KR101465233B1 - 감태와 바실러스 속 is-2 균주를 포함하고 있는 어류용 사료 첨가제 - Google Patents

감태와 바실러스 속 is-2 균주를 포함하고 있는 어류용 사료 첨가제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항균활성 및 알긴산 분해활성을 가지는 바실러스 속 (Bacillus sp.) IS-2 균주, 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 및 프로바이오틱스 제제, 감태에 상기 균주를 첨가하여 발효한 감태 발효액, 상기 균주 또는 감태 발효액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제, 감태를 포함하는 배지 조성물에 바실러스 속 IS-2 균주를 넣고 배양하는 단계를 포함하는 사료 첨가제의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 사료 첨가제를 포함하는 사료 및 상기 사료를 어류에 급이하여 어류 병원성 세균에 대한 면역력을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

감태와 바실러스 속 IS-2 균주를 포함하고 있는 어류용 사료 첨가제{Feed additive for fish comprising Ecklonia cava and Bacillus sp. IS-2 strain}
본 발명은 감태와 바실러스 속 IS-2 균주를 포함하고 있는 어류용 사료 첨가제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항균활성 및 알긴산 분해활성을 가지는 바실러스 속 (Bacillus sp.) IS-2 균주, 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 및 프로바이오틱스 제제, 감태에 상기 균주를 첨가하여 발효한 감태 발효액, 상기 균주 또는 감태 발효액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제, 감태를 포함하는 배지 조성물에 바실러스 속 IS-2 균주를 넣고 배양하는 단계를 포함하는 사료 첨가제의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 사료 첨가제를 포함하는 사료 및 상기 사료를 어류에 급이하여 어류 병원성 세균에 대한 면역력을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
감태는 갈조식물의 다시마목 미역과 식물로서 우리나라에서는 주로 제주 연안 수심 10m 이내에 서식하고 있다. 감태는 거의 식용되지 않고 전복 및 소라 먹이로 주로 이용되고, 극히 일부만 알긴산 원료 등 한정된 용도로 사용되어 왔다. 최근, 감태에 많이 들어 있는 폴리페놀 물질인 플로로타닌(phlorotannin)이 항산화, 항고혈압, 혈전생성저해 및 항암 활성이 우수한 것으로 알려짐에 따라 기능성 식품 및 의약품의 중요 소재로 부각되고 있다.
한편, 국내 양식 산업은 크게 성장하고 있으나, 양식 중 발생하는 어류의 질병이 양식 산업 발전을 저해하는 결정적인 요인으로 작용하고 있다. 국내 양식 산업은 적은 수면적에 과다한 어류를 양식하는 고밀도 사육을 하고 있어, 세균성 질병에 의한 발병 빈도가 높으며, 질병 예방을 위해 사용되는 항생제의 오·남용과 단기간 성장을 위한 사료의 과다 투입으로 인하여 병원체의 내성증강과 수질오염이 심화되고, 이에 따라 질병 발생이 늘어나는 악순환이 계속되고 있다. 따라서, 영양원 확충 공급에 의한 사료효율을 향상시키고, 면역성이 우수하여 질병예방에 도움이 되며, 사료비의 절감효과가 있는 사료첨가제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
알긴산은 해조 다당류의 일종이고, β-1,4 결합의 D-만누론산과 α-1,4 결합의 L-글루론산이 연결된 사슬구조를 갖는다. 알긴산은 점성으로 인해 식품첨가제, 유화제 등에 이용되며, 섬유화하여 수술용 실로도 이용되고 있다. 현재 가장 많이 활용되는 알긴산의 형태는 알긴산의 나트륨염으로서 물에 가용성이며 점성, 겔화성, 수화성, 보수성, Ca2+과 같은 금속이온과의 반응성, 결착성, 필름형성 등과 같은 특성을 지니고 있어, 아이스크림, 시럽, 스프, 젤리, 푸딩, 잼, 어육 연제품 등에 널리 이용되며, 식품 산업에서뿐만 아니라 의약 산업에서도 널리 이용되고 있다. 일반적으로 시판되는 수용성 알긴산은 상온에서 용해시키는데 많은 시간이 소요되고, 알코올류가 포함되어 있는 용매에는 잘 용해되지 않으며, 침전을 일으키는 특성이 있다. 또한 알긴산의 농도가 높아짐에 따라 강한 점성을 갖게 되며, 특히 액상 식품의 경우는 0.5% 이상의 농도로 첨가되면 식품 고유의 특성을 잃게하는 단점을 가져서 사용에 큰 제한을 받는다. 이를 극복하기 위해 알긴산은 저분자화된 알긴산의 형태로 제조되어 이용되고 있다. 생체이용률의 측면에서도, 포유동물은 알긴산 분해효소를 갖지 않기 때문에 알긴산은 그 자체로 이용될 수 없고, 생체에서 이용될 수 있도록 알긴산의 중합도를 낮추기 위해 저분자화되어야 한다. 저분자 알긴산, 또는 알긴산 올리고당은 지방축적 억제 및 지방대사 촉진에 의한 항비만 효과 및 IL-6, TNF-α와 같은 사이토카인의 분비 촉진을 통한 면역기능강화 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.
현재, 알긴산은 주로 산 가수분해법에 의해 저분자 알긴산이나 알긴산 올리고당으로 전환된다. 그러나, 산에 의한 저분자 알긴산 또는 알긴산 올리고당의 제조방법은 공정상 과도한 산 처리 때문에 내산성 장치가 요구되고 폐기되는 강산을 중화시켜 배출해야하기 때문에 다량의 알칼리가 소요되므로 공정비용 및 환경오염 등의 문제점을 갖는다. 향후 식품생명공학 산업발전, 기능성 식품제품 개발 및 품질향상, 해조 다당류 분해공정개발 등을 위해서는 환경친화적인 알긴산 올리고당의 제조 방법이 요구되며, 이를 위해서 알긴산 분해능을 갖는 미생물 및 그로부터 분리된 알긴산 분해 효소의 개발이 해결안을 제시할 수 있다. 현재 일부 알긴산 분해효소를 생산하는 미생물이 알려져 있으나, 식품이나 의약품의 제조에 보다 효율적으로 이용될 수 있는 새로운 미생물 및 알긴산 분해 효소에 대한 요구가 여전히 존재한다.
