CN110063406A

CN110063406A - 解淀粉芽孢杆菌及其发酵种子液、应用与豆粕发酵方法

Info

Publication number: CN110063406A
Application number: CN201910208155.7A
Authority: CN
Inventors: 夏超笃; 艾琴; 湛穗璋; 刘小艳; 方炳虎
Original assignee: Guangdong Wens Dahuanong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Wens Dahuanong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2019-07-30

Abstract

本发明公开解淀粉芽孢杆菌，命名为DHN04，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号：GDMCC No:60376。该解淀粉芽孢杆菌可以高效地分泌中性蛋白酶，对降解豆粕抗原蛋白及提高发酵豆粕小肽含量有明显效果，是潜在的豆粕发酵菌种及微生态制剂。本发明同时还提供豆粕发酵方法，利用该解淀粉芽孢杆菌的发酵种子液，可有效地酶解大豆球蛋白和β‑伴大豆球蛋白，使小肽占比大幅度上升。

Description

解淀粉芽孢杆菌及其发酵种子液、应用与豆粕发酵方法

技术领域

本发明涉及一种微生物技术领域，具体涉及解淀粉芽孢杆菌及其发酵种子液、应用与豆粕发酵方法。

背景技术

豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品，其蛋白质组成合理、平衡，必需氨基酸含量丰富，是畜禽饲料中用量最大的植物源蛋白原料。

但由于豆粕中蛋白质分子质量大、结构复杂，同时含有较高的抗营养因子，限制了其消化利用率的进一步提升。其中热敏性抗营养因子通过加热或者膨化的方法就能使其钝化；但大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白等热稳定性抗营养因子在一般的饲料加工过程中不易被破坏，尤其在饲喂具有这些热稳定性抗营养因子的豆粕之后会引起一系列的过敏反应，如畜禽的胃肠胀气及腹泻。

研究表明，微生物发酵对饲料营养成分的影响及破坏均较小，而且可以同时去除多种抗营养因子，还可积累丰富的有益代谢产物及益生菌。因此采用生物发酵的方式处理豆粕，可以大幅提升豆粕的营养物质消化利用率，减少粪污排泄，达到节能减排的效果。此外，低抗营养因子优质发酵豆粕也可以有效替代鱼粉及血浆蛋白粉、肉骨粉等同源性蛋白，降低畜禽饲料安全隐患，减少益生菌、酸化剂、酶制剂及治疗用药物等添加，降低饲料配方成本。

目前市场上的发酵菌种及复合发酵剂对降解豆粕中抗原蛋白的处理效果不理想，且没有专门针对豆粕抗原蛋白降解处理，及提高发酵豆粕小肽含量的单一菌种。同时解淀粉芽孢杆菌更多的研究主要集中在对作物的生物防治上，对豆粕的发酵及抗原蛋白处理未见报道。

因此，筛选一种能够发酵高产蛋白酶，并特异降解豆粕抗原蛋白的菌株，为发酵豆粕的制备或者作为微生态制剂应用于玉米-豆粕型日粮中，对提高畜禽营养物质利用率及生产成绩，减少粪污排泄，促进畜禽健康养殖意义重大。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供解淀粉芽孢杆菌。该解淀粉芽孢杆菌能发酵产生分泌中性蛋白酶，能够协同性地提高酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解活性，以加速酶解豆粕中的大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白。

本发明的目的之二在于提供该解淀粉芽孢杆菌在解大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白上的应用。

本发明的目的之三在于提供该解淀粉芽孢杆菌的发酵种子液。

本发明的目的之四在于提供豆粕发酵方法，该方法是利用上述的解淀粉芽孢杆菌配合酸性蛋白酶和碱性蛋白酶对豆粕进行酶解，其具有较佳的酶解速率和效率。实现本发明的目的之一可以通过采取如下技术方案达到：

