CN109306329B - 枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01及其应用。该菌株的保藏编号为CDMCC NO.60294。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01显著区别于现有已知枯草芽孢杆菌菌株之处包括：(1)该菌株产酶活力高，所产生的蛋白酶包括角蛋白酶、羧肽蛋白酶、氨肽蛋白酶，这几种蛋白酶与普通枯草芽孢杆菌菌株产生的蛋白酶相比能够耐受100℃的温度，并且这些蛋白酶所分解所得苦味肽含量低、发酵产物有很强的风味作用，畜禽适口性很好；(2)该菌株具有肠道细胞黏附能力强的特点，黏附率高到62.78％。

Description

枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及应用。
背景技术
2013年，农业部2045号公告《饲料添加剂品种目录》中规定能够利用于微生态制剂的芽孢杆菌属种有枯草芽孢杆菌等。枯草芽孢杆菌在一定条件下产生芽孢，对高温、高压、强酸碱、挤压等不良环境的抵抗力很强，并且具有很强的蛋白酶、淀粉酶等活性，是开发新型微生态多功能剂的首选菌种。
目前，枯草芽孢杆菌制品的研究和开发的瓶颈问题是优良菌株的分离和筛选。虽然现有枯草芽孢杆菌菌株具有耐受胃酸、胆汁盐的能力，能够突破动物肠道环境的屏障，并且也能够产生酶，抑菌。但是，现有菌株不能定植于肠道中并大量繁殖，并且产蛋白酶活性低，蛋白酶也不具有耐高温性，并且这些蛋白酶所分解的蛋白质呈苦味，该缺陷使得枯草芽孢杆菌作为添加剂的应用效果欠佳。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种能够黏附于肠道细胞表面的、产蛋白酶活性高且具有耐高温性、分解蛋白无苦味的枯草芽孢杆菌菌株。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01，其保藏编号为CDMCCNO.60294。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01，为申请人从猪粪中分离得到，其生物学特征如下：菌落表面粗糙起皱，不透明，污白色，菌落圆形，呈火山口状，边缘呈锯齿状，革兰氏阳性菌；芽孢形态为椭圆形到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01的分子分类地位确定。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01的16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01显著区别于现有已知枯草芽孢杆菌菌株之处包括：(1)该菌株产酶活力高，所产生的蛋白酶包括角蛋白酶、羧肽蛋白酶、氨肽蛋白酶，这几种蛋白酶与普通枯草芽孢杆菌菌株产生的蛋白酶相比能够耐受100℃的温度，并且这些蛋白酶所分解所得苦味肽含量低、发酵产物有很强的风味作用，畜禽适口性很好；(2)该菌株具有肠道细胞黏附能力强的特点，黏附率高到62.78％。
本发明的目的还在提供上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01作为饲料添加剂的应用。
本发明的目的还在于提供一种饲料添加剂，该饲料添加剂以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01或/和其代谢物为活性成分。
在其中一些实施例中，所述饲料添加剂的剂型为粉剂、颗粒剂或液体剂。
在其中一些实施例中，所述饲料添加剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01的培养物以及饲料中可以接受的载体制备而成。
在其中一些实施例中，所述饲料添加剂中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01的活菌数不小于1000亿CFU/g。
本发明的再一目的是提供一种饲料，包含有上述的饲料添加剂。
在其中一些实施例中，所述饲料中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01的活菌数为107～109CFU/g。进一步地，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01的活菌数为108CFU/g。
本发明的再一目的是提供一种上述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)一级斜面培养：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01接种于一级斜面培养基上进行活化培养，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；
(2)二级液体培养：将步骤(1)所得一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中进行种子培养，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；
(3)三级扩大培养：将步骤(2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液体接种于三级液体培养基中进行扩大培养，得到三级枯草芽孢杆菌种子液；
(4)液体发酵：将步骤(3)所得的三级枯草芽孢杆菌种子液接种于液体发酵培养基中，进行发酵培养。
在其中一些实施例中，步骤(1)中：所述活化培养的条件包括：温度为32～38℃，时间为25～35h；所述的一级斜面培养基的配方包括：大豆蛋白胨6.0～12.0g/L，酵母膏6.0～12.0g/L，氯化钠1.0～4.0g/L，葡萄糖4.0～10.0g/L，琼脂20～30g/L，溶剂为水；
步骤(2)中，所述种子培养的条件包括：装液量为250～300mL/1000mL，温度为33～37℃，转速为150～200rpm，时间为25～30h；所述的二级液体培养的配方包括：大豆蛋白胨6.0～12.0g/L，酵母膏6.0～12.0g/L，氯化钠1.0～4.0g/L，葡萄糖4.0～10.0g/L，溶液为水；
步骤(3)中，所述扩大培养的条件包括：接种量为1.0～4.0％，温度为33～37℃，转速为150～200rpm，时间为25～30h；所述的三级液体培养基的配方包括：大豆蛋白胨6.0～12.0g/L，酵母膏6.0～12.0g/L，氯化钠1.0～4.0g/L，葡萄糖4.0～10.0g/L，溶剂为水；
步骤(4)中，所述发酵培养的条件为：罐压0.02～0.10MPa，搅拌转速150～200rpm，通风量1.0：(0.2～1.0)，发酵时间20～30h；所述的发酵培养基的配方包括：氮源10～40g/L，碳源60～120g/L，KH2PO4 1.5～2.5g/L，CaCO3 6.0～12.0g/L，溶剂为水。
在其中一些实施例中，所述的氮源为鱼粉、豆粕、棉籽粕、菜籽粕、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、蛋白胨、酵母抽提物中的至少一种；其中，所述的鱼粉、豆粕、棉籽粕、菜籽粕使用前需粉碎至100～150目、用30％甲醛蒸汽灭菌20～30min；所述的碳源为葡萄糖、淀粉、蔗糖、糖蜜中的至少一种。
针对该菌株的特性，本发明相应地进行逐级扩大培养，配以培养基配方的改良，加之工艺参数的优化，最终获得发酵效率高、菌体增殖快的培养物制备方法，通过该制备方法，在30～50吨发酵罐规模发酵的情况下，也能够使获得的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DFS01培养物中活菌数为350亿CFU/ml，是现有枯草芽孢杆菌菌株基于常规发酵条件所不能比拟的。