한편, 한국등록특허 제1088442호에는 '감태발효 사료첨가물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 사료'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1248191호에는 '알긴산 분해 미생물 및 그의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 감태와 바실러스 속 IS-2 균주를 포함하고 있는 어류용 사료 첨가제에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 오징어 젓갈로부터 신규한 균주 바실러스 속(Bacillus sp.) IS-2 균주를 분리·동정하였고, 상기 균주가 알긴산 분해 능력 및 어류 병원성 세균에 대한 항균성을 보이는 것을 확인하였고, 감태를 포함하고 있는 조성물에 상기 균주를 넣어 발효시킨 감태 발효물 역시 어류 병원성 세균에 대해 항균력이 있고, 상기 감태 발효물을 첨가한 사료를 어류에 급이하였을 시 어류의 성장이 촉진되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 항균활성 및 알긴산 분해활성을 가지는 바실러스 속 (Bacillus sp.) IS-2 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 및 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 감태에 상기 바실러스 속 IS-2 균주를 첨가하여 발효한 감태 발효액을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 감태 발효액을 유효성분으로 포함하는 어류용 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 감태를 포함하는 배지 조성물에 바실러스 속 IS-2 균주를 넣고 배양하는 단계를 포함하는 사료 첨가제의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 사료 첨가제 및 상기 사료 첨가제를 포함하는 어류용 사료를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 사료를 어류에 급이하여 어류 병원성 세균에 대한 면역력을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 바실러스 속 IS-2 균주에 의한 감태 발효물은 어류 병원성 세균에 대한 항균력이 있으므로, 항생제 대체 사료 첨가제로 이용가능하며, 항생제 대체제의 국산화에도 이바지할 수 있다. 또한, 본 발명의 바실러스 속 IS-2 균주에 의한 감태 발효물을 첨가한 사료에서 어류의 성장이 촉진됨을 확인하였으므로 향후 양어가와 수산업 발전에도 큰 도움이 될 것으로 사료된다. 또한, 본 발명에 따른 알긴산 분해능을 갖는 바실러스 속 IS-2 균주는 저분자 알긴산을 효율적 및 친환경적으로 제조할 수 있어, 저분자 알긴산을 포함하는 식품이나 의약품의 제조에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 바실러스 속 (Bacillus sp.) IS-2 균주를 배양한 모습을 보여주는 사진으로 (A) 및 (B)는 MRS 한천 배지에서 배양된 모습이며, (C)는 skim milk 한천 배지 그리고 (D)는 blood 한천 배지에서 배양된 IS-2 균주의 모습을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 바실러스 속 IS-2 균주의 16S rRNA 분석에 의한 계통도를 보여주는 그림이다.
도 3은 바실러스 속 IS-2 균주의 배양 온도에 따른 건조균체중량 및 스트렙토코커스 이니애 (Streptococcus iniae) 균주에 대한 항균력을 나타내는 결과이다. 파란색 막대: 건조균체중량, 붉은색 실선: 항균력.
도 4는 바실러스 속 IS-2 균주의 배양 pH에 따른 건조균체중량 및 스트렙토코커스 이니애 균주에 대한 항균력을 나타내는 결과이다. 파란색 막대: 건조균체중량, 붉은색 실선: 항균력.
도 5는 탄소원 종류에 따른 바실러스 속 IS-2 균주의 건조균체중량을 확인한 결과이다. control: 포도당을 빼지 않은 TSB(tryptic soy broth) 배지.
도 6은 가용성 전분 (soluble starch) 농도에 따른 바실러스 속 IS-2 균주의 건조균체중량을 확인한 결과이다. x축은 배지 리터당 가용성 전분 첨가량이다.
도 7은 질소원 종류에 따른 바실러스 속 IS-2 균주의 건조균체중량을 확인한 결과이다. control: 가용성 전분 45g/ℓ와 염화나트륨 15g을 함유한 TSB 배지.
도 8은 효모 추출물의 농도에 따른 바실러스 속 IS-2 균주의 건조균체중량을 확인한 결과이다. x축은 배지 리터당 효모 추출물 첨가량이다.
도 9는 배양 시간에 따른 바실러스 속 IS-2 균주의 건조균체중량을 확인한 결과이다. 파란색 막대: 건조균체중량, 붉은색 실선: 항균력.
도 10은 최적배지 조성에 바실러스 속 IS-2 균주를 넣고 24시간 배양한 후의 건조균체중량 및 pH 변화를 확인한 결과이다. control: TSB(tryptic soy broth) 배지.
도 11은 본 발명의 감태 발효물 시제품의 사진이다.
도 12는 본 발명의 감태 발효물을 사료에 첨가하여 넙치에 먹이로 공급한 뒤, 8주 동안 넙치의 무게 변화를 확인한 결과이다. Con, 대조구(일반 사료); P.C, 양성대조구(일반 사료에 바실러스 속 IS-2 균주 배양액을 1% 첨가한 사료); E1 및 E2, 시험군(일반 사료에 감태 발효액을 0.5%(E1) 및 1%(E2) 첨가한 사료).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항균활성 및 알긴산 분해활성을 가지는 바실러스 속 (Bacillus sp.) IS-2 균주를 제공한다.
본 발명자들은 오징어 젓갈로부터 신규한 균주 바실러스 속(Bacillus sp.) IS-2 균주를 분리·동정하였고, 상기 균주가 알긴산 분해 능력 및 어류 병원성 세균에 대한 항균성을 보이는 것을 확인하였고, 감태를 포함하고 있는 조성물에 상기 균주를 넣어 발효시킨 감태 발효물 역시 어류 병원성 세균에 대해 항균력이 있고, 상기 감태 발효물을 첨가한 사료를 어류에 급이하였을 시 어류의 성장이 촉진되는 것을 확인하여, 본 발명의 바실러스 속 IS-2 균주를 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2014년 5월 21일에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC12596BP).
본 발명은 또한, 본 발명의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
"항균 (antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명의 바실러스 속 IS-2 균주는 어류 병원성 세균에 대해 항균 능력을 가지고 있으며, 상기 어류 병원성 세균은 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda), 스트렙토코커스 이니애 (Streptococcus iniae), 비브리오 앙귈라리움 (Vibrio anguillarium), 비브리오 캄프벨리 (Vibrio campbellii), 비브리오 할베이 (Vibrio harveyi), 비브리오 퍼니시 (Vibrio furnisii) 또는 스트렙토코커스 파라우베리스 (Streptococcus parauberis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
본 발명의 바실러스 속 IS-2 균주는 어류 병원성 세균에 대해 항균 능력을 보유하고 있으며(표 3 참고), 내산성이 있고(표 5 참고), 내염성(표 6 참고)이 있으므로 프로바이오틱스로서 유용하게 이용될 수 있다.
상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바실러스 속 IS-2 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 감태에 본 발명의 바실러스 속 IS-2 균주를 첨가하여 발효한 감태 발효액을 제공한다.
미생물을 이용한 발효기술은 식품, 의약품 및 화장품 산업 등의 다양한 분야에서 응용되고 있는데, 발효에 의하여 단백질 및 탄수화물 등의 고분자 물질이 저분자화됨으로서 생체 흡수율이 높아지고, 기존 성분과 다른 유용한 성분의 생성으로 인하여 생리 기능성이 증가하며, 유해 미생물의 살균 효과도 나타나 제품의 저장성도 높아지는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 감태 발효액은 감태 분말을 포함하는 배지 조성물에 알긴산 분해능력과 항균능력이 있는 바실러스 속 IS-2 균주를 첨가하여 발효시킨 용액으로, 상기 감태 발효액은 알긴산이 저분자형태로 분해되어 생체 이용률이 증가된 형태로 포함되어 있고, 바실러스 속 IS-2로부터 생성된 항균 물질도 포함되어 있는 것이 특징이다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 감태 발효액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공한다. 상기 사료 첨가제는 바람직하게는 면역증강용이며, 어류용 사료첨가제로 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 감태 발효액은 전술한 바와 같이 저분자 형태의 알긴산과 항균 물질이 포함되어 있다.
