CN114158645B - 一种藻类蛋白饲料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种藻类蛋白饲料的制备方法，并涉及该蛋白饲料，属于动物饲料技术领域。所述藻类蛋白饲料的制备方法，主要步骤为：将藻类原料粉碎，最好加入蛋白酶，添加比例为0.5‑2.5％，混合后调节水分，再加入5‑12％，保藏编号为：CGMCC No.20659的纳豆芽孢杆菌Bacillus natto，37℃恒温发酵48‑72h，发酵后进行烘干、粉碎，得到藻类蛋白饲料；藻类原料由小球藻：大螺旋藻：尾丝藻＝2‑4：2‑5：3‑4组成。制得的蛋白饲料富含粗蛋白、小肽、藻类多糖、维生素、矿物质及微量元素，能够部分或全部代替蛋白原料，可改善动物肠道健康。

Description

一种藻类蛋白饲料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种藻类蛋白饲料的制备方法，并涉及该蛋白饲料，属于动物饲料技术领域。

背景技术

藻类为动物饲料提供了一种可持续的蛋白质来源，全面的医学和营养研究表明，许多不同类型的藻类产生的高质量的蛋白质可与其他替代蛋白质饲料的原料相媲美。

蛋白质由不同的氨基酸组成，营养质量是由其氨基酸的含量、比例和可用性决定的。蛋白质效率比(PER)是一种很好的衡量方法，它用饲养试验中试验动物消耗每单位蛋白质的体重增加来表示。另一个衡量标准是生物价值(BV)，它是衡量动物组织中为生长或维持而保留的氮含量。

藻类提供的不仅仅是优质蛋白质，还提供高质量的营养化合物，包括肽、碳水化合物、脂类、维生素、色素、矿物质和微量元素。

在一种新的食品被宣布为安全供人类食用之前，它必须经过一系列详细的毒理学测试，以证明该产品的无害性。在藻类的短期或长期喂养实验中，或在急性或慢性毒性研究中，均未发现严重异常。

美国的许多藻类生产商已经获得GRAS认证，FDA承认这种材料通常被认为是安全的。根据欧洲联盟规定核准的食品清单包括藻类作为饲料。目前还没有商业化的转基因藻类生物饲料。转基因食品或饲料在欧盟是不允许的。

藻类作为动物饲料中有价值的营养成分，其营养含量正迅速得到重视。藻类生物饲料是一种可再生资源，可替代肉类、乳制品、家禽和鱼类饲料中的传统成分。

藻类含有健康生物饲料所需的所有维生素、矿物质和微量营养素，包括维生素A、B₁、B₂、B₆、C、D和E等。藻类富含烟酸、碘、钾、铁、镁和钙。每个细胞都含有多糖、糖和淀粉，以及铁、钠、磷、镁、铜和钙。藻类生物饲料能够提供陆地植物无法提供的营养，如ω-3脂肪酸等强抗氧化剂。藻类的生产力指标非常出色。

藻类生物饲料的产量已经大大超过粮食。由于生物技术的创新，未来十年生物饲料的产量可能会增加10倍。

藻类生物饲料富含优质蛋白质、维生素、微量营养素(微量元素)和类胡萝卜素。藻类还提供多不饱和脂肪酸(PUFAs)，特别是n-3和n-6系列的脂肪酸，如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(AA)，这些脂肪酸被认为对动物和人类的饮食和治疗具有重要的药理作用。藻类产生有价值的生物分子，包括虾青素、叶黄素、胡萝卜素、叶绿素、藻胆蛋白和-1,3-葡聚糖。几项研究解释了每种生物分子是如何增进动物健康的。目前，也有一些海藻饲料，经过发酵而制备成饲料，例如如下申请，公开号：108782956A的发明《一种海藻饲料的制备方法》公开了一种海藻饲料的制备方法，该海藻饲料的组成是由海藻粉组成，加入含有酵母菌、乳酸菌、地衣芽孢杆菌的EM菌进行发酵获得的一种海藻饲料，可以提高仔猪的生产性能。

公开号：108271938A的发明《一种改善母猪便秘的功能性海藻饲料添加剂》公开了一种改善母猪便秘的功能性海藻饲料添加剂，其组成由浒苔5-15份、石莼5-15份、海带25-35份、裙带25-30份、马尾藻10-15份、紫菜10-20份，加入枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌进行酶解发酵，可以有效缓解母猪便秘。

公开号：CN109043168A的中国发明《一种利用养猪场污水养殖微藻生产仔猪饲料的方法》公开了一种利用养猪场污水养殖微藻生产仔猪饲料的方法，涉及养殖技术领域，包括以下步骤：(1)将预先培养的处于对数生长期浓度为1-1.5g/L的微藻液碱驯化处理后用污水扩大培养；(2)养猪场污水沉淀后稀释、杀菌消毒，将微藻接种至污水中养殖；(3)用水泵将含有微藻的污水抽入收藻袋中过滤，得到浓缩藻液，发酵后，得到微藻发酵液；制作仔猪饲料，本发明仔猪饲料，可大大降低养猪场饲喂成本，而且可以降低饲料系数，提高仔猪生长速度，降低死亡率。