解淀粉芽孢杆菌，命名为DHN04，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号：GDMCC No:60376。分类学名称为：bacillus amyloliquefaciens，保藏日期为2018年5月24日；地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；广东省微生物研究所，电话 020-87137633。邮编：510075。

实现本发明的目的之二可以通过采取如下技术方案达到：

该解淀粉芽孢杆菌可有效降解大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。

实现本发明的目的之三可以通过采取如下技术方案达到：

该解淀粉芽孢杆菌经芽孢种子培养基二次活化而得，所述芽孢种子培养基由以下组分制成：8-12g蛋白胨、4-6g牛肉膏、4-6g NaCl 加水定容至1000mL，所述芽孢种子培养基的pH为7.2-7.4。

进一步地，该发酵种子液通过以下步骤制得：将解淀粉芽孢杆菌 DHN04在到营养琼脂平板上涂板，28-40℃培养后，在平板上挑取单个菌落解淀粉芽孢杆菌DHN04到芽孢种子培养基中，28-40℃活化得到一级种子液，再将一级种子液以1-3wt％的添加量添加到芽孢种子培养基中28-40℃活化得到发酵种子液。

实现本发明的目的之四可以通过采取如下技术方案达到：

豆粕发酵方法，利用上述的发酵种子液进行发酵。

进一步地，向豆粕混合液中加入1-3wt％的上述的发酵种子液，将pH调整至6-10，于35-42℃发酵。进一步地，同时向每100g豆粕混合液中加入复合蛋白酶，其中复合蛋白酶由碱性蛋白酶和酸性蛋白酶组成。

进一步地，复合蛋白酶的总活度为3000-6000U。

进一步地，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶与酸性蛋白酶按1: 0.8-1.2的活度比组成。

进一步地，发酵的pH值为7.5-8.5。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌是从土壤分离筛选的，能产生较高的中性蛋白酶，该菌种对豆粕进行酶解时，可特异性地降解豆粕中的大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白，提高发酵豆粕小肽含量，提升发酵豆粕的品质，是一种具有良好应用前景的菌株。

本发明的提供的解淀粉芽孢杆菌经复筛后，酶活度可达 50.38U/mL，为枯草芽孢杆菌标准株的2倍以上。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌DHN04透明圈；

图2为候选菌种发酵液蛋白酶活复筛比较图；

图3为解淀粉芽孢杆菌DHN04革兰氏染色图；

图4为解淀粉芽孢杆菌DHN04的生长曲线。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

以下具体实施方式中，如未特殊指出，所提及的百分比均为重量百分比；如未特殊指出，所涉及的培养基可为市售的普通培养基。

本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，命名为DHN04，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号：GDMCC No:60376。地址：广东省广州市先烈中路100号大院广东省微生物研究所59栋5楼，广东省微生物研究所，邮编510075，电话：020-87137633，传真： 020-87686803。

该解淀粉芽孢杆菌菌株DHN04为革兰氏阳性的杆菌，芽孢偏端生或中生，芽孢呈椭圆形，菌体单个、成对或链状排列。在营养平板培养基上培养48h，菌落表面干燥，粗糙不透明，边缘不整齐；在营养肉汤培养基中培养48h后呈沉淀性混浊。

该解淀粉芽孢杆菌菌株DHN04可以产生较高酶活的中性蛋白酶，可应用于降解豆粕抗原蛋白。

本发明还提供一种豆粕发酵方法，向豆粕混合液中加入1-3wt％的上述的解淀粉芽孢杆菌的发酵种子液，将pH调整至6-10，于 35-42℃发酵。

该方法通过解淀粉芽孢杆菌能产生较高酶活度的蛋白酶，以有效降解豆粕中的大豆球蛋白β-伴大豆球蛋白。

以下具体实施方式中所使用到的培养基包括但不限于以下培养基：

营养平板培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，脱脂奶粉1.5％，琼脂1.5％-2.0％，水1L，pH 7.2-7.4。

菌种保藏斜面培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂1.5％-2.0％，水1L，pH 7.2-7.4；

