CN103525724B - 一种棉粕微生物发酵剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棉粕微生物发酵剂及其制备方法，是以酿酒酵母和植物乳杆菌为菌种，利用液体发酵进行扩大培养，添加保护剂后制得微生物发酵剂，其微生物发酵剂总活菌为2×10⁹cfu/g。利用本发明所述方法制备的微生物发酵剂能显著降解棉粕中的游离棉酚，有效抑制发酵过程中杂菌的生长，从而降低酸度、改善其适口性。脱毒发酵过程中还将一部分植物蛋白转换为菌体蛋白，增加B族维生素和活性酶，起到增加蛋白源及生物添加剂的作用，极大地提高其棉粕脱毒发酵的使用价值。本发明所述制备方法，菌种和发酵工艺简单，成本低，发酵效果好、发酵棉粕成本低，具有较强的市场竞争力。

Description

一种棉粕微生物发酵剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵剂，尤其是一种含有酿酒酵母菌与植物乳杆菌的棉粕微生物发酵剂及其制备方法。

背景技术

随着养殖业和饲料工业的迅速发展，蛋白饲料资源相对匮乏已成为制约我国养殖业发展的主要因素之一。我国是产棉大国，年产棉籽1100万吨以上，棉籽饼粕产量达600万吨以上。棉籽粕中粗蛋白质量分数为38%-50%，但蛋白质（氨基酸）消化利用率较豆粕低，并且棉籽饼粕中含有游离棉酚等有毒有害物质，因此限制了棉籽饼粕在饲料中的应用。

目前，国内外棉籽去毒的方法主要有加热处理法、旋液分离法、碱处理法、化学添加剂法、溶剂提取法和生物发酵法等。现有的处理技术，存在一定的缺陷，脱毒率不够高、设备成本高、破坏棉籽中的营养成分降低营养价值或者有化学残留。如用化学制剂、有机溶剂处理后残存的气味和色泽往往降低了棉籽仁的食用价值。

现有研究表明，以生物发酵方法对棉籽的营养价值影响最小。在采用生物发酵方法将棉籽饼粕中棉酚的脱毒方法，即利用微生物在发酵过程中对棉酚的转化降解作用而达到脱毒的目的。

但是现有公开技术对菌种和发酵条件工艺要求较高，选用的菌种组合或者抗逆性差、易霉变不易保存，或者酸度大、适口性差，或者无法有效降解棉粕游离棉酚和粗纤维，影响了饲料营养的消化、吸收和利用，从而降低了饲料转化率，增加了发酵棉粕的成本，降低了市场竞争力，不利于棉粕在饲料中的广泛使用。因此，急需对菌种和发酵工艺简单、低成本、低酸度的棉粕微生物发酵剂进一步的研究。

专利CN101307300B公开了在发酵条件下乳酸杆菌脱除棉酚能力最高，同时棉籽蛋白发酵后粗蛋白含量有所增加，粗纤维含量有所降低，增加了棉籽蛋白作为饲料的营养价值的内容。在此基础上，专利CN101897383B公开了一种发酵法去除棉菜粕毒物和提高营养价值的方法，使用棉粕、菜粕混合后，先加入料水和复合酶制剂，再接种能产蛋白酶菌或/和产乳酸菌及分解硫代葡萄糖甙或/和棉酚的微生物菌种，然后进行发酵得到处理后得到的棉菜粕，从而得到无毒高营养饲用发酵棉菜粕蛋白原料，解决了棉菜粕利用率低，在饲料中添加量少及存在有毒物质的危害等问题。

但是上述专利公开的乳酸杆菌发酵剂，在降低棉酚方面仍然存在一些不足。

发明内容

本发明提供了一种棉粕微生物发酵剂及其制备方法，将酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum），利用液体发酵进行扩大培养，添加保护剂后制得微生物发酵剂，其发酵工艺简单，并能有效降解棉粕中游离棉酚、改善其适口性，降解棉粕游离棉酚和粗纤维，分泌与合成大量活性益生菌，并能提高饲料转化率。