公开号：CN103504172A的中国发明《一种绿狐尾藻的猪饲料及制备方法》公开了一种绿狐尾藻的猪饲料及制备方法，它由玉米粉、豆饼、麦麸、新鲜绿狐尾藻一定比例组成，其步骤：A、按比例称取玉米粉、豆饼、麦麸，分别进行粉碎到40-60目；B、将粉碎后的玉米粉、豆饼、麦麸搅拌均匀；C、将称取的新鲜绿狐尾藻进行粉碎打桨；D、将B步骤粉碎后的原料与C步骤粉碎打桨后鲜绿狐尾藻搅拌均匀，获得一种绿狐尾藻的猪饲料；E、将绿狐尾藻的猪饲料装入密封的容器，进行发酵；F、按照不同时期猪的需要量加入绿狐尾藻的猪饲料到食槽。配方合理，猪正常生长发育需要的维生素、氨基酸和矿物元素均从绿狐尾藻中获得，通过适度发酵使玉米粉、豆饼、麦麸中粗纤维、淀粉和蛋白质等降解为猪更加容易吸收利用的糖、氨基酸。

公开号：CN107343566A的中国发明《一种绿色健康猪饲料加工及绿色健康猪的饲养方法》公开了一种绿色健康猪饲料加工及绿色健康猪的饲养方法，属于畜类饲料加工及饲养技术领域。将绿色无转基因玉米、小麦、燕麦、麦麸、米糠、豆粕、花生饼、红薯秧、花生秧、苜蓿、螺旋藻、小球藻、富硒酵母、神曲、甘草锌、虾皮、鱼粉、桑叶、荷叶、银杏叶、枸杞叶、黄芪叶、淡竹叶、茜草、夏枯草、炙甘草、茵陈、党参、当归、熟地、绞股蓝、芦荟、金银花、杭白菊、玫瑰花、茉莉花、黑木耳、山楂片、精碘盐，用山泉水浸泡、煮熟、发酵、烘干、粉碎、造粒，装袋，制成绿色健康猪饲料；用鲜奶、鲜豆浆与山泉水浸泡即食；每日定时驱赶猪群散步、奔跑、锻炼、按摩、洗澡。此猪肉：营养均衡，鲜香味美，诱人食欲。具有食用与保健双重功效。

公开号：CN110235993A的中国发明《一种含有螺旋藻发酵物的饲料及其制备方法》，公开了一种含有螺旋藻发酵物的饲料及其制备方法。本发明的猪饲料按质量百份数算由10-15份桑树叶、10-25份玉米渣、5-10份葡萄渣、5-10份西瓜皮、5-10份南瓜粉、15-25份米糠、15-25份豆粉、3-5份螺旋藻发酵物、1-3份橘子皮、5-10份诱食剂组成。本发明采用工艺发酵法制备螺旋藻发酵物，利用冷冻干燥粉碎制备桑树叶、玉米渣、葡萄渣、西瓜皮、橘子皮，最后将以微波处理和红外处理后的原料混合，制粒得含有螺旋藻发酵物的饲料。本发明的配方原料易得、营养成分丰富，能提高猪的免疫力，提高猪的食欲，帮助其快速生长。

因为目前藻类包括很多种，其中的蛋白含量也参差不齐，分布在3％-80％之间，上述发明的制备过程中，多数都没有选用单独的藻类来制备动物饲料，一方面，之前的工艺很多都是藻类饲料与一些常见的饲料原料进行组合、或者藻类和中药组合、或者是藻类与一些加工的副产品进行组合，这些组合可以直接进行饲喂动物，确实能够达到食用和保健的功能，但是本领域公开的相关的应用藻类的饲料，均未关注到动物每个生理阶段所需的维生素和微量元素的需要量，可能是因为公认藻类富含维生素和微量元素，但是发明人在实践中发现，使用这类饲料，长期饲喂下，容易造成动物缺乏某种维生素和微量元素而发生状况。其次，如果在一个合理的饲料配方中加入藻类混合后，再一起制备的情况下，由于目前饲料配方中的组成成分繁多，操作复杂，且制备过程中维生素之类的成分容易被破坏，其有效含量降低，会严重影响其饲料的营养效价。目前中国进入无抗时代，直接饲喂动物的饲料中还会添加抗菌肽、酸化剂等成分来改善动物肠道健康，提供动物免疫力，减少动物发病的概率，所以，如果将藻类直接与饲料混合再进行各种制备过程，不仅制备过程繁琐，在考虑维生素类效价被影响的同时，还要考虑到所加入的这些抗菌肽、酸化剂等是否可以不受制备过程的影响而降低其效价。

针对目前国家各种饲料原料价格飙升，特别是动物源性的蛋白饲料-鱼粉的价格飙升，并应对养殖大环境的变化，寻找一种可以替代鱼粉，且维生素和微量元素含量丰富且平衡的高蛋白的纯藻类饲料，是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种可以替代鱼粉的高蛋白纯藻类蛋白饲料原料，因为其他的饲料原料在发酵后也不会达到粗蛋白含量特别高的效果，而且本发明中的纯藻类发酵只替代饲料中的蛋白原料，不影响整个饲料配方的平衡，不需要重新设计计算配方，使用很方便。本发明选用几种纯藻类蛋白饲料原料复合进行发酵，选用小球藻、大螺旋藻和尾丝藻一起进行发酵，经烘干后，具有高达67％以上的粗蛋白含量，经发酵后小肽含量提高，消化吸收利用率高达90％以上，且含有丰富的益生菌可以调节肠道健康，对比其他发明中的藻类与其他原料一起发酵并饲喂动物有着比较专一的特点，可以制定专门替代高蛋白原料的替换方案。所以本发明的目的是应对目前市场各种饲料原料价格飙升，特别是动物源性的蛋白饲料-鱼粉的价格飙升，选择用发酵后的藻类蛋白饲料替代配方中使用的鱼粉，因为鱼粉是饲料中最常用的高蛋白的动物源性蛋白饲料，本发明藻类蛋白饲料的粗蛋白含量与鱼粉中的粗蛋白含量是最接近的，由于目前世界鱼粉的总产量都在逐年下降，鱼粉的价格居高不下，供给不稳定；同时也为了适应目前国内禁抗的形势，寻求一种能够用藻类替代蛋白原料的藻类蛋白饲料，寻找优质的蛋白来源，来减少动物肠道中发酵蛋白的数量，减少病原微生物的基质，在替代昂贵的动物蛋白饲料的同时，还可以在养殖中发挥藻类蛋白饲料突出的优势，重要的是本发明的制备过程只针对藻类蛋白饲料的制备，制备后可以部分或全部替代饲料配方中的高蛋白质饲料，不影响饲料中其他成分的营养效价的同时，还能够发挥藻类蛋白饲料特有的功能，包括高消化率、富含多糖等可以提高动物免疫力、降低动物发病率，富含矿物质和维生素，可以额外补充动物所需的微量元素和维生素，以改善动物的生产性能，而发酵制备的藻类蛋白饲料中含有丰富的益生菌，可以调节动物肠道健康，提供给动物更健康、更有针对性的饲料原料。

