CN103981118A - 一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用。所用菌株枯草芽孢杆菌WEI-2分离自60日龄健康仔猪粪便，能够耐受低pH环境和高浓度猪胆盐，在胃肠消化液中长时间保持活性，分泌高活性淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶，对大肠杆菌、沙门氏菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直径达到20-30mm。经过发酵后，与载体混合再利用喷雾干燥获得干燥活性菌粉，经载体稀释后获得饲料添加剂产品。该添加剂适合畜禽养殖全程使用，可以提高畜禽生产性能，促进畜禽生长，增强畜禽机体免疫力，降低幼龄动物死亡率，降低粪便排泄量，减少粪臭，改善养殖环境。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和在畜禽养殖中的应用，尤其适用于畜禽饲料添加剂，属于饲用微生物添加剂技术领域。
背景介绍
抗生素在畜禽产品中的长期使用带来的畜禽类产品的食品安全性问题已经越来越受到人们的关注，因为长期、大量使用抗生素、抗菌药物抑制病原菌的同时，动物肠道的正常菌群也受到抑制，动物肠道微生态平衡被破坏，耐药性、药物残留等问题给动物和人类的健康带来了巨大的威胁和危害，所以寻求有效、安全、绿色、天然的饲用抗生素替代产品，成为了畜禽养殖行业关注的热点问题。
微生态制剂是一种天然的活性微生物制剂，具有无毒、无抗药性、无残留、无副作用的特点。近年来，微生态制剂对于动物肠道微生态平衡的调节作用和提高动物机体免疫力，进而提高养殖动物的健康水平和生产性能的功效已经得到人们的普遍认可，是公认的饲用抗生素的最佳替代品之一。
枯草芽孢杆菌是农业部《饲料添加剂品种目录》所列菌种，是微生物饲料添加剂的常用菌种。枯草芽孢杆菌对人和动物没有毒性，在生长过程中可以产生高活性的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，能够促进畜禽对饲料的消化利用率；能够产生抑菌代谢物，抑制肠道病原菌的生长；该菌是严格好氧细菌，进入肠道后通过生物夺氧的作用为肠道乳酸菌类和双歧杆菌类厌氧微生物提供厌氧环境从而促进有益菌的生长，调节肠道微生态平衡。
因此，筛选一株性能优良的枯草芽孢杆菌，并开发出低成本、高产量，能长期保持活性的菌粉产品，对于发展绿色饲料，保证食品安全具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCCNo.7744。
从健康仔猪粪便中分离、筛选得到一株芽孢杆菌，经16S rDNA测序鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)，命名为WEI-2，并于2013年6月19日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.7744，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所邮编：100101电话：86-10-64807596。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744属革兰氏阳性细菌，杆状，芽孢中生或偏中生，孢囊膨大但不显著，7％氯化钠中生长，pH5.7生长，可利用阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，可利用葡萄糖和柠檬酸盐，水解淀粉，液化明胶，硝酸盐还原试验为阳性，V-P测定为阳性。生长温度范围在30-40℃，适宜pH值的范围7.0-8.0，是严格好氧菌。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744在pH为2-3的人工胃液中保持3h，存活率90％；在人工胃肠消化液中保持26h，活菌数可以维持在108CFU／mL，这个时间符合肠道生理周期，能够保证菌体发挥益生作用；在猪胆盐浓度为20g／L的人工猪胆盐溶液中，保持3h，存活率为75％，这个胆盐浓度远远高于动物体内的0.3g／L的平均胆盐浓度。
上述特性评价试验中，所述人工胃液包括如下成分：每1000mL水中含有胃蛋白酶3g，NaCl2g，用盐酸调pH至2-3；所述人工胃肠消化液包括如下成分：人工胃液pH调至3，人工肠液包括如下成分：每1000mL水中含有胰蛋白酶10g，KH2P047g，调pH至7.5，测试过程中，菌体在人工胃液中保持2h，然后接入人工肠液中保持24h；所述人工猪胆盐溶液成分包括：每1000mL水中含有胰蛋白酶1g，猪胆盐20g，NaCl5g，调pH至7.0。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的发酵上清液中同时具有淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的活性，三种酶的产量分别为246U／mL，683U／mL和152.6U／mL。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744对大肠杆菌、沙门氏菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直径达到20-30mm。