본 발명의 사료 첨가제에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병 예방제와 같은 첨가제가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 사료첨가제는 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 사료 첨가제는 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 리파제와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 어류에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가용 조성물에는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제가 사용될 수 있는 동물은 잉어, 뱀장어, 참돔, 방어, 넙치, 문어 등의 유영성 동물, 대하, 보리새우, 꽃게 등의 유영성 저서 은신 동물, 전복, 소라, 해삼, 성게 등의 포복성 저서 동물 등의 어류일 수 있고, 바람직하게는 넙치일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 감태를 포함하는 배지 조성물에 바실러스 속 IS-2 균주를 넣고 배양하는 단계를 포함하는 사료 첨가제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 바실러스 속 IS-2 균주에 의해 발효된 감태 발효물과 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 감태는 배지 조성물 총 중량 기준으로 3 중량% 이하로 포함될 수 있는데, 바람직하게는 2.5~3 중량%일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3 중량%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 배지 조성물은 배지 조성물 1ℓ 기준으로, 가용성 전분 40~50g, 효모 추출물 35~45g, 염화칼슘·이수화물 5~13g, 염화나트륨 5~13g, 황산망간·칠수화물 0.02~0.06g, 황산마그네슘·칠수화물 2.1~2.9g, 황산아연·칠수화물 0.05~0.25g, 황산철·칠수화물 0.01~0.15g, 인산수소이나트륨·12수화물 1~6g 및 제2인산칼륨 5~13g일 수 있고, 바람직하게는 가용성 전분 43~47g, 효모 추출물 38~42g, 염화칼슘·이수화물 7~11g, 염화나트륨 7~11g, 황산망간·칠수화물 0.03~0.05g, 황산마그네슘·칠수화물 2.3~2.7g, 황산아연·칠수화물 0.1~0.2g, 황산철·칠수화물 0.01~0.1g, 인산수소이나트륨·12수화물 1~5g 및 제2인산칼륨 7~11g일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 배양 단계는 33~38℃, pH 7~9의 조건에서 20~30 시간 동안 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 사료 첨가제 및 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제는 감태 발효물을 유효성분으로 포함하며, 감태 발효물은 감태를 포함하는 조성물에 본 발명의 바실러스 속 IS-2 균주를 첨가하여 배양함으로써 제조된 것이다. 상기 사료 첨가제에 추가로 첨가될 수 있는 성분 및 제형에 관해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 감태 발효물 사료 첨가제는 기존에 사용되고 있는 공지의 사료 조성물 또는 사료 제품에 일정 비율로 첨가하여 기능성 성분이 보강된 배합사료 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 사료 첨가제는 어류용 사료 조성물 기준으로 0.3 내지 1.5% (w/w, 건물기준)으로 배합될 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 1.0% (w/w, 건물기준)으로 배합될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 사료를 어류에 급이하여 어류 병원성 세균에 대한 면역력을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 사료는 감태를 포함하는 조성물에 알긴산 분해능력과 항균력을 가진 바실러스 속 IS-2 균주를 첨가하여 발효시킨 감태 발효물을 포함하고 있어, 상기 사료를 어류에 급이하면 사료 내 포함된 유효성분들의 생체 이용율이 증대되어 어류의 증체량이 증가되고, 항균 물질이 포함되어 있어 어류 병원성 세균에 대한 면역력이 증가될 수 있다. 특히, 넙치 또는 전복 등의 양어용 어류를 위해 사용됨으로서 넙치 또는 전복 등의 양어류의 성장률 및 생존율 등을 향상시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 프로바이오틱 균주의 분리 및 선정
1-1. 미생물의 분리
제주대학교 허문수 교수 실험실에서 오징어 젓갈로부터 균을 분리하였다. 균 분리를 위해 채취한 오징어 젓갈 샘플은 생리식염수로 단계 희석하여 사용하였으며, 0~10%의 식염이 첨가된 MRS 배지에 희석액을 100㎕ 유리 도말봉으로 도말하고 25, 30 및 35℃에서 48시간 배양하여 미생물을 분리하였다.
1-2. 분리균주의 항균활성 측정
분리균주가 생산하는 배양액의 병원성 세균에 대한 항균 활성은 McFarland No 0.5로 희석된 각각의 병원성 세균 현탁액을 멸균된 면봉을 사용하여 준비된 Muller Hinton Agar(MHA) 한천배지에 골고루 도말하고 건조시킨 후, 멸균된 종이 디스크(직경 8mm, Advantec, 일본)에 분리된 균주의 배양액 50㎕을 접종하여 각 배양온도에 맞추어 24시간 배양하여 투명환을 캘리퍼(caliper)로 측정하였다. 캘리퍼로 측정된 투명환은 종이 디스크의 직경도 포함된다. 항균활성 실험에 사용된 병원성 세균 균주는 하기 표 1과 같다.
항균실험에 사용된 균주 목록
세균명 균주 번호
에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda) KCTC 12267
스트렙토코커스 이니애 (Streptococcus iniae) KCTC 3657
비브리오 알기놀리티쿠스 (Vibrio alginolyticus) KCCM 40513
비브리오 앙귈라리움 (Vibrio anguillarium) KCTC 2711
비브리오 캄프벨리 (Vibrio campbellii) KCCM 40864
비브리오 할베이 (Vibrio harveyi) KCCM 40866
비브리오 퍼니시 (Vibrio furnisii) KCCM 41679
비브리오 살모니시다 (Vibrio salmonicida) KCCM 41663
스트렙토코커스 파라우베리스 (Streptococcus parauberis) KCTC 3651
사용된 배지 조성
배지 조성(/ℓ)
MRS broth Proteose peptone No.3 10 g
Beef Extract 10 g
Yeast Extract 5 g
Dextrose 20 g
Polysorbate80 1 g
Ammonium Citrate 2 g
Sodium Acetate 5 g
Magnesium Sulfate 0.1 g
Manganese Sulfate 0.05 g
Dipotassium phosphate 2 g
NB (Nutrient broth) Beef Extract 3 g
Peptone 5 g
TSB (Tryptic Soy broth) Pancreatic digest of casein 15 g
Papaic digest of soybean 5 g
Sodium chloride 15 g
BHIB (Brain heart infusion broth) Calf brains, Infusion from 200 g 7.7 g
Beef heart, Infusion from 250 g 9.8 g
Proteose peptone 10 g
Dextrose 2 g
Sodium chloride 5 g
Disodium phosphate 2 g
1-3. 알긴산 분해 미생물 스크리닝
균주 분리를 위해 샘플(해수 및 해양 토양)을 103배 희석한 후 배양배지(sodium alginate 5g, yeast extract 5g, NaCl 5g, K2HPO4 2g, MgSO4·7H2O 1g, KCl 1g, CaCl2 0.5g, agar 15g)에 도말하여 30℃에서 3일간 배양한 후 분리하였다. 분리한 균을 24시간 더 배양한 후, 액상 배양배지(sodium alginate 5g, yeast extract 5g, NaCl 5g, K2HPO4 2g, MgSO4·7H2O 1g, KCl 1g, CaCl2 0.5g)에 1% 접종하였다. 배양액 상태에서 1일 후 알긴산(alginate)이 모두 분해되면 ++, 2일 이후에 알긴산이 분해되면 +로 표시하였다. 알긴산의 분해는 불용성의 침전을 형성하기에 육안으로 분해 유무를 확인하였다. 그 결과, 제주대에서 분리한 바실러스 속 (Bacillus sp.) IS-2 균주를 배양 균주로 선정하였다.
1-4. 인공 위액 및 인공 담즙산에 대한 내성, 내염성 및 내열성 시험
분리한 균주에 대해 산 저항성은 단순 산성 pH에 대한 내성과 어류 내 소화관 조건과 유사한 인공위액 내성실험을 실시하였다. 단순 산성에 대한 내성 조사는 제주대에서 분리한 바실러스 속 IS-2 균주를 대상으로 0.0005 M 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼를 염산으로 보정하여 만든 pH 3.0의 NB 배지에 각 균주를 적정 배율 희석하여 1.0x108 cfu/㎖이 되도록 하였다. 30℃에서 30분간 방치한 후 NA(nutrient agar)에 도말하여 균수를 측정하였으며 생존율이 10% 이하로 줄어들지 않는 것을 저항성이 있는 것으로 판정하였다. 인공 위액의 조제는 1N 염산을 사용하여 pH 3.0으로 조정한 NB 액체배지에 펩신(Sigma, 미국)이 1,000 units/㎖가 되도록 첨가하여 사용하였다. NB 액체 배지에서 30℃, 24시간 배양된 균주를 원심분리하여 회수한 후, 전술한 단순 산성에 대한 내성 실험과 같은 방법으로 저항성을 판정하였다.