本发明的再一目的是提供一种饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
参照上述的方法进行发酵，获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01的培养物；
所述培养物直接用作饲料添加剂，或者将所述培养物与饲料中可以接受的载体制备成饲料添加剂。
在其中一些实施例中，所述的饲料添加剂为粉剂，制备方法包括如下步骤：取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01的培养物，经离心、微滤浓缩后添加载体，喷雾干燥，即得。
在其中一些实施例中，所述的载体为有机载体和/或无机载体；其中，有机载体选自玉米芯粉、脱脂米糠、玉米蛋白粉、变性淀粉、麦芽糖糊精、葡萄糖中的至少一种；无机载体选自轻质碳酸钙粉、沸石粉、蒙脱石粉、麦饭石粉中的至少一种。该粉剂制备中，所述添加载体之后所得混合物中固形物含量在15～45％。喷雾干燥之后所得粉剂中的水分为4～6％，菌体得率为95％，活菌数≥1×103亿CFU/g。
在其中一些实施例中，所述饲料添加剂中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01的活菌数大于等于1000亿CFU/g。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01与现有的枯草芽孢杆菌相比：
本发明的菌株具有肠道细胞粘附能力强的特点，黏附率高到62.78％，在用于饲料添加剂时，能够延长该菌在肠道环境的逗留，充分与肠道食物进行接触，成为优势菌群，改善肠道微生物环境，更充分的消化食物，促进肠道健康；本申请的菌株产酶活力高，能够产生多种蛋白酶，包括角蛋白酶、羧肽蛋白酶、氨肽蛋白酶，且这几种蛋白酶能够耐受100℃的温度，在用于饲料添加剂时，不管是在饲料加工过程中，还是饲料运输储存的过程中，饲料中的蛋白酶会很稳定；本申请的菌株所产蛋白酶活力高，非常产物苦味肽含量低价，分解产物不苦，分解的蛋白质具有很强的风味作用，适口性好。这些菌株特点，能够确保在用作添加剂时，添加剂产品质量稳定，在添加剂进入畜禽肠道后，这些蛋白酶相对于枯草芽孢杆菌本身就能够优先发挥作用，使得该添加剂的使用见效更快、效果更强、更好。
本发明提供的菌株已在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)保藏，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮政编码510075；本发明菌株的信息为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01；保藏号为CGMCC No.60294；保藏日期为2017年12月4日。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CDMCC NO.60294的筛选
1、初筛
(1)采用的试剂：
生理盐水的配制方法是：0.85wt％的氯化钠，高压灭菌后备用。
人工胃液的配制方法是：1％wt胃蛋白酶，0.85％wt的氯化钠，用HCl调pH值到1.5，使用0.22μm细菌过滤器过滤灭菌备用。
人工胆盐的配制方法是：在液体肉汤中添加0.3wt％的猪胆盐(分析纯)，高压灭菌后备用。
LB固体培养基的配制方法是：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂15g，加水至1000mL，NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌，冷却至50℃，倒平板。
(2)方法：
猪粪、鸡粪、牛粪、豆豉、腐烂稻草、猪场土壤等样品各5g，浸泡于20mL灭菌0.85wt％生理盐水中，震荡打散样品，使样品充分和生理盐水接触，90℃恒温水浴锅静置10min，取上清5mL，5000rpm离心10min，弃上清。
菌体沉淀加入10mL人工胃液，37℃震荡2h。5000rpm离心10min，弃上清，将菌体沉淀加入10mL人工胆盐中，37℃震荡4h。
梯度稀释涂布于LB固体培养基。37℃恒温培养箱培养20～24h，纯化菌落。
猪粪中分离出Z-1菌、Z-2菌，鸡粪中分离出J-1菌、J-2菌，牛粪中分离出N-1菌、N-2菌，豆豉样品中分离出D-1菌、D-2菌，腐烂稻草中分离出C-1菌、C-2菌，猪场土壤中分离出T-1菌、T-2菌。
初筛得到的以上菌株再进行进一步复筛。
2、复筛
(1)产蛋白酶能力的菌株的筛选
牛奶-LB培养基：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、脱脂奶粉15g，琼脂15g，水1000mL，NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌，冷却至60℃；将脱脂奶粉溶解后单独灭菌，然后加至冷却至60℃的酵母提取物蛋白胨培养基中，混匀倒平板。
用无菌牙签将分离纯化出的初筛菌株在1.5％的脱脂奶粉的LB培养基上进行点菌，37℃培养30h，观察平板长出的菌落，测量菌落周围的透明水解圈直径。计算透明圈直径与菌落直径比值(H/C)，发现菌Z-1、菌Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)、菌T-2的水解透明圈较大，其中菌Z-2的水解透明圈最大。
表1水解透明圈与菌落直径比值(H/C)
Figure GDA0001688036100000061
(2)抑菌能力测定
将LB固体培养基融化，冷却至45℃。加入过夜培养的大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌(每mL培养基加入1μL菌液)，震荡混匀，倒入无菌平板，水平凝固，在每个培养基平板上放置4只牛津杯，其间距相等。每只牛津杯中加入200μL待测菌液(Z-1、Z-2和T-2各做2～3个重复)，盖好皿盖，小心移至37℃培养箱，培养皿正放静置培养。培养24h后，打开皿盖，移去牛津杯，用卡尺测量抑菌圈直径(表2)。实验结果表明菌Z-2(DFS01，CDMCCNO.60294)的抑菌能力最强。
表2抑菌圈的测定
Figure GDA0001688036100000062
实施例2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CDMCC NO.60294的鉴定
(1)枯草芽孢杆菌Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)的初步鉴定
观察筛选出来的菌Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)的菌落形态，革兰氏染色后观察细菌形态特征。菌落表面粗糙起皱，不透明，污白色，菌落圆形，呈火山口状，边缘呈锯齿状，革兰氏阳性菌；芽孢形态为椭圆形到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。初步推测为芽孢杆菌属菌株。
(2)枯草芽孢杆菌Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)的分子鉴定
利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。
扩增细菌16S rRNA基因片段，引物如下：
上游引物(SEQ IDNO.2)5'-AGAGTT TGA TCC TGG CTCAG-3'；
下游引物(SEQ IDNO.3)5'-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3'。
