CN104774776A - 一株耐高温高湿的布拉迪酵母菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐高温高湿的布拉迪酵母菌及其应用，属于微生物领域。本发明的耐高温高湿的布拉迪酵母菌(Saccharomyces boulardii)，其保藏编号为CGMCC No.10381，所述布拉迪酵母菌其株增殖速度、最大生物量(即菌体最终密度)都显著高于同类酿酒酵母菌株，并且具有很强的耐高温耐湿的能力，使本发明的布拉迪酵母可以作为饲料添加剂，并在进行高温高湿处理过程中保存较高的活性。本发明的布拉迪酵母菌微胶囊可提高肉鸡的日增重、免疫器官指数、疾病抵抗力、抗氧化性、免疫球蛋白，并且对畜禽均无毒副作用，且来源广，价格便宜可作为饲料添加剂替代抗生素使用。
Description
技术领域
本发明涉及一株耐高温高湿的布拉迪酵母菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术
布拉迪酵母菌，又称布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)属于酿酒酵母的一个亚种，其没有病原性，能在37℃高温下良好生长，并具有独特的生物活性。布拉迪酵母菌能够有效地治疗人和动物的各种腹泻，且未发现不良反应。布拉迪酵母菌进入人和动物肠道后，不仅可以降解致病菌产生的毒素和中和细菌毒素，还能够刺激肠道黏膜从而增强免疫功能，同时调节肠道内微生态环境的平衡，阻止病原菌的侵袭，且布拉迪酵母菌制剂属于天然微生态制剂，不仅无毒副作用，还可以提供一定的营养物质。因此，布拉迪酵母菌在畜牧业上的应用越来越广泛。
布拉迪酵母菌作为益生菌中唯一的真菌，对提高畜禽生长性能有显著效果，可用于改善单胃动物营养和健康的饲料添加剂。但是布拉迪酵母菌在生长过程中，不形成芽胞，抗逆性较差，在液体条件下难以长期保存。在体内，作为外源菌，受胃肠道环境影响较大，容易丢失活性，从而失去其益生功效。
中国专利文献CN 104388325A公开了一株饲用布拉氏酵母，命名为：布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)SH94，保藏号为CCTCC No：M 2014211。上述布拉氏酵母从华中农业大学果园根际土壤中分离，并应用于制备仔猪饲料添加剂。所述布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)SH94具有较强的耐胃液肠液的能力，但是其在40℃处理6h，存活率达到60％，在70℃处理2min及在80℃处理30s后，存活率维持在60％，该菌株具有一定的耐热能力，但是耐热性不是很强。在实际应用中，布拉氏酵母产品在添加使用于配合颗粒饲料时，往往要经过高温高湿的制粒处理，此过程中布拉氏酵母活性会大量的丧失，会导致产品中有效成分损失较大，产品的保质期也较短，限制了其大规模应用。
发明内容
为此，本发明针对于现有技术中布拉迪酵母菌在添加入饲料时高温高湿处理过程中活性降低的问题，提供一株耐高温高湿的布拉迪酵母菌。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一株耐高温高湿的布拉迪酵母菌(Saccharomyces boulardii)，其保藏编号为CGMCC No.10381，该菌株已于2015年1月21日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述耐高温高湿的布拉迪酵母菌(Saccharomyces boulardii)通过以下方法分离筛选得到：
将荔枝皮粉碎，并将一定量荔枝皮粉碎物在含有50μg/mL氨苄青霉素的(YPD)液体培养基中28℃好氧培养至培养基呈混浊状态，取适当培养及稀释后涂平板，根据菌落形态挑取典型酵母菌单菌落(白色，大小1-2mm，湿润隆起，有酒香味)，通过镜检粗筛出酵母菌。通过生理生化、16S rDNA测序分析，最终筛选到一株布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)。该菌株已于2015年1月21日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。其保藏编号为CGMCC No.10381，建议的分类名为布拉迪酵母菌(Saccharomyces boulardii)。