인공 담즙산에 대한 내성조사는 0.3~0.5% 담즙염(bile salt)이 포함된 NB 배지에 균주를 적정 배율 희석하여 1.0x108 cfu/㎖가 되도록 한다. 30℃에서 30분간 방치한 후 NA에 도말하여 균수를 측정하였으며 생존율이 10% 이하로 줄어들지 않는 것을 저항성이 있는 것으로 판정하였다.
분리한 균주의 내염성을 확인하기 위해, NB 액체 배지에 염화나트륨을 1%, 3% 또는 5%의 농도로 첨가하여 배지를 제조하였다. 상기에 전술한 방법대로 24시간 배양한 균주를 얻은 후 적정비로 희석하여 1.0x108 cfu/㎖가 되도록 접종하였다. 37℃에서 1시간 배양 후 NA에 도말하여 균수를 측정하였으며 생존율이 10% 이하로 줄어들지 않는 것을 저항성이 있는 것으로 판정하였다.
또한 분리한 균주의 온도에 대한 안정성을 확인하기 위해 NB 액체 배지에 전술한 방법대로 24시간 배양한 균주를 얻은 후 적정비로 희석하여 1.0x108 cfu/㎖가 되도록 접종하였다. 60℃에서 1시간 배양 후 NA에 도말하여 균수를 측정하였으며 생존율이 10% 이하로 줄어들지 않는 것을 저항성이 있는 것으로 판정하였다.
1-5. 16S rRNA 염기서열 분석
16S ribosomal RNA의 분석은 Genomic DNA Extraction kit(Bioneer, 한국)를 사용하여 염색체 DNA를 분리한 후, 박테리아 16S rDNA 다용도 프라이머(universal primer)를 이용하여 16S rDNA를 증폭시켰다. 합성된 올리고뉴클레오티드의 각각의 프라이머는 정방향 프라이머(27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 서열번호 1) 및 역방향 프라이머(1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 2)의 염기서열로 구성 되었으며, 0.5μM 프라이머, 200μM dNTP 및 Taq DNA 중합효소 (Bioneer, 한국) 3㎕를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 94℃에서 5분 전변성, 30 사이클 동안 94℃에서 45초 변성, 50℃에서 45초 어닐링, 72℃에서 45초간 신장하였으며, 다시 72℃에서 5분간 신장하였다. 증폭된 PCR 산물은 EtBr을 첨가된 상태에서 전기영동하여 1% 아가로스(Promega Co., 미국) 겔에서 확인하였다. 이후 AccuprepTM PCR purification kit(Bioneer, 한국)을 이용하여 PCR 산물에 남아있는 프라이머, 뉴클레오티드, 중합효소 및 염을 제거하여 정제하였고 30㎕의 용출 버퍼(10mM Tris-Cl, pH 8.5)로 DNA를 용출하였다. 이를 ABI prismTM BigdyeTM terminator cycle sequencing Ready reaction kit V.3.1 (Fluorescent dye terminators method)와 ABI 3730XL capillary DNA sequencer(Applied Biosystems, 미국)를 사용하여 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. DNA 염기서열의 유사성(homology) 분석은 BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov/blast) 프로그램을 이용하였다. 그 후 ClustalW (www.clustal.org/) 프로그램을 사용하여 염기서열을 배열한 후 MEGA3 프로그램 V.3.0을 이용하여 계통도를 작성하였다.
2. 감태 분석 및 배양 최적화
2-1. 감태 성분 분석
감태의 안전성과 성분 분석을 위해서 유해 금속(납, 카드뮴, 수은)에 대한 분석과 미네랄(요오드, 칼슘), 비타민(비타민 B12) 성분 분석을 (사)한국단미사료협회 사료분석소에 의뢰하여 실시하였다.
2-2. 최적 pH 및 온도에 따른 배양 조건 최적화
바실러스 속 IS-2 균주를 이용한 배양조건 최적화 조사를 위해 250㎖ 삼각플라스크에 100㎖의 액체배지를 넣고 0.1N 염산과 0.1N 수산화나트륨 용액으로 배지의 초기 pH를 3~9 범위로 맞추어 121℃에서 15분간 멸균하였다. 균주 배양액을 1% 접종하여 37℃에서, 150rpm으로 교반하며 24시간 동안 배양한 후 성장을 측정하였다. 최적 배양온도는 20~50℃에서 조건을 확인하였다.
2-3. 배지 조성 최적화
미생물은 대부분 화학합성 종속영양미생물로서 탄소원 또는 에너지원으로 탄수화물을 이용한다. 탄소원(carbon source)은 미생물 배지에서 가장 중요한 요소이다. 일반적으로는 발효공정을 조절해야 할 경우는 포도당을 비롯한 단당류를 주로 사용한다. 그러나 상업적 용도로는 대부분 경제적인 이유로 포도당 또는 설탕을 사용하지 않고 값싼 녹말과 당밀(molasses)을 이용하는 경우가 많다. 그리고 대부분의 미생물은 유기 및 무기 질소원을 이용하여 생육을 한다. 질소원은 단백질 합성의 소재로서 각종 아미노산 합성에 필요하다. 대규모 공정에서는 암모늄염, 요소, 암모니아 가스, C.S.L.(옥수수전분 침출액)을 질소원으로 이용한다.
① 감태 첨가량 결정 및 탄소원 최적화
배지에 첨가하는 감태 첨가량 결정을 위하여 TSB(Tryptic Soy Broth)에 감태를 1, 3, 5, 7 및 9% 첨가하여 배양 실험을 하였다. 실험결과 3% 이상 감태를 첨가하기가 곤란하여 최종 3%를 감태 첨가량으로 결정하여 실험하였다. 바실러스 속 IS-2의 최적배지 개발을 위한 탄소원으로는 포도당(glucose), 글리세롤(glycerol), 덱스트린(dextrin), 가용성 전분(soluble starch), 젖당(lactose), 자당(sucrose) 및 메틸알코올(methyl alcohol)을 이용하였다. 탄소원 선정 실험은 TSB에서 포도당을 뺀 후, 상기 각 탄소원을 2%로 첨가하여 진행하였다. 1차 실험을 통해 가용성 전분으로 탄소원을 선정하고, 선정된 가용성 전분의 농도를 배지 리터당 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 및 50g까지 바꾸어가며 실험하였다.
② 질소원 최적화
바실러스 속 IS-2의 최적배지 개발을 위한 질소원으로는 효모 추출물(yeast extract)과 옥수수전분 침출액(C.S.L., corn steep liquor), 맥아추출물(malt extract), 히폴리펩톤(hipolypepton), 황산암모늄(ammonium sulfate), 인산암모늄(ammonium phosphate) 및 질산암모늄(ammonium nitrate)을 사용하였다. C.S.L.은 전처리 과정으로 7,000rpm으로 15분간 원심 분리하여 사용하였다. 질소원 농도 결정은 질소원의 농도를 2%로 고정하고 TSB 배지에서 질소원을 제거한 후 염화나트륨 5g을 첨가한 후 진행하였다. 배지에 탄소원으로 가용성전분 45 g/ℓ를 첨가하였다. 실험을 통해 질소원으로 효모 추출물을 선정하였고 이를 바탕으로 효모 추출물의 농도를 배지 리터당 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 및 50g까지 바꾸어가며 실험을 진행하였다.