反应体系：10×PCR缓冲液5μL、引物(20μmo1/L)各0.5μL、dNTP(2.5mmo1/L)5μL、Taq酶(5U/μL)0.5μL、模板DNA 1μL、水补足至50μL。
反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃返火30s，72℃延伸1.5min，进行30个循环，72℃延伸5min。
2％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增片段的测序结果见SEQ IDNO.1：
tgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctcccctccgggaaaccggggctaataccggatgcttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatcacctcc
菌Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例3、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01液剂-L1
(1)枯草芽孢杆菌一级斜面培养：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)的甘油保藏管中挑一环菌液接种于一级斜面培养基上，于37℃培养25小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨6.0，酵母膏6.0，氯化钠1.0，葡萄糖4.0，琼脂20，加水至1000mL，pH值7.0。
(2)枯草芽孢杆菌二级液体培养：
将步骤(1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量250mL/1000mL，在35℃、150rpm条件下培养25小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级液体培养为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨6.0，酵母膏6.0，氯化钠1.0，葡萄糖4.0，加水至1000mL，pH值7.0。
(3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤(2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液体按体积百分比1.0％，接种在液体培养基中，在35℃、150rpm条件下培养25小时，得到枯草芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤(2)中的培养基。
(4)枯草芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：鱼粉2.0，豆粕5.0，蛋白胨4.0，葡萄糖30.0，淀粉20.0，糖蜜20.0，KH2PO4 1.5，CaCO3 6.0，加水至1000mL；其中，鱼粉、豆粕先粉碎至100目、用40％甲醛蒸汽灭菌20min后使用。培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至105℃，并保温25min，自然冷却5min，通冷却水冷却至30℃，接入步骤(3)中所述种子菌液，接种量为1.0％，罐压0.02MPa，搅拌转速150rpm，通风量1.0:0.2，发酵时间20小时，直至菌数达到20亿CFU/ml。
实施例4、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01液剂-L2
(1)枯草芽孢杆菌一级斜面培养：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)的甘油保藏管中挑一环菌液接种于一级斜面培养基上，于38℃培养35小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨12.0，酵母膏12.0，氯化钠4.0，葡萄糖10.0，琼脂30，水1000mL，pH值7.0。
(2)枯草芽孢杆菌的二级液体培养：
将步骤(1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量300mL/1000mL，在35℃、200rpm条件下培养30小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级液体培养为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨12.0，酵母膏12.0，氯化钠4.0，葡萄糖10.0，水1000mL，pH值7.0；
(3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤(2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液体按体积百分比4.0％，接种在液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养30小时，得到枯草芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤2)中的培养基。
(4)枯草芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：豆粕20.0，棉籽粕20.0，淀粉70.0，蔗糖50.0，KH2PO4 2.5，CaCO3 12.0，水1000mL；豆粕、棉籽粕先粉碎至150目、用40％甲醛蒸汽灭菌40min后使用；培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至121℃，并保温35min，自然冷却15min，通冷却水冷却至40℃，接入步骤(3)中所述种子菌液，接种量为3.0％，罐压0.10MPa，搅拌转速200rpm，通风量1.0:1.0，发酵时间30小时，直至菌数达到20亿CFU/ml。
实施例5、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01液剂-L3
(1)枯草芽孢杆菌一级斜面培养：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)的甘油保藏管中挑一环菌液接种于一级斜面培养基上，于32℃培养35小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨6.0，酵母膏12.0，氯化钠4.0，葡萄糖10.0，琼脂30，水1000mL，pH值7.0。
(2)枯草芽孢杆菌的二级液体培养：
将步骤(1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量260mL/1000mL，在33℃、180rpm条件下培养26小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级液体培养为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨6.0，酵母膏12.0，氯化钠4.0，葡萄糖10.0，水1000mL，pH值7.0。
(3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤(2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液体按体积百分比2.0％，接种在液体培养基中，在36℃、160rpm条件下培养27小时，得到枯草芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤(2)中的培养基。
