CN102178057A - 枯草芽孢杆菌及其饲料添加剂和发酵剂 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一株枯草芽孢杆菌及其饲料添加剂和发酵剂。本发明的枯草芽孢杆菌具有良好的抗逆性功能和益生功能：可以耐受pH2.0，1％胃蛋白酶的人工胃液、可以耐受0.3％的人工胆盐、可以耐受80℃的制粒温度；对大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌有较强抑制作用，产纤维素酶能力较强，可以降解纤维素。用本发明的枯草芽孢杆菌制备的生物饲料添加剂在畜禽、水产养殖中可以部分替代抗生素的使用，提高动物免疫力，提高饲料转化率，降低养殖成本。本发明的枯草芽孢杆菌的另一用途是可以用于豆粕、棉粕或菜粕等的发酵，可以防止饲料霉变，促进饲料中纤维素的消化，提高饲料中营养的利用率。

Description

枯草芽孢杆菌及其饲料添加剂和发酵剂

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其饲料添加剂和发酵剂。

背景技术

在我国，抗生素等抗菌药物的滥用造成了药物残留以及大量耐药性细菌产生，其结果严重阻碍了畜、禽、水产养殖业的健康持续发展，为食品安全和消费者的身体健康埋下了隐患，因此寻找安全、无残留的抗生素替代品迫在眉睫。包含益生菌的生物饲料添加剂是一种十分理想的抗生素替代品，而益生菌是开发质量稳定、效果明显、性价比高的生物饲料添加剂的重要基础。但益生菌的研究和开发的瓶颈问题是优良菌株的分离和筛选。目前益生菌菌种存在以下3大问题：(1)很难突破胃酸和胆汁的屏障，真正能够进入动物肠道内并扩繁的菌种并不多；(2)难以耐受饲料制粒的高温；(3)菌种的产酶、抑菌能力差。

发明内容

本发明的目的在于提供一株抗逆性强、益生功能优秀的益生菌——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，此菌有良好的抗逆性功能和益生功能：耐人工胃酸、耐胆盐、耐高温、对大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌有较强抑制作用、产纤维素酶能力较强，可以降解纤维素。

本发明的另一目的是提供了该枯草芽孢杆菌的应用。

本发明还提供了包含该枯草芽孢杆菌的饲料添加剂和发酵剂。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一株枯草芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.4628。

其中，该菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的枯草芽孢杆菌可用于制备饲料添加剂。

其中，本发明的枯草芽孢杆菌在用于制备饲料添加剂中，主要用于畜、禽或水产养殖的饲料添加剂，如：鸡、鸭、猪、牛、羊、鱼等的饲料添加剂。

本发明的枯草芽孢杆菌也可用于制备发酵剂。

其中，本发明的枯草芽孢杆菌在用于制备发酵剂中，主要用于豆粕、棉粕或菜粕发酵中的发酵剂。

本发明还提供包含该枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，其特征在于枯草芽孢杆菌的添加量为10⁷-10⁹CFU/Kg。

进一步，枯草芽孢杆菌的添加量为10⁸CFU/Kg。

本发明还提供了包含该枯草芽孢杆菌的发酵剂，其特征在于枯草芽孢杆菌的添加量为10⁷-10⁹CFU/Kg。

进一步，枯草芽孢杆菌的添加量为10⁸CFU/Kg。

其中，发酵枯草芽孢杆菌时用的发酵培养基由如下成分组成：蔗糖8-15g/L，蛋白胨3-7g/L，牛肉膏1-5g/L，酵母浸粉0.5-2g/L，七水合硫酸镁0.5-2g/L，硫酸锰0.0005g/L，pH 6.5-7.5。

进一步，发酵培养基由如下成分组成：蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，酵母浸粉1g/L，七水合硫酸镁0.5-g/L，硫酸锰0.0005g/L，pH 7.0。

发酵条件为：发酵温度为25-35℃，发酵时间为12-24小时，pH值为6.5-7.5，转速为150-250rpm，初始接种量为1-5％。

优选地，发酵条件为：发酵温度为28℃，发酵时间为14小时，pH值为7.0，转速为180rpm，初始接种量为2％。

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为申请人从传统发酵豆豉中分离得到，其生物学特征如下：菌落表面粗糙起皱，不透明，污白色，菌落圆形，边缘呈锯齿状，革兰氏阳性菌；芽孢形态为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。本发明的枯草芽孢杆菌经过耐人工胃液、胆盐及耐热性筛选；又经过产酶能力筛选和抑菌能力筛选，显著区别于现有的枯草芽孢杆菌，本发明的枯草芽孢杆菌可以耐受pH2.0，1％胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3％的人工胆盐，可以耐受80℃的制粒温度，可以抑制致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，具有较强的产纤维素酶的能力，可以降解纤维素。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)已于2011年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.4628。