③ 무기물과 미량원소 최적화
바실러스 속 IS-2의 배지최적화를 위한 무기물로 제2인산칼륨 (K2HPO4), 황산마그네슘·칠수화물 (MgSO4·7H2O), 염화칼슘·이수화물 (CaCl2·2H2O), 염화나트륨, 인산수소이나트륨·12수화물 (Na2HPO4·12H2O)를 사용하였고, 미량원소로는 황산철·칠수화물 (FeSO4·7H2O), 황산망간·칠수화물 (MnSO4·7H2O), 황산아연·칠수화물 (ZnSO4·7H2O), 황산구리·5수화물 (CuSO4·5H2O), 염화코발트·육수화물 (CoCl2·6H2O)를 사용하였다. 실험에 사용한 무기물의 농도는 각각 염화칼슘·이수화물과 제2인산칼륨은 0~11 g/ℓ, 황산마그네슘·칠수화물의 경우 0~3 g/ℓ, 미량원소의 경우 황산망간·칠수화물은 0~100 ㎎/ℓ의 농도로 첨가하고 염화코발트·육수화물의 경우 0~50 ㎎/ℓ의 농도로 첨가하고 황산아연·칠수화물과 황산철·칠수화물의 경우 0~250 ㎎/ℓ의 농도 범위에서 실험을 진행하였다.
2-4. 배양 시간에 따른 항균물질의 생산
배양시간이 항균물질의 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 바실러스 속 IS-2의 전배양액을 배지 최적화된 배지에서 배양하면서 6시간 간격으로 시료를 채취하여 4,000rpm에서 원심분리하여 얻은 상등액을 0.45㎛ pore size 필터(Advantec, 미국)로 여과하여 항균 활성 측정에 사용하였다. 항균 활성 측정을 위해 MHA(Muller hinton agar)에 스트렙토코커스 이니애 (Streptococcus iniae)을 도말한 후 건조하였다. 그 후 종이 디스크를 올려놓고 여기에 항균활성 측정 시료를 100㎕씩 떨어뜨려 37℃에서 24시간 배양 후 투명환의 직경을 측정하였다.
2-5. 균체 농도 측정
균체농도는 건조균체질량(Dry Cell Weight)으로 측정하였다. 균일한 시료를 얻기 위해 볼텍서로 균질화한 1㎖의 배양액을 13,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 1㎖의 증류수를 넣어 혼합하고 다시 원심분리 하였다. 이 과정을 3회 반복하여 항량을 구한 용기에 균체를 넣고 105℃에서 항량이 나올 때까지 건조하였다.
2-6. 시제품 제작
실험에 의해 최적화 배양 조건과 최적 배지조성을 이용하여 10ℓ의 배지를 제조하였다. 이를 37℃에서 24시간 배양하여 시제품을 제조하였다.
3. 어류 성장 실험
실험어로 사용된 넙치 치어는 위미리에 위치한 양식장에서 구입하였으며, 제주대학교 해양과학대학 사육실에서 수행하였다. 넙치는 실험하기 전에 환경에 적응 할 수 있도록 2주간 아크릴 수조에서 순치시킨 후 실험에 사용하였다. 초기 넙치 평균무게는 17.3±0.1g이였으며, 각 수조당 15마리씩 무작위로 선택하여 사용하였다. 사육수는 모든 수조에 충분한 용존산소를 공급하기 위해 에어스톤을 설치하였으며, 실험기간동안 수온은 22~25℃로 유지하였고, 실험사료는 1일 2회(9시, 18시)로 어체중의 2%씩 공급하였으며, 실험사육은 총 8주 동안 수행하였다. 실험어의 무게 측정은 2주 간격으로 실시하였다.
사료제작을 위하여 시판하고 있는 넙치용 배합사료를 사용하였으며, 실험에 사용될 3개의 실험사료를 제작하였는데, 실험사료는 감태를 바실러스 속 IS-2 균주로 발효한 배양액을 각각 기본사료에 0.5%, 1%씩 첨가하여 제작하였고 각각을 E1 및 E2로 명기하였으며, 대조군은 기본사료로, 양성대조군(P.C)은 감태를 첨가하지 않은 배지에서 바실러스 속 IS-2를 발효시켜 기본사료에 1% 첨가한 것을 사용하였다.
실시예 1. 바실러스 속 (Bacillus sp.) IS-2 균주의 분리 및 선정
(1) 바실러스 속 IS-2 균주의 배양학적 및 형태학적 특성
바실러스 속 IS-2 균주의 고체배지에서의 콜로니 성상은 도 1에 나타내었다. (A)와 (B)는 1.5% 염화나트륨을 첨가한 MRS 배지에서 생육한 사진인데, 콜로니의 모양은 부정형(irregular)의 형태를 보였으며, 집락의 주변에 열편(iobate) 형태를 보였다. 또한 콜로니의 가장자리가 불규칙하고 솟아 있으며 점성을 가지고 있었다. 이는 청국장에서 자주 발견되는 폴리글루타메이트 (polyglutamate)로 추측된다. (C)는 skim milk 배지에서 배양한 사진이며 (D)는 면양 혈청배지에 배양한 사진으로 혈액세포 용혈성은 없는 것으로 확인되었다.
(2) 바실러스 속 IS-2 균주의 16S rRNA 분석
바실러스 속 IS-2 균주의 16S rRNA는 PCR 증폭을 통해 얻은 1399bp 크기의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI)의 BLAST를 이용하여 분석한 결과, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens)와 100% 상동성을 보였다. 바실러스 속에서 분리균과 가장 근연종으로 나타난 상기 기준주(type strain)의 16S rRNA 염기서열를 토대로 계통도를 작성하였다(도 2).
(3) 바실러스 속 IS-2 균주의 항균 활성 분석
바실러스 속 IS-2 균주의 어류 질병 유발 세균 7종에 대하여 항균력을 확인하였다(표 3). 프로테아제 활성의 경우 탈지유 한천배지에서 투명환의 크기를 측정하여 표시하였다. + 표시는 투명환의 지름이 8~10mm, ++의 경우 10~12mm의 경우, +++의 경우 12~14mm를 의미한다. 항균력의 경우 스트렙토코커스 이니애 (Streptococcus iniae KCTC 3657)와 비브리오 앙귈라리움 (Vibrio anguillarium KCTC 2711)에 대해서 높은 항균력을 보였다.
바실러스 속 IS-2 균주의 프로테아제 활성과 항균력 실험 결과
균주
 프로테아제 활성 저해환 (mm)
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
바실러스 속
IS-2		 +++ 5.5 10.2 - 10.4 6.7 4.6 2.2 - 8.9
(실험 균주는 P1, Edwardsiella tarda KCTC 12267; P2, Streptococcus iniae KCTC 3657; P3, Vibrio alginolyticus KCCM 40513; P4, Vibrio anguillarium KCTC 2711; P5, Vibrio campbellii KCCM 40864; P6, Vibrio harvey KCCM 40866; P7, Vibrio furnisii KCCM 41679; P8, Vibrio salmonicida KCCM 41663; P9, Streptococcus parauberis KCTC 3651)
(4) 알긴산 (alginate) 분해 균주 스크리닝 결과
젓갈 종류와 제주도 12개 지역에서 채취한 해수 및 해양 토양 시료로부터 분리한 균주를 대상으로 알긴산 분해능을 시험하였다. 실험결과 136개 균주 중에 총 30개의 균주가 활성을 나타내었다. 이 중에서 사료 첨가제로 이용 가능한 균주는 조개젖에서 분리한 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 창조수산에서 분리한 바실러스 속 (Bacillus sp.), 제주대의 균주인 바실러스 속 IS-2 그리고 토양분리 바실러스 서브틸리스 등 총 4종 이었으며, 이 중에서 발효의 편의성과 효능이 검증된 측면등을 고려하여 최종으로 제주대의 바실러스 속 (Bacillus sp.) IS-2를 선정하였다.