(4)枯草芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：鱼粉10，豆粕10，菜籽粕5，葡萄糖20，淀粉30，蔗糖20，KH2PO4 2.0，CaCO37.0；鱼粉、豆粕、菜籽粕先粉碎至110目、用40％甲醛蒸汽灭菌25min后使用；培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至121℃，并保温30min，自然冷却10min，通冷却水冷却至35℃，接入步骤(3)中所述种子菌液，接种量为2.5％，罐压0.05MPa，搅拌转速160rpm，通风量1.0:0.3，发酵时间21小时，直至菌数达到20亿CFU/ml。
实施例6、制备芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01液剂-L4
(1)枯草芽孢杆菌一级斜面培养：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)的甘油保藏管中挑一环菌液接种于一级斜面培养基上，于32℃培养35小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨7.0，酵母膏10.0，氯化钠2.0，葡萄糖5.0，琼脂23，pH值7.0。
(2)枯草芽孢杆菌的二级液体培养：
将步骤(1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量260mL/1000mL，在33℃、180rpm条件下培养26小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级液体培养为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨8.0，酵母膏9.0，氯化钠3.0，葡萄糖7.0，pH值7.0。
(3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤(2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液体按体积百分比2.0％，接种在液体培养基中，在36℃、160rpm条件下培养27小时，得到枯草芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤(2)中的培养基。
(4)枯草芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：棉籽粕10，菜籽5，尿素20，蛋白胨2，葡萄糖50，糖蜜50，KH2PO42.0，CaCO38.0，水1000mL；棉籽粕、菜籽先粉碎至110目、用40％甲醛蒸汽灭菌25min后使用；培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至121℃，并保温30min，自然冷却10min，通冷却水冷却至35℃，接入步骤(3)中所述种子菌液，接种量为2.5％，罐压0.05MPa，搅拌转速160rpm，通风量1.0:0.3，发酵时间21小时，直至菌数达到20亿CFU/ml。
实施例7、制备芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01液剂-L5
(1)枯草芽孢杆菌一级斜面培养：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)的甘油保藏管中挑一环菌液接种于一级斜面培养基上，于35℃培养35小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨11.0，酵母膏8.0，氯化钠3.5，葡萄糖9.0，琼脂28，水1000mL，pH值7.0。
(2)枯草芽孢杆菌的二级液体培养：
将步骤(1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量270mL/1000mL，在37℃、200rpm条件下培养25小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级液体培养为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨7.0，酵母膏11.0，氯化钠3.5，葡萄糖9.0，水1000mL，pH值7.0。
(3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤(2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液体按体积百分比2.0％，接种在液体培养基中，在36℃、160rpm条件下培养27小时，得到枯草芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤(2)中的培养基。
(4)枯草芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：鱼粉5，棉籽粕10，磷酸氢二铵10，蛋白胨5，葡萄糖70，淀粉20，KH2PO4 2.0，CaCO3 8.0，水1000mL；鱼粉、棉籽粕先粉碎至110目、用40％甲醛蒸汽灭菌25min后使用；培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至121℃，并保温30min，自然冷却10min，通冷却水冷却至35℃，接入步骤3)中所述种子菌液，接种量为2.5％，罐压0.05MPa，搅拌转速160rpm，通风量1.0:0.6，发酵时间21小时，直至菌数达到20亿CFU/ml。
实施例8、制备芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01液剂-L6
(1)枯草芽孢杆菌一级斜面培养：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-2CDMCC NO.60294的甘油保藏管中挑一环菌液接种于一级斜面培养基上，于35℃培养35小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨9.0，酵母膏12.0，氯化钠4.0，葡萄糖10.0，琼脂29，水1000mL，pH值7.0。
(2)枯草芽孢杆菌的二级液体培养：
将步骤(1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量270mL/1000mL，在37℃、200rpm条件下培养25小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级液体培养为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨10.0，酵母膏11.0，氯化钠2.5，葡萄糖10.0，水1000mL，pH值7.0。
(3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤(2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液体按体积百分比3.0％，接种在液体培养基中，在36℃、160rpm条件下培养27小时，得到枯草芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤(2)中的培养基。