本发明第一个方面提供一种棉粕微生物发酵剂，包括酿酒酵母菌、植物乳杆菌。

本发明所述的酿酒酵母菌与植物乳杆菌重量比例为(95-99)∶(1-5)，优选为(95-98)∶(2-3)。

本发明所述的发酵剂所述发酵剂还包括保护剂及培养基中的任意一种或其混合。

本发明第二个方面提供一种棉粕微生物发酵剂的制备方法，具体步骤包括：

步骤1，将选育和制种的酿酒酵母菌、植物乳杆菌按比例混合，得复合菌种；

步骤2，将复合菌种接种于糖蜜液体培养液中，进行液体高速培养；

步骤3，扩大培养后，将所得的液体培养物与保护剂混合，得到微生物发酵剂。

本发明所述的棉粕脱毒微生物发酵剂中，总活菌含量为5×10⁸-5×10⁹cfu/g，优选为1×10⁹-3×10⁹cfu/g，如2×10⁹cfu/g。

本发明所述的酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）优选为保藏编号为ACCCNo：20065的菌种，植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）优选为保藏编号为ACCCNo：11118的菌种。

本发明所述的液体培养物与保护剂重量比例为(2-30)∶1，优选为(5-20)∶1。

本发明所述的酿酒酵母菌、植物乳杆菌的选育和制种步骤为：

步骤1，将酿酒酵母菌通过马铃薯培养基培养，将植物乳杆菌通过MRS琼脂培养基传代培养，根据菌落直径大小筛选菌株，将其置于0℃-4℃温度下保存；将得到的菌株接种分别接种于马铃薯培养基和MRS琼脂培养基中，将两种菌株分别在恒温条件下培养，取样测定，根据菌落总数筛选菌种；

步骤2，将筛选出的酿酒酵母菌、植物乳杆菌分别转接入装有MRS琼脂培养基和马铃薯培养基的茄子瓶中培养，待茄子瓶表面菌苔布满，得所需的酿酒酵母菌、植物乳杆菌。

其中，酿酒酵母菌与植物乳杆菌重量比例为(95-99)∶(1-5)，优选为(95-98)∶(2-3)。

所述步骤1的第一次筛选步骤中：

培养温度为25-35℃，优选为25-30℃；

培养时间为20-60h，优选为24-48h；

菌株的筛选条件优选为直径≥2mm的酿酒酵母菌落及直径≥5mm的植物乳杆菌落的菌落。

所述步骤1的第二次筛选步骤中，恒温条件培养是在两种菌株分别在转速为220-250r/min的恒温摇床中进行。

所述步骤1的第二次筛选步骤中：

培养温度为25-38℃，优选为28-35℃；

培养时间为20-60h，优选为24-48h；

菌种的筛选利用平板计数法进行菌落总数测定，其筛选条件为菌落总数≥10亿/ml的菌种。

所述步骤2中：

培养温度为25-38℃，优选为28-35℃；

培养时间为24-60h，优选为36-48h。

所述步骤2所得到的酿酒酵母菌、植物乳杆菌于2-6℃下保存备用。

本发明所述的复合菌种进行液体高速培养为将糖蜜液体培养基在120-125℃下高温灭菌15-20min，将复合菌种接种于已灭菌的糖蜜液体培养基中，复合菌种与糖蜜液体培养基重量比为1∶(30-100)，优选为1∶(50-100)。

本发明所述的液体高速培养还包括复合菌种与糖蜜液体培养基在温度28-35℃下搅拌混合24-36小时，其转速为200-220r/min，当活菌总数达到25亿/ml浓度且pH值达到4.0-4.5时停止发酵。

