강화시켜 식이 에너지 수율을 개선하고 질환을 최소함으로써, 광범위 항생제 치료에의 의존을 감소시키고 동물 대변 오염에 의해 야기된 환경적 영향을 감소시키는 것을 목적으로 프로바이오틱 첨가제로서 동물 사료 조성물 내에 포함될 수 있다. 본 발명자들은 확립된 동물 모델을 사용함으로써, 메탄생성 고세균이 동물 사료 내에 풍부하게 존재하도록 하는 것이 사육된 동물에서 성장률 및 기생충 감염에 대한 면역 반응을 개선할 잠재력을 가진다는 것을 시험하고 입증하였다. 마우스에게 투여될 때, 사료 보충제는 모델 동물의 성장률 및 소화관 점막 장벽 기능을 증가시켜, 상기 동물이 원형 장내 기생충 에이치. 폴리자이러스(H. polygyrus)에 의한 감염에 대한 더 강한 내성을 갖게 한다. 상기 언급된 장점들 이외에, 수생 동물, 예컨대, 어류 또는 갑각류에서 보다 더 빠른 성장률, 사료의 보다 더 높은 소화/흡수 및 사료 전환 비, 및 탱크 물 중의 오염물질의 감소된 양이 명확히 입증될 수 있다. 따라서, 이러한 생체활성 첨가제는 (i) 에너지 활용을 개선하여 보다 더 우수한 성장률을 이끌어낼 수 있고, (ii) 광범위 항생제 치료에 대한 필요성을 감소시킴으로써 감염에 대한 내성을 증가시킬 수 있고, (iii) 배설물의 질을 개선함으로써 환경에 덜 영향을 미칠 수 있는 것으로 입증되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것을 특징으로 하는, 동물 사육 사료에서 사용되는 생체활성 식품 보충제를 제공하는 것이다.

바람직한 실시양태에서, 생체활성 식품 보충제의 적어도 하나의 고세균 종은 메탄생성 고세균 종이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 메탄생성 고세균 종은 메타노스패라 스타츠마내 종 또는 메타노브레비박터 스미씨이 종이다.

한 실시양태에서, 생체활성 식품 보충제는 표준 사육 조건에 비해 동물 성장률을 증가시키고/시키거나, 기생충 감염에 대한 동물 민감성을 감소시키고/시키거나, 환경에 대한 동물 대변 폐기물의 영향을 개선하는 것을 추가 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 생체활성 식품 보충제는 고세균 종이 실질적으로 풍부하다는 것을 추가 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 생체활성 식품 보충제를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 한 실시양태에서, 상기 언급된 조성물은 고체 형태로 존재하는 것을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 조성물의 그램당 약 10⁵개 내지 약 10⁸개의 고세균 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 추가 목적은 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 앞서 정의된 생체활성 식품 보충제를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다:

· 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단을 수득하는 단계; 및

· 상기 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단을 담체와 혼합하는 단계.

상기 방법의 한 실시양태에서, 담체는 수성 용액, 오일, 고세균 배양 배지 및/또는 반추위액을 포함하거나 이들로 구성된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 방법은 담체가 액체 담체이고 하기 단계들을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다:

· 1% w/v 내지 10% w/v의 증점제를, 액체 담체 및 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단을 포함하는 액체 조성물에 첨가하는 단계;

· 액체 조성물을 혼합하여 증점된 용액을 수득하는 단계; 및

· 증점된 용액을 건조하여 고체 조성물을 수득하는 단계.

또 다른 실시양태에서, 증점제는 당, 전분 및/또는 젤라틴이다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단은 반추위 추출물로부터의 단리에 의해 수득된다.

본 발명의 추가 목적은 상기 방법을 통해 수득된 동물 사육 사료로서 사용되는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 상기 생체활성 식품 보충제 또는 조성물을 사육된 동물에게 제공하는 단계를 각각 포함하는, 사육된 동물의 성장률을 증가시키는 방법, 사육된 동물의 기생충 감염에 대한 민감성을 감소시키는 방법 및 환경에 대한 사육된 동물 대변 폐기물의 영향을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 동물 사육 사료에서 사용되는 생체활성 식품 보충제의 제조에 사용되는 메탄생성 고세균 종의 집단을 제공하는 것이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 생체활성 식품 보충제, 조성물, 방법 및 집단에서 언급된 사육된 동물은 조류, 포유동물 또는 수생 동물이다.

언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 식품 보충제는 동물 사육에 유리하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이 용도로 한정되지 않는다. 식품 보충제는 애완동물, 갇힌 동물 또는 인간에게 투여될 수도 있다.

도 1은 생체활성 식품 보충제가 무경험(naive) 야생형 마우스에서 체중 획득을 촉진한다는 것을 보여준다. 생체활성 식품 보충제를 함유하는 곡물-기제 음식 또는 비처리된 대조군을 7주 동안 6주령의 특정 병원체 무함유(SPF) 수용된 암컷 C57BL/6 마우스들(n = 6)에게 공급하였고, 체중을 측정하였다. 체중은 실험 시작 시 군들 사이에 유의하게 상이하지 않았다. 생체활성 식품 보충제를 4주 동안 제공받은 후 마우스들의 체중은 비처리된 마우스에 비해 유의하게 상승되었다. 보충된 마우스들의 체중은 실험의 나머지 기간 동안 상승된 상태로 유지되었다.
도 2는 생체활성 식품 보충제가 무경험 야생형 마우스에서 페이어스 패치(Peyer's patch) 크기를 촉진한다는 것을 보여준다. 생체활성 식품 보충제를 함유하는 곡물-기제 음식 또는 비처리된 대조군을 7주 동안 6주령의 SPF 수용된 암컷 C57BL/6 마우스들(n = 6)에게 공급한 후, 마우스들을 해부하였고, 크기를 기준으로 장내 페이어스 패치를 점수화하였다. 생체활성 식품 보충제를 함유하는 규정식을 제공받은 마우스들은 명확히 더 큰 페이어스 패치를 가졌다.
도 3은 생체활성 식품 보충제가 장내 기생충 에이치. 폴리자이러스에 대한 내성을 증가시킨다는 것을 보여준다. 생체활성 식품 보충제를 함유하는 곡물-기제 음식 또는 비처리된 대조군을 6주령의 SPF 수용된 암컷 C57BL/6 마우스들(n = 6,4)에게 공급하였다. 그 후, 200 감염 유닛의 에이치. 폴리자이러스를 사용한 위관영양으로 마우스들을 감염시켰고, 대변 기생충 알 카운트를 측정함으로써 감염 후 2주 내지 6주에서 감염성을 측정하였다. 그들의 규정식 중의 생체활성 식품 보충제로 처리된 마우스들은 비처리된 군에 비해 대변 그램당 유의하게 감소된 수의 기생충 알을 가졌다.
도 4는 생체활성 식품 보충제가 마우스에서 장내 기생충 존재량을 감소시킨다는 것을 보여준다. 생체활성 식품 보충제를 함유하는 곡물-기제 음식 또는 비처리된 대조군을 6주령의 SPF 수용된 암컷 C57BL/6 마우스들(n = 4-6)에게 공급하였다. 그 다음, 200 감염 유닛의 에이치. 폴리자이러스를 사용한 위관영양으로 마우스들을 감염시켰고, 해부하고 장 내강에서 기생충의 가시적 카운팅을 수행함으로써 감염 후 6주에서 성충 기생충 존재량을 측정하였다. 기생충 존재량은 비처리된 군에 비해 생체활성 식품 보충제로 처리된 마우스에서 명확히 감소되었다.
도 5는 3종의 상이한 병원성 비브리오들에 대한 고세균의 성장 억제 효과를 측정하기 위한 시험관내 어세이를 보여준다. 패널 a: 마린 아가(Marine Agar) 위의 브이. 하르베이(V. harveyi) BB120; 패널 b: 마린 아가 위의 브이. 캄프벨리이(V. campbellii) LMG21363; 패널 c: 마린 아가 위의 브이. 파라해몰라이티커스(V. parahaemolyticus) PV1; 패널 d: 나인 솔트 아가(Nine Salts Agar) 위의 브이. 하르베이 BB120; 패널 e: 나인 솔트 아가 위의 브이. 캄프벨리이 LMG21363; 패널 f: 나인 솔트 아가 위의 브이. 파라해몰라이티커스 PV1.
도 6은 48시간 동안 병원성 비브리오 하르베이 BB120에 노출된 아르테미아 나우플리이(Artemia nauplii)의 생존(%)에 대한 고세균의 효과를 평가하기 위한 생체내 챌린지 시험의 결과를 보여준다. 값은 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다(n = 5). 상이한 문자로 표시된 막대는 유의하게 상이하다(일원 Anova, p ≤ 0.05).
도 7은 3개의 실험군들에 대한 4개월 2주의 기간에 걸친 체중 획득 곡선을 보여준다: 대조군, 저용량 보충 사료 및 고용량 보충 사료. 데이터 점은 표준 편차 오차 막대를 가진, 각각의 군의 표본 세트의 평균 중량에 상응한다.
도 8은 3개의 실험군들에서 물 중의 물고기 폐기물 오염물질의 분석을 보여준다. A) 3회 반복실험에 대한 평균 인산염 농도. 제시된 인산염 값은 실험 전에 물에서 측정된 농도를 공제한 후 수득되었고, 탱크 내의 총 물고기 중량의 mg당 인산염 mg/ℓ로서 제공되어 있다. B) 3회 반복실험에 대한 평균 아질산염 농도. 제시된 값은 탱크 내의 총 물고기 중량의 mg당 아질산염 mg/ℓ로서 제공되어 있다.