(4)枯草芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：菜籽粕15，尿素20，蔗糖70，糖蜜40，KH2PO4 2.5，CaCO3 9.0，水1000mL；菜籽粕先粉碎至110目、用40％甲醛蒸汽灭菌25min后使用；培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至121℃，并保温30min，自然冷却10min，通冷却水冷却至35℃，接入步骤(3)中所述种子菌液，接种量为2.5％，罐压0.05MPa，搅拌转速160rpm，通风量1.0:0.6，发酵时间21小时，直至菌数达到20亿CFU/ml。
实施例9、制备芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01液剂-L7
(1)枯草芽孢杆菌一级斜面培养：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)的甘油保藏管中挑一环菌液接种于一级斜面培养基上，于35℃培养35小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨9.0，酵母膏12.0，氯化钠4.0，葡萄糖10.0，琼脂29，水1000mL，pH值7.0。
(2)枯草芽孢杆菌的二级液体培养：
将步骤(1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量270mL/1000mL，在37℃、200rpm条件下培养25小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级液体培养为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨10.0，酵母膏11.0，氯化钠2.5，葡萄糖10.0，水1000mL，pH值7.0。
(3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤(2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液体按体积百分比3.0％，接种在液体培养基中，在36℃、160rpm条件下培养27小时，得到枯草芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤(2)中的培养基。
(4)枯草芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：鱼粉5，棉籽粕10，磷酸氢二铵10，蛋白胨5，葡萄糖70，淀粉20，KH2PO4 2.5，CaCO3 9.0，水1000mL；鱼粉、棉籽粕先粉碎至110目、用40％甲醛蒸汽灭菌25min后使用；培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至121℃，并保温30min，自然冷却10min，通冷却水冷却至35℃，接入步骤(3)中所述种子菌液，接种量为2.5％，罐压0.05MPa，搅拌转速160rpm，通风量1.0:0.6，发酵时间21小时，直至菌数达到20亿CFU/ml。
实施例10、制备芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01液剂-L8
(1)枯草芽孢杆菌一级斜面培养：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)的甘油保藏管中挑一环菌液接种于一级斜面培养基上，于35℃培养35小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨9.0，酵母膏12.0，氯化钠4.0，葡萄糖10.0，琼脂29，水1000mL，pH值7.0。
(2)枯草芽孢杆菌的二级液体培养：
将步骤1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量270mL/1000mL，在37℃、200rpm条件下培养25小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级液体培养为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨10.0，酵母膏11.0，氯化钠2.5，葡萄糖10.0，水1000mL，pH值7.0。
(3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤(2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液体按体积百分比3.0％，接种在液体培养基中，在36℃、160rpm条件下培养27小时，得到枯草芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤(2)中的培养基。
(4)枯草芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：豆粕10，尿素10，酵母抽提物5，葡萄糖30，蔗糖10，糖蜜40，KH2PO4 2.5，CaCO3 9.0，水1000mL；豆粕先粉碎至1200目、用40％甲醛蒸汽灭菌25min后使用；培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至121℃，并保温30min，自然冷却10min，通冷却水冷却至35℃，接入步骤3)中所述种子菌液，接种量为2.5％，罐压0.05MPa，搅拌转速160rpm，通风量1.0:0.6，发酵时间21小时，直至菌数达到20亿CFU/ml。
实施例11、制备芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01液剂-L9
(1)枯草芽孢杆菌一级斜面培养：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-2(DFS01，CDMCC NO.60294)的甘油保藏管中挑一环菌液接种于一级斜面培养基上，于35℃培养35小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨9.0，酵母膏12.0，氯化钠4.0，葡萄糖10.0，琼脂29，水1000mL，pH值7.0。
(2)枯草芽孢杆菌的二级液体培养：
将步骤(1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量270mL/1000mL，在37℃、200rpm条件下培养25小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级液体培养为按下述比例配置的混合液(g/L)：大豆蛋白胨10.0，酵母膏11.0，氯化钠2.5，葡萄糖10.0，水1000mL，pH值7.0。
(3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤(2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液体按体积百分比3.0％，接种在液体培养基中，在36℃、160rpm条件下培养27小时，得到枯草芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤(2)中的培养基。