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种藻类蛋白饲料，采用本发明的藻类蛋白饲料，能部分或全部代替蛋白原料，同时能够保证并提高仔猪的生产性能和提高动物的免疫力。

本发明同时提供一种藻类蛋白饲料的制备方法，主要包括以下步骤：

将藻类原料粉碎，过18目的筛孔，混合后调节水分至30-35％质量百分比，加入经液态增殖后的纳豆芽孢杆菌，进行37℃恒温发酵，发酵后，采用流化床干燥机进行烘干，空气蒸汽换热器进行换热，进风温度为125℃，进料后排气温度为70℃，烘干后水分在8.5-10％之间，再进行粉碎，过40目的筛孔，得到一种高蛋白、高消化率、富含多糖且含有有益菌等的藻类蛋白饲料；

所述藻类原料的质量组成比例为：小球藻：大螺旋藻：尾丝藻＝2-4：2-5：3-4；

较佳的，所述藻类原料的质量组成比例为：小球藻：大螺旋藻：尾丝藻＝2：5：3、4：2：4；

较佳的，所述藻类原料的质量组成比例为：小球藻：大螺旋藻：尾丝藻＝3：4：3；

较佳的，藻类原料粉碎过筛后加入蛋白酶；

所述蛋白酶的添加质量比例为0.5-2.5％；

较佳的，所述蛋白酶的添加质量比例为1％。

所述纳豆芽孢杆菌的接种量为5-12％，发酵48-72h；

较佳的，所述纳豆芽孢杆菌的接种量为8％，发酵72h；

所述藻类蛋白饲料的粗蛋白含量能够达到60～70％，小肽含量能够达到12～16％。

所述藻类蛋白饲料的消化率能够达到90％以上。

所述藻类蛋白饲料的多糖含量能够达到20～25％。同时含有丰富的维生素和矿物质。总维生素含量在30-100mg/kg之间，其中胡萝卜素、维生素E、烟酸的含量分别能够达到6.5mg/kg、8.0mg/kg、40.0mg/kg以上；矿物质主要以碘为主，可达3.0-6.0％，其中钙含量在0.5-2.0％、钾含量在2-6％之间、磷的含量在0.1-1％之间。

本发明发酵中应用的纳豆芽孢杆菌是经过提纯的一株产高酶活蛋白酶的纳豆芽孢杆菌，在发酵过程中，纳豆芽孢杆菌可以产生多种抗菌素，有杀菌抑菌的作用，具有广谱抗菌作用，能够维持动物的肠道健康，保持动物肠道微生物的平衡。所述纳豆芽孢杆菌已于2020年9月16日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No.20659，分类命名：纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)。

将保藏菌种纳豆芽孢杆菌经液态增殖，按照1‰接种量接种到牛肉蛋白胨液体培养基中，37℃培养24h，活化2-3代即可应用。

本发明中的蛋白酶是从纳豆芽孢杆菌，保藏编号：CGMCC No.20659提纯获得，是一种中性蛋白酶，该蛋白酶在pH5.0-11.0范围内稳定；在50℃下放置6-7h，残余活力仍能达到20％。37℃放置48h仍能保持约80％的活性。在发酵藻类饲料时，能达到良好的分解蛋白质的效果,在发酵海藻原料的过程中，可以更好的将海藻原料中的大分子蛋白变成小分子蛋白，能够提高海藻饲料的消化率和小肽含量。

有益效果：

(1)本发明中的各种藻类组分的粗蛋白均在45～65％之间，混合经过发酵后，粗蛋白的含量在60～70％之间，能够部分或全部代替蛋白原料；并且发酵后产生的小肽含量能够达到12～16％，同时消化率可以提高到90％以上，传统饲料中的蛋白质在动物消化道内酶的作用下并不能全部降解为游离氨基酸，而本发明发酵后生成的小肽能够完全通过肠粘膜细胞，直接进入循环系统后被机体组织代谢利用。

(2)本发明中的各种藻类的多糖含量在20～25％之间，能够补充普通蛋白原料中缺乏的营养成分。藻类多糖具有提高动物免疫力的作用，能增强动物机体特异性和非特异性免疫功能，提高动物的抗应激能力。

(3)本发明中的藻类的维生素，包括水溶性及脂溶性维生素、矿物质及微量元素含量较高，且以天然的螯合物形式存在，容易被动物吸收利用，可调节饲料营养的平衡，易被动物吸收利用，促进动物的生长。