该菌株具体有典型的布拉氏酵母形态特征：该菌株在YPD琼脂糖固体培养基上繁殖形成的菌落为圆形，大而湿润，呈乳白色，光滑，边缘清晰，生长迅速；镜检显示细胞个体较大，呈近球形，多边芽殖。
生理生化特征：发酵葡萄糖。耐热能力实验结果显示布拉迪酵母菌在100％湿度、75℃和85℃下处理1min(图4)后，菌粉产品在100％湿度75℃和85℃处理1min存活率分别可达58.4％和57.9％。在110℃和130℃高温下分别处理30s、45s和60s，结果表明，该布拉迪酵母菌存活率保持在64-83％(图4B)。耐人工胃液和肠液能力实验结果显示布拉迪酵母菌在pH2.0的人工合成胃液中处理30min、90min和180min后存活率降至29.1％、23.5％和18.2％(5A)。在模拟肠液中处理30min、90min和180min后，布拉迪酵母菌存活率降至80.61％、65.42％和41.68％。以上生理生活化结果表明，该布拉迪酵母菌具有很好的高温高湿耐受力和较高的肠环境耐受力。但胃环境耐受力较弱。
一种布拉迪酵母菌添加剂，含有上述的布拉迪酵母菌。
上述布拉迪酵母菌添加剂中，含有上述布拉迪酵母菌的微胶囊。
上述布拉迪酵母菌添加剂中，所述布拉迪酵母菌的微胶囊的制备方法包括步骤如下：
(1)将布拉迪酵母菌菌液加入到海藻酸钠-碳酸钙溶液中，得到浓度为1×106cfu/mL菌液作为水相；将表面活性剂Span80分散于液体石蜡中作为油相，往油相中加入水相，以400rpm搅拌5min形成稳定的乳化液；向其中加入冰醋酸酸解碳酸钙解离出Ca2+，与海藻酸钠产生凝胶化反应，形成海藻酸钙微胶囊，固定化时间为10min；最后去离子水多次冲洗，通过分液漏斗分离沉降海藻酸钙微胶囊；
(2)将海藻酸钙微胶囊加入到培养基中，培养微胶囊化的布拉迪酵母菌至菌体充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离得到微胶囊。
一种布拉迪酵母菌微胶囊培养方法，将上述的布拉迪酵母菌包于微胶囊中，然后在YPD培养基中，28℃下，好氧培养微胶囊化的布拉迪酵母菌。
上述述的耐高温高湿的布拉迪酵母菌或上述布拉迪酵母菌添加剂在制备动物饲料添加剂中的用途。
上述用途中，所述动物为肉鸡。
上述耐高温高湿的布拉迪酵母菌或上述布拉迪酵母菌添加剂在家禽饲养中作为抗生素使用的用途。
上述的耐高温高湿的布拉迪酵母菌或上述布拉迪酵母菌添加剂在制备抗生素药物中的用途。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明的保藏编号为CGMCC No.10381的布拉迪酵母(Saccharomycesboulardii)具有较高的活性，其株增殖速度、最大生物量(即菌体最终密度)都显著高于同类酿酒酵母菌株，并且具有很强的耐高温耐湿的能力：本发明的布拉迪酵母菌在100％湿度75℃和85℃处理1min存活率分别可达58.4％和57.9％；在110℃和130℃高温下分别处理30s、45s和60s，存活率保持在64-83％，上述耐高温耐湿的能力使本发明的布拉迪酵母作为饲料添加剂在进行高温高湿处理过程中保存较高的活性。
2、本发明的布拉迪酵母菌添加剂含有布拉迪酵母菌的微胶囊，为了提高本申请的布拉迪酵母的胃肠环境能力耐受性，将布拉迪酵母菌进行微囊化，提供了布拉迪酵母菌微胶囊，所述布拉迪酵母菌微胶囊：(1)将布拉迪酵母菌通过微囊化转变成一种稳定的细粉颗粒，改变微生态制剂产品的形态，这种微胶囊产品具有良好的流动性和分散性，很容易与其它饲料混合均匀，便于运输、贮存和添加使用；(2)微胶囊化后的酵母菌耐酸性和热稳定性得到提高，由于微胶囊的保护，能够有效地防止菌体失活，提高布拉迪酵母菌产品的稳定性。在体内，还能防止胃液的破坏，从而使尽可能多的菌体到达肠道，真正起到保健和治疗的作用；(3)可将配伍禁忌的各种成分在同一产品中隔开。(4)使不溶于水的物质能均匀地分散在水溶性介质中。本发明的微胶囊对畜禽均无毒副作用，且来源广，价格便宜可作为饲料添加剂替代抗生素使用，可提高肉鸡的日增重、免疫器官指数、疾病抵抗力、抗氧化性、免疫球蛋白。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本文公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1布拉迪酵母与普通酿酒酵母生长曲线，每隔2h测定菌体密度(n＝3，*P<0.05)。
