CN105255793B - 一种具有降解棉酚作用的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

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本发明公开了一种具有降解棉酚作用的植物乳杆菌及其应用。该植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)于2015年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.10999。将其应用于棉粕进行固态厌氧发酵，发酵后对于棉酚的降解率可达到68.35％，能有效抑制杂菌生长，防止二次污染，使得棉粕饲料真正做到安全无毒。发酵后的棉粕饲料富有酸香味，大大促进棉粕作为蛋白质饲料的利用率，对于缓解蛋白质饲料紧缺，减少鱼粉、豆粕等进口，降低饲料成本，提高畜牧业效益具有重要意义，能够真正广泛地应用于工业生产中。

Description

一种具有降解棉酚作用的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有降解棉酚作用的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
棉粕(Cottonseed Meal,CSM)是棉籽经脱壳、加热、压扁成薄片用溶剂己烷浸出油后， 所剩余的副产品。棉粕是重要的蛋白饲料资源之一，其粗蛋白含量约为40％，仅次于豆粕，而且我国是世界产棉大国，棉花产量居世界第一位，每年棉籽饼粕产量约400-500万吨。但是，棉粕却得不到高效利用，究其原因，是因为棉酚等有毒物质的存在，使得其应用大大受到限制。近年来随着畜牧业的发展，世界范围内蛋白质饲料的缺乏日益突出。棉籽饼粕是当前形势下理想的替代豆粕的植物蛋白质源，而且棉籽饼粕价格低廉，现时售价不到大豆饼粕价格的一半，对棉籽饼粕的开发利用，无疑会给我国畜牧业带来显著的经济效益。
棉酚(Gossypol)俗称棉毒素，是棉籽腺体中一种黄色的多酚色素，分子式为C30H30O8， 分子量518.5。游离棉酚(Free Gossypol，FG)的毒性作用主要表现如下：破坏睾丸生精上皮， 影响动物的生殖机能；对肠胃黏膜有刺激作用，易引起肠胃黏膜发炎出血；使机体神经受到损伤及抑制等。饲料中游离棉酚含量超过安全界限，将导致畜禽食欲下降、生长迟缓、体重减轻、腹泻、毛发脱落、不育等，严重的会导致心肌损伤，引起内脏充血和水肿，胸腔和腹腔体液浸出、出血、甚至死亡。
目前，一些公开专利文献涉及棉酚降解的方法及其应用，例如CN 104146166 A公开了一种添加七水硫酸亚铁和晶体赖氨酸的棉粕饲料，能有效降低其中游离棉酚的含量；CN 103766597 A公开了一种新的饲料加工技术——蒸汽爆破处理技术，可以快速高效地去除棉粕中的游离棉酚；CN 102178030 A公开了一种添加1％的NaOH溶液进行棉副产品脱棉酚的方法。但是，目前涉及利用乳酸菌发酵来降低棉粕中棉酚含量的专利申请文件不多，例如CN 104031852 A公开了一种产朊假丝酵母菌固态发酵棉杆，降解率达53.9％；CN102154120 A公开了一种稻根霉菌发酵棉粕后，对棉酚的降解率为61.38％。
前人多用霉菌进行好氧发酵棉粕，此过程中，由于与空气充分接触，容易造成杂菌污染，其他杂菌跟着一起发酵，导致发酵产品容易二次污染，这样发酵后的棉粕不但做不到安全脱毒，反而有可能增加其毒性。而本发明筛选出的具有益生功能的乳酸菌，不仅游离棉酚的降解率高达65％以上，而且利用此益生菌来进行棉粕发酵脱毒，具有诸多优点：采用厌氧发酵的形式，避免了与空气的大量接触，有效抑制杂菌污染；而且发酵过程中乳酸菌产酸，pH值不断降低，更加抑制了其他腐败菌的生长，同时产生了大量有机酸等其他营养物质，更加赋予棉粕饲料一种功能性饲料的特性；发酵后的棉粕饲料富有酸香味，能大大提高适口性与动物的采食量，真正意义上做到棉粕的安全脱毒，使得棉粕能够得到高效利用。
因此，筛选出一种能通过厌氧发酵高效降解棉酚的益生菌，并在棉粕以及其他棉副产品中实际应用就显得十分必要。本发明在总结现有技术的基础上，通过大量实验研究，终于完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，探究筛选出一种新型的游离棉酚降解菌，使用本发明所述乳酸菌株可以使高棉酚含量棉粕中的游离棉酚去除率达到68.35％，并且有很好的菌株稳定性。使用该降解菌株可以高效降解棉籽粕中的游离棉酚，使之达到使用标准，把棉籽粕变成可利用的饲料蛋白源，对提高棉籽粕的高效利用率以及促进我国饲养业的发展具有重要的意义。