(4)本发明发酵过程中应用的纳豆芽孢杆菌，是一株经过筛选提纯后的产高酶活蛋白酶的菌株，在发酵过程中产生的有益菌和多种代谢产物抗菌素等，一方面能够保持动物肠道健康，另一方面能够对多种细菌产生一定的抗菌活性。

(5)本发明发酵过程中应用的蛋白酶，酶活含量在8600U，在发酵过程中，能够达到菌酶协同的作用，有效的降低饲料中非淀粉多糖的含量，可以将大分子蛋白分解成小分子蛋白，提高小肽含量，进一步提高饲料的消化利用率。

(6)本发明提供的藻类蛋白饲料配方温和，方便操作控制，容易实现工业化生产。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明，除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)FMN-1，于2020年9月16日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20659，所述菌种由沈阳丰美生物技术有限公司的姜丹于2020年7月30日-8月30日之间，在沈阳丰美生物技术有限公司的生物试验室中从日本纳豆中筛选得到。

纳豆芽孢杆菌简称纳豆菌，属细菌科、芽孢杆菌属，是枯草芽孢杆菌的一个亚种。大小通常为(0.7～0.8)μm×(0.2～0.3)μm，嗜氧型革兰氏阳性，芽孢呈椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。纳豆菌生长的最高温度为45～55℃，最低为5～20℃，最适生长温度37℃；pH 7.0～7.5，最适生长pH 7.3.孢子耐热性强，可在肠道内萌发。纳豆菌的抵抗性较强，其芽孢具有耐酸、耐碱、耐高温(100℃)、耐挤压的高度稳定性，易于保存，实验室可在-70℃的冰箱中长久保存，在胃酸4h后的存活率为100％，同时具有强力的病原菌抑制能力，进入小肠内，能够改变动物肠道菌群生态，调节肠道菌群，产生的抗菌肽具有广谱抗菌作用。

所述的纳豆芽孢杆菌为保藏号为CGMCC No.20659的纳豆芽孢杆菌FMN-1，该菌种从日本纳豆中筛选得到。

所述的纳豆芽孢杆菌FMN-1的筛选方法如下：

称取纳豆于0.85％的无菌生理盐水中，振荡，将菌悬液在80℃的恒温水浴锅中加热10min后，迅速冷却至室温，此菌悬液为原始菌液。

将原始菌液用生理盐水梯度稀释制备10^-1～10^-8浓度的稀释液，各取100μL上述的10^-5～10^-8浓度的稀释菌悬液加到牛肉膏蛋白胨培养基的平板上，涂匀稀释液，将上述平板放入37℃恒温培养箱中倒置培养24h。

挑取不同菌落形态的单菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察，根据常见细菌系统鉴定手册中关于芽孢杆菌属形态的描述，挑取具有芽孢杆菌细胞形态的菌株，对产气荚膜梭菌进行抑菌试验，反复纯化出对产气荚膜梭菌具有较强的抑菌效果的菌株，纳豆芽孢杆菌的菌株形状为圆形，边缘不规则，中间凸起，表面褶皱，颜色为白色，呈不透明状，致密。

对产气荚膜梭菌有较强的抑菌效果的菌株的筛选方法如下：

将C型产气荚膜梭菌于胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基上复苏，挑单个黑色菌落至液体硫乙醇酸盐培养基中，37℃厌氧培养10h。同时准备好试管，装入已灭菌过的液体硫乙醇酸盐培养基待用。

选取十株已经经过鉴定和挑单菌落经过培养的纳豆芽孢杆菌继续筛选，将纳豆芽孢杆菌与产气荚膜梭菌加入装有液体硫乙醇酸盐培养基的试管中，37℃厌氧培养24h，通过肉眼观察细菌的生长情况，如果试管中的溶液澄清透明，说明没有细菌生长，如果试管中有絮状细菌或浑浊，说明有细菌生长。

选取能够使溶液澄清透明的试管，纳豆芽孢杆菌产生的蛋白酶是一种中性丝氨酸蛋白酶，可水解酪素平板形成透明圈，挑取上述经过鉴定且经抑菌筛选出的纳豆芽孢杆菌单菌落在酪素培养基的平板上分别连续划线分离，将上述平板放入37℃恒温培养箱中倒置培养24h，选取菌落周围产生水解圈的菌株，并且水解圈直径与菌落直径比值最大的菌落进一步分离纯化得到产高酶活蛋白酶的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌FMN-1，并进行保藏，保藏编号为CGMCC No.20659。

所述的牛肉膏蛋白胨培养基的组成：琼脂粉20.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，氯化钠5.0g/L，其余为水，pH值7.0～7.2。

所述的胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基的组成：胰胨15.0g/L，大豆胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，焦亚硫酸钠1.0g/L，柠檬酸铁铵1.0g/L，0.5％的D-环丝氨酸溶液10％，琼脂15.0g/L，其余为水，pH值为7.6±0.2。

所述的液体硫乙醇酸盐培养基的组成：胰酶消化酪蛋白胨15.0g/L，L-胱氨酸0.5g/L，葡萄糖5.0g/L，酵母膏5.0g/L，氯化钠2.5g/L，硫乙醇酸钠0.5g/L，刃天青0.001g/L，其余为水，pH值为7.1±0.2。

所述的酪素培养基的组成：琼脂粉20.0g/L，酪素5.0g/L，葡萄糖1.0g/L，酵母膏1.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.1g/L，其余为水，pH值7.0～7.2。

