CN111647541A - 丁酸梭菌活菌制剂及其生产方法、动物饲料添加剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种丁酸梭菌活菌制剂及其生产方法、动物饲料添加剂，丁酸梭菌活菌制剂生产方法包括以下步骤:培养基配制步骤、种子液配制步骤和发酵步骤，培养基配制步骤中的固态发酵培养基配制步骤中的固态发酵培养基包括蜂花粉；种子液配制步骤包括将经活化处理的丁酸梭菌菌种接入种子培养基配制步骤得到的种子培养基中,得到种子液；发酵步骤包括将上述步骤得到的种子液接入固态发酵培养基配制步骤得到的固态发酵培养基中,发酵完成后,将固态培养基粉碎得到丁酸梭菌活菌制剂，丁酸梭菌在固态发酵和蜂花粉的抗氧化性的共同作用下，芽孢转化率高，动物食用由蜂花粉固态发酵的丁酸梭菌后，能够提高动物生长性能。

Description

丁酸梭菌活菌制剂及其生产方法、动物饲料添加剂

技术领域

本发明涉及丁酸梭菌发酵工艺领域，具体是涉及一种丁酸梭菌活菌制剂及其生产方法、动物饲料添加剂。

背景技术

丁酸梭菌是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，能在动物肠道内定植，并产生以丁酸等短链脂肪酸为主的益生产物，自从2003年欧盟批准丁酸梭菌用作肉鸡和断奶仔猪的饲料添加剂以来，目前已逐步推广作为益生菌类饲料添加剂使用。大量研究结果表明，丁酸梭菌能够产生丰富的淀粉酶、B组维生素等，促进消化吸收；同时丁酸梭菌能够抑制有害菌生长并促进有益菌增殖，调节肠道菌群失调；丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸能够促进肠道上皮细胞的再生和修复；饲喂丁酸梭菌后动物的生长性能明显提高，饲料消化率升高。

目前，丁酸梭菌生产工艺主要有液体发酵和固体发酵，液体发酵大都采用酵母膏、蛋白胨等培养基，如中国发明专利CN201611253561.8公开一种液态丁酸梭菌发酵培养基，其中发酵培养基包括以下组分：胰蛋白胨、鱼粉、酵母膏、葡萄糖、淀粉、氯化钠、乙酸钠等。固体发酵采用麸皮、豆粕或中药作为主要发酵底物，如中国发明专利CN201711428535.9公开一种丁酸梭菌发酵产物以及丁酸梭菌固态发酵方法，其中将粉碎后的麸皮、豆粕以及玉米粉过筛后得到的混合物再与其他物质混合进行发酵。中国发明专利CN201710559452.8公开一种饲用丁酸梭菌、促进畜禽生长的微生态制剂及其制备方法，其中发酵底物基质组分包括粉状太子参须提取物、山楂、陈皮、六神曲、紫苏叶等。

但是包括上述发酵底物的发酵培养基中底物的还原能力较差，以至于在该发酵培养基中发酵的丁酸梭菌的活性较差，食用该种丁酸梭菌的畜禽最终的生长性能不满足现市场的需求。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种底物还原能力强的丁酸梭菌活菌制剂的生产方法。

本发明的第二目的是提供一种由上述生产方法生产得到的丁酸梭菌活菌制剂。

本发明的第三目的是提供一种含有上述丁酸梭菌活菌制剂的动物饲料添加剂。

为了实现上述的第一目的，本发明提供的丁酸梭菌活菌制剂的生产方法包括以下步骤:培养基配制步骤、种子液配制步骤和发酵步骤，培养基配制步骤包括种子培养基配制步骤和固态发酵培养基配制步骤,所述固态发酵培养基配制步骤中的固态发酵培养基包括蜂花粉；种子液配制步骤包括将经活化处理的丁酸梭菌菌种接入所述种子培养基配制步骤得到的种子培养基中,得到种子液；发酵步骤包括将上述步骤得到的所述种子液接入所述固态发酵培养基配制步骤得到的固态发酵培养基中,发酵完成后,将所述固态培养基粉碎得到所述丁酸梭菌活菌制剂。

由此可见，蜂花粉内含有是有花植物雄蕊中的雄性生殖细胞，内含丰富的营养物质，并且蜂花粉具有抗氧化性，固态发酵培养基的还原能力得到提升，固态发酵底物具有良好的抗氧化效果，丁酸梭菌在固态发酵和蜂花粉的共同作用下，芽孢转化率高，并且蜂花粉的花粉多糖具有提高免疫力的作用，动物食用由蜂花粉固态发酵的丁酸梭菌后，能够提高动物生长性能。