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WEI-2CGMCC No.7744是本发明过程中分离到的所有芽孢杆菌中生长速率和产孢速率最快，生物量和芽孢产量最高，生长稳定性最好的一株芽孢杆菌，适宜作为工业化生产菌株。该菌株在肉汤培养基中生长25h左右活菌数达到最大，为2.6×109CFU／mL，生长至36h左右芽孢产量达到最高，为2.1×109CFU／mL左右，产孢率大约为80％，菌株经多次传代和多次重复发酵试验，生长特性和产量稳定。
本发明的第二个目的是提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744作为畜禽饲料添加剂的制备方法。所述制备方法的具体步骤如下：
(1)斜面菌种的活化：从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的保藏甘油管中挑一环菌液划线于营养琼脂平板，于32-37℃，培养15-20h，使芽孢杆菌复壮，并长出单菌落，挑单菌落划线于斜面培养基进行活化，所述斜面培养基同样是营养琼脂，配方为：每1000mL水中含有：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15-20g，pH值为7.2-7.4，常规灭菌。
(2)种子摇瓶的制备：从上述活化好的斜面上挑一环菌种接于装有250-300mL液体种子 培养基的1000mL三角瓶中，于35-37℃，振荡培养20-30h，即得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的摇瓶种子液，活菌数为2×109CFU／mL，芽孢处于刚开始形成的状态。所述摇瓶种子培养基的配方为：每1000mL水中含有：蛋白胨20g，酵母膏10g，三水合磷酸氢二钾1g，一水合硫酸锰0.1g，pH值为7.4，常规灭菌。
(3)种子罐的培养：将上述制备好的摇瓶种子液按照1％(v／v)的接种量接入装有50L种子发酵培养基的100L种子发酵罐中，于35-37℃，培养20-25h，搅拌转速为250-300rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂。得到二级种子发酵液，活菌数为3.2×109CFU／mL，芽孢处于刚开始形成的状态。所述种子发酵培养基与摇瓶种子培养基的配方一致。
(4)生产发酵：将上述制备好的种子发酵液按照1-2％(v／v)的接种量接入装有2500L发酵培养基的5000L生产发酵罐中，于35-37℃，发酵25-30h，搅拌转速为250-300rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂。发酵结束获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的活菌发酵液，活菌数为5×109CFU／mL以上，芽孢产率为80％左右。所述发酵培养基的配方为：每1000mL水中含有：蛋白胨20g，酵母膏5g，葡萄糖10g，三水合磷酸氢二钾1g，一水合硫酸锰0.15g，七水合硫酸镁0.3g，pH值为7.2。
(5)发酵液后处理：发酵结束后的发酵液通过高速管式离心机富集菌体(15000-20000rpm)后转移至混合搅拌罐中，按照载体与菌泥的质量比为2∶1-3∶1的比例向混合搅拌罐中加入载体，混合均匀。同时将喷雾干燥设备的蒸汽压力保持在0.3-0.6MPa，进口温度达到180-200℃，出口温度达到110-140℃，塔内压力保持在-12-18Pa，然后打开进料罐阀门，开始水喷雾，待压力稳定，出口温度保持在80-90℃时，打开打浆泵，将菌泥与载体的混合物料打入缓冲罐，开始喷雾干燥，干燥过程中保持罐内压力及进出口温度的稳定，干燥后的干粉粉碎至80目以上，获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的活性干燥菌粉。利用营养琼脂平板对活性干燥菌粉进行计数，菌粉活菌数达到2×101CFU／g以上，根据计数结果，利用载体将活菌含量稀释至≥200亿CFU／g，得到成品菌粉。所述载体为可溶性淀粉。
本发明的第三个目的是提供枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744作为畜禽饲料添加剂在畜禽养殖中的应用，是将该添加剂成品菌粉以0.05-0.1‰的比例拌入畜禽全价饲料，用于畜禽养殖全程。经畜禽饲喂试验证明，本发明的饲料添加剂可以显著提高畜禽生产性能，促进畜禽生长，增强机体的抗病能力，降低幼龄动物死亡率，降低粪便排泄量，减少粪臭，改善养殖环境。