所述蛋白酶的制备方法如下：

将纳豆芽孢杆菌FMN-1，按照12％的接种比例接入牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，37℃、180r/min下恒温培养24h，活菌数达到(4.0～6.0)×10⁸～(4.0～6.0)×10⁹cfu/g，以2％接种量接种至液体发酵培养基，37℃、180r/min下恒温培养48h后取发酵液，5000r/min离心10min，取上清液即为蛋白酶粗酶液。

所述牛肉膏蛋白胨的液体培养基组成：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，氯化钠5.0g/L，其余为水，pH值7.0～7.2。

所述的液体发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，蔗糖10.0g/L，大豆蛋白胨20.0g/L，磷酸氢二钾4.0g/L,磷酸二氢钾2.0g/L,氯化钙0.2g/L，硫酸镁0.5g/L，其余为水,pH值7.0。

本发明提供的由纳豆芽孢杆菌FMN-1产生的粗酶液中蛋白酶的酶活特性稳定性如下表1：

表1蛋白酶活性的稳定性试验

该菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上连续传代10代，每代菌株在48h的发酵液中蛋白酶的活性测定结果表明，在其6代内，产生的蛋白酶的特性仍然可以保持稳定，第4代时达到了26.23U/mL，酶活高且产酶好。

将硫酸铵缓慢加入在上述的粗酶液中，直至25％饱和度，4-8℃过夜，8000rpm离心30min，取上清液，在上清液中加硫酸铵至终饱和度为60％，4-8℃过夜，8000rpm离心30min，收集沉淀，目的主要是去除上清液中的杂蛋白和多糖类物质。取上述沉淀100mg，用10mL20mm的PB缓冲溶液复溶，取复溶后的蛋白溶液进行凝胶层析和阳离子交换层析。

为了确定凝胶层析中最佳的缓冲溶液浓度，首先将上述复溶的蛋白质溶液取10mL进行凝胶层析，层析柱选择的是XK 26/100，分别选择10mm、20mm、30mmPB的缓冲溶液，流速为3mL/min，样品经过凝胶层析柱洗脱后收集所有滤液，干燥后得到蛋白酶粉末，提纯后蛋白酶活性及比活力见表2。可以得出：20mmPB缓冲溶液，凝胶层析柱洗脱的效果最佳，确定凝胶层析柱洗脱中，缓冲溶液的浓度为20mmPB。

表2凝胶层析提纯后的蛋白酶的活性

收集经20mmPB缓冲溶液，凝胶层析柱洗脱的滤液继续进行阳离子交换层析，阳离子交换层析柱为Hitrap SP FF,用不同pH值的20mm PB缓冲溶液分别洗脱优化，pH值分别为6.5、7.0、7.5，流速为2mL/min，洗脱后收集滤液进行干燥后得到蛋白酶粉末，提纯后蛋白酶活性及比活力见表3。

10mmPB溶液的配制过程为：取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g,定容至1000mL。

20mmPB溶液的配制过程为：取NaCl 16g，KCl 0.4g，Na₂HPO₄ 2.88g，KH₂PO₄ 0.48g,定容至1000mL。

30mmPB溶液的配制过程为：取NaCl 24g，KCl 0.6g，Na₂HPO₄ 4.32g，KH₂PO₄ 0.72g,定容至1000mL。

不同pH值的20mmPB溶液的配制过程为：取NaCl 16g，KCl 0.4g，Na₂HPO₄ 2.88g，KH₂PO₄0.48g,定容至1000mL，分别配制三份，然后用氢氧化钠和冰乙酸调节pH值为6.5、7.0、7.5。

表3阳离子层析提纯后的蛋白酶的活性

在凝胶层析中，选择不同浓度的PB缓冲溶液进行洗脱，可以得出在20mmPB缓冲溶液下，洗脱的效果最佳。阳离子交换层析过程中，选择20mmPB而不同pH的缓冲溶液进行洗脱，可以得出在20mmPB缓冲溶液的pH为7.0的时候，总蛋白的质量、蛋白酶酶活、比活力的结果均是最理想的。

最终确定凝胶层析及阳离子交换层析为：将上述复溶的蛋白质溶液取10mL进行凝胶层析，层析柱选择的是XK 26/100，20mm的缓冲溶液，流速为3mL/min，样品经过凝胶层析柱洗脱后收集滤液，然后将收集的滤液继续进行阳离子交换层析，阳离子交换层析柱为Hitrap SP FF,用pH值7.0的20mm PB缓冲溶液洗脱优化，流速为2mL/min，洗脱后收集滤液进行干燥后得到蛋白酶粉末。

实施例1

菌种的活化：

将纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCC No.20659)、植物乳杆菌(产品购自生合生物科技有限公司)、酿酒酵母(产品购自安琪酵母股份有限公司)分别接入牛肉膏蛋白胨、MRS、PDA的液体培养基中，37℃，静置，培养24h，活化后的纳豆芽孢杆菌FMN-1、植物乳杆菌及酿酒酵母的种子液的活菌数，经检测均能达到1×10⁹CFU/mL，将活化好的三种菌的种子液分别按照1％的接种量继续分别接种于牛肉膏蛋白胨、MRS、PDA的液体培养基中，培养的温度为37℃，静置培养24h，按照上述步骤，活化3代即可应用。

所述牛肉膏蛋白胨的液体培养基组成：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，氯化钠5.0g/L，其余为水。

所述MRS的液体培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏粉8g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸三铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，余量为水。