本发明获得的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，该菌株已于2015年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10999。
所述植物乳杆菌CGMCC No.10999具有以下特性：
(1)菌落特征：在MRS培养基上生长良好，形成乳白色、半透明、圆形菌落，菌落表面湿润。细菌形态呈中长杆状，两端椭圆，革兰氏染色反应呈阳性，无运动性，不产芽孢。
(2)生长特性：该菌株的最低生长温度为16℃，最高生长温度为40℃，该菌株以30-37℃的生长温度为佳，最适生长初始pH值为6.0；本发明植物乳杆菌CGMCC No.10999菌株的延滞期相对较短，4h左右开始进入对数生长期，16h左右就达到稳定期。生长曲线如图1。
(3)该菌株具有耐酸性，产酸性能良好。产酸曲线如图2。
(4)植物乳杆菌CGMCC No.10999能以游离棉酚为唯一碳源进行生长，在游离棉酚(FG)浓度为0.1g/L的唯一碳源培养基中，对FG的降解率最高可达到68.23％。游离棉酚的降解率随着时间的变化曲线如图3。
本发明提供的植物乳杆菌CGMCC No.10999可用于生物降解游离棉酚，可在高浓度游离棉酚含量的棉籽粕的生物处理中应用。发酵后可有效降低棉粕中游离棉酚的含量，具有十分广泛的应用前景。
生物材料保藏
植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，该菌株已于2015年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10999。
附图说明
图1为植物乳杆菌CGMCC No.10999的生长曲线。
图2为植物乳杆菌CGMCC No.10999的产酸曲线。
图3为不同时间下植物乳杆菌CGMCC No.10999对游离棉酚的降解效果图。
图4为利用植物乳杆菌CGMCC No.10999发酵前后棉粕中游离棉酚的含量变化图。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1游离棉酚标准液的配置
所述游离棉酚为游离棉酚标准品，由江南大学油脂及植物蛋白工程研究中心提供，使用时配制成1000mg/L的标准液。具体配制方法为：精确称取100mg的游离棉酚标准品，将其溶解于100mL的乙腈中，于棕色容量瓶中定容，充分混匀溶解后，转移至棕色试剂瓶中，置于-20℃下保存备用。
实施例2降解游离棉酚的乳酸菌的筛选
配制以游离棉酚为唯一碳源的固体培养基，其中无碳基础培养基配方如下：硫酸铵5g，磷酸二氢钾1g，氯化钠0.1g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.1g，酵母膏0.2g，吐温807.5ml，琼脂 20g。加去离子水至1000mL，115℃湿热灭菌20min。无菌条件下，在灭过菌的无碳基础培养基中，加入游离棉酚标准液，使其浓度达到0.1g/L。
将分离自传统发酵食品的不同乳酸菌株涂布于上述以游离棉酚为唯一碳源的固体培养基上，同时，以不加碳源的培养基作为阴性对照，葡萄糖基础培养基作为阳性对照。37℃下静置恒温培养，定期观察菌株的生长情况，进行初步筛选。将初筛选出的部分菌株，接种于以游离棉酚为唯一碳源的液体培养基中，利用高效液相色谱法(HPLC)检测其中游离棉酚含量的变化，从而筛选出能高效降解游离棉酚的乳酸菌株。
实施例3植物乳杆菌CGMCC No.10999生长曲线的测定
取-20℃甘油管保存的植物乳杆菌CGMCC No.10999，将其在MRS固体培养基上划线培养。在37℃培养24小时左右后，从生长良好的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)单菌落上挑取乳酸菌细胞接种到MRS液体培养基中静置培养24小时，培养温度为37℃。然后按2％接种量将此活化后的植物乳杆菌CGMCC No.10999培养液接种到新鲜MRS液体培养基中，于温度为37℃，转速为150r/min的摇床中振荡培养24小时，每隔2个小时取5mL培养液使用紫外分光光度计测600nm下的OD值并进行平板计数，根据结果绘制植物乳杆菌CGMCC No.10999的生长曲线，其结果如图1所示，从图1中可以看出：植物乳杆菌CGMCC No.10999 在MRS培养基中生长迅速，在4h左右即进入对数生长期，16h左右进入稳定期。随着培养时间的延长，该乳酸菌株生长产酸，pH不断降低，进入稳定期后，pH下降趋势渐缓，可见图2。