(4)枯草芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基为按下述比例配置的混合液(g/L)：豆粕10，棉籽粕5，硫酸铵10，酵母抽提物5，葡萄糖20，淀粉30，蔗糖35，糖蜜30，KH2PO4 2.5，CaCO3 9.0，水1000mL；豆粕、棉籽粕先粉碎至1200目、用40％甲醛蒸汽灭菌25min后使用；培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至121℃，并保温30min，自然冷却10min，通冷却水冷却至35℃，接入步骤(3)中所述种子菌液，接种量为2.5％，罐压0.05MPa，搅拌转速160rpm，通风量1.0:0.6，发酵时间21小时，直至菌数达到20亿CFU/ml。
实施例12、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01粉剂-P1
将实施例3得到的发酵液(液剂L-1)经负压真空浓缩到原体积的30％后，加入预先混合好的载体中，载体组成为：轻质碳酸钙粉30％，脱脂米糠70％，控制固形物含量在15％，喷雾干燥。最终物料水分4％，物料菌体得率为96％，制剂的活菌数为1.2×103亿CFU/g。
实施例13、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01粉剂-P2
将实施例4得到的发酵液(液剂L-2)经负压真空浓缩到原体积的60％后，加入预先混合好的载体中，载体组成为：沸石粉10％，玉米芯粉90％，控制固形物含量在30％，喷雾干燥。最终物料水分5％，物料菌体得率为95.5％，制剂的活菌数为1.4×103亿CFU/g。
实施例14、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01粉剂-P3
将实施例5得到的发酵液(液剂L-3)经负压真空浓缩到原体积的50％后，加入预先混合好的载体中，载体组成为：麦饭石粉60％，变性淀粉40％，控制固形物含量在35％，喷雾干燥。最终物料水分6％，物料菌体得率为97％，制剂的活菌数为2.4×103亿CFU/g。
实施例15、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01粉剂-P4
将实施例6得到的发酵液(液剂L-4)经负压真空浓缩到原体积的35％后，加入预先混合好的载体中，载体组成为：蒙脱石粉40％，玉米芯粉20％，麦芽糖糊精40％，控制固形物含量在40％，喷雾干燥。最终物料水分5％，物料菌体得率为96％，制剂的活菌数为2.4×103亿CFU/g。
实施例16、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01粉剂-P5
将实施例7得到的发酵液(液剂L-5)经负压真空浓缩到原体积的50％后，加入预先混合好的载体中，载体组成为：轻质碳酸钙粉20％，沸石粉25％，玉米蛋白粉30％，葡萄糖25％，控制固形物含量在20％，喷雾干燥。最终物料水分4.5％，物料菌体得率为98％，制剂的活菌数为2.7×103亿CFU/g。
实施例17、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01粉剂-P6
将实施例8得到的发酵液(液剂L-6)经负压真空浓缩到原体积的35％后，加入预先混合好的载体中，载体组成为：轻质碳酸钙粉10％，蒙脱石粉20％，变性淀粉40％，麦芽糖糊精30％，控制固形物含量在30％，喷雾干燥。最终物料水分4％，物料菌体得率为97％，制剂的活菌数为1.8×103亿CFU/g。
实施例18、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01粉剂-P7
将实施例9得到的发酵液(液剂L-7)经负压真空浓缩到原体积的55％后，加入预先混合好的载体中，载体组成为：沸石粉20％，蒙脱石粉15％，玉米芯粉25％，脱脂米糠40％，控制固形物含量在15％，喷雾干燥。最终物料水分5％，物料菌体得率为95％，制剂的活菌数为1.4×103亿CFU/g。
实施例19、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01粉剂-P8
将实施例10得到的发酵液(液剂L-8)经负压真空浓缩到原体积的30％后，加入预先混合好的载体中，载体组成为：轻质碳酸钙粉20％，麦饭石粉30％，脱脂米糠20％，玉米蛋白粉30％，控制固形物含量在45％，喷雾干燥。最终物料水分6％，物料菌体得率为97％，制剂的活菌数为1.8×103亿CFU/g。
实施例20、制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01粉剂-P9
将实施例11得到的发酵液(液剂L-9)经负压真空浓缩到原体积的40％后，加入预先混合好的载体中，载体组成为：沸石粉30％，麦饭石粉30％，玉米蛋白粉20％，麦芽糖糊精20％，控制固形物含量在20％，喷雾干燥。最终物料水分5％，物料菌体得率为98％，制剂的活菌数为2.1×103亿CFU/g。
实施例21、枯草芽孢杆菌颗粒剂的耐高温性
将对人工胃液、人工胆盐具有良好耐受的菌株枯草芽孢杆菌制剂(参照实施例20获得)按照108CFU/kg的终含量添加到预混料和全价料中进行制粒处理，检测菌株的存活率；
在80℃、90℃、100℃下制粒处理10分钟的枯草芽孢杆菌存活率分别在100％、92％、86％，结果见表3；说明该枯草芽抱杆菌可以耐受高温制粒处理而保持良好的活性。
表3、枯草芽孢杆菌在不同制粒温度下处理10min芽孢存活率结果
Figure GDA0001688036100000161
实施例22、枯草芽孢杆菌添加剂的贮存稳定性
常温常压下，参照实施例20制备粉剂，获得活菌数为5×1010CFU/g的枯草芽孢杆菌饲料添加剂，贮存6个月和12个月的存活率分别92％和81％，说明该枯草芽孢杆菌贮存性良好，可以在一定的时期内保持一定的活菌数量，保证活菌活性。
表4、5×1010CFU/g的枯草芽孢杆菌饲料添加剂贮存活菌存活率结果
Figure GDA0001688036100000162
实施例23、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01的定植能力
(1)对胶原蛋白的定植能力
胶原蛋白是一种重要的细胞外基质，对于枯草芽孢杆菌的肠道黏附定植具有重要的作用。本研究提取鼠尾胶原铺于96孔板，模拟肠道黏附环境，MTT法分析枯草芽孢杆菌对细胞外基质黏附能力。结果显示，本发明的枯草芽孢杆菌对胶原蛋白有很强的黏附能力，黏附菌数达到108CFU/mL，黏附率达到41.5％。以广东省微生物菌种保藏中心提供的、编号为GIMT1.011的枯草芽孢杆菌标准菌株为对照菌株，该对照菌株的黏附率为28.47％。
(2)对肠道细胞的黏附能力
枯草芽孢杆菌在肠道的黏附定植部位主要发生在结肠，因此本发明采用人结肠癌细胞SW480模拟肠道环境，通过MTT法测定枯草芽孢杆菌对结肠细胞的黏附能力。结果显示，与胶原蛋白黏附能力结果一致，黏附菌数达到108CFU/mL，黏附率达到62.78％。以广东省微生物菌种保藏中心提供的、编号为GIMT1.011的枯草芽孢杆菌标准菌株为对照菌株，该对照菌株的黏附率为35.12％。
实施例24、枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂的应用
将126头健康的30±2日龄杜×长×大三元杂交断奶仔猪(体重平均为8.2±0.16kg)按公母各半的原则随机分为7组，每组3个重复，每个重复6头猪，组1是空白对照，饲喂基础日粮，组2饲喂金霉素添加量为75mg/kg的基础日粮，组3、组4、组5分别饲料喂添加107CFU/kg、108CFU/kg、109CFU/kg枯草芽孢杆菌饲料添加剂(参照实施例20制备的粉剂)的基础日粮，组6饲喂添加枯草芽孢杆菌(CGMCC No.6101)108CFU/kg的基础日粮，组7饲喂添加枯草芽孢杆菌(CCTCC NO:M2013343)108CFU/kg的基础日粮。自由采食和自由饮水。试验期间按猪场常规方法进行饲养管理。试验第21天晚上8点停止喂料，照常供水，于次日早上对猪只空腹称重，计算试验的平均日增重，平均日采食量与饲料转化效率。