알긴산 분해 균주 스크리닝 결과
번호 분리원 균주명 알긴산 분해능 비고
cjb-1 오징어 2 미동정 -
cjb-2 오징어 1 Enterococcus feacium -
cjb-3 꼴뚜기 1 Bacillus cereus -
cjb-4 꼴뚜기 2 미동정 -
cjb-5 조개젓 1 Bacillus subtilis +
cjb-6 조개젓 2 Bacillus cereus +
cjb-7 꽃멸치젓 1 미동정 -
cjb-8 꽃멸치젓 2 Bacillus niabensis -
cjb-9 자리돔 2 미동정 -
cjb-10 자리돔 3 Enterococcus casseliflavus -
cjb-11 자리돔 1 Bacillus anthracis -
cjb-12 갈치속젓 1 미동정 ++
cjb-13 누룩 1 Enterobacter sp. -
cjb-14 누룩 2 Cronobacter sakazakii - 수막염 유발
cjb-15 누룩 3 Enterococcus feacium -
cjb-16 남원해수 1-1 Vibrio azureus - 발광성 해양세균
cjb-17 남원해수 1-2 Vibrio fluvialis - 복막염 유발
cjb-18 남원해수 1-3 Vibrio azureus - 발광성 해양세균
cjb-19 남원해수 1-4 Vibrio sp. -
cjb-20 남원해수 1-5 Vibrio parahaemolyticus ++ 장염비브리오 유발
cjb-21 남원해수 1-6 Vibrio alginolyticus -
cjb-22 남원해수 1-7 Vibrio parahaemolyticus - 장염비브리오 유발
cjb-23 남원해수 1-8 Serratia marcescens - ?렴, 패혈증 유발
cjb-24 위미해수 1-1 Vibrio sp. -
cjb-25 위미해수 1-2 미동정 -
cjb-26 위미해수 1-3 Vibrio parahaemolyticus - 장염비브리오 유발
cjb-27 위미해수 1-4 Vibrio alginolyticus -
cjb-28 위미해수 1-5 Shewanella algae - 안내염 유발
cjb-29 위미해수 1-6 미동정 -
cjb-30 위미해수 1-7 Photobacterium ganghwense -
cjb-31 창조수산 1 Vibrio sp. -
cjb-32 창조수산 2 Shewanella algae -
cjb-33 창조수산 3 Vibrio alginolyticus -
cjb-34 창조수산 4 Bacillus sp. -
cjb-35 창조수산 5 Bacillus sp. +
cjb-36 성산토양 1 Photobacterium ganghwense -
cjb-37 성산토양 2 Vibrio alginolyticus -
cjb-38 성산토양 3 Vibrio parahaemolyticus -
cjb-39 성산토양 4 Vibrio azureus +
cjb-40 성산토양 5 Vibrio sp. -
cjb-41 성산토양 6 Photobacterium ganghwense -
cjb-42 성산토양 7 Vibrio fluvialis +
cjb-43 성산토양 8 Proteus sp. +
cjb-44 성산토양 9 Vibrio azureus +
cjb-45 성산토양 10 Vibrio parahaemolyticus -
cjb-46 성산토양 11 Vibrio alginolyticus -
cjb-47 성산토양 12 Vibrio parahaemolyticus -
cjb-48 성산해수 1 Vibrio sp. -
cjb-49 성산해수 2 Acinetobacter venetianus -
cjb-50 성산해수 3 Vibrio alginolyticus +
cjb-51 성산해수 4 Acinetobacter venetianus -
cjb-52 성산해수 5 Vibrio fluvialis -
cjb-53 성산해수 6 Vibrio azureus -
cjb-54 성산해수 7 Vibrio azureus +
cjb-55 성산해수 8 Serratia marcescens -
cjb-56 성산해수 9 Vibrio furnissii -
cjb-57 한동해수 1 Vibrio alginolyticus -
cjb-58 한동해수 2 Vibrio alginolyticus +
cjb-59 한동해수 3 Vibrio azureus -
cjb-60 한동해수 4 Vibrio azureus +
cjb-61 한동해수 5 Shewanella algae -
cjb-62 한동해수 6 Shewanella algae -
cjb-63 김녕해수 1 Pseudomonas plecoglossicida -
cjb-64 김녕해수 2 Pseudomonas plecoglossicida -
cjb-65 김녕해수 3 Vibrio furnissii -
cjb-66 김녕해수 4 Vibrio alginolyticus -
cjb-67 김녕해수 5 Shewanella algae -
cjb-68 김녕해수 6 Vibrio parahaemolyticus -
cjb-69 김녕해수 7 Acinetobacter venetianus -
cjb-70 김녕해수 8 Vibrio furnissii +
cjb-71 함덕해수 1 Photobacterium ganghwense +
cjb-72 함덕해수 2 Vibrio sp. ++
cjb-73 함덕해수 3 Acinetobacter bereziniae -
cjb-74 함덕해수 4 Vibrio sp. +
cjb-75 삼양해수 1 Acinetobacter soli -
cjb-76 삼양해수 2 Photobacterium ganghwense -
cjb-77 삼양해수 3 Shewanella haliotis -
cjb-78 삼양해수 4 Vibrio azureus -
cjb-79 삼양해수 5 Vibrio alginolyticus -
cjb-80 삼양해수 6 Vibrio parahaemolyticus -
cjb-81 한동토양 1 Acinetobacter venetianus -
cjb-82 한동토양 2 Vibrio furnissii -
cjb-83 한동토양 3 Photobacterium ganghwense -
cjb-84 한동토양 4 Vibrio sp. -
cjb-85 함덕토양 1 Acinetobacter bereziniae -
cjb-86 함덕토양 2 Vibrio sp. +
cjb-87 함덕토양 3 Acinetobacter soli +
cjb-88 함덕토양 4 Photobacterium ganghwense +
cjb-89 함덕토양 5 Shewanella haliotis -
cjb-90 김녕토양 1 Vibrio azureus -
cjb-91 김녕토양 2 Vibrio alginolyticus +
cjb-92 김녕토양 3 Vibrio parahaemolyticus +
cjb-93 김녕토양 4 Vibrio harveyi +
cjb-94 김녕토양 5 Vibrio harveyi +
cjb-95 애월해수 1 Vibrio alginolyticus -
cjb-96 애월해수 2 Vibrio fluvialis -
cjb-97 애월해수 3 분석불가 -
cjb-98 애월해수 4 분석불가 -
cjb-99 화순토양 1 분석불가 -
cjb-100 화순토양 2 Shewanella sp. -
cjb-101 화순토양 3 Vibrio alginolyticus -
cjb-102 한림해수 1 Shewanella sp. -
cjb-103 한림해수 2 Acinetobacter sp. -
cjb-104 한림해수 3 Vibrio sp. +
cjb-105 고산해수 1 Vibrio sp. -
cjb-106 고산해수 2 분석불가 -
cjb-107 고산해수 3 Vibrio alginolyticus -
cjb-108 고산해수 4 Acinetobacter venetianus -
cjb-109 고산해수 5 Shewanella haliotis -
cjb-110 고산해수 6 Vibrio alginolyticus +
cjb-111 화순해수 1 Vibrio alginolyticus -
cjb-112 화순해수 2 Vibrio parahaemolyticus -
cjb-113 화순해수 3 Uncultured Acinetobacter sp. Clone -
cjb-114 화순해수 4 Vibrio furnissii -
cjb-115 하효해수 1 Shewanella sp. -
cjb-116 하효해수 2 Bacillus subtilis -
cjb-117 하효해수 3 Vibrio alginolyticus -
cjb-118 하효해수 4 Acinetobacter beijerinckii -
cjb-119 하효해수 5 Vibrio parahaemolyticus -
cjb-120 제주대 Bacillus sp. +
cjb-121 분리 Bacillus Bacillus subtilis +
cjb-122 창조수산 1 Alteromonas sp. -
cjb-123 창조수산 2 - -
cjb-124 창조수산 3 - -
cjb-125 창조수산 4 분석불가 -
cjb-126 창조수산 5 - -
cjb-127 창조수산 6 Vibrio sp. +
cjb-128 창조수산 7 Vibrio sp. +
cjb-129 창조수산 8 Vibrio alginolyticus -
cjb-130 창조수산 9 - -
cjb-131 창조수산 10 Agrococcus terreus -
cjb-132 감귤박 분리 1 Bacillus sp. -
cjb-133 감귤박 분리 2 Bacillus sp.