实施例4植物乳杆菌CGMCC No.10999的培养，用于棉粕发酵菌种的制备
斜面菌种：制作MRS斜面培养基，划线接种植物乳杆菌CGMCC No.10999，于37℃下培养18h，将斜面菌种于-20℃冰箱中保存。
一级种子：从斜面菌种保藏管中挑取菌落转接至新鲜MRS斜面培养基中，划线接种，于 37℃下培养18h。
二级种子：从一级种子中按2％接种量接种至新鲜MRS液体培养基中，于37℃下培养18h，即制成发酵菌种。
实施例5不同时间下植物乳杆菌CGMCC No.10999对游离棉酚降解情况分析
取经过两次传代，已培养至对数生长期的植物乳杆菌CGMCC No.10999，按照2％的接种量将其接种于以棉酚为唯一碳源的液体培养基中，于37℃，150r/min的摇床中进行培养，间隔24h取样，将取出的培养液于4℃、10000rpm的转速离心10min取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法检测其中游离棉酚残留量。每个时间的处理做3个平行样。同时，设置不加植物乳杆菌CGMCC No.10999为对照组。
结果见图3，植物乳杆菌CGMCC No.10999降解游离棉酚的速率初期较为缓慢，随着时间的增长降解率不断升高，在10天左右基本趋于平缓，降解率最高可达到68.23％。
实施例6植物乳杆菌CGMCC No.10999在棉粕脱毒中的应用
发酵培养基的制备：将棉粕粉碎过50目筛，将其与玉米粉，麦麸的比例按照7:2:1进行混合均匀，组成发酵底物。将底物在115℃下灭菌20min后，按照水分含量40％，接种量10％，在自封袋中密闭厌氧发酵48h，分别测量发酵前后棉粕中游离棉酚的含量，结果见图4。
利用本发明所述的植物乳杆菌CGMCC No.10999接种到棉粕底物中进行发酵，通过对比棉粕发酵前后其中游离棉酚的含量变化，可得出48h后该菌株对棉粕中游离棉酚的去除率达到68.35％，可有效降低棉粕中的游离棉酚含量，具有良好的应用效果。
实施例7植物乳杆菌CGMCC No.10999在生产高品质棉粕中的应用
按照实施例6的方法，利用植物乳杆菌CGMCC No.10999对棉粕进行固态厌氧发酵后，得到的棉粕饲料产品，具有乳酸菌发酵后的酸香味，可提高畜禽的采食量，增加适口性。厌氧发酵的过程中，乳酸菌不断产酸，pH值不断降低，可有效抑制杂菌生长，发酵后的棉粕饲料感官品质良好，未检测到霉菌等污染。同时乳酸菌发酵产生了有机酸等对动物机体有益生作用的物质，发酵后的棉粕饲料中粗蛋白含量提高16.12％，增强了棉粕的营养价值。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种具有降解棉酚作用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，该菌株已于2015年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10999。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC No.10999在生物降解游离棉酚中的应用。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC No.10999在发酵棉粕以降低其中游离棉酚含量中的应用。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC No.10999在棉粕脱毒中的应用。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC No.10999在有效抑制杂菌生长，防止二次污染，提高适口性，获得安全无毒棉粕饲料中的应用。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC No.10999在提高蛋白质饲料的利用率中的应用。
7.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC No.10999在降低饲料成本中的应用。
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