芽孢种子培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，水1L，pH 7.2-7.4。

复筛培养基：豆粕；2％、葡萄糖1％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.4％、 KH₂PO₄ 0.03％、CaCl₂0.1％；其中豆粕经过60目筛过滤。

所有的培养基在接种前都经120-125℃灭菌20-30min。

实施例1：菌种的筛选分离

用无菌镊子采集豆豉、畜禽肠道内容物、土壤等样品，装入袋中并做标记。采集到的样品每个样品取1g倒入含9mL无菌水的试管中，摇匀后放入80℃恒温水浴锅中处理20min，然后摇匀稀释，分别取10^-4、10^-5和10^-6三个稀释度涂布到营养平板培养基中，每个稀释度做3个重复，倒置于30℃恒温培养箱中培养24h。观察营养平板培养基上菌落周围的透明圈，并计算出(H/C)比值，标号记录。

将营养平板培养基中具有透明圈的菌落在脱脂牛奶平板上进行划线分离纯化。最后将分离出的单菌落接种到菌种保藏斜面培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24h后，放入冰箱中4℃保藏。结果如图1。

用游标卡尺量透明圈直径及菌落的直径，并计算透明圈与菌落的比值。结果如表1：

表1菌株透明圈/菌落筛选结果

表1中记录了30株菌的情况，其中标准株BZ1及BZ2(BZ为枯草芽孢杆菌标准株(CICC 10732))的透明圈/菌落比值最小，分别为1.45和1.42；最大的为DHN1，其透明圈/菌落比值为3.52；挑取透明圈/菌落比值在2.5以上的菌落，划线纯化并保存。

实施例2：菌种复筛与鉴定

1)复筛

将实施例1筛选得到的菌株接种于芽孢种子培养基，于180 r/min、37℃培养18h。

活化后的菌种按2％接种量接种于复筛培养基(250mL三角瓶， 50mL复筛培养基，菌种加1mL，5.5×10⁶cfu/mL)，于180r/min、 37℃培养48h，得发酵液。

取发酵液，4℃、10000r/min离心10min。以BZ标准株、市购枯草芽孢杆菌和市购发酵剂为对比，用Folin-酚法测定上清液蛋白酶活性，参照《GB/T 23527-2009蛋白酶制剂》附录B酶活力测定方法的福林法进行。结果如图2。

其中BZ标准株的酶活为22.56U/mL，DHN08酶活最低为0.36 U/mL，DHN10酶活最高为53.65U/mL，DHN04酶活为50.38U/mL。因此结合透明圈/菌落比值选择DHN04为候选菌种进行生理生化及 16S rRNA分子鉴定，序列如SEQ ID No.1所示。

2)革兰氏染色鉴定

用接种环挑取DHN04单菌落涂布至载玻片，用生理盐水稀释均匀，火焰固定后进行革兰氏染色，而后根据《伯杰氏细菌学鉴定手册》通过显微镜进行形态学鉴定。结果如图3及表2。

表2生理生化试验结果如下：

注：“+”表示为阳性反应，“-”表示为阴性反应

3)菌种16S rDNA测序鉴定

提取目标菌株基因组作为模粄，利用通用引物进行PCR扩增后测序。引物序列，27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R： 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；

PCR反应体系为25μL，其体系为10×Taq Buffer 2.5μL，dNTPs (2.5mM)2μL，ExTaq(5U/μL)0.25μL，27F(10μM)0.5μL，1492R (10μM)0.5μL，ddH₂O 16.25μL，3μL DNA模板。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火 1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min。PCR完成后电泳检测为阳性的PCR产物，测序并Blast在线比对。测序结果见序列表SEQ ID No.1。