本发明的其它有益效果在于：

(1)本发明的枯草芽孢杆菌的抗逆性强，可以耐受制粒高温，耐受人工胃液，人工胆盐，因此在经过饲料制粒，动物胃肠道环境后，还有大量活菌可以顺利进入动物的肠道，在肠道中发挥益生功能，提高动物免疫力，降低养殖成本；

(2)本发明的枯草芽孢杆菌可以有效抑制动物肠道常见致病菌大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌；

(3)本发明的枯草芽孢杆菌可以产生纤维素酶，有利于动物消化吸收饲料中的纤维素；

(4)本发明的枯草芽孢杆菌经过培养和发酵可作为生物饲料添加剂添加到养殖动物的饮水或饲料中，改善动物肠道健康，提升动物免疫力，增加动物的生产性能；

(5)本发明的枯草芽孢杆菌还可以作为发酵剂发酵豆粕、棉粕或菜粕，可以抑制霉菌的产生，增加养殖动物对豆粕、棉粕和菜粕中营养成分的吸收。

附图说明

图1发酵豆粕与豆粕的对比照片。左图为添加枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628 10⁸CFU/kg的发酵豆粕，右图为空白对照。

通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式

实施例1枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628的筛选

1、初筛

纳豆、豆豉、腐乳、猪粪、鸡粪、牛粪等样品各5克，浸泡于20ml灭菌0.85％生理盐水，震荡打散样品，使样品充分和生理盐水接触，90℃恒温水浴锅静置10分钟，取上清5ml，5000rpm离心10分钟，弃去上清。菌体沉淀加入10ml人工胃液中，37℃静置2小时。5000rpm离心10分钟，弃去上清，将菌体沉淀加入10ml人工胆盐中，37℃静置4小时。震荡混匀后，梯度稀释涂LB培养基。30℃培养箱培养12-24个小时后，纯化菌落。得到纳豆样品中分离出的N-1、N-2菌，豆豉样品中分离出的C-1(CGMCC No.4628)、C-2菌，腐乳样品中没有分离到菌落，猪粪中分离出Z-1、Z-2菌，鸡粪中分离出J-1、J-2菌，牛粪中分离出F-1、F-2菌。初筛得到的菌株再进行进一步复筛。

生理盐水的配置方法是：0.85％的氯化钠，高压灭菌后备用。

人工胃液的配制方法是：1％胃蛋白酶，0.85％的氯化钠，用HCl调pH值到2.0，细菌过滤器过滤备用。

人工胆盐的配置方法是：在液体肉汤中添加0.3％的猪胆盐(分析纯)，高压灭菌后备用。

LB固体培养基的制作方法是：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂1.5％，pH7.0，高压灭菌后备用。

2、复筛

(1)产纤维素酶能力的筛选

用无菌牙签将分离纯化出的菌株在0.5％羧甲基纤维素的LB～CMC培养基上进行点菌，30℃培养24h，用0.1％刚果红染色1小时，弃去染料，再用1M NaCl溶液洗涤1小时，根据菌落周围有无出现水解透明圈，测定透明圈与菌落直径，计算透明圈直径与菌落直径比值(H/C)，发现N-1、C-1(CGMCC No.4628)、C-2的水解透明圈较大，其中C-1的水解透明圈最大(表1)。

LB～CMC培养基的配置方法是：羧甲基纤维素0.5％，胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，高压灭菌20min。

表1  水解透明圈与菌落直径比值(H/C)

(2)抑菌能力测定

将LB固体培养基融化，冷却至45℃。加入过夜培养的E.coli K88、K99和金黄色葡萄球菌(每毫升培养基加入1微升菌液)，震荡混匀，倒入无菌平板，水平凝固，在每个琼脂平板上轻轻放置4只牛津杯，其间距应相等。每只牛津杯中加入200μL待测菌液(N-1、C-1和C-2各做2-3个重复)，盖好皿盖，小心移至37℃培养箱，平皿正放静置培养。培养20小时后，打开皿盖，移去牛津杯，用卡尺测量抑菌圈直径(表2)。实验结果表明C-1菌(CGMCC No.4628)的抑菌能力最强。