본 개시는 본 개시의 일부를 형성하는, 첨부된 도면과 관련하여 제공된 하기 상세한 설명을 참조함으로써 더 용이하게 이해될 수 있다. 본 개시는 본원에 기재되어 있고/있거나 제시되어 있는 특정 조건 또는 파라미터로 한정되지 않고, 본원에서 사용된 용어는 단지 예로써 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이고 청구된 개시의 한정을 위한 것이 아니라는 것을 이해해야 한다.

본원 및 첨부된 청구범위에서 사용될 때, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수 형태 용어는 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "조성물"의 언급은 복수의 조성물들을 포함하고, "프로바이오틱"의 언급은 하나 이상의 프로바이오틱의 언급을 포함한다.

또한, 달리 언급되어 있지 않은 한, "또는"의 사용은 " 및/또는"을 의미한다. 유사하게, "포함한다", "포함하고", "포함하는", "포괄한다", "포괄하고" 및 "포괄하는"은 상호교환가능하고 한정하기 위한 것이 아니다. 다양한 실시양태들의 설명이 용어 "포함하는"을 사용하는 경우, 당분야에서 숙련된 자는 일부 특정 경우 용어 "본질적으로 구성된" 또는 "구성된"을 사용하여 실시양태를 대안적으로 기술할 수 있다는 것을 이해할 것이라는 것도 이해해야 한다.

본 개시의 프레임에서, 이하에서 종종 단순히 "보충제"로서도 지칭되는 "생체활성 식품 보충제"는 활성 물질을 포함하는 임의의 유형의 식품 보충제이다. 표현 "활성 물질" 및 "생체활성 화합물"은 생물학적 활성을 가진, 즉 살아있는 유기체, 조직 또는 세포에 대한 효과를 가진 임의의 화학물질 또는 생물학적 물질을 지칭한다. 상기 표현은 생물학적 또는 화학적 사건을 변경시키거나, 억제하거나, 활성화시키거나 다른 방식으로 영향을 미치는 임의의 화합물을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 활성 물질 또는 생체활성 화합물은 즉, 숙주 관련 또는 주위 미생물 군집을 변경시키거나, 사료의 개선된 사용을 보장하거나 그의 영양을 향상시키거나, 질환에 대한 숙주 반응을 향상시키거나 주위 환경의 질을 개선하여 숙주 동물에 유리하게 영향을 미침으로써 실질적으로 프로바이오틱으로서 작용한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 프레임에서, 생체활성 식품 보충제를 특징짓는 생체활성 화합물은 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단을 포함한다.

본원에서 사용될 때 용어 "집단"은 시간 및 공간에 의해 정의된 동일한 종의 개별 유기체들의 군을 의미한다. 그러나, 이 용어는 임의의 수의 종을 포함할 수 있는 군집, 즉 특정 생태학적 적소에서 서식하는 유기체들의 군으로서 의도될 수도 있다. 이와 관련하여, 용어 "집단"은 "혼합된 집단"으로서도 지칭된다. 관련 분야에서 숙련된 자에게 자명할 바와 같이, 상업적으로 입수가능한 대체물이 예상되지 않는 경우, 생체활성 식품 보충제 내로 포함될 고세균 종들의 집단은 연속 희석법, 획선평판법, 분주평판/도말평판법, 농화 배양법, 선택적 배지를 활용하는 방법, 차등 배지를 활용하는 방법 등을 포함하는 임의의 통상의 단리 방법을 통해 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 실시양태에서, 생체활성 식품 보충제의 활성 물질은 메탄생성 고세균 종, 즉 무산소 조건에서 대사 부산물로서 메탄을 생성하는 고세균 종이다. 메탄생성균은 자연에서 널리 분포되어 있는 다양한 군의 엄격한 혐기성균이고 다양한 영구적 무산소 서식지, 예컨대, 침수된 토양, 침전물, 오니 소화제 또는 일부 동물의 소화관에서 발견될 수 있다. 모든 공지된 메탄생성균들은 고세균에 속하고 산소에 극도로 민감하다. 메탄생성균의 특징은 메탄(CH₄)으로의 C-1 화합물(예를 들면, CO₂, 메탄올, 포르메이트, 또는 N-메틸 기)의 환원이다. 메탄생성균은 혐기성 환경에서 다른 형태의 혐기성 호흡에 의해 생성된 과도한 수소 및 발효 생성물을 제거하는 중추적인 생태학적 역할을 수행한다. 메탄생성 고세균도 이러한 환경에서 종종 메탄의 주요 공급원이고 일차 생산자로서 역할을 수행할 수 있기 때문에 메탄의 산화로부터 에너지를 유도하는 유기체(이들 중 대다수는 세균임)와 함께 생태계에서 중추적인 역할을 수행한다. 메탄생성균은 유기 탄소를 주요 온실 가스이기도 한 메탄으로 분해하는 탄소 주기에서 핵심적인 역할도 발휘한다. 메탄생성은 인간 및 다른 동물, 특히 반추동물의 소화관에서도 일어난다. 반추위에서, 메탄생성균을 포함하는 혐기성 유기체는 셀룰로스를 동물에 의해 사용될 수 있는 형태로 분해한다. 동물, 예컨대, 소는 이들 유기체들 없이 풀을 먹을 수 없을 것이다. 메탄생성의 유용한 생성물은 소화관에 의해 흡수되는 반면, 메탄은 동물에 의해 방출된다.

메탄생성 고세균 종의 목록은 메타노박테리움 브리안티이(Methanobacterium bryantii), 메타노박테리움 포르미쿰(Methanobacterium formicum), 메타노브레비박터 아르보리필리커스(Methanobrevibacter arboriphilicus), 메타노브레비박터 고트스칼키이(Methanobrevibacter gottschalkii), 메타노브레비박터 루미난티움(Methanobrevibacter ruminantium), 메타노브레비박터 스미씨이(Methanobrevibacter smithii), 메타노코커스 청신겐시스(Methanococcus chunghsingensis), 메타노코커스 부르토니이(Methanococcus burtonii), 메타노코커스 애올리커스(Methanococcus aeolicus), 메타노코커스 델타(Methanococcus deltae), 메타노코커스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii), 메타노코커스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis), 메타노코커스 반니엘리이(Methanococcus vannielii), 메타노코르푸스쿨룸 라브레아눔(Methanocorpusculum labreanum), 메타노쿨레우스 보우르겐시스(Methanoculleus bourgensis), 메타노쿨레우스 마리스니그리(Methanoculleus marisnigri), 메타노플로렌스 스토르달렌미렌시스(Methanoflorens stordalenmirensis), 메타노폴리스 리미나탄스(Methanofollis liminatans), 메타노게니움 카리아시(Methanogenium cariaci), 메타노게니움 프리기둠(Methanogenium frigidum), 메타노게니움 오르가노필룸(Methanogenium organophilum), 메타노게니움 울페이(Methanogenium wolfei), 메타노마이크로비움 모바일(Methanomicrobium mobile), 메타노파이러스 칸들레리(Methanopyrus kandleri), 메타노레굴라 보오네이(Methanoregula boonei), 메타노새타 콘실리이(Methanosaeta concilii), 메타노새타 써모필라(Methanosaeta thermophila), 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans), 메타노사르시나 바르케리(Methanosarcina barkeri), 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei), 메타노스패라 스타츠마내(Methanosphaera stadtmanae), 메타노스피릴리움 훈가테이(Methanospirillium hungatei), 메타노써모박터 데플루비이(Methanothermobacter defluvii), 메타노써모박터 써마우토트로피커스(Methanothermobacter thermautotrophicus), 메타노써모박터 써모플렉서스(Methanothermobacter thermoflexus), 메타노써모박터 울페이(Methanothermobacter wolfei) 및 메타노쓰릭스 소치게니이(Methanothrix sochngenii)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체활성 식품 보충제를 위한 활성 물질로서 사용된 고세균 종은 메타노스패라 스타츠마내 종 및/또는 메타노브레비박터 스미씨이 종이다.

본 발명의 생체활성 식품 보충제는 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단을 포함한다는 사실을 특징으로 한다. 그러나, 여러 다른 물질들, 특히 다른 종류의 프로바이오틱스가 상기 보충제에 존재할 수 있다. 이것은, 이하에 상세히 기재될 바와 같이, 여러 미생물들의 블렌드(일반적으로 미생물총으로서 명명됨)가 존재할 수 있는 소의 반추위 추출물로부터 상기 고세균 집단을 수득하였을 때 특히 사실이다. 이 이론에 반드시 구속될 필요는 없지만, 본 발명자들에 의해 수득된 일부 관찰결과는 고세균 집단이 양성 공생 관계를 유지하고 특히 보다 많은 유형의 혐기성 미생물들을 포함하는 복합 집단의 보존 면에서 소위 "고세균 관련 미생물총"(즉, 예를 들면, 혐기성/발효 프로바이오틱을 포함하는 고세균과 선택된 환경에서 공생 관계를 통상적으로 확립하는 미생물들의 앙상블(ensemble))의 적합한 환경적 성장/증식 조건을 촉진한다. 본 발명에 따른 고세균 풍부 식품 보충제에서 하나 초과의 프로바이오틱 사이의 평형은 가능하게는 사육된 동물에 대한 본 발명의 보충제의 인지된 양성 효과의 핵심 특징들 중 하나이다.