4)生长曲线绘制

冻存的解淀粉芽孢杆菌活化，挑选菌种保藏斜面培养基上生长良好的菌落置于芽孢种子培养基中，放至37℃、180r/min摇床中培养。分别取10⁹cfu/mL的菌液500μL加至100mL的LB培养基并置于摇床中37℃180r/min培养。按照起始时、2、4、6、…、48h时的时间点取样并检测菌液OD₆₀₀nm值，期间每隔2小时取出1管，用酶标仪在波长600nm下测定菌液的OD值，然后以时间t为横坐标， OD₆₀₀nm为纵坐标绘制菌的生长曲线。结果见图4。

实施例3：豆粕发酵方法

1)制备发酵种子液：将解淀粉芽孢杆菌DHN04在到营养平板培养基上涂板，28-40℃培养12h后，在平板上挑取单个菌落解淀粉芽孢杆菌DHN04到芽孢种子培养基中，28-40℃活化12h得到一级种子液，再将一级种子液以2％的添加量添加到100mL芽孢种子培养基中 28-40℃活化12h得到发酵种子液；

2)发酵：将豆粕和水按1:1的重量比混合得到豆粕混合液，向三角瓶装入100g豆粕混合液，加入2g的步骤1)所得到的发酵种子液，将pH调整至7.5-8.5，于40℃发酵酶解；

3)检测：发酵48h后，样品于50℃烘干，粉碎过80目筛，用试剂盒检测抗原蛋白含量。

实施例4：豆粕发酵方法

2)发酵：将豆粕和水按1:1的重量比混合得到豆粕混合液，向三角瓶装入100g豆粕混合液，加入2g的步骤1)所得到的发酵种子液、15mg酶活度为20万U/g的碱性蛋白酶，60mg酶活度为5万 U/g的酸性蛋白酶，将pH调整至7.5-8.5，于40℃发酵酶解；

对比例1：豆粕发酵方法

1)发酵：将豆粕和水按1:1的重量比混合得到豆粕混合液，向三角瓶装入100g豆粕混合液，加入0.15g酶活度为20万U/g的碱性蛋白酶，将pH调整至7.5-8.5，于40℃发酵酶解；

2)检测：发酵48h后，样品于50℃烘干，粉碎过80目筛，用试剂盒检测抗原蛋白含量。

对比例2：豆粕发酵方法

1)发酵：将豆粕和水按1:1的重量比混合得到豆粕混合液，向三角瓶装入100g豆粕混合液，加入0.6g酶活度为5万U/g的酸蛋白酶，将pH调整至7.5-8.5，于40℃发酵酶解；

对比例3：豆粕发酵方法

1)发酵：将豆粕和水按1:1的重量比混合得到豆粕混合液，向三角瓶装入100g豆粕混合液，加入0.15g酶活度为20万U/g的碱性蛋白酶和0.6g酶活度为5万U/g的酸蛋白酶，将pH调整至7.5-8.5，于40℃发酵酶解；

对比例4：豆粕发酵方法

1)发酵：将豆粕和水按1:1的重量比混合得到豆粕混合液，将 pH调整至7.5-8.5，于40℃发酵酶解；

实施例3-4与对比例1-4的抗原蛋白结果见表3所示。

表3解淀粉芽孢杆菌DHN04发酵降解豆粕抗原蛋白

由表3可知，实施例3与对比例3相比，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的含量明显降低，尤其是大豆球蛋白的含量，与单独使用酸性蛋白酶或单独使用碱性蛋白酶相比，该含量的降低更显著。对比例4 的空白对照组，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量明显高于其它组。实施例4采用解淀粉芽孢杆菌联合酸性蛋白酶和碱性蛋白酶对豆粕的降解，最终大豆球蛋白相对于实施例3有显著的降低，即解淀粉芽孢杆菌联合酸性蛋白酶和碱性蛋白酶对豆粕具有协同增效的作用。