腹泻频率＝(腹泻仔猪头数×仔猪腹泻天数)/(试验仔猪头数×试验天数)×100％。结果见表5。
表5、枯草芽孢杆菌对断奶仔猪生产性能的影响
Figure GDA0001688036100000171
注：同行数据肩注字母不同表示差异显著(P＜0.05)
结果表明：108CFU/kg添加量的枯草芽孢杆菌(CDMCC NO.60294)可以显著改善断奶仔猪的生产性能。整个试验期，添加枯草芽孢杆菌(CDMCC NO.60294)组的日增重和采食量显著高于空白对照组(P＜0.05)，料重比显著低于空白对照组(P＜0.05)，腹泻率明显低于空白对照组和抗生素组。和组6、组7相比，饲喂枯草芽孢杆菌(CDMCC NO.60294)的组，比饲喂枯草芽孢杆菌(CGMCC No.6101)和饲喂添加枯草芽孢杆菌的日增重、采食量、料重比和腹泻率明显改善。试验证明，在仔猪的日粮中添加本发明量的枯草芽孢杆菌(CDMCCNO.60294)能显著提高仔猪的采食量，促进饲料利用率，提高仔猪的生长速度和日增重，使猪只的生产性能得到很大提高，也可替代部分抗生素，预防仔猪腹泻的发生。
实施例25、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01产酶测试
本发明的枯草芽孢杆菌具有同时产蛋白酶、氨肽酶及羧肽酶的能力。
将豆粕和水，以1：0.5的重量比例充分混匀，以重量比1％的接种量接种实施例12制备得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01粉剂-P1，发酵温度为35℃，发酵时间为72h。发酵容器为250mL的锥形瓶，装入50mL豆粕与水混合物，放入培养箱中进行发酵。
空白对照为不接种本申请枯草芽孢杆菌菌粉的豆粕和水(1：0.5)的混合物。
对照1以1％接种量接种枯草芽孢杆菌(保藏编号CCTCC NO：M2013626)菌粉的豆粕和水(1：0.5)的混合物，发酵温度为35℃，发酵时间为72h。
对照2以1％接种量接种枯草芽孢杆菌(保藏编号CCTCC NO：M2013539)菌粉的豆粕和水(1：0.5)的混合物，发酵温度为35℃，发酵时间为72h。
对照3以1％接种量接种枯草芽孢杆菌(保藏编号CGMCC No.9660)菌粉的豆粕和水(1：0.5)的混合物，发酵温度为35℃，发酵时间为72h。
发酵结束后，采用：(1)Folin-酚法测定发酵物中的蛋白酶活性，测定结果见表6；(2)以的Arg-MCA、Leu-MCA、Ala-MCA为氨肽酶荧光底物，利用荧光分光光度计测定氨肽酶活性，测定结果见表7；(3)以Cbz-Gly-Tyr、Cbz-Ala-Glu为底物测定羧肽酶活性，测定结果见表8。
表6蛋白酶活力(U)
Figure GDA0001688036100000181
Figure GDA0001688036100000191
结果表明：本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01，与对照组相比，具有较高的产蛋白酶能力。
表7氨肽酶活力(U)
实验组名称 吸光度值(A) 氨肽酶活力(U)
空白对照 0 0
实验组 0.291±0.001 312.51±5.23
对照组1 0 0
对照组2 0 0
对照组3 0 0
结果表明：本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01，与对照组相比，本发明的枯草芽孢杆菌具有产氨肽酶的能力，对照组不产生氨肽酶。
表8羧肽酶活力(U)
实验组名称 吸光度值(A) 羧肽酶活力(U)
空白对照 0 0
实验组 0.257±0.02 402.51±3.27
对照组1 0 0
对照组2 0 0
对照组3 0 0
结果表明：本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01，与对照组相比，本发明的枯草芽孢杆菌具有产羧肽酶的能力，对照组不产生羧肽酶。
实施例26、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01发酵豆粕测试
本发明的枯草芽孢杆菌发酵豆粕，可以显著降低豆粕的苦味肽，增加豆粕的酵香风味。
将豆粕和水，以1：0.5的比例充分混匀，以1％的接种量接种实施例12制备得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01粉剂-P1，发酵温度为35℃，发酵时间为72h。发酵容器为250mL的锥形瓶，装入50mL豆粕与水混合物，放入培养箱中进行发酵。
空白对照为不接种枯草芽孢杆菌菌粉的豆粕和水(1：0.5)的混合物。
对照1以1％接种量接种枯草芽孢杆菌(保藏编号CCTCC NO：M2013626)菌粉的豆粕和水(1：0.5)的混合物，发酵温度为35℃，发酵时间为72h。
对照2以1％接种量接种枯草芽孢杆菌(保藏编号CCTCC NO：M2013539)菌粉的豆粕和水(1：0.5)的混合物，发酵温度为35℃，发酵时间为72h。
对照3以1％接种量接种枯草芽孢杆菌(保藏编号CGMCC No.9660)菌粉的豆粕和水(1：0.5)的混合物，发酵温度为35℃，发酵时间为72h。
用正丁醇提取发酵豆粕中的苦味肽，利用考马斯亮蓝比色法测定苦味肽的OD值，根据蛋白质标准曲线计算其对应的蛋白含量，最后计算出苦味肽在发酵豆粕中的百分含量。测定结果见表9。
表9苦味肽在发酵豆粕中的含量(％)
实验组名称 苦味肽含量(％)
空白对照 24.1％
实验组 2.73％
对照组1 21.41％
对照组2 22.09％
对照组3 19.52％
结果表明：本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01，与对照组相比，使用本发明的枯草芽孢杆菌发酵豆粕，可以显著降低豆粕中的苦味肽，增加发酵豆粕的酵香风味，而对照组对苦味肽的降低作用不明显，发酵豆粕的酵香风味不强。
本发明采用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFS01：(1)抗逆性及定植能力强，活菌数高，可以耐受制粒高温，耐受人工胃液、人工胆盐。具体地，能够耐受pH1.5、1wt％胃蛋白酶的人工胃液，能够耐受0.3wt％的人工胆盐，还能够耐受80℃温度。因此，在经过饲料制粒，畜禽胃肠道环境后，还有大量活菌可以顺利进入肠道并迅速定植繁殖，在肠道中发挥益生功能，提高畜禽免疫力，降低养殖成本；同时还可以避免贮存和运输中活菌急速下降。(2)可以有效抑制畜禽肠道常见致病菌大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌，降低畜禽腹泻率，促进生长；(3)具有较强的产蛋白酶、氨肽酶及羧肽酶的功能，可以显著降低豆粕中的苦味肽，增强豆粕的酵香风味，有利于畜禽消化吸收饲料中的蛋白质，提高饲料转化率；(4)本发明采用多种物质作为氮源、碳源以及载体的来源，生产成本低廉，具有显著的经济效益、社会效益和生态效益，扩大了实际应用范围。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州大峰收生物科技有限公司
<120> 枯草芽孢杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1547
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa 60
cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc 120
ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgc ttgtttgaac cgcatggttc aaacataaaa 180
ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa 240
tggctcacca aggcaacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact 300
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa 360
gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt 420
agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc 480
acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt 540
attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa 600
ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac 660
gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg 720
tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 780
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 840
tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 900
cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 960
taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc gggggcagag 1020
tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc 1140
ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200
ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc 1260
ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc 1320
gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1440
agtcggtgag gtaacctttt aggagccagc cgccgaaggt gggacagatg attggggtga 1500
agtcgtaaca aggtagccgt atcggaaggt gcggctggat cacctcc 1547
<210> 3
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DFS01，其特征在于，其保藏编号为CDMCCNO.60294。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DFS01在制备饲料添加剂中的应用。
3.一种饲料添加剂，其特征在于，该饲料添加剂以权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DFS01或/和其代谢物为活性成分。
4.根据权利要求3所述的饲料添加剂，其特征在于，该饲料添加剂为粉剂、颗粒剂或液体剂。
5.根据权利要求4所述的饲料添加剂，其特征在于，该饲料添加剂由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DFS01的培养物以及饲料中可以接受的载体制备而成。
6.一种饲料，其特征在于，包含有权利要求3至5任一项所述饲料添加剂。
7.一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DFS01的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）一级斜面培养：将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DFS01接种于一级斜面培养基上进行活化培养，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；
（2）二级液体培养：将步骤（1）所得一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中进行种子培养，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；
（3）三级扩大培养：将步骤（2）得到的二级枯草芽孢杆菌种子液体接种于三级液体培养基中进行扩大培养，得到三级枯草芽孢杆菌种子液；
（4）液体发酵：将步骤（3）所得的三级枯草芽孢杆菌种子液接种于液体发酵培养基中，进行发酵培养。
8.根据权利要求7所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DFS01的发酵方法，其特征在于，步骤（1）中：所述活化培养的条件包括：温度为32~38℃，时间为25~35h；所述的一级斜面培养基的配方包括：大豆蛋白胨6.0~12.0 g/L，酵母膏6.0~12.0 g/L，氯化钠1.0~4.0g/L，葡萄糖4.0~10.0 g/L，琼脂20~30 g/L，溶剂为水；
步骤（2）中，所述种子培养的条件包括：装液量为250~300mL/1000mL，温度为33~37℃，转速为150~200rpm，时间为25~30h；所述的二级液体培养的配方包括：大豆蛋白胨6.0~12.0g/L，酵母膏6.0~12.0 g/L，氯化钠1.0~4.0 g/L，葡萄糖4.0~10.0 g/L，溶液为水；
步骤（3）中，所述扩大培养的条件包括：接种量为1.0~4.0%，温度为33~37℃，转速为150~200rpm，时间为25~30h；所述的三级液体培养基的配方包括：大豆蛋白胨6.0~12.0 g/L，酵母膏6.0~12.0 g/L，氯化钠1.0~4.0 g/L，葡萄糖4.0~10.0 g/L，溶剂为水；
步骤（4）中，所述发酵培养的条件为：罐压0.02~0.10MPa，搅拌转速150~200rpm，通风量1.0：（0.2~1.0），发酵时间20~30 h；所述的发酵培养基的配方包括：氮源10~40 g/L，碳源60~120g/L，KH2PO4 1.5~2.5 g/L，CaCO3 6.0~12.0 g/L，溶剂为水。
9.根据权利要求8所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DFS01的发酵方法，其特征在于，所述的氮源为鱼粉、豆粕、棉籽粕、菜籽粕、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、蛋白胨、酵母抽提物中的至少一种；所述的碳源为葡萄糖、淀粉、蔗糖、糖蜜中的至少一种。
10.一种饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
参照权利要求7至8任一项所述的方法进行发酵，获得权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DFS01的培养物；
所述培养物直接用作饲料添加剂，或者将所述培养物与饲料中可以接受的载体制备成饲料添加剂。
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