따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시양태에서, 생체활성 식품 보충제는 고세균 종이 실질적으로 풍부하다는 사실을 특징으로 한다. 본원에서 사용될 때, "실질적으로 풍부하다"는 본 발명의 보충제 내의 고세균 세포의 집단이 총 미생물 프로바이오틱 세포의 적어도 1%, 바람직하게는 총 미생물 프로바이오틱 세포의 약 2% 내지 약 10%라는 것을 의미한다. 이 풍부함은 바람직하게는 프로바이오틱 미생물의 하나 초과의 미생물 집단이 조성물에 존재할 때 전술된 유리한 효과를 가진다. 일부 실시양태에서, 보충제에 존재하는 보다 더 높은 백분율, 예컨대, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 최대 100%의 미생물 세포는 고세균 세포이다. 즉, 생체활성 식품 보충제는 프로바이오틱 미생물을 포함하는 임의의 다른 미생물을 함유하지 않는다.

언급된 바와 같이, 본 발명의 생체활성 식품 보충제는 프로바이오틱으로서 작용한다. 구체적으로, 본 발명의 생체활성 식품 보충제의 한 목적은 사육된 동물의 생리학의 일부 양태들의 증강 및/또는 향상, 및 상기 개선된 생리학 관련 상태가 주변 환경에 미치는 필연적인 영향이다. 배경 단락에서 설명된 바와 같이, 이것은 사육된 동물(이 경우, 수생 동물, 예컨대, 어류, 뱀장어류 또는 갑각류)이 사육되는 환경과 극도로 밀접한 관계를 갖는 양식의 경우 특히 사실이다. 그러나, 본 발명에 따른 사육된 동물은 조류, 예컨대, 닭, 가금류, 타조 등, 또는 포유동물, 예를 들면, 가축, 예컨대, 소, 양, 돼지, 말, 설치류 등, 및 또한 가능하게는 영장류 및 인간일 수도 있다. 따라서, 생체활성 식품 보충제는 사육 조건이 표준 사육 조건에 비해 유리하게 개선되도록 생리학적 동물 파라미터에 긍정적으로 영향을 미침으로써 이러한 생리학적 동물 파라미터에 작용한다는 사실을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 생체활성 식품 보충제는 동물 성장률을 증가시키고/시키거나, 기생충 감염에 대한 동물 민감성을 감소시키고/시키거나, 환경에 대한 동물 대변 폐기물의 영향을 개선하는 데 유용하다. 하기 실시예 단락에 상세히 기재될 바와 같이, 본 발명의 보충제의 이들 유용한 성질은 적합한 기간 동안 보충제를 공급받은 포유동물 및 수생 동물 모델 둘 다에서 입증됨으로써, 상기 언급된 유리한 특징을 뒷받침한다. 따라서, 추가로, 본 발명의 한 목적은 생체활성 식품 보충제 또는 이를 포함하는 조성물을 사육된 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물 성장률을 증가시키거나, 기생충 감염에 대한 동물 민감성을 감소시키거나 환경에 대한 동물 대변 폐기물의 영향을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 한 양태에 따라, 본 발명의 생체활성 식품 보충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물도 제공된다. 본 개시의 프레임에서, 용어 "조성물"은 용어 "제제"와 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 사용될 때, "조성물"은 특정 방식으로 제조되어 특정 목적을 위해 사용되는 성분들 또는 화합물들의 혼합물을 지칭한다. 이 개념은 활성 물질을 포함하는 상이한 화합물들이 조합되어 최종 생성물을 생성하는 과정과도 분명히 연관되어 있다. 통상적으로, 성분이 사용될 때 독특한 성질을 최종 생성물(즉, 최종 조성물)에 부여하기 때문에, 최종 조성물에 대한 특징적인 특징을 수득하기 위해, 예컨대, 그의 성분들이 단독으로 사용될 때 이들 성분들로부터 수득될 수 없는 효과, 그의 성분들의 임의의 잠재적 상승작용적 작용을 용이하게 하는 고도의 효과, 최종 사용자를 위한 취급 성질 및/또는 안전성의 개선 등을 달성하기 위해 상기 성분들을 특정 식에 따라 혼합한다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태들로 존재할 수 있고, 바람직한 형태는 통상적으로 의도된 투여 모드 및/또는 의도된 적용에 의해 좌우된다. 조성물은 통상적으로 활성 물질을 위한 적어도 하나의 허용가능한 담체(경우에 따라 희석제 수단으로서 사용될 수도 있음), 부형제 등을 포함한다. 본원에서 사용될 때, "허용가능한 담체"는 전달 수단으로서 작용할 뿐만 아니라 필요한 경우 활성 물질을 위한 분배 수단으로서도 작용하는 임의의 물질이다. 상기 용어는 최종 사용자(이 경우 사육된 동물)에 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매, 액체 희석제, 흡수 지연제 등뿐만 아니라, 미리 구성된 식품 펠렛으로서 고체 담체도 포함한다. 적합한 담체의 예는 당분야에서 잘 공지되어 있고 수성 용액(예를 들면, 염화나트륨 용액, 인산염 완충 염화나트륨 용액 등), 물, 오일, 예컨대, 어류 오일, 유화액, 예컨대, 유/수 유화액, 다양한 유형의 습윤화제 등을 포함한다.

본 개시에 따른 조성물은 액체 형태로 제공될 수 있다. 액체 조성물은 담체가 액체 담체이고 임의의 또 다른 첨가된 부형제의 존재에도 불구하고 액체 형태를 유지하는 조성물이다. 액체 제제는 예를 들면, 수성 용액, 비-극성 용액 또는 유화액을 포함한다. "수성 용액"은 용매가 실질적으로 물로 만들어진 용액이다. 본 개시의 프레임에서, 용어 "수성"은 물과 연관되어 있거나, 물과 관련되어 있거나, 물과 유사하거나 물에 용해된다는 것을 의미한다. 이 표현은 물 함량이 예를 들면, 총 용액 중량의 5 중량% 미만인 고도로 농축된 및/또는 점성 용액, 예를 들면, 시럽(즉, 포화된 물/당 용액) 등도 포함한다. "비-극성 용액"은 용매가 비-극성 화합물인 용액이다. 비-극성 용매는 낮은 유전 상수를 갖고 물과 혼합될 수 없는 화합물을 의미한다. 비-극성 용액은 예를 들면, 오일을 포함할 수 있다. "오일"은 주위 온도에서 점성 액체이고 소수성 및 친유성 둘 다를 가진 임의의 비-극성 화학 물질이다. 본 발명에 따른 특히 적합한 오일은 어류 오일이다. "유화액"은 통상적으로 혼합될 수 없는(블렌딩될 수 없는) 2종 이상의 유체들의 혼합물이다. 유화액은 콜로이드로서 지칭되는 물질의 시스템의 보다 더 일반적인 클래스의 부분이다. 용어 콜로이드와 유화액이 종종 상호교환가능하게 사용될지라도, 본 개시의 프레임에서, 용어 유화액은 분산상 및 연속상 둘 다가 유체, 예를 들면, 액체일 때 사용된다. 유화액에서, 한 유체("분산상")는 다른 유체("연속상")에 분산되어 있다.

본 발명에 따른 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 생체활성 식품 보충제를 포함하는 조성물은 고체 형태, 즉 담체가 고체 담체이거나 액체 담체(또는 액체 조성물)의 함량 및/또는 액체 담체(또는 액체 조성물) 내의 추가 부형제의 존재가 비-유체 조성물을 생성할 정도인 경우의 제제로 존재한다. 이것은 특히 반-고체 조성물, 동결건조된 조성물, 퍼티(putty) 유사 제제, 겔 유사 물질, 합성 하이드로겔 등도 포함한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "겔"은 유체에 의해 그의 전체 부피에 걸쳐 팽윤되어 있는 비-유체 콜로이드성 네트워크 또는 중합체 네트워크를 지칭한다. 겔은 액체 매질의 부피에 걸쳐 있고 표면 장력 효과를 통해 그를 구속하는 고체 3-차원적 네트워크이다. 내부 네트워크 구조는 물리적 결합(물리적 겔) 또는 화학적 결합(화학적 겔)으로부터 발생될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "하이드로겔"은 팽윤제가 수성 용액인 겔을 지칭한다. 하이드로겔은 가교연결된 중합체 쇄의 네트워크로 구축된 거대분자 중합체 겔이다. 이것은 물이 분산 매질인 콜로이드성 겔로서 종종 발견되는 친수성 단량체로부터 합성된다. 하이드로겔은 고도 흡수성(이들은 90% 초과의 수성 용액을 함유할 수 있음) 천연 또는 합성 중합체 네트워크이다. 그들의 특성의 결과로서, 하이드로겔은 전형적으로 단단하되 탄성을 띠는 기계적 성질을 발생시킨다.

언급된 바와 같이, 고체 조성물은 특정 부형제를 액체 담체 또는 액체 조성물에 첨가함으로써 생성될 수도 있다. 이 방법은, 본 발명의 경우와 마찬가지로, 활성 물질이 액체 용액에 이미 포함되어 있을 때 특히 유리하다. 본 발명의 한 실시양태에서, 사실상 고세균(사실상 본 발명의 활성 물질)은 액체 배양 배지("브로쓰"로서도 지칭됨)에서 배양된다. 고체 조성물이 동물 사육을 위해 사용되고자 하는 경우, 이러한 액체 배양 배지는 증점제의 첨가에 의해 고체화될 수 있거나 증점될 수 있다. "증점 물질" 또는 "증점제"는 그의 다른 성질을 실질적으로 변화시키지 않으면서 액체의 점성을 증가시킬 수 있는 물질이다. 증점제는 생성물의 안정성을 증가시키는 다른 성분 또는 유화액의 현탁을 개선할 수도 있다. 식품 증점제는 종종 다당류(전분, 식물성 검 및 펙틴) 또는 단백질을 기제로 한다. 이 카테고리는 전분, 예컨대, 갈분(arrowroot), 옥수수전분, 카타쿠리(katakuri) 전분, 감자 전분, 사고(sago), 타피오카 및 이들의 전분 유도체를 포함한다. 식품 증점제로서 사용되는 식물성 검은 알기닌 및 이의 염(예를 들면, 알긴산(E400), 알긴산나트륨(E401), 알긴산칼륨(E402), 알긴산암모늄(E403), 알긴산칼슘(E404)), 구아 검, 로커스트 콩 검 및 잔탄 검을 포함한다. 식품 증점제로서 사용되는 단백질은 콜라겐, 난백, 푸르셀라란(furcellaran) 및 젤라틴을 포함한다. 당은 아가로스, 트레할로스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 카라기난을 포함한다. 일부 증점제들은 약한 점착성 내부 구조를 형성하는 콜로이드 혼합물로서 액체상에 용해되어 겔을 형성하는 겔화 물질(겔화제)이다. 전형적인 겔화제는 예를 들면, 천연 검, 전분, 펙틴, 아가-아가 및 젤라틴을 포함한다. 상이한 증점제들은 맛, 투명성, 및 화학적 및 물리적 조건에 대한 그들의 반응의 차이로 인해 소정의 적용에서 더 또는 덜 적합할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 사료 조성물에 포함된 증점제는 당, 젤라틴 및/또는 전분으로부터 선택된다.