cjb-134 감귤박 분리 3 Bacillus sp. -
cjb-135 감귤박 분리 4 Lysinibacillus sp. or Bacillus sp. -
cjb-136 감귤박 분리 5 Oceanobacillus sp. -
(5) 바실러스 속 IS-2 균주의 인공위액 및 인공 담즙산에 대한 내성, 내염성 및 내열성 분석
바실러스 속 IS-2 균주의 인공위액 및 인공 담즙산에 대한 내성을 조사하였다. 인공위액 펩신의 경우 1,000 units/㎖에서 실험하였으며 내담즙성의 실험은 0.3%와 0.5%에서 진행하였다. 그 결과 펩신의 경우 98.6%의 생존율로 인공위액에 대한 균주의 내성이 확인되었으며(표 5), 인공 담즙산의 경우 0.3%와 0.5%의 첨가량 모두에서 낮은 생존율을 보여 본 발명의 균주는 내답즙성은 없음을 확인하였다(표 5). 내염성의 경우는 염화나트륨 1~5% 모든 구간에서 60% 이상의 생존율을 보여 내성이 있는 것으로 확인되었고(표 6), 내열성의 경우는 60℃에서 30분간 처리하였을 경우, 생존율의 급격한 감소가 확인되어 본 발명의 균주는 내열성이 낮은 특성을 보여 향후 포자 유도등의 방법을 고려하여야 할 것으로 사료되었다(표 7).
펩신과 인공 담즙산에 대한 바실러스 속 IS-2 균주의 내성 실험
대조군 펩신 담즙 0.3% 담즙 0.5%
바실러스 속
IS-2 (cfu/㎖)		 1.0.E+08 1.0.E+08 1.1.E+06 2.9.E+05
생존율 (%) 98.6 1.1 0.3
바실러스 속 IS-2 균주의 내염성 실험
대조군 염화나트륨 1% 염화나트륨 3% 염화나트륨 5%
바실러스 속
IS-2 (cfu/㎖)		 1.0.E+08 1.0.E+08 7.4.E+07 6.4.E+07
생존율 (%) 96.2 71.2 61.5
바실러스 속 IS-2 균주의 내열성 실험
대조군 60℃, 30분
바실러스 속 IS-2 (cfu/㎖) 1.0.E+08 4.2.E+04
생존율 (%) 0
실시예 2. 감태 성분 분석 및 배양배지 및 조건 최적화
(1) 감태 성분 분석
감태의 경우 제주도 서귀포시 소재 태림상사에서 분말 상태로 가공된 감태를 구매하여 실험하였으며, (사)한국단미사료협회 사료분석소에 성분 분석을 의뢰한 결과 하기 표 8과 같은 결과를 확인할 수 있었다.
감태 성분 분석 결과
분석결과
요오드 710. 55 ppm
칼슘 1.35 %
납 0.92 ppm
카드뮴 1.58 ppm
수은 0.03 ppm
비타민 B12 0.27 ㎎/㎏
(2) 최적 온도 및 pH 조건에 따른 배양조건 최적화와 항균물질 생산 분석
배양온도가 바실러스 속 IS-2 균주의 생육 및 항균물질 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 배양온도 30~40℃ 사이에서 균주의 생육이 좋았으며, 15~20℃ 사이에서는 생육이 불량하였다. 스트렙토코커스 이니애 (Streptococcus iniae)에 대한 항균 활성은 25~30℃에서 생장시킨 배양액에서 높게 나타났으나, 생육이 좋았던 40℃의 경우에는 배양액의 항균 활성이 급격히 떨어지는 결과를 보였다. 이에 배양 최적 온도는 35℃로 결정하였다(도 3).
그 후, pH가 바실러스 속 IS-2 균주의 생육 및 항균물질 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 배지의 pH가 7~9 사이에서 균주의 생육이 왕성하게 나타났지만, 항균 활성은 pH 8에서 가장 높게 확인되었다(도 4). 이 결과를 토대로 pH 8을 최적의 pH로 선정하였다.
(3) 배지조성 최적화
① 감태 첨가량 및 탄소원 최적화
감태의 첨가량은 3%로 선정하였으며, 배지최적화를 위한 탄소원으로는 포도당, 글리세롤, 덱스트린, 가용성 전분, 젖당, 자당 및 메탄올를 비교해본 결과 가용성 전분이 가장 높은 건조균체중량을 보여주었다(도 5). 이를 바탕으로 가용성 전분의 농도를 0 g/ℓ에서 50 g/ℓ로 변경하면서 최적 농도를 확인한 결과, 가용성 전분의 농도가 45 g/ℓ일때 가장 높은 건조균체중량을 보여주었다(도 6).
② 질소원 최적화
바실러스 속 IS-2 균주의 배지최적화를 위해 다양한 질소원으로는 균주를 배양해본 결과, 효모 추출물을 질소원으로 사용했을 경우에 가장 높은 건조균체중량을 보였다(도 7). 이를 바탕으로 효모 추출물의 농도를 0 g/ℓ에서 50 g/ℓ까지 변경하며 최적의 농도를 확인한 결과, 효모 추출액의 농도가 40 g/ℓ일 때, 건조균체중량이 3.1 g/ℓ로 가장 높게 확인되었다(도 8).
③ 무기물과 미량원소 최적화
바실러스 속 IS-2 균주의 배지최적화를 위해 무기물과 미량원소를 각각 필요농도에 맞추어 첨가하여 배양하였고, 모든 실험군에서 미네랄 첨가가 건조균체중량의 증가로 이어진 것을 확인하였다. 염화칼슘·이수화물의 경우는 9 g/ℓ 첨가 시, 염화나트륨의 경우 큰 차이를 보이지는 않았지만 15 g/ℓ 첨가 시 가장 높은 건조균체중량을 보였으며, 황산망간·칠수화물의 경우는 0.04 g/ℓ 첨가 시, 염화코발트·육수화물의 경우 0.04 g/ℓ 첨가 시, 황산아연·칠수화물의 경우 0.15 g/ℓ 첨가 시, 황산철·칠수화물의 경우 0.05 g/ℓ 첨가 시, 인산수소이나트륨·12수화물의 경우 9 g/ℓ 첨가 시 그리고 제2인산칼륨의 경우 9 g/ℓ 첨가 시에 건조균체중량이 가장 높게 확인되었다(표 9).