所述PDA的液体培养基组成：葡萄糖15g/L，酵母浸粉4g/L，马铃薯10g/L，余量为水。

将小球藻粉：大螺旋藻粉：尾丝藻粉按照3：4：3的比例组合进行混合，准备四份，一份作为对照组，直接测定各项营养指标的含量，其余三份作为试验组，均按照料：水的比例为7：3的比例与水进行混合后，按照藻类原料和水的总量的1％的添加量添加蛋白酶，8％的添加量添加活化好的菌株，试验组1添加植物乳杆菌、试验组2添加纳豆芽孢杆菌、试验组3添加酿酒酵母。分别37℃发酵72小时后进行烘干、粉碎后测定各项营养指标的含量，结果见表4；

所述蛋白酶是经纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCC No.20659)提纯出来的中性蛋白酶；

表4藻类蛋白饲料在不同菌种发酵的情况下的营养指标的对比

分析：表4是验证本次实施例中选用微生物发酵与不发酵的差异，以及添加不同菌种发酵后的差异，进行营养成分分析。结果显示，经过微生物发酵后的三个试验组的各项营养指标均比对照组高；使用了(保藏编号CGMCC No.20659)的纳豆芽孢杆菌发酵的试验组2的粗蛋白分别比对照组、试验组1、试验组3高21.82％、11.87％和10.69％；而酸溶蛋白(小肽含量)、藻类多糖以及消化率均比对照组和试验组1、3高。所以选用微生物发酵藻类效果很好，且使用纳豆芽孢杆菌发酵后效果最好。

实施例2

纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCC No.20659)活化步骤同实施例1。

将小球藻粉：大螺旋藻粉：尾丝藻粉按照3：4：3的比例组合进行混合，准备四份，一份作为对照组，直接测定各项营养指标的含量。其余三份作为试验组，均按照料：水的比例为7：3的比例与水进行混合后,按照藻类原料和水的总量的1％的添加量添加蛋白酶，蛋白酶是经纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCC No.20659)提纯出来的中性蛋白酶，添加活化好的纳豆芽孢杆菌，试验组1添加的菌的量是按照藻类原料和水的总量的5％进行添加、试验组2添加的菌的量是按照藻类原料和水的总量的8％进行添加、试验组3添加的菌的量是按照藻类原料和水的总量的12％进行添加。分别37℃发酵72小时后进行烘干、粉碎后测定各项营养指标的含量，结果见表5。

表5藻类蛋白饲料在菌种不同添加比例的情况下的营养指标的对比

分析：表5各试验组添加了不同比例的纳豆芽孢杆菌，最后进行营养成分分析其不同添加比例下进行发酵的差异。结果：显示纳豆芽孢杆菌在8％添加比例的时候效果最优，均显著高于试验组1和试验组3；粗蛋白含量分别较试验组1和3提高了10.26％和8.89、酸溶蛋白(小肽含量)分别较试验组1和3提高了29.47％和27.21％、藻类多糖含量分别较试验组1和3提高了14.44％和18.24％、消化率分别较试验组1和3提高了5.17％和4.84％。所以纳豆芽孢杆菌在添加比例为8％的时候，发酵海藻饲料的效果最好。

实施例3

纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCC No.20659)活化步骤同实施例1。

将小球藻粉：大螺旋藻粉：尾丝藻粉分别按照2：5：3、3：4：3、4：2：4的比例组合进行混合，与水再按照7：3的比例进行混合后，试验组1的藻类的比例按照2：5：3、试验组2的藻类的比例按照3：4：3、试验组3的藻类的比例按照4：2：4，三个试验组均按照藻类原料和水的总量的1％的添加量添加蛋白酶，蛋白酶是经纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCC No.20659)提纯出来的中性蛋白酶，按照8％的添加量添加活化好的纳豆芽孢杆菌进行发酵。37℃发酵72小时后进行烘干、粉碎后测定各项营养指标的含量，结果见表6。

表6藻类蛋白饲料在藻类之间不同配比的情况下的营养指标的对比

分析：表6各试验组采用不同比例组合的海藻原料混合，采用相同的条件进行制备，最后进行营养成分分析其差异。结果显示不同比例组合的海藻原料进行发酵后的结果有差异，小球藻粉：大螺旋藻粉：尾丝藻粉按照3：4：3的比例组合进行混合后制备的效果是最优的，均显著高于试验组1和试验组3；粗蛋白含量分别较试验组1和3提高了10.10和11.45％、酸溶蛋白(小肽含量)分别较试验组1和3提高了33.25％和29.16％、藻类多糖含量分别较试验组1和3提高了12.35％和20.62％、消化率分别较试验组1和3提高了3.64％和2.82％。

实施例4

纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCC No.20659)活化步骤同实施例1。

将小球藻粉：大螺旋藻粉：尾丝藻粉按照3：4：3的比例组合进行混合，准备四份，一份作为对照组，直接测定各项营养指标的含量。其余三份作为试验组，试验组1添加的蛋白酶为中性蛋白酶，(产品购自邢台思倍特生物科技有限公司，酶活5万U/g)、试验组2添加的蛋白酶为经纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCC No.20659)提纯出来的中性蛋白酶，酶活含量为8600U/g、试验组3添加的蛋白酶为中性蛋白酶，(产品购自山东隆大生物工程有限公司，酶活5万U/g)；试验组1的中性蛋白酶的添加量为0.18％，试验组2的中性蛋白酶的添加量为1％，试验组3的中性蛋白酶的添加量为0.18％，各试验组中蛋白酶的添加量均是按照最终折合到发酵料中具有相同的酶活计算的；三个试验组混合后均按照料：水的比例为7：3的比例与水进行混合后添加活化好的纳豆芽孢杆菌，三个试验组均按照藻类原料和水的总量的8％的添加量添加活化好的纳豆芽孢杆菌进行发酵。37℃发酵72小时后进行烘干、粉碎后测定各项营养指标的含量，结果见表7。