조성물은 통상적으로, 구체적인 필요에 따라, 다른 성분, 예를 들면, 유기산 또는 이의 염; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) (폴리)펩티드, 예를 들면, 폴리아르기닌 또는 트리펩티드; 단백질, 예컨대, 식물성 공급원, 예컨대, 콩으로부터 유래한 단백질; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루탐산, 아스파르트산, 라이신, 메티오닌, 트립토판 또는 아르기닌; 단당류, 이당류, 및 셀룰로스 또는 이의 유도체, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 당 알코올, 예컨대, 만니톨 또는 소르비톨; 비타민; 오일, 예컨대, 대두유; 지방산; 인지질; 및/또는 이온, 예컨대, 나트륨을 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 고체 조성물은 고체 제제의 모든 장점들(저장의 용이성, 정확한 용량, 진공 포장 등)을 유지하면서 사육된 동물, 예컨대, 닭 및 돼지를 위한 단순한 주문형 전달 수단을 갖기 위해 물, 예컨대, 식수에서 나중에 가용화되도록 구상될 수도 있다.

제제 형태와 무관하게, 본 발명의 조성물의 한 중요한 양태는 프로바이오틱의 전형적인 생리학적 효과를 발휘하도록 구상되는 그의 고세균 세포 함량이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 조성물은 조성물의 그램당 약 10⁵개 내지 약 10⁸개의 고세균 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이를 근거로, 용량은 여러 파라미터들, 예컨대, 동물의 유형, 그의 식습관, 그의 체중 등에 따라 최적화될 수 있다. 게다가, 상기 농도 범위는 한정적이지 않고, 보다 더 낮거나 보다 더 높은 범위가 본 개시의 프레임에서 예상될 수 있다. 한 시나리오에서, 본 발명의 생체활성 식품 보충제는 예를 들면, 사육된 동물을 위해 미리 형성된 또는 상업적으로 입수가능한 사료와 혼합될 수 있다: 혼합 시 최종 동물 사료의 그램당 약 10⁵개 내지 약 10⁸개의 고세균 세포를 유지하는 것은 바람직한 실시양태로서 간주된다.

본 발명의 추가 양태는 본 발명에 따른 조성물을 제조하는 방법, 및 상기 방법을 통해 수득된 조성물이다. 일반적으로 말해서, 본 발명에 따르면, 동물 사료로서 적합한 조성물을 제조하는 방법은 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단을 수득하는 단계 및 이를 적합한 담체와 혼합하는 단계를 포함한다. 필요에 따라, 담체는 액체 제제 또는 고체 제제가 수득될 수 있도록 액체 담체 또는 고체 담체일 수 있다.

당업자에게 자명할 바와 같이, 적어도 하나의 고세균 종의 집단은 임의의 공지된 방법, 예컨대, 단리된 고세균 균주(이의 동결건조된 형태를 포함함)의 상업적 구입, 펠렛화 단계를 이용하거나 이용하지 않으면서 적합한 배양 브로쓰(예를 들면, 라이프니츠 인스티튜트(Leibniz Institute) DSMZ - 독일 미생물 및 세포 배양물 수집기관 게엠베하(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)로부터의 메타노스패라 배지 I 또는 메타노박테리움 배지)에서의 고세균의 배양 등에 의해 수득될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 고세균은 다른 공급원, 예를 들면, 반추위 추출물, 예를 들면, 소의 반추위 추출물로부터의 단리로부터 수득될 수 있다. 반추위 추출물은 완벽한 배양 조건 - 소 반추위 내의 혐기성 조건 - 하에서 미생물(특히 메탄생성 고세균)에게 영양을 공급하는 영양분을 함유하기 때문에 고세균을 위한 완벽한 배양 배지를 대표한다. 상용적인 실험실 절차를 통해 다량의 반추위 추출물이 하루에 한 마리 소로부터 추출될 수 있고; 이것은 가능하게는 (예를 들면, 산소 및/또는 극한 온도에의 노출을 통해) 멸균될 수 있고, 이로부터 수득된 반추위액은 혐기성 조절된 실험실 조건 하에서 고세균을 배양하기 위한 주성분으로서 사용될 수 있다. 더욱이, 소의 메탄생성 미생물총의 높은 기능적 잠재력은 소로부터 사후에 용이하게 수득될 때조차도 보존될 수 있고, 그 후 식물-기제 규정식의 보다 더 우수한 소화 및 사육된 동물, 예컨대, 닭, 돼지 및 어류를 위한 면역 시스템 활성화를 촉진하도록 활용될 수 있다. 예를 들면, 소 사후의 혐기성 반추위 미생물총은 메탄생성 고세균이 풍부한 반추위액을 수득하도록 기계적 압착에 의해 반추위로부터 추출될 수 있고; 이것은 메쉬 여과될 수 있고 가능하게는 궁극적으로 적합한 동결보호제(당, 전분, 젤라틴 등)를 사용하는 상용적인 냉동-건조 또는 분무-건조 방법에 의해 보존될 수 있다.

일단 적어도 하나의 고세균 종의 집단이 수득되면, 이것은 액체 또는 고체 담체인 담체와 혼합된다. 일부 양태에서, 특히 액체 조성물이 예상될 때, 담체는 심지어 동일한 배양 브로쓰 및/또는 추출 과정(예를 들면, 반추위 추출물의 압착) 후 반추위 추출물로부터 수득된 반추위액일 수 있고, 이때 미생물이 배양되어 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 액체 조성물로부터 시작하여 고체 조성물을 수득하기 위해, 추가 단계를 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 특정 방법은 액체 담체 및 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단을 포함하는 액체 조성물에 1% w/v 내지 10% w/v의 증점제를 첨가하는 단계, 액체 조성물을 가열하거나 가열하지 않으면서 수득된 액체 조성물/증점제를 임의의 적합한 수단(예를 들면, 교반기)으로 혼합하여 증점된 용액을 수득하는 단계, 및 증점된 용액을 건조하여 고체 조성물을 수득하는 단계를 예상한다. 그 후, 상기 고체 조성물은 막대, 블록, 펠렛, 과립, (미세)구 등을 수득하기 위해 가장 편리한 방식으로 성형될 수 있다.

하기 단락들을 더 명확히 하기 위해, "페이어스 패치"는 결합 조직 캡슐에 의해 둘러싸여 있지 않다는 점을 제외하고 구조 면에서 림프절과 유사한 대략 알 형태의 림프 조직 소절이다. 페이어스 패치는 편도선 및 충수의 림프 조직을 포함하는, 림프 소절로서 공지되어 있는 비-캡슐화된 림프 조직의 클래스에 속한다. 마이크로폴드 세포(M 세포)로서 공지되어 있는 특수한 상피 세포는 장 내강을 마주보는 페이어스 패치의 면을 따라 늘어서 있는 반면, 외부 면은 많은 림프 세포들 및 림프 혈관들을 함유한다. 페이어스 패치의 기능은 회장에서 병원성 미생물을 분석하고 이것에 반응하는 것이다. 소화관에서 미생물로부터의 항원은 각각의 페이어스 패치의 표면을 따라 늘어서 있는 M 세포에 의한 세포내이입(endocytosis)을 통해 흡수된다. 이들 항원들은 림프 조직으로 전달되고, 이 조직에서 이들은 대식세포에 의해 흡수되고 T 림프구 및 B 림프구에 제시된다. 위험한 병원성 항원을 제시받았을 때, 림프구는 병원체 특이적 항체를 생성하고 병원체 사멸 세포독성 T 림프구로 변하고 림프관을 통해 림프절로 이동하여 면역 시스템의 다른 세포에게 알림으로써 면역 반응을 유발한다. 그 후, 신체는 병원체가 장을 넘어 퍼질 수 있기 전에 병원체에 대한 전신 범위 면역 반응을 준비한다. 림프 시스템의 다른 성분과 마찬가지로, 페이어스 패치는 그를 둘러싸는 조직이 염증을 갖게 되어, 그가 독소 및 외부 세균에 대한 투과성을 갖게 될 때 염증 또는 궤양을 갖게 될 수 있다.

실시예 1

본 발명을 더 명확히 기술하고 설명하기 위해, 하기 실시예들이 상세히 제공되나, 이들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다. 여기에 기재된 예시적 실시양태에서, 소 반추위로부터의 본 발명의 생체활성 성분의 채취 및 준비를 수행하여, 마우스를 위한 사료 펠렛을 개선한다. 이것은 소 반추위로부터의 천연 발생 고세균의 단리 및 마우스 사료 내로의 후속 도입에 의해 달성된다.