基于上述特性，本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744具有显著的益生特性，动物服用后可以通过胃液和胆盐，并在肠道中存活，其分泌的消化酶有助于提高饲料转化率，高效抑菌活性可以提高畜禽的健康状况。由该菌株制备的饲料添加 剂可以用作畜禽微生物饲料添加剂，具有提高畜禽生产性能，促进畜禽生长，增强畜禽机体免疫力，降低幼龄动物死亡率，降低粪便排泄量，减少粪臭，改善养殖环境的有益功效。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744对人工胃肠消化液的耐受性。图中前2h是菌株在人工胃液中的存活曲线，随后的24h是菌株从人工胃液转接至人工肠液后的存活曲线。
图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，其中无抑菌圈的是空白培养基对照组；有较大抑菌圈的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的培养液的上清液。
图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744在5000L生产发酵罐条件下的生长曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的分离和鉴定
称取60日龄健康仔猪的粪便1g，放入盛有99mL灭菌的0.85％生理盐水的三角瓶中(三角瓶中预先放入20粒无菌玻璃珠)，37℃，180rpm振荡30min，80℃处理15min，吸取1mL悬浊液做十倍递增梯度稀释，选取2-3个适宜稀释度，吸取0.1mL稀释液于无菌营养琼脂平板表面，每个稀释度做两个平行，用涂布棒均匀涂布，37℃培养24-48h。从平板上挑选不同形态的菌落划线纯化，分别保藏并进行16S rDNA的测序鉴定。
实施例二：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744耐受低pH胃液、人工胃肠消化液和猪胆盐
从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的保藏斜面(营养琼脂培养基)挑一环菌苔接于装有50mL肉汤培养基的300mL三角瓶中，于37℃，180rpm振荡培养30h，此时芽孢产量接近80％，将菌液在6000rpm的条件下离心10min，弃去上清，用灭菌的0.85％的生理盐水洗涤一次，再用同体积生理盐水悬浮。吸取10mL悬浮菌液分别接于装有90mL pH分别为1、2、3、4、5的人工胃液和90mL人工猪胆盐溶液的500mL三角瓶中，猪胆盐浓度分别为3g／L、5g／L、10g／L、15g／L、20g／L，以不加胆盐的样品为对照。然后在37℃，静置培养180min，分别于初始接种、30min、60min、120min、180min对培养 物进行活菌计数，绘制活菌数变化曲线，计算菌株在不同pH人工胃液和不同浓度人工胆盐中保温180min时的存活率。菌株在pH为3的人工胃液中保温2h后吸取10mL菌悬液接于装有90mL人工肠液的500mL三角瓶中，同样在37℃，静置培养，分别于初始接种、3h、6h、21h、24h对培养物进行活菌计数，绘制活菌数变化曲线。
测定结果显示，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744以孢子形式在pH高于1的人工胃液中保持180min(3h)，存活率达到90％以上；在浓度为20g／L的人工猪胆盐溶液中保持180min(3h)，存活率为75％；在人工消化液中保持26h，活菌数可以维持在108CFU／mL，这个时间符合肠道生理周期，能够保证菌体发挥益生作用。上述结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744能够耐受酸性环境，耐受高浓度猪胆盐，并且能够在消化液中保持足够长的存活时间，说明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744是一株高抗逆性益生芽孢杆菌，可以经过畜禽的胃、十二指肠，最终以较高的活性状态达到小肠，发挥益生作用。
实施例三：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的产酶特性
在检测分离到的芽孢杆菌的产酶活性时，发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744在可溶性淀粉平板、酪素平板和刚果红纤维素平板上均有较大的透明圈。随后将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的单菌落接种于肉汤培养基中，37℃，180rpm，振荡培养25-30h，10000rpm离心10min，获得上清液。分别用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)、福林-酚法和以羧甲基纤维素钠为底物检测还原糖的方法测定上清液中淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的活性，结果表明，发酵上清液中同时具有上述三种酶的活性，三种酶的活力分别为246U／mL，683U／mL和152.6U／mL。
实施例四：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的抑菌活性