미네랄 종류별 첨가량 최적화 실험 결과
첨가 미네랄 첨가량(g/ℓ) 건조중량 첨가 미네랄 첨가량(g/ℓ) 건조중량
염화칼슘·이수화물
(CaCl2·2H2O)		 0 2.3 염화코발트·육수화물
(CoCl2·6H2O)		 0 2.4
1 2.4 0.01 2.3
3 2.7 0.02 2.6
5 3.2 0.03 2.3
7 3.8 0.04 2.7
9 4.2 0.05 2.0
11 3.9 황산마그네슘·칠수화물
(MgSO4·7H2O)		 0 2.3
염화나트륨 0 2.2 0.5 2.2
3 2.5 1.0 1.6
6 2.3 2.0 2.0
9 2.5 2.5 2.6
12 2.4 3.0 2.2
15 2.9 황산아연·칠수화물
(ZnSO4·7H2O)		 0 2.0
18 2.6 0.05 2.5
황산망간·칠수화물
(MnSO4·7H2O)		 0 1.8 0.10 2.3
0.02 2.7 0.15 3.0
0.04 3.4 0.20 2.1
0.06 2.5 0.25 1.6
0.08 2.2 제2인산칼륨
(K2HPO4)		 0 2.1
0.10 2.3 1 2.6
황산철·칠수화물
(FeSO4·7H2O)		 0 2.9 3 1.8
0.05 3.7 5 2.8
0.10 3.5 7 3.2
0.15 3.4 9 4.0
0.20 3.6 11 3.6
0.25 3.4
인산수소이나트륨·12수화물
(Na2HPO4·12H2O)		 0 2.1
1 2.0
3 2.6
5 2.1
7 2.4
9 2.7
11 2.4
(4) 배양시간에 따른 항균 물질 생산
바실러스 속 IS-2 균주의 생육과 항균물질의 생산에 대한 배양시간의 영향을 검토하였다. 균의 성장은 120시간까지 완만하게 증가하다가 그 이후에는 정지상태에 들어갔다. 또한 스트렙토코서스 이니애에 대한 항균활성은 24시간이 지나면서 서서히 나타나기 시작하였다. 항균물질 생성 경향은 Garden의 분류 방식에 따르면 이차 대사물질의 생산 경향을 따르고 있는 것으로 확인되었다. 여기에 포함된 대사산물로는 항생물질, 생리활성물질, 냄새 성분 등 균체의 생육과는 직접적인 관련이 없는 물질들이 있다. 최적 배양시간은 경제성을 고려해서 24시간으로 선정하였다.
상기의 결과들을 토대로 하여 최적 배양 배지의 조성 및 배양 조건을 하기 표 10에 정리하였다.
최적 배지 조성 및 조건
성분 농도 (g/ℓ)
감태 30
가용성 전분 45
효모 추출물 40
염화칼슘·이수화물 (CaCl2·2H2O) 9
염화나트륨 9
황산망간·칠수화물 (MnSO4·7H2O) 0.04
황산마그네슘·칠수화물 (MgSO4·7H2O) 2.5
황산아연·칠수화물 (ZnSO4·7H2O) 0.15
황산철·칠수화물 (FeSO4·7H2O) 0.05
인산수소이나트륨·12수화물 (Na2HPO4·12H2O) 3
제2인산칼륨 (K2HPO4) 9
온도 35℃, pH 8.0
(5) 감태 발효물 시제품 제작
시제품은 앞에서 결정된 최적배양배지(표 10)를 가지고 5ℓ 삼각 플라스크에 2ℓ의 배양액을 넣고 바실러스 속 IS-2 균주를 첨가하여 35℃에서 24시간 배양하여 제조하였다. 건조균체중량은 3.4 g/ℓ였으며 생균수는 1.1 ×109 cfu/㎖ 이었다(도 10 및 도 11).
실시예 3. 어류 성장에 미치는 감태 발효물의 효과 분석
8주간의 사료 공급 후, 어류의 최종무게를 측정하여 증체율(weight gain), 일간 성장률(specific growth) 및 사료전환효율(feed conversion ratio)을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 11과 같다. 모든 실험 사료에서 처음 2주간은 유의적인 차이가 없었으나, 4주후부터는 양성대조군과 E1 사료 실험군에서 다른 사료에 비해 어류 성장률이 증가함을 알 수 있었고, E2 사료 실험군에서는 6주후부터 어류 성장률이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 12).
8주 동안 실험사료를 공급한 넙치의 성장 실험 결과
증체율 (%) 일간 성장률 (%) 사료전환효율 (%)
대조군(기본사료) 215.7±10.2 0.9±0.1 9.06±0.71
양성대조군(바실러스 속 IS-2 균주 배양액 1% 첨가) 293.1±20.7 1.1±0.2 6.59±0.44
E1 (감태 발효액 0.5% 첨가) 301.7±9.4 1.1±0.1 6.36±0.21
E2 (감태 발효액 1% 첨가) 309.8±11.5 1.1±0.1 6.23±0.15
한국생명공학연구원 KCTC12596BP 20140521
<110> Repiatec Co. Ltd. Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Feed additive for fish comprising Ecklonia cava and Bacillus sp. IS-2 strain <130> PN14134 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 배지 조성물 총 중량 기준으로 2.5~3 중량%의 감태를 포함하며, 배지 조성물 1ℓ 기준으로, 가용성 전분 43~47g, 효모 추출물 38~42g, 염화칼슘·이수화물 7~11g, 염화나트륨 7~11g, 황산망간·칠수화물 0.03~0.05g, 황산마그네슘·칠수화물 2.3~2.7g, 황산아연·칠수화물 0.1~0.2g, 황산철·칠수화물 0.01~0.1g, 인산수소이나트륨·12수화물 1~5g 및 제2인산칼륨 7~11g인 배지 조성물에 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda), 스트렙토코커스 이니애 (Streptococcus iniae), 비브리오 앙귈라리움 (Vibrio anguillarium), 비브리오 캄프벨리 (Vibrio campbellii), 비브리오 할베이 (Vibrio harveyi), 비브리오 퍼니시 (Vibrio furnisii) 및 스트렙토코커스 파라우베리스 (Streptococcus parauberis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 어류 병원성 세균에 대한 항균 활성 및 알긴산 분해활성을 가지는 바실러스 속 (Bacillus sp.) IS-2 균주 (기탁번호 KCTC12596BP)를 넣고 배양하는 단계를 포함하는 사료 첨가제의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제9항의 방법에 의해 제조된 사료 첨가제.
  13. 제12항의 사료 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료.
  14. 제13항에 있어서, 상기 사료는 어류용인 것을 특징으로 하는 사료.
  15. 제13항의 사료를 어류에 급이하여 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda), 스트렙토코커스 이니애 (Streptococcus iniae), 비브리오 앙귈라리움 (Vibrio anguillarium), 비브리오 캄프벨리 (Vibrio campbellii), 비브리오 할베이 (Vibrio harveyi), 비브리오 퍼니시 (Vibrio furnisii) 및 스트렙토코커스 파라우베리스 (Streptococcus parauberis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 어류 병원성 세균에 대한 면역력을 증가시키는 방법.
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