本发明所述保护剂为甘油与HO(CH₂CH₂O)_nH（n=200）混合物，其混合重量比例为(20-100)∶1，其中优选为(50-100)∶1

本发明所述的马铃薯培养基、MRS琼脂培养基、糖蜜液体培养基为本领域技术人员常用培养基。

本发明所述的棉粕微生物发酵剂是按与棉粕重量比例为(0.01-0.03)∶1，加入棉粕中，发酵去除游离棉酚。

本发明所述的酿酒酵母菌可有效降解游离棉酚、植物乳杆菌可有效减低酸度和改善适口性。将选育和制种的酿酒酵母菌、植物乳杆菌与专用培养基发酵，在发酵中添加易于溶解的糖蜜，所得的棉粕微生物发酵剂具有以下的优点或有益效果：

1.制备发酵剂使用菌种和发酵工艺简单，制备成本低；

2.可降低棉粕酸度，对病害菌有抑制作用，避免棉粕在发酵过程受到其他杂菌的污染，保证了产品质量；

3.能有效降解棉粕中的游离棉酚、降解和软化粗纤维，显著降低棉粕游离棉酚和粗纤维的浓度，改善了棉粕脱毒发酵后的适口性；

4.利用本发明所述发酵剂对棉粕进行脱毒发酵过程中能分泌与合成大量活性益生菌，各种生化酶能调节机体胃肠道微生态平衡和提高消化酶活性，降低酸度促进饲料营养的消化、吸收和利用，提高饲料转化率和饲料报酬；发酵还能将一部分植物蛋白转换为菌体蛋白，合成生物活性小肽类氨基酸、促生长因子等营养与激素类物质，增加B族维生素和活性酶，其中的微生物菌体蛋白，β-葡聚糖等能有效提高动物免疫力；

5.抗逆性强，易于长期保存；

6.分散系数高，在棉粕脱毒发酵过程中，本发明所述发酵剂可均匀分散于棉粕四周，有效提高棉粕脱毒发酵的效率；

7.棉粕脱毒发酵过程中，所需本发明所述发酵剂使用量少，发酵效果好，可大大降低棉粕脱毒发酵成本，提高棉粕脱毒发酵所制得蛋白质在饲料中应用的市场竞争力。

附图说明

图1是本发明实施例发酵剂对棉粕发酵后的SDS-PAGE凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种棉粕微生物发酵剂及其制备方法。

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1

制备棉粕微生物发酵剂。

本实施例选用酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）保藏编号为ACCCNo：20065以及植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）保藏编号为ACCCNo：11118的两种菌种进行选育和制种，其步骤为：

步骤1，将酿酒酵母菌通过马铃薯培养基培养，将植物乳杆菌通过MRS琼脂培养基传代培养，观察菌种生长速度，30℃培养36h将直径≥2mm的酿酒酵母菌落，直径≥5mm的植物乳杆菌落的菌株在4℃温度加以保存；将得到的酿酒酵母菌株接种于马铃薯培养基中，将植物乳杆菌株接种在MRS培养基中，将两种菌株分别在转速为250r/min的恒温摇床中在30℃培养24h，取样，利用平板计数法进行菌落总数测定，菌落总数15亿/ml的菌种用于生产制种；

步骤2，将筛选出的植物乳杆菌、酿酒酵母菌分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，在30℃温度下培养36h，待茄子瓶表面菌苔布满，得到用于后续培养的酿酒酵母菌、植物乳杆菌，然后放入4℃的冰箱中保存。

其次，在得到所需的酿酒酵母、植物乳杆菌后，制备棉粕微生物发酵剂的具体步骤为：

步骤1，将选育和制种的酿酒酵母菌、植物乳杆菌分别以98数量份和2数量份混合；

步骤2，将复合菌种接种于糖蜜液体培养液中进行液体高速培养；

步骤3，扩大培养后，将所得的液体培养物与保护剂混合，其重量比例为5.5∶1，保护剂为甘油与HO(CH₂CH₂O)₂₀₀H，混合重量比例为60∶1，得到微生物发酵剂。