1.培养液上清的制备
从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的保藏斜面挑一环菌苔接种于肉汤培养基中，37℃，180rpm振荡培养22h，此时菌体即将产生芽孢，取1mL菌液12000rpm离心1min，取上清液。
2.抑菌活性检测平板的制备
将15mL完全熔化的LB琼脂培养基倒入培养皿中，待其凝固后垂直放上牛津杯；另取完全熔化的LB琼脂培养基，待其冷却到55℃时加入指示菌混匀，取10mL混有指示菌的培养基倒入放有牛津杯的培养皿中，待完全凝固后拔出牛津杯，制成检测平板。所述指示菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌。
3.抑菌活性的测定
取200μL培养液上清加入检测平板的孔中，4℃放置24h后放入37℃培养箱中培养20h，测得抑菌圈直径大小为20-30min。
实施例五：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的生长发酵特性
从本发明过程中分离到的所有芽孢杆菌中，挑选了初筛效果良好的10株经过鉴定为枯草芽孢杆菌，并且性状优良的菌株进行复筛，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744，比较这些菌株的生长发酵特性。从10株菌的营养琼脂活化平板上分别挑取单菌落接于装有250mL肉汤培养基的1000mL三角瓶中，于37℃，180rpm振荡培养，定时取样镜检观察，分别于刚产生芽孢和不再产生芽孢的两个时间点取样，利用10倍递增稀释涂布法测定活菌数，对于不再产生芽孢的时间点，停止培养，将培养液在80℃条件下处理15min后，同样进行10倍递增稀释涂布测定芽孢数，测定结果见表1。所测的10株枯草芽孢杆菌中，综合菌株的生长速率、产孢速率、生物量和产孢率四个指标的测定结果，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744优于其余菌株。进一步对该菌株连续传代，每一代均进行生长特性测试，结果表明，经过10代的培养，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的生长速率、产孢速率、产量等发酵性能均保持稳定，该菌株适合作为工业生产菌株。
表110株枯草芽孢杆菌的生长发酵特性
实施例六：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744作为畜禽饲料添加剂的制备
根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的生长和产孢特性，经过培养基优化和发酵条件优化，最终形成了最优的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744畜禽饲料添加剂的制备工艺。具体如下：
(1)斜面菌种的活化：从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的保藏甘油管中挑一环菌液划线于营养琼脂平板，于32-37℃，培养15-20h，使芽孢杆菌复壮，并长出单菌落，挑单菌落划线于斜面培养基进行活化，所述斜面培养基同样是营养琼脂，配方为：每1000mL水中含有：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15-20g，pH值为7.2-7.4，常规灭菌。
(2)种子摇瓶的制备：从上述培养好的斜面上挑一环菌种接于装有250mL液体种子培养基的1000mL三角瓶中，于35-37℃，振荡培养20-30h，即得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的摇瓶种子液，活菌数为2×109CFU／mL，芽孢处于刚开始形成的状态。所述摇瓶种子培养基的配方为：每1000mL水中含有：蛋白胨20g，酵母膏10g，三水合磷酸氢二钾1g，一水合硫酸锰0.1g，pH值为7.4，常规灭菌。
(3)种子罐的培养：将上述制备好的摇瓶种子液按照1％(v／v)的接种量接入装有50L种子发酵培养基的100L种子发酵罐中，于35-37℃，培养20-25h，搅拌转速为250-300rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂，得到一级种子发酵液，活菌数为3.2×109CFU／mL，芽孢处于刚开始形成的状态。所述种子发酵培养基与摇瓶种子培养基的配方一致。
(4)生产发酵：将上述制备好的种子发酵液按照1-2％(v／v)的接种量接入装有2500L发酵培养基的5000L生产发酵罐中，于35-37℃，发酵25-30h，搅拌转速为250-300rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂。发酵结束获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的活菌发酵液，活菌数为5×109CFU／mL以上，芽孢产率为80％左右。所述发酵培养基的配方为：每1000mL水中含有：蛋白胨20g，酵母膏5g，葡萄糖10g，三水合磷酸氢二钾1g，一水合硫酸锰0.15g，七水合硫酸镁0.3g，pH值为7.2。