进一步的方案是，蜂花粉为油菜花粉。

可见，油菜花花期长，花粉产量大，购买成本较低，能够有效降低生产成本。

进一步的方案是，按总质量为100％计，固态发酵培养基包括20％～25％蜂花粉、3％～5％紫菜、2％～3％葡萄籽粕、0.5％～1.5％莲藕、2％～5％牡蛎壳、5％～10％燕麦麸皮、0.05％～0.15％硫酸镁、0.5％～1.5％乙酸钠、0.01％～0.05％硫酸锰和余量的水。

可见，上述组分中的蜂花粉、紫菜、葡萄籽粕、莲藕、牡蛎壳和燕麦麸皮为丁酸梭菌的发酵提供不同的营养成分，硫酸镁、乙酸钠和硫酸锰对丁酸梭菌菌体有一定的作用，在以上比例的成分的相互作用下，能够提高丁酸梭菌的芽孢转化率和存活率

进一步的方案是，丁酸梭菌的生产方法具体包括以下步骤：

S1、对丁酸梭菌菌种进行活化处理；

S2、将经过活化处理的丁酸梭菌菌种按5％的接种量转接到装有种子培养基的三角瓶中，在37℃下培养16h～20h得到一级种子液，将一级种子液按5％的接种量转接至装有种子培养基的种子罐中，在37℃下培养16h～20h得到二级种子液；

S3、将二级种子液转接入装有固态发酵培养基的固态发酵罐中，在37℃培养36h～40h；

S4、发酵完成后，将固态发酵培养基干燥粉碎。

可见，对最终得到固态发酵培养基中的丁酸梭菌进行干燥粉碎制成菌粉，能够改善活菌菌粉的储存有效期和存活率。

进一步的方案是，种子培养基包括10g/L的胰蛋白胨、22g/L的酵母浸粉、26g/L的葡萄糖、1g/L的无水硫酸铵、0.2g/L的硫酸镁、1g/L的碳酸氢钠、0.2g/L的硫酸锰、0.2g/L的氯化钙以及0.5g/L的半胱氨酸，种子培养基的pH值为6.8至7.0，种子培养基在121℃下灭菌20min。

可见，对种子培养基进行灭菌处理，减少其他细菌对丁酸梭菌的生长造成干扰。

进一步的方案是，固态发酵培养基的配制步骤为：将油菜花、紫菜、葡萄籽粕、莲藕、牡蛎壳、燕麦麸皮粉碎至100目以下；将各组分按比例混合搅拌溶解，在121℃下灭菌20min。

进一步的方案是，在S4中，发酵完成后，将固态培养基放入真空干燥箱中，在50℃和真空度≤50pa，干燥至固态培养基水分≤6％；然后粉碎至60目以下。

可见，控制该成品的含水量≤6％，可延长产品的保存有效期，将成品粉碎至60目以下，使丁酸梭菌在动物体内能够更好地被吸收，发挥丁酸梭菌在动物体内的作用。

进一步的方案是，在S1中，活化处理具体为：从-80℃冷冻保存的甘油管中取丁酸梭菌液体菌接入到种子培养基中，在恒温培养箱37℃培养箱48h。

可见，甘油对丁酸梭菌有保护作用，在低温冷冻保存下的丁酸梭菌能够保持活性，使得丁酸梭菌在37℃下，能够正常生长。

为实现上述的第二目的，本发明提供的丁酸梭菌活菌制剂由上述的丁酸梭菌活菌制剂的生产方法生产得到。

为实现上述的第三目的，本发明提供的动物饲料添加剂包括如上述的丁酸梭菌活菌制剂。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式对本发明进行进一步说明。

实施例一

本实施例提供一种丁酸梭菌活菌制剂的生产方法及由该生产方法制成的丁酸梭菌制剂，该生产方法包括以下步骤：

S1、从-80℃冷冻保存的甘油管中取出对丁酸梭菌菌种接入种子培养基中，在恒温培养箱37℃培养生长48h，以实现丁酸梭菌菌种活化处理；

S2、种子液配制步骤为：将经过活化处理的丁酸梭菌菌种按5％的接种量转接到装有种子培养基的三角瓶中，在37℃下培养16h～20h得到一级种子液，将一级种子液按5％的接种量转接至装有种子培养基的种子罐中，在37℃下培养16h～20h得到二级种子液，一级种子液和二级种子液的培养终点均通过镜检来确定；

S3、发酵步骤：将二级种子液转接入装有750L固态发酵培养基的固态发酵罐(规格为1000L)中，在37℃培养36h～40h，通过镜检来判定发酵终点；

S4、发酵完成后，采用真空干燥箱，在50℃、真空度≤50pa，干燥至固态培养基水分≤6％；然后粉碎至60目以下，分装保存。

培养基配制步骤包括种子培养基配制步骤和固态发酵培养基配制步骤。

种子培养基的配制需要在执行步骤S1之前完成，种子培养基配制步骤：种子培养基包括10g/L的胰蛋白胨、22g/L的酵母浸粉、26g/L的葡萄糖、1g/L的无水硫酸铵、0.2g/L的硫酸镁、1g/L的碳酸氢钠、0.2g/L的硫酸锰、0.2g/L的氯化钙以及0.5g/L的半胱氨酸，种子培养基的pH值为6.8至7.0，种子培养基在121℃下灭菌20min。