방법

마우스: 암컷 C57BL/6 마우스들은 8주령에서 처리를 제공받기 시작하였다. 체중을 주기적으로 측정하였고 마우스 건강을 면밀히 모니터링하였다.

생체활성 식품 보충제 제조: 고세균 계, 유리아캐오타 문, 메타노박테리아 강, 메타노박테리알레스 목, 메타노박테리아세애 과에 속하는 메타노스패라 스타츠마내 균주 DSZM 3091 및 메타노브레비박터 스미씨이 균주 DSMZ 861을 독일 미생물 및 세포 배양물 수집기관(DSMZ, Braunschweig, Germany)으로부터 구입하였다. 이들을 교반하면서 2-bar H₂/CO₂(80%-20%) 대기 하에서 헌게이트(hungate) 튜브 내에서 37℃에서 혐기성 조건 하에서 메탄생성균 배양의 특별한 지시 및 혐기성균 배양의 특별한 지시에 따라 각각 액체 배지 322 및 119(DSMZ, Braunschweig, Germany)에서 성장시켰다.

보충 사료로서 투여된 생체활성 식품 보충제: 특별히 준비된 사료 펠렛을 각각의 마우스 우리에 임의로 공급하였다. 각각의 메타노스패라 스타츠마내 및 메타노브레비박터 스미씨이 액체 배양물로부터의 500 ㎖를 5일의 항온처리 후 배양 병으로부터 회수하고 5 g의 아가로스/젤라틴과 조합하고 혼합하여 고체 생성물을 생성하였다. 아가로스/젤라틴-생체활성 식품 보충제 혼합물을 약 2 내지 4 mm 직경의 고체 조각으로 기계적으로 분쇄하였다. 19 kg의 표준 마우스 사료 펠렛을 6 ℓ의 증류된 H₂O에 용해시켰고, 아가로스/젤라틴 생체활성 식품 보충제 혼합물을 추후에 첨가하였다. 완전한 혼합물을 5분 동안 교반하여 균질한 덩어리를 수득하였다. 이 덩어리를 0.5 x 1 cm의 조각으로 감소시키고 알루미늄 포일 위에 도말하고 21℃에서 밤새 건조하였다.

에이치. 폴리자이러스 모델: C57BL/6을 사육하고 특정 병원체 무함유(SPF) 조건 하에서 유지하였다. 모든 마우스들에게 실험의 시작 전에 표준 사육 규정식을 공급하였다. 한 실험 내에서 분석된 SPF 마우스들의 상이한 군들 내에서 장내 세균을 표준화하기 위해, 기생충 감염 전에 3주 동안 모든 마우스들을 함께 수용하였다. 그 다음, 마우스들을 200 L3 헬리그모소모이데스 폴리자일러스 바케리(Heligmosomoides polygyrus bakeri)(Hpb)로 경구 감염시켰고, 동시에 규정식을 대조군 표준식 또는 전술된 생체활성 식품 보충제를 포함하는 실험식으로 바꾸었다. Hpb 감염 후, 실험의 나머지 기간 동안 함께 수용 또는 혼숙을 중단하였다. 포화된 NaCl을 사용한 습한 대변 부유에 의한 채취로 실험 전체에 걸쳐 알 생산을 정량하였고 맥마스터 벌레 알 카운팅 챔버(McMaster Worm Egg Counting Chamber)(Weber Scientific International, Ltd, Hamilton, NJ, USA)를 이용하여 눈으로 세었다. 실험의 말기에 동물을 희생시켰고 해부 현미경을 사용함으로써 각각 소장 내용물 및 외부 표면의 수동 카운팅으로 성충 존재량 및 장내 페이어스 패치 크기를 측정하였다.

결과

생체활성 식품 보충제는 무경험 야생형 마우스에서 중량 획득을 촉진한다.

마우스 체중에 대한 생체활성 식품 보충제의 효과를 시험하였다(도 1). 통상의 사료를, 상기 보충제를 함유하는 1% 아가-기제 비히클 또는 대조군으로서 아가-기제 비히클 단독과 혼합하였다. 아가-기제 비히클 및 생체활성 식품 보충제에 대한 가능한 혐오감에 대해 마우스들을 모니터링하였다. 마우스들은 아가-기제 비히클 또는 보충제를 함유하는 사료를 먹는 것에 대한 혐오감을 보이지 않았다. 생체활성 보충제가 도입되었을 때 마우스 체중은 출발점에서 유의하게 상이하지 않았다. 각각의 사료를 공급한지 4주 후, 상기 보충제를 제공받은 마우스들은 대조군 비히클을 제공받은 마우스들에 비해 통계학적으로 유의한 중량 획득을 보였다.

생체활성 식품 보충제는 점막 면역을 촉진한다.

마우스 소장 점막 면역에 대한 생체활성 식품 보충제의 효과를 시험하였다(도 2). 장은 척추동물에서 병원체가 들어가는 공통된 경로이므로, 점막은 병원체 침입을 방지하는 중요한 장벽을 형성한다. 소장에서의 림프 응집체인 페이어스 패치는 점막 장벽 기능을 위해 요구된 장내 점막 항체 분비 세포의 생성 및 고유의 미생물총의 양육을 위한 예비 부위이다. 마우스 장에서 페이어스 패치의 크기는 점막 항체 생성 및 질과 직접적으로 연관되어 있기 때문에, 본 발명자들은 7주의 지속기간 동안 생체활성 식품 보충제 또는 대조군 비히클을 제공받은 마우스에서 페이어스 패치 크기를 측정하였다. 페이어스 패치 크기를 작음, 규칙적임 또는 확장됨으로서 등급화하였고 각각의 장에 대한 평균 크기 점수를 계산하였다. 각각의 마우스 소장은 통상적으로 7개의 페이어스 패치들을 갖고, 이것은 각각의 군에서 변하지 않았다. 페이어스 패치의 평균 크기는 대조군 비히클을 제공받은 마우스에 비히 생체활성 식품 보충제를 제공받은 마우스에서 더 높았다.

생체활성 식품 보충제는 기생충 감염에 대한 내성을 증가시킨다.

천연 장내 기생충에 대한 내성에 대한 생체활성 식품 보충제의 효과를 시험하였다(도 3 및 4). 장내 기생충(연충)은 농업에서 공통된 부담이므로; 본 발명자들은 원형 연충 감염인 Hpb를 사용하여 그들의 규정식 중의 생체활성 식품 보충제를 제공받은 마우스들의 감염 민감성의 변화를 측정하였다. Hpb를 표준화된 모델에 따라 경구 투여하였고, 감염 후 2주 내지 4주에서 대변 벌레 알 카운팅을 수행함으로써 벌레 적응도(worm fitness)를 측정하였다. 생체활성 식품 보충제를 제공받은 마우스는 대조군 비히클만을 제공받은 마우스에 비해 유의하게 더 낮은 벌레 알 카운트를 가졌는데, 이것은 처리된 마우스에서의 증가된 기생충 내성을 시사한다. 감염 후 4주에서, 마우스들을 희생시키고 해부하여, 감염에 대한 숙주 민감성을 측정하기 위한 또 다른 핵심 파라미터인 장내 벌레 존재량을 측정하였다. 생체활성 식품 보충제로 처리된 마우스에서 검출된 벌레의 수는 대조군 비히클만을 제공받은 마우스에 비해 유의하게 더 낮았으므로, 생체활성 식품 보충제가 원형 장내 기생충 감염에 대한 내성을 증가시킨다는 발견을 강화하였다.

이 연구는 사육된 동물에서 성장률 및 선천성 질환 내성을 촉진할 수 있는 생체활성 사료 성분으로서 본 발명의 생체활성 식품 보충제를 사용할 잠재력을 시험하였다. 데이터는 상기 보충제가 잘 확립된 마우스 모델에서 성장 및 감염에 대한 내성 둘 다를 촉진함으로써, 개념의 첫 번째 핵심 증거를 제공한다는 것을 명확히 보여준다. 상기 보충제는 동물 소화관에서 천연 발생 생물학적 상호작용을 활용하기 때문에, 농업에서 질환 관리를 위한 현재의 약물-기반 방법에 대한 생리학적으로 및 생태학적으로 더 안전한 대안을 대표한다.

생체활성 식품 보충제를 제공받은 마우스들에서 관찰된 증가된 체중 획득은 메탄생성 고세균이 복합 식이성 탄수화물을 소화하기 위해 세균과 생화학적 공생 관계에 있음으로써, 에너지 수율을 증가시킨다는 보고와 일치한다. 데이터는 생체활성 식품 보충제가 주로 소화관 내강 및 점액에서 그의 유리한 효과를 발휘한다는 증거도 제공한다. 첫째, 증가된 체중 획득은 소화관에서의 증가된 식이성 에너지 수율로부터 비롯될 가능성이 가장 높다. 둘째, 소화관 관련 림프 조직(페이어스 패치)의 향상된 발생은 장 미세환경의 국한된 변화로부터 비롯된다. 셋째, 소화관에 위치하는 감염에 대한 증가된 내성이 관찰되었다. 상기 보충제는 숙주 조직의 대부분을 투과하는 항생제 약물과 대조적으로 동물 소화관을 표적화함으로써 함유/국한된다.

점막 장벽은 병원체 침입을 방지하는 데 있어서 중요한 역할을 수행할뿐만 아니라, 소화관을 넘어 확장하는 숙주 면역 시스템에 엄청난 영향을 미치는 고유의 미생물총의 양육에서도 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 생체활성 식품 보충제는 장 항상성을 촉진함으로써 전체 면역 시스템 적응도를 개선하여, 다양한 조직들(상피 표면, 호흡 시스템, 어류 아가미 등)에서 면역 내성을 증가시킬 수 있다는 것이 예상될 수 있다.