表2  抑菌圈的测定

实施例2枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628的鉴定

(1)枯草芽孢杆菌C-1(CGMCC No.4628)的初步鉴定

观察筛选出来的C-1(CGMCC No.4628)菌的菌落形态，革兰氏染色后观察细菌形态特征。菌落表面粗糙起皱，不透明，污白色，菌落圆形，边缘呈锯齿状，革兰氏阳性菌。芽孢形态为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。初步推测为芽孢杆菌属菌株。

(2)枯草芽孢杆菌C-1(CGMCC No.4628)的分子鉴定

利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上游引物5’-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，见SEQ ID NO.2和下游引物5′-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3，见SEQ ID NO.3扩增细菌16S rRNA基因片段。反应体系50μL：10×PCR缓冲液5μL、引物(20μmol/L)各0.5μL、dNTP(2.5mmol/L)5μL、Taq酶(5U/μL)0.5μL、模板DNA 1μL、水补足至50μL。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，进行30个循环，72℃延伸5min。2％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增片段的测序结果见SEQ IDNO.1。

C-1菌(CGMCC No.4628)经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。实施例3枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628菌粉的制备

取过夜培养的枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628 10mL转接入500ml发酵培养基(初始接种量为2％)，28℃发酵14小时，pH值为7.0，转速为180rpm。发酵后，菌体离心，60℃烘干，菌粉4℃保存。

平板菌落计数法检测菌粉的活菌数约为10¹⁰CFU/g。

发酵培养基的组成为：蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，酵母浸粉1g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.0005g/L，pH 7.0。

平板菌落计数法的操作方法为：待测样品经适当倍数稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样品涂布到平板上，经过培养，每个单细胞生长繁殖形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的活菌数。实施例4枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628抗逆性的验证

(1)制粒高温的耐受性

将0.5g菌粉溶于4.5mL灭菌生理盐水的玻璃试管中，用平板菌落计数法计算活菌数。将玻璃试管在90℃水浴锅中加热10分钟后，迅速冷却到室温，平板菌落计数法计算残存活菌数，残存活菌数为95.4％。

(2)人工胃液的耐受性

将0.5g菌粉溶于4.5mL灭菌生理盐水的玻璃试管中，用平板菌落计数法计活菌数。取0.5mL上述菌液加入4.5mL人工胃液中，37℃静置2小时，平板菌落计数法计残存活菌数，残存活菌数为93.7％。

(3)人工胆盐的耐受性

将0.5g菌粉溶于4.5mL灭菌生理盐水的玻璃试管中，用平板菌落计数法计活菌数。取0.5mL上述菌液加入4.5mL人工胆盐培养基中，37℃静置2小时，平板菌落计数法计残存活菌数，残存活菌数为97.7％。

验证性实验表明本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628的抗逆性强，可以耐受制粒高温，耐受人工胃液，人工胆盐，因此在经过饲料制粒，动物胃肠道环境后，还有大量活菌可以顺利进入动物的肠道，在肠道中存活，发挥益生功能。

实施例6枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628益生功能验证

(1)抑菌功能验证

过夜培养的致病性大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌菌液用平板菌落计数法计数。分别在3管4.5ml的大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌菌液中加入0.5g枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628的菌粉，37℃培养4小时，平板菌落计数法计算残存的大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌的活菌数。残存致病性大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌的活菌数为24.7％、28.8％和30.4％。

(2)产纤维素酶能力的验证

以2％接种量接种枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628菌粉到1000ml LB培养基，28℃发酵14小时，滴20uL发酵液在含0.5％羧甲基纤维素的LB～CMC培养基平板上，观察纤维素水解透明圈大小，计算水解透明圈直径与菌落直径比值为3.0。。

实施例7枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628在发酵豆粕中的应用

将豆粕和水以1∶0.5的比例充分混匀，以1％的接种量接种枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628菌粉，添加量为10⁸CFU/Kg，发酵温度为30℃，发酵时间为3d。发酵容器为250mL的锥形瓶，装满后放在培养箱中进行发酵。空白对照为不接种枯草芽孢杆菌菌粉的豆粕和水(1∶0.5)的混合物，对照1为1％接种量接种枯草芽孢杆菌(申请号200710120407.8中所用的枯草芽孢杆菌)菌粉的豆粕和水(1∶0.5)的混合物，对照2为1％接种量接种枯草芽孢杆菌C-2的豆粕和水(1∶0.5)的混合物。