其中，液体高速培养具体为糖蜜液体培养基在121℃高温灭菌15min，将复合菌种接种于上述液体培养基中，其重量比例为1∶50，在28℃搅拌36小时，其转速为200r/min，当活菌总数达到25亿/ml浓度且pH值达到4.4时停止发酵。

本发明所述的马铃薯培养基、MRS琼脂培养基、糖蜜液体培养基为本领域技术人员常用培养基。

实施例2

制备棉粕微生物发酵剂。

本实施例选用酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）保藏编号为ACCCNo：20065以及植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）保藏编号为ACCCNo：11118的两种菌种进行选育和制种，其步骤为：

步骤1，将酿酒酵母菌通过马铃薯培养基培养，将植物乳杆菌通过MRS琼脂培养基传代培养，观察菌种生长速度，30℃培养40h将直径大于2mm的酿酒酵母菌落，直径大于5mm的植物乳杆菌落的菌株在4℃温度加以保存；将得到的酿酒酵母菌株接种于马铃薯培养基中，将植物乳杆菌株接种在MRS培养基中，将两种菌株分别在转速为250r/min的恒温摇床中在30℃培养24h，取样，利用平板计数法进行菌落总数测定，菌落总数18亿/ml的菌种用于生产制种；

步骤2，将筛选出的植物乳杆菌、酿酒酵母菌分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，在30℃温度下培养36h，待茄子瓶表面菌苔布满，得到用于后续培养的酿酒酵母菌、植物乳杆菌，然后放入4℃的冰箱中保存。

其次，在得到所需的酿酒酵母菌、植物乳杆菌后，制备棉粕微生物发酵剂的具体步骤为：

步骤1，将选育和制种的酿酒酵母菌、植物乳杆菌分别以97数量份和3数量份混合；

步骤2，将复合菌种接种于糖蜜液体培养液中进行液体高速培养；

步骤3，扩大培养后，将所得的液体培养物与保护剂混合，其重量比例为6.5∶1，保护剂为甘油与HO(CH₂CH₂O)₂₀₀H，混合重量比例为80∶1，得到微生物发酵剂。

其中，液体高速培养具体为糖蜜液体培养基在121℃高温灭菌15min，将复合菌种接种于糖蜜液体培养基，其重量比例为1∶75，在28℃搅拌36小时，其转速为200r/min，当活菌总数达到25亿/ml浓度且pH值达到4.3时停止发酵。

本发明所述的马铃薯培养基、MRS琼脂培养基、糖蜜液体培养基为本领域技术人员常用培养基。

性能检测

1、微生物发酵剂对棉粕营养以及游离棉酚含量影响的检测

检测方法：

1.粗蛋白CP的检测参照GB/T6432-1994饲料中粗蛋白的检测方法；

2.游离棉酚含量的检测参照GB/T13086-1991饲料中游离棉酚的测定方法；

检测结果：

经过检测，以上实施例的产品的性能均能达到以下指标。

表1，微生物发酵剂对棉粕初蛋白CP以及游离棉酚含量的测试

备注：表1中，所述比率指的是变化比率，数值为正值的情况下为增加的比例，数值为负值的情况下为下降比例。

检测结果分析：

本发明实施例1-2中，使用微生物发酵后的棉粕，粗蛋白CP分别由44.56%上升为45.62%、由44.36%上升为47.12%，说明使用本发明所述的微生物发酵剂，不会破坏棉粕中的粗蛋白CP，反而可以增加其粗蛋白含量，可以避免棉粕中的蛋白含量在脱毒发酵过程中损失；

本发明实施例1-2中，使用微生物发酵后的棉粕，棉粕中游离棉酚含量分别由968mg/Kg下降为151mg/Kg、由893mg/Kg下降为86mg/Kg，可以看出使用本发明所述的微生物发酵剂降解棉粕中游离棉酚的效果显著，从而可以有效改善饲料的适口性。

2、SDS-PAGE凝胶电泳分析检测

检测方法：

使用上海生物化学研究所生产的SDS-PAGE超低分子量标准蛋白质和多肽（分子量3.313-20.10kDa）作为MARK，进行电泳分析测试，上层浓缩胶为5%，下层分离胶浓度含量为15%。