固态发酵培养基的配制需要在执行步骤S3前完成，固态发酵培养基配制步骤：将油菜花、紫菜、葡萄籽粕、莲藕、牡蛎壳、燕麦麸皮粉碎至100目以下；将按总质量为100％计的20％蜂花粉、4％紫菜、3％葡萄籽粕、1％莲藕、3％牡蛎壳、7％燕麦麸皮、0.1％硫酸镁、0.1％乙酸钠、0.025％硫酸锰和余量的水搅拌溶解均匀，在121℃下灭菌20min。

终得到的丁酸梭菌活菌制剂活菌数6.5*10⁹cfu/g，芽孢数6.4*10⁹cfu/g。

实施例二

本实施例一种丁酸梭菌活菌制剂的生产方法及由该生产方法制成的丁酸梭菌制剂，该生产方法与实施例一基本相同，不同之处在于：油菜花粉的含量为23％，终得到的丁酸梭菌活菌制剂活菌数6.7*10⁹cfu/g，芽孢数6.5*10⁹cfu/g。

实施例三

本实施例一种丁酸梭菌活菌制剂的生产方法及由该生产方法制成的丁酸梭菌制剂，该生产方法与实施例一基本相同，不同之处在于：油菜花粉的含量为25％，终得到的丁酸梭菌活菌制剂活菌数6.8*10⁹cfu/g，芽孢数6.5*10⁹cfu/g。

下面对实施例2中得到的丁酸梭菌制剂进行还原能力的检测，具体检测方法为：检测发酵前后油菜花粉固态发酵培养基还原能力的变化情况，发酵前、发酵4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h，32h、36h、40h的样品溶于100ml的纯水中，均质5min，离心取上清检测还原能力。

采用普鲁士兰法对上述样品进行检测，分别精密吸取各组样品1mL，加入0.2mol/LpH＝6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL及1％铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，于50℃水浴加热20min后迅速冷却，再加入10％三氯乙酸溶液2.5mL，混匀后吸取2.5mL溶液于比色管中，加蒸馏水2.5mL和0.1％氯化铁溶液0.5mL，常温反应10min后于700nm处测定吸光值，吸光值越大，表明还原能力越强，检测结果见表1。

表1

由表1内检测数据得知，发酵后含有油菜花粉的固态培养基的还原能力最高提升至3.98倍，说明采用固态发酵后不仅能够提高丁酸梭菌的芽孢转化率，也能提高固态发酵培养基的底物的还原能力，使添加有固态发酵的丁酸梭菌活菌制剂的动物饲料具有良好的抗氧化效果。

下面设置不同对照组和添加有实施例2中的动物饲料就动物的生长性能进行测试。

对照组1是没有添加丁酸梭菌活菌制剂的普通饲料。

对照组2是添加液体发酵的丁酸梭菌活菌制剂的动物饲料，该组丁酸梭菌活菌制剂的制作方法可参考中国发明专利CN201910399392.6。

1、肉鸡养殖功效试验：

选取1日龄健康雏鸡(鸡品种为科宝500)，2232羽，共设置3组，每组6个重复，每个重复124羽，第一组为对照组，按照养殖标准正常养殖；第二组为丁酸梭菌液体发酵组，丁酸梭菌活芽孢数为5亿/g，在第一组的基础上，每吨饲料添加200g的含丁酸梭菌的饲料添加剂；第三组为丁酸梭菌固体发酵组，丁酸梭菌活芽孢数为5亿/g，在第一组的基础上，每吨饲料添加200g的含丁酸梭菌的饲料添加剂。针对肉鸡进行了评价指标的制定，每天记录肉鸡死亡羽数和耗料量，在42日龄测定肉鸡均重，并计算料肉比和欧洲指数。

A、肉鸡成活率的测定

肉鸡出栏时，统计每组试验鸡的总数，计算肉鸡的成活率，计算公式：成活率＝出栏活羽数/进鸡数×100％，测定每组饲料添加剂产品对肉鸡成活率的影响。

B、肉鸡均重的测定

肉鸡出栏时，称取每组试验组鸡的总体重，并统计每组试验鸡的总羽数。计算各组肉鸡的均重，计算公式：末均重＝各组鸡的总重/鸡羽数。测定每组益生菌饲料添加剂产品对肉鸡体重的影响。