图2微囊化和游离布拉迪酵母生长曲线，每隔2h测定菌体密度(n＝3，*P<0.05)。
图3微囊化布拉迪酵母发酵前后对比。
图4微囊化和游离布拉迪酵母在高温高湿条件下存活率。(n＝3，*P<0.05，**P<0.01)。
图5微囊化和游离布拉迪酵母菌在模拟胃液和肠液中存活率。(n＝3，*P<0.05，**P<0.01)。
具体实施方式
实施例1：微囊化布拉迪酵母菌及其生长曲线
一、方法：
1.生长活性比较：
本发明布拉迪酵母为一种酿酒酵母，将之与普通酿酒酵母((Saccharomyces cerevisiae)，购于ATCC)进行生长活性对比。
方法如下：将活化两代的待测菌株以1％的接种量(约2×106cfu/mL)接种于装有100mLYPD培养基的300mL三角瓶中，28℃，180rpm培养，每2小时取样，测定600nm处吸光值。以培养时间为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制生长曲线。
为了提高本申请的布拉迪酵母的胃肠环境能力耐受性，将布拉迪酵母菌进行微囊化，制备布拉迪酵母菌微胶囊。
其中，布拉迪酵母菌微胶囊的制备方法如下：
按与海藻酸钠一定的质量比(1：1.5)，称取碳酸钙，分散于少量蒸馏水中，然后加入一定浓度完全溶解的海藻酸钠溶液(海藻酸钠浓度为1-2g/L)，搅拌均匀，并加入布拉迪酵母菌菌液，使其初始接种浓度为1×106cfu/mL，作为水相；表面活性剂Span80充分分散于液体石蜡中作为油相，按一定水油两相体积比值(1：5-6)，往油相中加入水相，以400rpm搅拌5min形成稳定的乳化液；向其中加入冰醋酸酸解碳酸钙解离出Ca2+，与海藻酸钠产生凝胶化反应，形成海藻酸钙微胶囊，固定化时间为10min；最后去离子水多次冲洗，通过分液漏斗分离沉降海藻酸钙微胶囊，将适于微胶囊产品加入到YPD培养基中，培养微胶囊化的微生物至微生物细胞充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离得到湿微胶囊产品。
微囊化酵母菌生长曲线测定：根据OD600调整相同菌体密度的游离(未包被)和微囊化酿酒酵母转移到YPD液体培养基中，28℃，180rpm好氧培养14h；每个处理三个平行。每隔2h测定其OD600值，对于微囊化包埋和游离培养的酵母菌，分别以空胶囊和空白培养基作为空白对照。最后用紫外分光光度计测定其OD600值。
二、结果
结果如图1所示。本申请所筛得布拉迪酵母菌株增殖速度、最大生物量(即菌体最终密度)都显著高于同类菌株。
微囊化布拉迪酵母菌经发酵培养后，得到产品活菌数分别大5.5×1010cfu/g。图2显示的是游离和微囊化布拉迪酵母菌生长曲线图，布拉迪酵母经微囊化和游离培养两种方式进入生长稳定期时间分别是7h和6h(图2)，在第0和2h，布拉迪酵母在微囊化和游离两种方式下，菌体生长密度差异不显著(P>0.05)，但在第4h起，微囊化布拉迪酵母的菌体密度显著高于游离培养酿酒酵母(P<0.05)，酿酒酵母经微囊化后最高菌体密度是游离培养的1.76倍。
图3显示的是微囊化布拉迪酵母发酵前与发酵后的形态及其粒径分布图。由图可见，微囊化布拉迪酵母的粒径大小较均匀，球形度好，能隐约看到有菌体在微胶囊中分布；经发酵培养后菌体长满了微胶囊，菌体密度很大。微囊化布拉迪酵母发酵前表面结构平滑，而经发酵培养以后，微生物在微胶囊表面各部位挤压空间大量繁殖，尽管两者均有轻微膨胀，但都没发现破囊现象。
实施例2体外评价实验
一.方法
1)微囊化布拉迪酵母及其培养方法同上。
2)体外评价实验