检测结果：如附图1。

检测结果分析：

从SDS-PAGE凝胶电泳图分析，对比MARK与本发明实施例以及实施例中棉粕发酵前与发酵后的电泳图，可以看出使用本发明实施例所得的微生物发酵剂，对棉粕进行微生物固态发酵后，棉粕底物中蛋白质和肽分子质量分布有明显变化。

其中，发酵前棉籽粕底物中蛋白质分子质量较大，大部分蛋白分子质量大于20KDa，且多集中在40-100KDa；经过酿酒酵母菌和植物乳杆菌固态发酵处理后，大分子蛋白几乎全部被降解为小分子蛋白或小分子肽，分子质量基本在14KDa以下。

这是因为在棉粕固态发酵过程中，棉籽粕底物中的粗蛋白一部分被微生物用于合成菌体蛋白，另一部分被降解为小分子蛋白和小分子肽；另外在微生物的作用下，非蛋白氮转化为真蛋白氮，提高了粗蛋白和氨基酸的利用率，因此也提高了棉籽粕的营养价值。

此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其配方、工艺所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种棉粕微生物发酵剂，其特征在于，包括酿酒酵母菌、植物乳杆菌；

其中：

酿酒酵母菌为保藏编号为ACCCNo：20065的菌种，植物乳杆菌为保藏编号为ACCCNo：11118的菌种；

所述酿酒酵母菌与植物乳杆菌重量比例为(95-99)∶(1-5)；

所述酿酒酵母、植物乳杆菌的制备方法为：

步骤1，将酿酒酵母菌通过马铃薯培养基培养，将植物乳杆菌通过MRS琼脂培养基传代培养，根据菌落直径大小筛选菌株，将其置于0℃-4℃温度下保存；将得到的菌株接种分别接种于马铃薯培养基和MRS琼脂培养基中，将两种菌株分别在恒温条件下培养，取样测定，根据菌落总数筛选菌种；

步骤2，将筛选出的酿酒酵母菌、植物乳杆菌分别转接入装有马铃薯培养基和MRS琼脂培养基的茄子瓶中培养，待茄子瓶表面菌苔布满，得所需的酿酒酵母菌、植物乳杆菌。

2.根据权利要求1所述的棉粕微生物发酵剂，其特征在于，所述发酵剂还包括保护剂及培养基中的任意一种或其混合。

3.根据权利要求2所述的棉粕微生物发酵剂，其特征在于，培养物与保护剂的重量比例为(2-30)∶1。

4.根据权利要求2所述的棉粕微生物发酵剂，其特征在于，所述保护剂包括甘油与HO(CH₂CH₂O)_nH，其中n＝200，其混合重量比例为(20-100)：1。

5.根据权利要求1所述的棉粕微生物发酵剂，其特征在于，所述的步骤1筛选的菌株具体为直径≥2mm的酿酒酵母菌落的菌株及直径≥5mm的植物乳杆菌落的菌株。

6.根据权利要求1所述的棉粕微生物发酵剂，其特征在于，所述的步骤1筛选的菌种为菌落总数≥10亿/ml。

7.一种如权利要求1所述的棉粕微生物发酵剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，将选育和制种的酿酒酵母、植物乳杆菌混合，得复合菌种；

步骤2，将复合菌种接种于糖蜜液体培养液中进行液体高速培养；

步骤3，扩大培养后，将所得的液体培养物与保护剂混合，得到微生物发酵剂。

8.根据权利要求7所述的棉粕微生物发酵剂的制备方法，其特征在于，所述的复合菌种进行液体高速培养，是将复合菌种接种于已灭菌的糖蜜液体培养基中，复合菌种与糖蜜液体培养基重量比为1∶(30-100)，搅拌至活菌总数达到25亿/ml浓度且pH值达到4.0-4.5时停止发酵。