(5)发酵液后处理：发酵结束后的发酵液通过高速管式离心机富集菌体(15000-20000rpm)后转移至混合搅拌罐中，按照载体与菌泥的质量比为2∶1-3∶1的比例向混合搅拌罐中加入载体，混合均匀。同时将喷雾干燥设备的蒸汽压力保持在0.3-0.6MPa，进口温度达到180-200℃，出口温度达到110-140℃，塔内压力保持在-12-18Pa，然后打开进料罐阀门，开始水喷雾，待压力稳定，出口温度保持在80-90℃时，打开打浆泵，将菌泥与载体的混合物料打入缓冲罐，开始喷雾干燥，干燥过程中保持罐内压力及进出口温度的稳定，干燥后的干粉粉碎至80目以上，获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的活性干燥菌粉。利用营养琼脂平板对活性干燥菌粉进行计数，菌粉活菌数达到2×1011CFU／g以上，根据计数结果，利用载体将活菌含量稀释至≥200亿CFU／g，得到成品菌粉。所述载体为可溶性淀粉。
实施例七：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744作为畜禽饲料添加剂对于蛋鸡生产性能的影响
试验选用北京郊区某蛋鸡养殖场提供的150日龄罗曼褐蛋鸡720只，分为4组，每组6个重复，每个重复30只鸡。对照组饲喂基础日粮(表2)，试验1、2、3组分别饲喂在基础日粮中添加0.05‰、0.1‰和0.15‰本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744成品菌粉的日粮。试验期所有实验条件保持一致，密闭式鸡舍，阶梯式两层笼养，每笼15只，专人负责，每天光照恒定16h，自然通风，自由采食、饮水，保持栏舍清洁卫生。预饲期7天，正试期56天，试验在提供试验动物的蛋鸡养殖场进行。试验期间每天观察鸡群健康状况及采食状况，测定并记录各项参数指标，结果见表3和表4。
由表3的结果可以看出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744对于蛋鸡产蛋性能的影响。与对照组相比，试验1、2组的全期平均蛋重、平均日产蛋量、产蛋率显著提高，死淘率、破蛋率和料蛋比显著降低，表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCCNo.7744的成品菌粉在基础日粮中的添加剂量为0.05-0.1‰时，可以明显提高蛋鸡对饲料的消化利用率和生产性能。然而，当添加剂量增加至0.15‰时，与对照组相比，蛋鸡的全期平均蛋重显著降低，死淘率明显升高，平均日产蛋量、产蛋率和平均日耗料量均没有显著改善，虽然破蛋率明显低于对照组，但是却显著高于其余两个剂量组，这些结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744成品菌粉在基础日粮中的添加剂量过高(>0.1‰)并不能对蛋鸡的产蛋性能产生更好的影响。
由表4的结果可以看出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744对于蛋鸡蛋品质的影响。与对照组相比，试验1、2组的A级蛋的比例、蛋比重、蛋黄比率、蛋壳厚度均有显著增加，蛋形指数更适合孵化率的提高。但是当成品菌粉的添加剂量增加至0.15‰时，这些指标与对照组相比均没有显著差异，表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCCNo.7744成品菌粉在蛋鸡基础日粮中的添加剂量不是越高越好，最佳剂量可以控制在 0.05-0.1‰。
表2基础日粮组成及营养水平
注：*预混料可为每kg全价料提供：VA8800IU，VD31980IU，VE11IU，VK31.1mg，VB11.65mg，VB26.6mg，VB32.42mg，VB522mg，VB62.2mg，VB120.033mg，生物素0.88mg，叶酸0.88mg，Cu24mg，Fe1.08mg，Mn84mg，Zn72mg，I0.456mg，Se0.24mg。
表3不同添加剂量组对蛋鸡产蛋性能的影响
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)
表4不同添加剂量组对蛋品质的影响
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)
实施例八：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744作为畜禽饲料添加剂对断奶仔猪的影响
本次饲喂试验在北京郊区某生猪养殖场进行，并从该猪场选用25日龄杜洛克×长白×大白三元杂交健康断奶仔猪240头，所有仔猪的出生日期相差3天以内，且21日龄左右断奶，体重相近，母猪的胎次、仔猪的性别比例尽量保持一致，随机分为4组，每组6个重复，每个重复10头，组间体重差异不显著，每组的性别比例尽量一致。对照组饲喂基础日粮(表5)，试验1、2、3组分别饲喂在基础日粮中添加0.025‰、0.05‰和0.1‰本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744成品菌粉的日粮。饲喂时间共37天，预饲期7天，正试期30天，试验期间，试验猪和对照猪在相同环境和管理条件下饲养，自由采食，自由饮水，按照猪场正常程序注射疫苗、驱虫和去势。