①在恒温干燥箱中对微囊化布拉迪酵母菌进行高温耐受性评价，1g微囊化布拉迪酵母菌在110℃和130℃下分别处理30s、45s和60s，以未包被布拉迪酵母菌菌粉作为对照。此外，微囊化布拉迪酵母菌和布拉迪酵母菌菌粉在100％湿度，75℃和85℃条件下处理1min。微囊化布拉迪酵母菌需经破囊后通过梯度稀释平板倾注法进行活菌计数，酿酒酵母和屎肠球菌分别于YPD和MRS琼脂培养基培养48h，统计活菌数，每个处理做三个重复。
②模拟胃液耐受性实验，将0.5g微囊化布拉迪酵母菌和布拉迪酵母菌菌粉两种样品转移到预热的装有4.5mL模拟胃液试管中，37℃80rpm处理0min、30min、90min和180min。结束后加入破囊液中和pH值同时释放布拉迪酵母菌，梯度稀释，倾注法进行活菌计数，每个处理三个重复。
③模拟肠液耐受性实验，将0.5g微囊化布拉迪酵母菌和布拉迪酵母菌菌粉两种样品转移到预热装有4.5mL模拟肠液的试管中，37℃80rpm处理0min、30min、90min和180min。结束后加入破囊液中和pH值同时释放益生菌并进行活菌计数，梯度稀释，倾注法进行活菌计数，每个处理三个重复。
人工胃液的配制方法：在16.4mL质量分数为0.1kg/L的盐酸中加入蒸馏水调节pH至2.0。每100mL溶液中加入1g胃蛋白酶，待其充分溶解后，用0.22um的微孔滤膜除菌。
人工肠液的配制方法：取6.8gKH2PO4于500mL蒸馏水中溶解，以质量分数4g/LNaOH缓冲液调节溶液pH值至6.8，定容至1000mL。每100mL溶液中加入1g胰蛋白酶，待其充分溶解后，用0.22um的微孔滤膜除菌。
二.结果
布拉迪酵母菌粉及微囊化布拉迪酵母菌在100％湿度、75℃和85℃下处理1min(图4)后，菌粉产品在100％湿度75℃和85℃处理1min存活率分别下降了41.6％和42.1％。而微囊化的酿酒酵母仅分别下降了12.3％和16.5％。相比菌粉，微囊化后的酵母存活率分别提高了29.2％和25.3％(P<0.01)(图4A)。在110℃和130℃高温下分别处理30s、45s和60s，结果表明：随着温度升高和处理时间延长，存活率逐渐下降，在110℃下处理30s，130℃分别处理30s、微囊化的布拉迪酵母存活率显著高于菌粉(P<0.05)，在130℃分别处理45s和60s后都极显著高于未包的菌粉(P<0.01)，存活率保持在80-90％(图4B)。
图5显示的是微囊化布拉迪酵母及菌粉在模拟胃肠液中的耐受性评价。酵母菌粉在模拟胃液处理30min、90min和180min后存活率降至29.1％、23.5％和18.2％(图5A)。经微胶囊包埋后存活率分别为89.1％、82.1％和74.6％，这意味着微胶囊包埋后，存活率分别提高了60.4％、59.2％和56.7％(P<0.01)。在模拟肠液中也得到相似的结果，微囊化后布拉迪酵母在模拟肠液中处理30min、90min和180min后，相比菌粉存活率分别提高了16.1％、15.4％和25.6％(P<0.01)(图5B)，这说明布拉迪酵母难以在低pH值和高胆盐浓度下存活，而微胶囊包埋具有良好的保护作用，可以提高其通过胃肠道后的存活率。
实施例3：肉鸡饲养试验
一、方法：
试验动物：1日龄AA肉鸡公雏，随机选取400只，随机分成4个处理组，每组5个重复，每个重复20只鸡。试验日粮分别为：A.空白对照组(基础日粮组)；B.基础日粮+1g抗生素(Aureomycin)/kg日粮；C基础日粮+108cfu微囊化布拉迪酵母菌/kg日粮。试验期为42d，1-21d为试验前期，22-42d为试验后期，基础日粮为玉米-豆粕型，参照中国肉鸡饲养标准(2004)分2阶段配制。
生长性能
分别于试验的第1天、第21天、第42天以各重复为单位空腹称重，记录试验前期和试验后期的耗料量和死淘数，计算试验前期、试验后期和试验全期各重复的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。
免疫器官指数
分别于21、42日龄，从每个重复抽取3只与平均体重相近的试验鸡，称重后颈部放血屠宰，取脾脏和法氏囊，并称重，计算免疫器官指数；免疫器官相对重量＝免疫器官重量/活体重量×100％
抗氧化能力