表7藻类蛋白饲料在采用不同来源的蛋白酶与海藻原料混合制备后营养指标的对比

分析：表7各试验组采用不同来源的蛋白酶与海藻原料混合，采用相同的条件进行制备，最后进行营养成分分析其差异。结果显示不同来源的蛋白酶进行发酵后的结果有显著的差异，试验组1、2、3均显著高于对照组；加入纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCCNo.20659)提纯出来的中性蛋白酶的试验组2的效果明显优于试验组1和3，粗蛋白含量分别较试验组1和3提高了10.22和9.68％、酸溶蛋白(小肽含量)分别较试验组1和3提高了44.44％和32.37％、藻类多糖含量分别较试验组1和3提高了22.36％和21.39％、消化率分别较试验组1和3提高了8.53％和7.63％。

实验例藻类蛋白饲料的应用实验

本次试验在保育猪阶段进行，将体重在12公斤左右的保育猪(大长白三元杂交)200头，随机分为4组，每组5个重复，每个重复10头猪，4组为对照组，饲喂玉米-豆粕型日粮，试验A组：本发明藻类蛋白饲料原料替代40％的鱼粉，其他配方组成同对照组；试验B组：本发明藻类蛋白饲料原料替代60％的鱼粉，其他配方组成同对照组；试验C组：本发明藻类蛋白饲料原料完全替代鱼粉，其他配方组成同对照组，各试验组配方见表8。

其中藻类蛋白饲料的制备过程：纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCC No.20659)活化步骤同实施例1。

将小球藻粉：大螺旋藻粉：尾丝藻粉按照3：4：3的比例组合进行混合，按照藻类原料和水的总量的1％的添加量添加蛋白酶，蛋白酶是经纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCCNo.20659)提纯出来的中性蛋白酶，与水再按照7：3的比例进行混合后，按照藻类原料和水的总量的8％的添加量添加活化好的纳豆芽孢杆菌进行发酵。37℃发酵72小时后进行固液分离，烘干、粉碎后即得。

表8保育猪饲料配方组成及营养水平

注本发明中所有的试验用饲料及饲料添加剂均由沈阳丰美生物技术有限公司提供。

试验地点为辽宁葫芦岛某猪场，每日饲喂三次，每次以吃饱略剩为限，保持猪舍内清洁卫生与消毒，试验期为28天。试验期间记录上料量和剩料量，由此计算出平均日增重、日采食量和料重比。并记录粪便及皮毛评分情况，以及猪肠道微生物菌群的测定情况。

表9保育猪生产性能的影响

各组试验的保育猪的体重、采食量、料肉比如表9。与对照组的实验结果比较，试验组A、B、C的日增重比对照组分别提高了4.92％、5.35％、5.20％，料肉比对照组分别降低了1.29％、1.34％和1.34％，日采食量均比对照组高3.53％、3.89％、3.77％，三组数据均与对照组差异显著(P<0.05)。本发明中替代鱼粉的藻类蛋白饲料，是经过特定的酶和特定的微生物进行发酵后的产品，粗蛋白含量高，与鱼粉的粗蛋白含量持平，经过发酵，藻类蛋白饲料中小肽含量高达15％以上，这些是鱼粉中没有的，而小肽是小分子蛋白，更容易被仔猪吸收利用，同时本发明中的藻类蛋白饲料经过蛋白酶和纳豆芽孢杆菌进行发酵后，降低了饲料中非淀粉多糖的含量，可以将大分子蛋白质分解成小分子蛋白，具有非常高的消化率，因为保育猪这个阶段是属于仔猪阶段，仔猪消化机能不完善，生长强度高，应激大，所以在饲料组成方面就特别注意其组成，在满足保育猪的营养需求的情况下，尽量使用更容易消化吸收的原料。

表10粪便及皮毛评分情况表

注：1、粪便评分标准：1分为便秘，2分为正常，3分为软便，4分为腹泻，5分为水便。

2、皮毛评分标准：根据皮肤的颜色和毛的颜色及长短打分，1分为差，2分为中等，3分为好。

3、不正常粪便率是腹泻率与软便率之和。

各组试验的保育猪的腹泻率如表10，与对照组的实验结果比较，试验A、B、C组的腹泻率比对照组分别降低了39.02％、40.85％、41.06％，同时试验A、B、C组的软便率也比对照组低。因为仔猪在保育阶段机体发育不够完善，环境应激，消化不良、饲养管理不达标等等因素都会引起仔猪的各种疾病，在仔猪上表现的最明显的就是腹泻，而在本次实验中，因为藻类蛋白饲料中含有其他饲料中没有的藻类多糖，能够提高动物的免疫力，提高动物的抗应激能力。不仅可以保证能够满足仔猪的营养需求，同时可以降低仔猪的腹泻率，能够保证仔猪安全的度过断奶期，提高断奶重。

同时，由于藻类蛋白饲料中富含维生素和矿物质，能够补充动物对微量元素和维生素的需求，所以动物的皮毛评分上可以体现出来，本发明中的藻类蛋白饲料替代鱼粉后，可以改善仔猪的皮毛状态。

表11猪肠道微生物菌群的测定(CFU/g)