试验起始和结束时早晨空腹称重，记录每天的饲料实际消耗量，每天上午定时观察仔猪健康状况和排便情况，并做记录。于实验结束时的早晨8点，对空腹仔猪进行前腔静脉采血15mL，用于测定血清免疫学指标，同时收集仔猪粪便，利用相应的分离培养基和培养条件对 粪便中不同微生物进行活菌计数，利用复合式气体自动检测仪测定粪样中氨气含量。试验结果见表6-表9。
由表6的结果可以看出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744对于断奶仔猪生长性能的影响。与对照组相比，当枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCCNo.7744的成品菌粉添加剂量在0.05-0.1‰的范围内时，断奶仔猪的体重增加量明显高于对照组，而添加剂量为0.025‰时仔猪的体重增加与对照组没有显著差异，表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744对于断奶仔猪具有促生长作用，且最适添加剂量为0.05-0.1‰。同样地，试验1组与对照组的头均耗料量差异不显著，但是试验2、3组的头均耗料量比对照组明显增加，说明饲料中添加一定剂量的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744有助于提高断奶仔猪的采食量，增进猪只的食欲；从料重比的结果来看，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的成品菌粉添加剂量在0.05-0.1‰的范围内时，料重比显著优于试验1组和对照组，说明本发明的芽孢杆菌制剂还可以促进断奶仔猪对于饲料营养成分的消化吸收，大大提高了猪场的养殖效率。
由表7的结果可以看出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744对于断奶仔猪健康水平的影响。在整个试验期间，对照组猪只的皮毛肤色相对实验组暗，且有疾病和因病死亡的情况发生，而实验组的猪只则皮红毛亮、食欲旺盛，体型均匀，整齐度良好，虽然试验1组也出现疾病和因病死亡的情况，但是发病率和死亡率均明显低于对照组，而试验2、3组均没有出现疾病和死亡的情况。另外，从腹泻率的统计结果来看，猪只食用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744后腹泻率均比对照组显著下降，而且以试验2、3组最低。说明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744能够显著提高断奶仔猪的健康水平和疾病抵抗能力，能够显著降低幼龄动物的死亡率，添加剂量以0.05-0.1‰为最佳。
由表8的结果可以看出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744对于断奶仔猪机体免疫力的影响。通过测定对照组与试验组的IgG、IgM和IgA，以及补体C3和C4的含量水平，结果表明，虽然实验组的补体水平与对照组没有显著差异，但是三种抗体的水平尤其是试验2、3组显著高于对照组，说明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCCNo.7744可以显著提高断奶仔猪体液特异性免疫功能，而且添加剂量以0.05-0.1‰为最佳。
由表9的结果可以看出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744对于断奶仔猪粪便微生物组成及粪臭的影响。与对照组相比，试验组粪便中的大肠杆菌数量明显降低，乳酸菌与双歧杆菌的数量显著增加，表明肠道中的有益菌数量明显升高。试验2、3组的粪便氨气含量明显低于对照组和试验1组，而且试验期间，观察猪舍的卫生情况，试验2、3组的粪便排泄量、粪臭及猪舍环境均好于对照组，试验1组略好于对照组。说明猪只服用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744后，对于降低断奶仔猪的粪便排泄量， 减少粪臭，改善猪舍养殖环境有显著的功效。
表5基础日粮组成及营养水平
表6不同添加剂量组对断奶仔猪生长性能的影响
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P〈0.05)，肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)
表7不同添加剂量组对断奶仔猪健康水平的影响
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母表示差异不显著(P〉0.05)
表8不同添加剂量组对断奶仔猪血清免疫学指标的影响