分别于21、42日龄，从每个重复抽取3只与平均体重相近的试验鸡，颈部采血，3000rpm离心10min后分离得到血清，参考南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定方法测定第21日龄和42日龄收集的血清中总超氧化物歧化酶(Total Superoxide dismutase，T-SOD)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量。
二、结果
由表1可见：实验前期(1-21天)，微胶囊组和抗生素组日增重显著高于对照组，其他无显著差别。证明微囊化布拉迪酵母菌在提高肉鸡日增重方面可替代抗生素。
表1 微囊化布拉迪酵母菌对肉鸡日增重、采食量及饲料转化率的影响(n＝15)
注：同一行数值上标有不同字母者表示各处理组之间差异显著(P<0.05)。
由2可见：整个饲养过程，微胶囊组脾脏指数和法氏囊免疫器官指数均显著高于对照组，法氏囊免疫器官指数甚至显著高于和抗生素组，其他无显著差别。证明微囊化布拉迪酵母菌在提高肉鸡免疫器官指数，抵抗疾病方面可替代甚至优于抗生素。
表2 微囊化布拉迪酵母菌对肉鸡免疫器官指数的影响g/kg(n＝15)
注：同一行数值上标有不同字母者表示各处理组之间差异显著(P<0.05)。
由表3可见：整个饲养过程，微胶囊组和抗生素组肉鸡血清中总超氧化物歧化酶及过氧化氢酶含量均高于对照组，其中微胶囊组氧化氢酶含量甚至高于抗生素组。证明微囊化布拉迪酵母菌在提高肉鸡抗氧化性能方面，可替代甚至优于抗生素。
表3 微囊化布拉迪酵母菌对肉鸡抗氧化性能的影响(n＝15)
注：同一行数值上标有不同字母者表示各处理组之间差异显著(P<0.05)。
由表4可见，微胶囊组肉鸡免疫球蛋白M和G均显著高于对照组，抗生素组也高于对照组，但差异不显著，且低于微胶囊组。证明微囊化布拉迪酵母菌在提高肉鸡免疫球蛋白方面，可替代甚至优于抗生素。
表4 微囊化布拉迪酵母菌对肉鸡血清免疫球蛋白的影响(n＝15)
注：同一行数值上标有不同字母者表示各处理组之间差异显著(P<0.05)。
上述结果表明，微囊化布拉迪酵母菌作为一种饲用益生菌，完全可以在肉鸡饲养过程中替代抗生素使用，其效果甚至优于抗生素。
Claims (9)
1.一株耐高温高湿的布拉迪酵母菌(Saccharomyces boulardii)，其保藏编号为CGMCC No.10381。
2.一种布拉迪酵母菌添加剂，其特征在于，含有权利要求1所述的布拉迪酵母菌。
3.根据权利要求2的布拉迪酵母菌添加剂，其特征在于，含有权利要求1所述的布拉迪酵母菌的微胶囊。
4.根据权利要求3所述的布拉迪酵母菌添加剂，其特征在于，所述布拉迪酵母菌的微胶囊的制备方法包括步骤如下：
(1)将布拉迪酵母菌菌液加入到海藻酸钠-碳酸钙溶液中，得到浓度为1×106cfu/mL菌液作为水相；将表面活性剂Span80分散于液体石蜡中作为油相，往油相中加入水相，以400rpm搅拌5min形成稳定的乳化液；向其中加入冰醋酸酸解碳酸钙解离出Ca2+，与海藻酸钠产生凝胶化反应，形成海藻酸钙微胶囊，固定化时间为10min；最后去离子水多次冲洗，通过分液漏斗分离沉降海藻酸钙微胶囊；
(2)将海藻酸钙微胶囊加入到培养基中，培养微胶囊化的布拉迪酵母菌至菌体充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离得到微胶囊。
5.一种布拉迪酵母菌微胶囊培养方法，其特征在于，将权利要求1所述的布拉迪酵母菌包于微胶囊中，然后在YPD培养基中，28℃下，好氧培养微胶囊化的布拉迪酵母菌。
6.权利要求1所述的耐高温高湿的布拉迪酵母菌或权利要求2-4任一项所述布拉迪酵母菌添加剂在制备动物饲料添加剂中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述动物为肉鸡。
8.权利要求1所述的耐高温高湿的布拉迪酵母菌或权利要求2-4任一项所述布拉迪酵母菌添加剂在家禽饲养中作为抗生素使用的用途。
9.权利要求1所述的耐高温高湿的布拉迪酵母菌或权利要求2-4任一项所述布拉迪酵母菌添加剂在制备抗生素药物中的用途。
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