结果：与空白对照相比，豆粕经过枯草芽孢杆菌发酵后，其颜色、粘稠度和风味明显改善(图1)，其中接种枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628的发酵豆粕比接种枯草芽孢杆菌(申请号200710120407.8中所用的枯草芽孢杆菌)的发酵豆粕和接种枯草芽孢杆菌C-2的发酵豆粕的颜色、粘稠度和风味改善更为明显。在室温继续放置未发酵豆粕和发酵豆粕一周后，观察到未发酵豆粕被霉菌污染，发酵豆粕未被霉菌污染。放置两周后，枯草芽孢杆菌(申请号200710120407.8中所用的枯草芽孢杆菌)发酵豆粕和枯草芽孢杆菌C-2发酵豆粕被霉菌污染，枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628发酵豆粕未被霉菌污染，说明枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628具有防止霉菌感染的功效，且作用比枯草芽孢杆菌(申请号200710120407.8中所用的枯草芽孢杆菌)和枯草芽孢杆菌C-2更佳。

实施例8枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628作为饲料添加剂的应用

将126头健康的28±2日龄杜×长×大三元杂交断奶仔猪(体重平均为7.5±0.12kg)按公母各半的原则随机分为7组，每组3个重复，每个重复6头猪，组1是空白对照组，饲喂基础日粮，组2饲喂金霉素添加量为75mg/kg的基础日粮，组3、组4、组5分别饲喂添加10⁷CFU/kg、10⁸CFU/kg、10⁹CFU/kg枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628菌粉的基础日粮，组6饲喂添加枯草芽孢杆菌(申请号200710120407.8中所用的枯草芽孢杆菌)10⁸CFU/kg的基础日粮，组7饲喂添加枯草芽孢杆菌C-2菌粉10⁸CFU/kg的基础日粮。自由采食和自由饮水。试验期间按猪场常规方法进行饲养管理。试验第21天晚上8点停止喂料，照常供水，于次日早上对猪只空腹称重，计算试验的平均日增重，平均日采食量与饲料转化效率。

腹泻频率＝(腹泻仔猪头数×仔猪腹泻天数)/(试验仔猪头数×正试期天数)×100％。

结果见表3。

表3枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628对断乳仔猪生长性能的影响

注：同行数据肩注字母不同表示差异显著(p＜0.05)

结果表明：108CFU/kg添加量的枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628可以显著改善断奶乳猪的生长性能。整个试验期，添加枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628组的日增重和采食量显著高于空白对照组(P＜0.05)，料重比显著低于空白对照组(P＜0.05)，腹泻率明显低于空白对照组和抗生素组。和组6、组7相比，饲喂枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628的组比饲喂枯草芽孢杆菌(申请号200710120407.8中所用的枯草芽孢杆菌)和饲喂枯草芽孢杆菌C-2菌组的日增重、采食量、料重比和腹泻率明显改善。试验证明，在仔猪的日粮中添加本发明量的枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628能显著提高仔猪的采食量，促进饲料利用率，提高仔猪的生长速度和日增重，使猪只的生产性能得到很大提高，也可替代部分抗生素，预防仔猪腹泻的发生。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC No.4628。

2.如权1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于该菌的16S rRNA基因序列如SEQID NO：1所示。

3.权1或权2所述的枯草芽孢杆菌在制备饲料添加剂中的应用。

4.如权3所述的枯草芽孢杆菌在制备饲料添加剂中的应用，其特征在于所述的饲料添加剂为应用于畜、禽或水产养殖的饲料添加剂。

5.权1或权2所述的枯草芽孢杆菌在制备发酵剂中的应用。

6.如权5所述的枯草芽孢杆菌在制备发酵剂中的应用，其特征在于所述的发酵剂为用于豆粕、棉粕或菜粕发酵中的发酵剂。

7.一种包含权1或权2所述的枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，其特征在于枯草芽孢杆菌的添加量为10⁷-10⁹CFU/Kg。

8.如权7所述的饲料添加剂，其特征在于枯草芽孢杆菌的添加量为10⁸CFU/Kg。

9.一种包含权1或权2所述的枯草芽孢杆菌的发酵剂，其特征在于枯草芽孢杆菌的添加量为10⁷-10⁹CFU/Kg。

10.如权9所述的发酵剂，其特征在于枯草芽孢杆菌的添加量为10⁸CFU/Kg。

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