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)
表9不同添加剂量组对断奶仔猪粪便微生物数量及粪便氨气产量的影响
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P〈0.05)，肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)
综合实施例七和例八的结果可以看出，本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subitlis)WEI-2CGMCC No.7744的活性菌粉产品适合用作畜禽微生物饲料添加剂，当以日粮的0.05-0.1‰的剂量添加时，可以提高畜禽生产性能，促进畜禽生长，增强畜禽机体免疫力，降低幼龄动物死亡率，降低粪便排泄量，减少粪臭，改善养殖环境。
Claims (5)
1.一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为WEI-2，保藏编号为CGMCC No.7744。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用，其特征在于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744作为畜禽饲料添加剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)斜面菌种的活化：从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的保藏甘油管中挑一环菌液划线于营养琼脂平板，于32-37℃，培养15-20h，使芽孢杆菌复壮，并长出单菌落，挑单菌落划线于斜面培养基进行活化，所述斜面培养基同样是营养琼脂，配方为：每1000mL水中含有：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15-20g，pH值为7.2-7.4，常规灭菌。
(2)种子摇瓶的制备：从上述培养好的斜面上挑一环菌种接于装有250-300mL液体种子培养基的1000mL三角瓶中，于35-37℃，振荡培养20-30h，即得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的摇瓶种子液。所述摇瓶种子培养基的配方为：每1000mL水中含有：蛋白胨20g，酵母膏10g，三水合磷酸氢二钾1g，一水合硫酸锰0.1g，pH值为7.4，常规灭菌。
(3)种子罐的培养：将上述制备好的摇瓶种子液按照1％(v／v)的接种量接入装有种子发酵培养基的种子发酵罐中，于35-37℃，培养20-25h，搅拌转速为250-300rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂，得到二级种子发酵液。所述种子发酵培养基与摇瓶种子培养基的配方一致。
(4)生产发酵：将上述制备好的种子发酵液按照1-2％(v／v)的接种量接入装有发酵培养基的生产发酵罐中，于35-37℃，发酵25-30h，搅拌转速为250-300rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂。发酵结束获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的活菌发酵液。所述发酵培养基的配方为：每1000mL水中含有：蛋白胨20g，酵母膏5g，葡萄糖10g，三水合磷酸氢二钾1g，一水合硫酸锰0.15g，七水合硫酸镁0.3g，pH值为7.2。
(5)发酵液后处理：发酵结束后的发酵液通过高速管式离心机富集菌体后转移至混合搅拌罐中，按照载体与菌泥的质量比为2∶1-3∶1的比例向混合搅拌罐中加入载体，混合均匀。同时将喷雾干燥设备的蒸汽压力保持在0.3-0.6MPa，进口温度达到180-200℃，出口温度达到110-140℃，塔内压力保持在-12-18Pa，然后打开进料罐阀门，开始水喷雾，待压力稳定，出口温度保持在80-90℃时，打开打浆泵，将菌泥与载体的混合物料打入缓冲罐，开始喷雾干燥，干燥过程中保持罐内压力及进出口温度的稳定，干燥后的干粉粉碎至80目以上，获得枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)WEI-2CGMCC No.7744的活性干燥菌粉。利用营养琼脂平板对活性干燥菌粉进行计数，根据计数结果，利用载体将活菌含量稀释至≥200亿CFU／g，得到成品菌粉。所述载体为可溶性淀粉，所述高速管式离心机收集菌体的转速为15000-20000rpm。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用，其特征在于枯草芽孢杆菌WEI-2作为畜禽饲料添加剂的应用。
4.根据权利要求3所述的畜禽饲料添加剂的应用，其特征在于：适用于畜禽养殖全程使用。
5.根据权利要求3所述的畜禽饲料添加剂的应用，其特征在于：按照0.05-0.1‰拌全价饲料。
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