실시예 2

시험관내에서 병원성 비브리오들의 성장 및 생체내에서 이들 병원성 비브리오들의 병독성에 대한 본 발명의 생체활성 보충제의 효과를 평가하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 배양 의존적 방법을 이용하여 시험관내에서 3종의 선택된 병원체들에 대한 생체활성 보충제의 길항제성 활성을 평가하였고 무균 염수 새우 아르테미아(Artemia) 시스템을 이용하여 생체내에서 선택된 병원체 브이. 하르베이 BB120에 대한 고세균의 보호 효과를 평가하였다.

세균 균주 및 제조

병원성 균주 비브리오 캄프벨리이 LMG21363, 브이. 하르베이 BB120 및 브이. 파라해몰라이티커스 PV1을 시험에서 사용하였다. 모든 균주들을 20% 멸균 글리세롤을 가진 -80℃의 마린 브로쓰 2216(Difco Laboratories, Detroit, MI. USA)에서 보존하였다. 병원성 비브리오를 먼저 마린 아가(Difco Laboratories, Detroit, MI. USA) 위에서 24시간 동안 28℃에서 성장시킨 후, 연속적으로 진탕하면서 28℃에서 항온처리하여 마린 브로쓰에서 대수기까지 성장시켰다. 본 발명의 동결건조된 조성물을 10¹¹ CFU g^-1의 고세균 밀도로 제조하였다.

염수 새우 유충의 무균 부화

탈캡슐화 및 부화 후 무균 유충을 수득하였다. 요약하건대, 미국 유타주 그레이트 솔트 레이크(Great Salt Lake)로부터 유래한 2.5 g의 아르테미아 프란시스카나(Artemia franciscana) 낭포(EG Type, batch 21452, INVE Aquaculture, Dendermonde, Belgium)를 1시간 동안 89 ㎖의 증류수에서 수화시켰다. 3.3 ㎖ NaOH(32%) 및 50 ㎖ NaOCl(50%)을 사용한 탈캡슐화를 통해 멸균 낭포 및 유충을 수득하였다. 반응 동안, 0.22 ㎛ 여과된 통기를 제공하였다. 모든 조작을 층류 후드 하에서 수행하였고, 모든 도구들을 20분 동안 121℃에서 고온고압멸균하였다. 10 g/ℓ의 농도로 50 ㎖ Na₂S₂O₃을 첨가함으로써 탈캡슐화를 약 2분 후 중단시켰다. 그 다음, 통기를 종결하였고, 35 g/의 즉석 해양 합성 해수염(Aquarium Systems, Sarrebourg, France)을 함유하는 여과되고(0.2 ㎛) 고온고압멸균된 인공 해수(FAASW)를 사용하여 탈캡슐화된 낭포를 세척하였다. 그 다음, FAASW를 함유하고 통기 입구 및 출구 위에서 0.22 ㎛ 공기 여과를 제공받는 1 ℓ 유리 병에 상기 낭포를 현탁하였다. 상기 병을 28℃에서 대략 2000 lux의 일정한 조명 하에 놓았다. (유충이 세균을 섭취하기 시작하는 시간인) 단계 II에 도달하는 출현된 유충을 수집하였다.

시험관내 플레이트 어세이

각각의 병원성 비브리오의 분취액(50 ㎕)을 일반적인 성장 아가(마린 아가; MA) 및 새우 사료가 첨가된 최소 아가 위에 플레이팅하였다. 후자 아가는 멸균 전에 500 mg/ℓ 새우 사료(Crevetec PL500, Crevetec, Belgium)로 보충된 나인 솔트 아가(NSA)로 구성되었다. 플레이팅 후, 플레이트를 건조될 때까지 멸균 조건 하에서 개방된 상태로 방치하였다. 그 다음, 본 발명의 조성물을 100 mg/ℓ(= 10⁷ CFU/㎖)의 농도로 각각의 성장 배지(즉, 마린 브로쓰 또는 나인 솔트 용액)에 현탁하였고, 50 ㎕ 분취액을 아가 플레이트의 중심에 놓여있는 멸균 접종 원반 위로 옮겼다. 각각의 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 28℃에서 항온처리기 내에 넣었다. 병원성 비브리오의 성장을 48시간 동안 모니터링하였고 스폿팅된 원반 주변에서 투명 대역의 출현을 확인하였다.

각각의 접종된 아가 플레이트 위에서 병원체의 성장이 명확히 관찰될 수 있었다. 그러나, 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 플레이트들 중 어느 것도 스폿팅된 원반 주변에서 고세균에 의한 성장 억제를 표시하는 투명한 대역을 보이지 않았다.

생체내 챌린지 어세이

이 실험에서, 본 발명의 조성물의 사용에 의한 선택된 병원체 비브리오 하르베이 BB120을 사용한 챌린지에 대한 아르테미아 나우플리이의 보호를 평가하였다. 무균적으로 부화된 아르테미아를 100 ㎛ 멸균 시이브(sieve) 위에서 부화 병으로부터 채취하고 FAASW로 세척하였다. 아르테미아를, 2 아르테미아/㎖(= 튜브당 20 아르테미아 나우플리이)의 밀도로 10 ㎖의 FAASW를 함유하는 멸균 50 ㎖ 시험 튜브로 옮겼다. 고온고압멸균된 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) LVS3을 아르테미아 나우플리이를 위한 사료로서 각각의 시험 튜브에 10⁷ CFU/㎖로 첨가하였다. 어세이는 하기 처리들로 구성되었다(처리당 n = 5):

- 중성 대조군(고세균 또는 비브리오 하르베이 BB120의 첨가 없음)

- 양성 대조군(오직 고세균의 첨가)

- 음성 대조군(오직 비브리오 하르베이 BB120의 첨가)

- 시험(고세균의 첨가 + 비브리오 하르베이 BB120의 첨가)

고세균 및 병원성 비브리오 하르베이 BB120을 10⁷개 세포/㎖의 밀도(이것은 프로바이오틱의 경우 100 mg/ℓ와 동등함)로 첨가하였다. 아르테미아의 생존을 48시간 후 측정하였다. 48시간 후, TCBS 배지 위에 희석 플레이팅하고 48시간 동안 28℃에서 플레이트를 항온처리함으로써 병원성 비브리오의 수를 시험 처리(= 고세균의 첨가 + 비브리오 하르베이 BB120의 첨가)에서 확인하였다.

상이하게 처리된 아르테미아 나우플리이의 생존에 대한 고세균의 효과는 도 6에 제공되어 있다. 비챌린지된 아르테미아 나우플리이는 거의 90%의 평균 생존을 보였고, 브이. 하르베이 BB120으로 챌린지된 아르테미아 나우플리이는 평균 35%의 유의하게 더 낮은 생존을 보였다. 이들은 48시간 동안 브이. 하르베이 챌린지를 사용한 무균 아르테미아 챌린지 시스템에 대한 정상적인 결과이다. 고세균 단독의 적용은 비챌린지된 대조군보다 유의하게 더 낮은 평균 64%의 생존을 야기하였다. 고세균이 병원성 브이. 하르베이 BB120으로 챌린지된 아르테미아 나우플리이에 적용되었을 때, 생존은 병원체로 챌린지되었으나 생성물로 처리되지 않은 나우플리이에 비해 유의하게 더 높았다.

고세균을 사용한 처리에서 아르테미아 나우플리이는 비챌린지된 대조군 처리에서 아르테미아 나우플리이보다 더 활동적이고 더 큰 것으로 보인다는 것도 관찰되었다.

시험의 초기에 챌린지로서 첨가된 병원체의 밀도는 평균 7.0 x 10⁶ CFU ㎖^-1이었다(표 1 참조). 고세균만을 사용한 처리에서 비브리오의 존재는 시험의 초기 및 말기 둘 다에서 검출될 수 없었다. 시험의 말기에, 고세균이 챌린지와 함께 첨가될 때 병원체의 밀도는 평균 7.5 x 10⁶ CFU ㎖^-1이었다.

결과로부터, 고세균이 공지된 양식 병원체인 브이. 하르베이 BB120으로 챌린지된 아르테미아 나우플리이에게 유의한 보호를 제공한다는 결론을 내릴 수 있다. 시험관내 플레이트 시험에서 투명 대역의 부재 및 브이. 하르베이 BB120의 수가 생체내 챌린지 시험 동안 감소하지 않았다는 사실로 인해, 이 보호가 상기 병원체에 대한 프로바이오틱의 직접적인 항균 효과에 기인하였다는 결론을 내릴 수 없다. 그러나, 고세균에만 노출된 생체내 시험으로부터의 아르테미아는 대조군 처리(즉, LVS3만을 공급받음)로부터의 아르테미아 나우플리이보다 더 크고 더 활동적인 것으로 보인다는 것이 (정성적으로) 관찰되었다. 이것은 고세균이 발생 및 성장을 뒷받침하고, 그 결과 시험 동안 아르테미아 나우플리이의 질환 내성도 잠재적으로 뒷받침한다는 것을 시사한다.

실시예 3

물고기에서 영양, 성장, 대변 오염물질 및 소화관 마이크로바이옴(microbiome) 변화에 대한 본 발명의 생체활성 보충제의 효과를 입증하기 위해, 초식성 안시스트러스 돌리코프테러스(Ancistrus dolichopterus) 메기에 대한 여러 실험을 수행하였다.

방법

물고기:

어린 형제자매 안시스트러스 돌리코프테러스 메기(실험 시작 시 1개월령)를 사용하였다. 유충 물고기의 소화관을 먼저 그의 부모로부터 배출된 대변으로 접종하여 균질한 방식으로 물고기 장의 미생물 콜로니화를 촉진하였다. 물고기를 자율 물 여과 시스템으로 50 리터 아쿠아리움에서 유지하였다. 1 쿼터의 물을 매주 교체하였다. 물고기 건강 및 일상 행동을 주기적으로 검증하였다.