实施例5：豆粕发酵方法

2)发酵：将1.5kg豆粕原料和0.65L 40℃温水混合均匀，并加入 100mL的步骤1)所得到的发酵种子液；将pH调整至7.5-8.5，于36℃ 发酵酶解；

3)检测：发酵48h后，样品于50℃烘干，粉碎过80目筛，检测水分，粗蛋白，小肽含量。

实施例6：豆粕发酵方法

2)发酵：将1.5kg豆粕原料和0.65L 40℃温水混合均匀，并加入 43mL的步骤1)所得到的发酵种子液、0.32g酶活度为20万U/g的碱性蛋白酶，1.28g酶活度为5万U/g的酸性蛋白酶(57mL水溶解蛋白酶)；将pH调整至7.5-8.5，于36℃发酵酶解；

对比例5：豆粕发酵方法

1)发酵：将1.5kg豆粕原料和0.65L 40℃温水混合均匀，并加入 6g市售的发酵剂(用100mL水溶解)；将pH调整至7.5-8.5，于36℃ 发酵酶解；

2)检测：发酵48h后，样品于50℃烘干，粉碎过80目筛，检测水分，粗蛋白，小肽含量。

结果如下表所示：

表4发酵豆粕的效率

由上表可知，实施例5和实施例6发酵48h，小肽含量高达16％以上，明显高于市售的发酵菌剂，而增加酸性蛋白酶和碱性蛋白酶进行协同的，发酵48h后，小肽含量高达19％，明显高于单独使用解淀芽孢杆菌。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东温氏大华农生物科技有限公司

<120> 解淀粉芽孢杆菌及其发酵种子液、应用与豆粕发酵方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1402

<212> DNA

<213> 16SrRNA

<400> 1

ggctcctaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt gtgacgggcg 60

gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat 120

tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga tttgtgggat 180

tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc 240

aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc 300

agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc 360

gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc 420

tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga cctggtaagg 480

ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat 540

tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctg 600

cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac 660

cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag ttacagacca 720

gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc gctacacgtg 780

gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc tccccggttg 840

agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac gcccaataat 900

tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc 960

tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt cttccctaac 1020

aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc gtcagacttt 1080

cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt 1140

cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg tgagccgtta 1200

cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga agccaccttt 1260

tatgtctgaa ccatgcggtt caaacaacca tccggtatta gccccggttt cccggagtta 1320

tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct aacatcaggg 1380

agcaagctcc catctgtccg ct 1402

Claims

1.解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，命名为DHN04，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号：GDMCC No:60376。

2.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在解大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白上的应用。

3.一种解淀粉芽孢杆菌发酵种子液，其特征在于，由如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌经芽孢种子培养基二次活化而得，所述芽孢种子培养基由以下组分制成：8-12g蛋白胨、4-6g牛肉膏、4-6g NaCl加水定容至1000mL，所述芽孢种子培养基的pH为7.2-7.4。

4.如权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌发酵种子液，其特征在于，该发酵种子液通过以下步骤制得：将解淀粉芽孢杆菌DHN04在到营养琼脂平板上涂板，28-40℃培养后，在平板上挑取单个菌落解淀粉芽孢杆菌DHN04到芽孢种子培养基中，28-40℃活化得到一级种子液，再将一级种子液以1-3wt％的添加量添加到芽孢种子培养基中28-40℃活化得到发酵种子液。

5.豆粕发酵方法，其特征在于，利用如权利要求4所述的发酵种子液进行发酵。

6.如权利要求5所述的豆粕发酵方法，其特征在于，向豆粕混合液中加入1-3wt％的发酵种子液，将pH调整至6-10，于35-42℃发酵。

7.如权利要求6所述的豆粕发酵方法，其特征在于，同时向每100g豆粕混合液中加入复合蛋白酶，其中复合蛋白酶由碱性蛋白酶和酸性蛋白酶组成。

8.如权利要求7所述的豆粕发酵方法，其特征在于，所述复合蛋白酶的总活度为3000-6000U。

9.如权利要求7所述的豆粕发酵方法，其特征在于，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶与酸性蛋白酶按1:0.8-1.2的活度比组成。

10.如权利要求6所述的豆粕发酵方法，其特征在于，发酵的pH为7.5-8.5。