C、肉鸡料肉比的测定

肉鸡出栏时，统计每组的耗料量，根据每组末重与初重的差值计算出鸡的增重，计算公式：料肉比＝耗料量/增重。测定每组益生菌饲料添加剂产品对肉鸡料肉比的影响。

D、肉鸡欧洲指数的测定

欧洲效益指数(EPI)是通过肉鸡成活率、肉鸡体重、肉鸡料肉比及生产管理等各项指标，综合衡量肉鸡养殖的盈利指标，指数越大盈利越多。根据测定的试验数据，计算肉鸡的欧洲指数，计算公式：欧指＝(成活率×体重)/(料肉比×饲养天数)×10000，体重单位为kg，测定每组益生菌饲料添加剂产品对肉鸡欧洲指数的影响。

上述各组测定试验结果见下表2。

表2：

注：表中同列数据肩标字母相同或无字母则表示差异不显著(P>0.05)，字母不同者表示差异显著(P<0.05)。

通过实验结果可以看出，添加丁酸梭菌的对照组2和实施例2在肉鸡存活率、末重、料肉比上均优于对照组1，说明添加丁酸梭菌能够显著提高肉鸡的生长性能(P<0.05)。实施例2组在肉鸡存活率、末重、料肉比上均优于对照组1和对照组2，欧洲指数较对照组1提高31.86％(P<0.05)，较对照组2提高12.29％。通过本实验证明，采用固体发酵后的丁酸梭菌在提高动物生长性能方面优于液体发酵的丁酸梭菌，同时通过固体发酵还能提高油菜花粉等的利用度。

最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.丁酸梭菌活菌制剂的生产方法，其特征在于：包括以下步骤:

培养基配制步骤，所述培养基配制步骤包括种子培养基配制步骤和固态发酵培养基配制步骤,所述固态发酵培养基配制步骤中的固态发酵培养基包括蜂花粉；

种子液配制步骤,将经活化处理的丁酸梭菌菌种接入所述种子培养基配制步骤得到的种子培养基中,得到种子液；

发酵步骤,将上述步骤得到的所述种子液接入所述固态发酵培养基配制步骤得到的固态发酵培养基中,发酵完成后,将所述固态培养基粉碎得到所述丁酸梭菌活菌制剂。

2.根据权利要求1所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产方法，其特征在于：

所述蜂花粉为油菜花粉。

3.根据权利要求1或2所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产方法，其特征在于：

按总质量为100％计，所述固态发酵培养基包括20％～25％蜂花粉、3％～5％紫菜、2％～3％葡萄籽粕、0.5％～1.5％莲藕、2％～5％牡蛎壳、5％～10％燕麦麸皮、0.05％～0.15％硫酸镁、0.5％～1.5％乙酸钠、0.01％～0.05％硫酸锰和余量的水。

4.根据权利要求3所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产方法，其特征在于：所述生产方法具体包括以下步骤：

S1、对丁酸梭菌菌种进行活化处理；

S2、将经过活化处理的丁酸梭菌菌种按5％的接种量转接到装有所述种子培养基的三角瓶中，在37℃下培养16h～20h得到一级种子液，将所述一级种子液按5％的接种量转接至装有所述种子培养基的种子罐中，在37℃下培养16h～20h得到二级种子液；

S3、将所述二级种子液转接入装有所述固态发酵培养基的固态发酵罐中，在37℃培养36h～40h；

S4、发酵完成后，将所述固态发酵培养基干燥粉碎。

5.根据权利要求4所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产方法，其特征在于：

所述种子培养基包括10g/L的胰蛋白胨、22g/L的酵母浸粉、26g/L的葡萄糖、1g/L的无水硫酸铵、0.2g/L的硫酸镁、1g/L的碳酸氢钠、0.2g/L的硫酸锰、0.2g/L的氯化钙以及0.5g/L的半胱氨酸，所述种子培养基的pH值为6.8至7.0，所述种子培养基的ph值为6.8至7.0，所述种子培养基在121℃下灭菌20min。

6.根据权利要求4所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产方法，其特征在于：

所述固态发酵培养基的配制步骤为：将油菜花、紫菜、葡萄籽粕、莲藕、牡蛎壳、燕麦麸皮粉碎至100目以下；将各组分按比例混合搅拌溶解，在121℃下灭菌20min。

7.根据权利要求4所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产方法，其特征在于：

在S4中，发酵完成后，将所述固态培养基放入真空干燥箱中，在50℃和真空度≤50pa，干燥至所述固态培养基水分≤6％；然后粉碎至60目以下。

8.根据权利要求4所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产方法，其特征在于：

在S1中，所述活化处理具体为：从-80℃冷冻保存的甘油管中取丁酸梭菌液体菌接入到所述种子培养基中，在恒温培养箱37℃培养箱48h。

9.丁酸梭菌活菌制剂，其特征在于：由权利要求1至8任一项所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产方法生产得到。

10.动物饲料添加剂，其特征在于：包括如权利要求9所述的丁酸梭菌活菌制剂。