표준물 및 생체활성 사료 제조:

야채(총 습윤 중량의 75%를 차지하는, 시금치 잎, 오이, 서양호박, 녹색 완두 및 감자), 백색 대두 페이스트(15% 습윤 중량) 및 어육(10% 습윤 중량)으로 구성된 홈메이드 사료를 물고기에게 공급하였다. 이들 성분들을 잘게 다지고 혼합하여 페이스트를 형성하였고, 예열된 아가-아가를 첨가하고 철저히 혼합하였다. 최종 페이스트를 플라스틱 가방 내에 붓고 납작하게 만들고 -20℃에서 동결시켰다. 작은 조각을 절단하고 성에를 제거하고 중량을 측정하여 물고기에게 공급하였다.

생체활성 식품 보충제의 효과를 시험하기 위해, 사료의 그램당 10⁶개의 고세균 세포의 최종 농도로 저용량의 생체활성 사료 보충제를 포함하는 홈메이드 사료(저용량 보충 사료로서 지칭됨)의 회분(batch)을 제조하였다. 사료의 그램당 10⁸개의 고세균 세포의 최종 농도로 고용량의 생체활성 사료 보충제를 포함하는 홈메이드 사료(고용량 보충 사료로서 지칭됨)의 회분도 제조하였다.

유충 안시스트러스 메기를 군당 20개의 표본들을 가진 3개의 실험군으로 나누었고 다음과 같이 주당 6일 임의로 공급하였다:

1. 대조군: 생체활성 사료 보충제를 갖지 않는 표준 홈메이드 사료.

2. 저용량 보충제: 저용량의 보충제를 가진 홈메이드 사료.

3. 고용량 보충제: 고용량의 보충제를 가진 홈메이드 사료.

물고기를 4개월 3주 동안 이들 급식 조건 하에서 유지하였다.

물고기 중량 획득:

급식 실험의 1일째 날, 군당 20마리의 물고기들의 체중은 5 mg에 가까웠다. 그 후, 물고기들의 중량을 4개월 2주의 기간에 걸쳐 6개의 시점들에서 측정하였다.

사료 전환 비(FCR):

급식 실험을 시작한지 4개월 후, 3개의 실험군들 각각의 8개 표본들의 중량을 개별적으로 측정하였고 이들 표본들을 감소된 여과된 물 순환(0.5 ℓ/시)을 가진 개별 3 리터 탱크 내에 넣었다. 4일의 기간에 걸쳐, 각각의 물고기는 아침에 정확한 중량의 그의 각각의 사료를 제공받았다. 1일 사료 중량은 약 100 mg이었다. 5일째 날 아침에, 각각의 물고기의 중량을 측정하였고, 탱크의 바닥 내의 잔류 사료의 중량을 측정하였고, 대변을 채취하고 중량을 측정하였다. 1일 사료 중량을 합산한 후 잔류 사료의 중량을 공제함으로써 4일 기간 동안 총 섭취된 사료를 계산하였다. 5일째 날 아침의 물고기 중량으로부터 초기 물고기 중량을 공제함으로써 4일 기간 동안 물고기 중량 획득을 계산하였다. 4일 기간 동안 섭취된 사료의 중량을 동일한 기간에 걸친 물고기 중량 획득으로 나눔으로써 FCR을 수득하였다. USAID 기술 회보(Technical Bulletin) #07에 제시된 규칙에 따라 FCR을 계산하였다.

탱크 수질 측정:

급식 실험을 시작한지 3개월 3주 후 및 당일 급식 시간으로부터 6시간 후, 3개의 실험군들 각각의 8개 표본들을 그들의 아쿠아리움으로부터 채취하고 군당 1개 탱크씩 3개의 작은 3 리터 탱크 내에 넣었다. 3개의 군들에 걸쳐 균질한 초기 수질을 보장하기 위해 이들 3개의 탱크들을 동일한 수조로부터 나오는 깨끗한 물로 미리 채웠다. 수질 후속 분석을 위해 초기 물의 샘플을 보관하였다. 물고기는 30시간 동안 사료를 제공받지 않았다. 30시간 후, 각각의 실험군의 500 ㎖ 탱크 물을 채취하여 수질 파라미터를 측정한 반면, 물고기를 그들의 원래의 각각의 아쿠아리움에서 교체하였다. 광도계 AL450(Aqualytic) 및 각각의 키트를 사용하여 하기 물 파라미터를 측정하였다: 인산염, 아질산염, pH, 전도성. 초기 물에 대해 측정된 값을 공제한 후 최종 인산염 및 아질산염 값을 수득하였다. 실험군당 8마리의 물고기들의 중량을 측정하였고, 탱크 내의 물고기의 그램당 최종 인산염 및 아질산염 값을 제공하였다. 동일한 물고기 세트를 사용하여 7일 간격으로 이 전체 절차를 총 3회 반복하였다.

마이크로바이옴 메타바코딩(metabarcoding):

급식 실험을 시작한지 3개월 후, 대조군의 5개 표본들 및 고용량 보충 군의 5개 표본들을 물 순환 없이 깨끗한 물로 채워진 개별 3 리터 탱크 내에 넣었다. 2시간 후, 각각의 표본에 대해 개별적으로 채취된 대변을 파워소일(PowerSoil) DNA 단리 키트(MoBio)의 DNA 추출 튜브 내에 직접 넣었다. DNA 추출 후, 문헌(Takahashi et al. (PLoS One, DOI: 10.1371/journal.pone.0105592, 2014))에 의해 공개된, 프라이머 Pro341F/Pro805R(일루미나 어댑터 서열을 배제함)을 사용한 PCR로 원핵생물(세균 및 고세균) 16S 초가변 영역 V3-V4를 증폭하였다. 고순수 PCR 생성물 정제 키트(Roche)를 사용하여 10개의 PCR 생성물들을 정제하였다. TruSeq 나노(Nano) DNA 라이브러리 제조 키트(illumina)를 사용하여 10개의 샘플들 각각에 대해 라이브러리를 제조하였다. 상기 라이브러리를 실시간 정량 PCR로 정량하였고 등몰 양으로 모았다. 짝지어진-말단에 대해 MiSeq 리전트 나노(Reagent Nano) 키트 V2(500 주기)를 사용하여 MiSeq 일루미나 기계에서 실행된 2x250-bp 주기로 라이브러리의 풀을 서열분석하였다. 일루미나 실시간 분석 소프트웨어(v 1.17.28)를 이용하여 짝지어진-말단 판독물을 질에 대해 조절하였다. 베이스스페이스(BaseSpace) 일루미나 플랫폼(버전 1.0.1.0, 2016)에서 실시된 바와 같이, 일루미나의 16S 메타게노믹스(Metagenomics) 분석 파이프라인을 이용하여 조립된 판독물을 분석하였다.

결과

생체활성 보충제는 안시스트러스 메기 성장률을 향상시킨다:

소화관 마이크로바이옴은 사료 소화 및 영양분 동화에 있어서 중추적인 역할을 수행하고, 고도로 전문화된 미생물 군집은 그들의 에너지 부족 식물 규정식으로부터 영양분을 추출하기 위해 초식성 동물에서 진화하였다. 유익한 미생물을 사용한 사료의 보충은 영양분 동화를 개선할 수 있고 성장률을 증가시킬 수 있다.

생체활성 보충제를 공급받은 안시스트러스 메기는 대조군에 비해 더 높은 성장률(중량 획득으로서 표현됨)을 보였다(도 7). 그러나, 성장률의 차이는 대조군과 고용량 보충 사료 사이에서만 유의하다. 따라서, 영양 및 성장 반응은 사료 중의 보충제의 용량에 의해 좌우된다.

생체활성 보충제는 안시스트러스 메기에서 사료 전환 비를 개선한다:

유익한 미생물의 첨가에 의한 소화관 마이크로바이옴의 기능 개선은 성장 기간 동안 가속화된 성장 및 중량 획득을 유발할 수 있다. 사료 질량을 체중 증가로 전환시키는 효율을 측정하는 사료 전환 비(FCR)를 4일의 급식 기간에 걸쳐 실험군당 8개의 표본들에 대해 계산하였다(표 2). FCR 값은 대조군의 경우 24 내지 207이었고 저용량 보충 사료의 경우 19.9 내지 196.7이었고 고용량 보충 사료의 경우 6.5 내지 139이었다. 안시스트러스 메기가 특히 그의 고도로 발달된 강한 골격 및 그의 초식성 식습관으로 인해 느리게 성장하기 때문에, 이들 값들은 고도 생산성 사육된 물고기에 비해 상대적으로 상승된다. FCR 결과는 대조군에 비해 고용량 보충 사료를 공급받은 물고기에서 유의한 증가를 표시한다(t-검정, 양측: t-stat = 2.4178, df = 9.69, P = 0.0369). 대조군에 비해 저용량 보충 사료를 공급받은 물고기에서도 약간의 FCR 증가가 관찰되었다(t-검정, 양측: t-stat = 1.575, df = 12, P = 0.141). 따라서, 안시스트러스 메기의 FCR 개선은 고세균을 포함하는 생체활성 보충제의 용량에 의해 좌우되고, 고용량 보충 사료만이 대조군에 비해 유의한 개선을 보였다.