各组试验的保育猪的粪便中菌群情况如表11，试验A、B、C组的大肠杆菌数量显著低于对照组，而试验组的乳酸杆菌的数量显著高于对照组。大肠杆菌主要引起仔猪的腹泻。由于本发明中的藻类蛋白饲料是经过纳豆芽孢杆菌发酵的，纳豆芽孢杆菌富含多种抗菌肽，可以有效的抑制一些病原菌的生长，调节仔猪肠道的菌群平衡，保障动物的肠道健康，减少动物的发病几率。因为肠道的发育已经是限制仔猪后期健康生长的重要因素。目前仔猪早期断奶已经成为集约化，但是伴随而来的腹泻、生长迟缓、消化不良、免疫力低下等是仔猪的早期断奶综合症，解决不当会严重影响养猪业的经济效益，所以能够改善仔猪的肠道健康、平衡仔猪肠道微生物的菌群，减少有害菌的生长是目前比较关注的问题。

综上所述，本发明中制备的藻类蛋白饲料可以部分或全部替代鱼粉。首先本发明中制备的藻类蛋白饲料的粗蛋白含量在60～70％之间，与鱼粉的蛋白含量接近，可以不影响其他原料的组成进行等量替代；同时，由于在发酵过程中，加入由纳豆芽孢杆菌中提纯出来的蛋白激酶可以更有效的将藻类蛋白饲料中的大分子蛋白降解成小分子蛋白，从而提高藻类蛋白饲料中的小肽含量和消化率，更容易被动物吸收利用。

其次藻类蛋白饲料中含有的多糖和丰富的维生素和微量元素是藻类蛋白饲料特有的，多糖可以提高动物的机体免疫力，维生素和微量元素还可以对动物进行额外的补充，进而提供动物的生产性能以及减少动物的发病率。

最后本发明中应用纳豆芽孢杆菌对藻类蛋白饲料进行发酵，可以在发酵过程产生多种益生菌，并且产生抗菌肽，能够促进动物的肠道健康。特别是目前中国全面进入禁抗时代，饲料中禁止使用任何抗生素，所以我们要通过提高动物免疫力，保障动物肠道健康，才能降低动物的发病几率。因为肠道健康的根本是营造和建立动物生长繁殖的适宜体内环境。动物八成以上的问题都是由于肠道不健康造成的。所以动物的肠道问题至关重要。

由于本发明中的藻类蛋白饲料的粗蛋白含量与鱼粉中的粗蛋白含量接近，所以在本发明的应用中，藻类蛋白饲料原料可以等量的替代鱼粉。如果藻类蛋白饲料与要替代的蛋白原料中的粗蛋白含量差异较大，在保证饲料中的营养成分满足动物需求的前提下，合理的对配方进行调整进行替代。因为每个饲料配方师都有自己的思路和经验去设计饲料配方，需要根据原料的价格，营养成分等各种可变的因素去合理的选择部分或者全部替代高蛋白的饲料原料。

Claims (7)

1.一种藻类蛋白饲料的制备方法，主要包括以下步骤：

将藻类原料粉碎过筛，调节水分至30-35％质量百分比，加入1％蛋白酶，加入纳豆芽孢杆菌Bacillus natto，37℃恒温发酵48-72h，发酵后进行固液分离，将固体部分烘干、粉碎，得到藻类蛋白饲料；

所述藻类原料的质量组成比例为，小球藻∶大螺旋藻∶尾丝藻＝2-4∶2-5∶3-4；

所述纳豆芽孢杆菌的接种量为5-12％；

所述纳豆芽孢杆菌为保藏菌种，保藏编号为：CGMCC No.20659；

所述蛋白酶来自保藏编号为：CGMCC No.20659的纳豆芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述藻类蛋白饲料的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：

将纳豆芽孢杆菌，按照12％的接种比例接入牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，37℃、180r/min下恒温培养24h，活菌数达到4.0～6.0×10⁸～4.0～6.0×10⁹cfu/g，以2％接种量接种至液体发酵培养基，37℃、180r/min下恒温培养48h后取发酵液，5000r/min离心10min，取上清液即为蛋白酶粗酶液；

将硫酸铵缓慢加入上述的粗酶液中，直至25％饱和度，4-8℃过夜，8000rpm离心30min取上清液；在上清液中加硫酸铵至终饱和度为60％，4-8℃过夜，8000rpm离心30min，收集沉淀，取100mg沉淀用10mL 20mm的PB缓冲溶液复溶后，进行凝胶层析，层析柱为XK 26/100，流速为3mL/min，然后将收集的滤液进行阳离子交换层析，阳离子交换层析柱为Hitrap SPFF，用pH值7.0的20mm PB缓冲溶液洗脱优化，流速为2mL/min，洗脱后收集滤液进行干燥后得到蛋白酶粉末。

3.根据权利要求1-2任一所述藻类蛋白饲料的制备方法，其特征在于，所述藻类原料的质量组成比例为：小球藻∶大螺旋藻∶尾丝藻＝2∶5∶3或4∶2∶4。

4.根据权利要求1-2任一所述藻类蛋白饲料的制备方法，其特征在于，所述藻类原料的质量组成比例为：小球藻∶大螺旋藻∶尾丝藻＝3∶4∶3。

5.根据权利要求1-2任一所述藻类蛋白饲料的制备方法，其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌的接种量为8％。

6.权利要求1-5任一所述制备方法制得的藻类蛋白饲料。

7.根据权利要求6所述的藻类蛋白饲料，其特征在于，所述饲料中粗蛋白含量60～70％、小肽含量12～16％、消化率90％以上、多糖含量20～25％、总维生素含量30-100mg/kg，其中胡萝卜素6.5mg/kg以上、维生素E 8.0mg/kg以上、烟酸40.0mg/kg以上。