생체활성 보충제는 안시스트러스 메기에서 대변의 양을 감소시킨다:

사료 생체활성 보충제에 의해 유발된 개선된 소화 및 영양분 동화는 섭취된 사료의 중량당 생성된 대변의 중량을 감소시킬 것으로 예상된다. FCR의 계산을 위한 데이터와 동일한 데이터를 사용하고 실험의 5일째 날 생성된 대변의 중량을 측정함으로써, 소화된 사료의 중량당 대변 중량의 비를 계산하였다(표 3). 결과는 생체활성 보충제를 공급받은 물고기가 대조군보다 더 적은 양의 대변을 생성한다는 것을 보여준다. 독립적인 샘플들의 T-검정은 저용량 보충 사료 및 고용량 보충 사료 둘 다가 섭취된 사료의 중량당 대변의 중량을 유의하게 감소시켰다는 것을 표시한다(저용량: t-stat = 2.227, df = 12, P = 0.023; 고용량: t-stat = 3.761, df = 12, P = 0.0014). 이 결과는 생체활성 보충제가 대변 양의 단순한 감소로 인해 대변 오염물질의 양을 감소시킬 가능성이 있다는 것을 암시한다.

생체활성 보충제는 안시스트러스 메기 폐기물 오염물질을 감소시킨다:

동물 대변은 아질산염 및 인산염 오염물질의 공급원이다. 다량의 아질산염 및 인산염의 존재는 환경에 유해한 영향을 미치면서 폐수 오염을 표시한다. 대변에서 오염물질의 감소에 대한 생체활성 보충제의 효과를 초식성 메기 안시스트러스 돌리코프테러스에 대해 시험하였다. 수질 파라미터의 측정 결과(도 8)는 인산염 및 아질산염의 농도가 대조군 물고기를 함유하는 탱크의 물에 비해 생체활성 보충제(고용량 보충 사료 또는 저용량 보충 사료)를 공급받은 물고기를 함유하는 탱크의 물에서 유의하게 더 낮았다는 것을 표시한다(2개의 독립적인 샘플들의 t-검정: 대조군 대 저용량 보충 사료에서의 인산염, t-stat = 6.478, df = 2, P = 0.0115; 대조군 대 고용량 보충 사료에서의 인산염, t-stat = 6.298, df = 2, P = 0.012; 대조군 대 저용량 보충 사료에서의 아질산염, t-stat = 24.779, df = 2, P = 0.0008; 대조군 대 고용량 보충 사료에서의 아질산염, t-stat = 29.86, df = 2, P = 0.0006). 생체활성 사료 보충제의 두 실험 용량들(고용량 또는 저용량 실험 사료) 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.

출발 물 pH는 7.76 내지 7.91이었다. 실험의 말기에, 대조군에서의 물 pH는 7.57 내지 7.67의 범위 내에 있었지만, 저용량 보충 사료 및 고용량 보충 사료에서 물 pH는 7.59 내지 7.85의 범위 내에 있었다. 실험의 말기에, 물 전도성(μS/cm)은 저용량 보충 사료를 공급받은 군(275-277 μS/cm) 또는 고용량 보충 사료를 공급받은 군(270-274 μS/cm)에 비해 대조군(280-283 μS/cm)에서 더 높았다. 이들 결과는 생체활성 보충제를 공급받은 물고기에 비해 대조군에서 약간의 물 산성화 및 증가된 전도성을 표시한다.

생체활성 보충제는 안시스트러스 메기의 마이크로바이옴을 변화시킨다:

이 실험의 목적은 새로 채취된 대변에서 측정될 때 안시트러스 돌리코프테러스 메기에서 생체활성 프로바이오틱 x에 의해 유도된 미생물총 변화를 특징규명하는 것이다. 대조군의 5개 표본들 및 고용량 보충 사료 군의 5개 표본들의 대변을 새로 채취하였고 이들의 마이크로바이옴을 메타바코딩하였다. 고품질 짝지어진-말단 판독물의 수는 표본당 48'500 내지 57'200이었다. 메타바코드 분석의 결과는 마이크로바이옴이 대조군에 비해 생체활성 보충제를 공급받은 물고기에서 현저히 변경되어 있음을 표시한다. 이것은 표 4에서 제공된, 대조군 대 고용량 보충 사료 군에서 6개의 보다 더 풍부한 클래스의 세균들의 유의한 빈도 변화에서 관찰될 수 있다(대조군과 고용량 군 사이의 다변량 분산 분석(MANOVA) 검정: Pillai Trace t-stat = 0.984, F = 29.98, df1 = 6, df2 = 3, P = 0.009). 마이크로바이옴 변경은 샘플에서 발견된 세균 및 고세균 속의 다양성에 의해서도 인식될 수 있는데, 이 다양성은 고용량 보충 사료 군(범위: 샘플당 179개 내지 267개 속)보다 대조군(범위: 샘플당 246개 내지 313개 속)에서 더 높다. 일원(단일 인자) ANOVA 분석은 이 차이가 유의하다는 것을 표시한다(군 내에서 SS = 7272, df = 8, MS = 909; 군들 사이에서 SS = 10112.4, df = 1, MS = 10112.4, F = 11.125, P = 0.0103). 또 다른 중요한 차이점은 생체활성 보충제를 구성하는 고세균 종이 대조군의 물고기의 마이크로바이옴(모든 배정된 판독물의 0% 내지 0.004%)에 비해 고용량 보충 사료 군의 물고기의 마이크로바이옴에서 더 높은 존재도(모든 배정된 판독물의 0.005% 내지 0.225%)로 체계적으로 존재한다는 점이다. t-검정에 따라, 이 차이는 유의하다(t-stat = 2.532, df = 7, P = 0.019).

실시예에서 입증된 보충제의 유리한 성질에 비추어 볼 때, 생체활성 식품 보충제의 사용이 특히 면역 시스템 및 소화 능력에 대한 이익뿐만 아니라, 특히 동물 사육으로부터 비롯된 중요한 오염물질인 질산염 함량에 대한 대변 폐기물 질의 개선의 관점에서 사육된 동물에 영향을 미칠 수 있다고 주장할 수 있다.

Claims (20)

1. 적어도 하나의 고세균(Archaebacteria) 종의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 사료에서 사용하기 위한 생체활성 식품 보충제.
2. 청구항 1에 있어서,
   동물 사육 사료에서 사용하기 위한 생체활성 식품 보충제.
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
   상기 적어도 하나의 고세균 종은 메탄생성 고세균 종인 생체활성 식품 보충제.
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 메탄생성 고세균 종은 메타노스패라 스타츠마내(Methanosphaera stadtmanae) 종 또는 메타노브레비박터 스미씨이(Methanobrevibacter smithii) 종인 생체활성 식품 보충제.
5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 하나의 항에 있어서,
   추가로 표준 사육 조건에 비해 동물 성장률을 증가시키고/시키거나, 기생충 감염에 대한 동물 민감성을 감소시키고/시키거나, 환경에 대한 동물 대변 폐기물의 영향을 개선하는 것을 특징으로 하는 생체활성 식품 보충제.
6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 하나의 항에 있어서,
   추가로 고세균 종이 실질적으로 풍부함을 특징으로 하는 생체활성 식품 보충제.
7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 하나의 항에서 정의된 생체활성 식품 보충제를 포함하는 조성물.
8. 청구항 7에 있어서,
   조성물의 그램당 약 10⁵개 내지 약 10⁸개 사이의 고세균 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,
   고체 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 청구항 7 내지 청구항 9 중 어느 하나의 항의 조성물의 제조 방법으로서,
    · 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단을 수득하는 단계; 및
    · 상기 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단을 담체와 혼합하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 청구항 10에 있어서,
    상기 담체는 수성 용액, 오일, 고세균 배양 배지 및/또는 반추위액을 포함하거나 이들로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 청구항 10 또는 청구항 11에 있어서,
    상기 담체는 액체 담체이고,
    · 1% w/v 내지 10% w/v 사이의 증점제를 상기 액체 담체 및 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단을 포함하는 액체 조성물에 첨가하는 단계;
    · 상기 액체 조성물을 혼합하여 증점된 용액을 수득하는 단계; 및
    · 상기 증점된 용액을 건조하여 고체 조성물을 수득하는 단계
    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 청구항 10 내지 청구항 12 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 증점제는 당, 전분 및/또는 젤라틴인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 청구항 10 내지 청구항 13 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 고세균 종의 적어도 하나의 집단은 반추위 추출물로부터의 단리에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 청구항 10 내지 청구항 14 중 어느 하나의 항의 방법을 통해 수득된 동물 사료, 특히 동물 사육 사료로서 사용하기 위한 조성물.
16. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 하나의 항의 생체활성 식품 보충제 또는 청구항 7 내지 청구항 9 및 청구항 14 중 어느 하나의 항의 조성물을 동물에게 제공하는 단계를 포함하는 동물의 성장률을 증가시키는 방법.
17. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 하나의 항의 생체활성 식품 보충제 또는 청구항 7 내지 청구항 9 및 청구항 14 중 어느 하나의 항의 조성물을 동물에게 제공하는 단계를 포함하는 동물의 기생충 감염에 대한 민감성을 감소시키는 방법.
18. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 하나의 항의 생체활성 식품 보충제 또는 청구항 7 내지 청구항 9 및 청구항 14 중 어느 하나의 항의 조성물을 동물에게 제공하는 단계를 포함하는 환경에 대한 동물 대변 폐기물의 영향을 개선하는 방법.
19. 동물 사료, 특히 동물 사육 사료에서 사용하기 위한는 생체활성 식품 보충제의 제조에 사용하기 위한 메타노스패라 스타츠마내 고세균 종 또는 메타노브레비박터 스미씨이 고세균 종의 집단.
20. 청구항 1 내지 청구항 9, 청구항 14 및 청구항 16 내지 청구항 19 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 동물은 조류, 포유동물 또는 수생 동물인 생체활성 식품 보충제, 조성물, 방법 또는 집단.

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