CN110195027A - 烟草节杆菌zl-1及其堆肥低温发酵菌剂的制备方法与应用 - Google Patents

烟草节杆菌zl-1及其堆肥低温发酵菌剂的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)ZL‑1，以及烟草节杆菌ZL‑1堆肥低温发酵菌剂的制备方法，包括步骤：将烟草节杆菌ZL‑1菌液与玉米芯粉按体积质量比2:1(mL/g)混合均匀，晾干至含水率≤25％，即得烟草节杆菌ZL‑1堆肥低温发酵菌剂；其中，所述烟草节杆菌ZL‑1菌液中活菌数>1×108CFU/mL。本发明制备的堆肥发酵菌剂可以单独使用或与其他菌剂联合使用，旨在提高生物大分子的降解能力，提高堆肥的发酵速率和生物有机肥的品质。在5～10℃的低温环境中，加入该菌剂的堆肥堆体升温快、温度高，第7天进入高温期并持续8‑9天，最高温度63.4℃，达到了我国堆肥处理无害化标准。

Description

烟草节杆菌ZL-1及其堆肥低温发酵菌剂的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株烟草节杆菌ZL-1，以及含有此烟草节杆菌ZL-1的堆肥低温发酵菌剂的制备方法。
背景技术
节杆菌属(Arthrobacter)细菌是一类严格好氧菌，广泛分布于土壤和水环境中，在南极和北极的水域中均有发现过节杆菌属细菌。目前，有关节杆菌属细菌的研究集中在氨基酸、维生素和酶产生能力方面。有研究表明，烟草节杆菌作为一种水产益生菌可通过刺激水生动物机体的免疫系统或抑制致病菌的生长来提高水产动物免疫力。另外有报道称，有研究者从日本冲绳县垃圾堆肥化处理后的土壤中分离得到了一种有固氮能力的烟草节杆菌。
低温微生物是指在低温条件下具有生长能力的微生物，广泛分布于各种寒冷环境中，并在生态系统中占有独特而重要的地位。低温微生物一般可分为嗜冷型和耐冷型。嗜冷菌的最适生长的温度通常≤15℃，而耐冷菌是指能够在0℃左右生长良好，但最适生长温度＞20℃的微生物。低温微生物作为生态系统中重要而独特的一环，对其进行进一步研究不仅可以深入了解微生物适冷机制，并且其特殊产物如抗冻蛋白、低温酶、多聚不饱和脂肪酸等在环境保护以及食品医药等众多领域中都拥有巨大的应用价值。
堆肥技术是一种成本低，可操作性强，生物风险小的畜禽粪污资源化利用方法。此项技术利用微生物代谢活动分解生物大分子，并凭借微生物剧烈活动产生的高温杀灭病原微生物和其他有害物质，最终形成安全绿色的有机肥。然而堆肥易受环境温度的影响，当环境温度较低时，堆体难以快速升温启动，导致粪污无法有效发酵。有研究表明，由于传统的自然堆肥发酵所含土著微生物的种类和数量有限，因此，可以通过向物料中接种外源微生物菌剂来达到提高发酵效率或快速降解生物大分子的目的。与此同时，国内外对于低温型微生物适冷性的研究表明，其独特的感应机制可以使其在低温环境正常代谢，发挥独特的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株能够产低温蛋白酶的新型烟草节杆菌，并提供包含该微生物的堆肥低温发酵菌剂的制备方法。该菌剂接种于堆肥堆体中，可以利用其在低温环境中良好的生物活性和分泌低温蛋白酶的功能，提高生物大分子的降解能力，提高堆肥的发酵速率和生物有机肥的品质。
为了达到上述目的，本发明提供了一株烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)ZL-1，该烟草节杆菌ZL-1于2018年8月10日由中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC NO.16246。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种编码所述烟草节杆菌ZL-1的基因，所述基因序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述烟草节杆菌ZL-1，在10℃的低温环境中有良好的生物活性，同时具有降解酪蛋白的功能，利用其在低温环境中代谢产热以及产低温蛋白酶的能力，有助于堆体的快速升温，提高堆肥的发酵速率和生物有机肥的品质。
本发明还提供了一种烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂的制备方法，包括步骤：
将烟草节杆菌ZL-1菌液与载体按体积质量比2:1(mL/g)混合均匀，晾干至含水率≤25％，即得烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂；
其中，所述载体为玉米芯粉；所述烟草节杆菌ZL-1菌液中有效活菌数>1×108CFU/mL
优选方式下，所述玉米芯粉能通过40目筛；所述烟草节杆菌ZL-1菌液的制备方法为：
S1、制备种子液：取复壮后的烟草节杆菌ZL-1单菌落，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，15℃摇床震荡培养培养48小时，得到烟草节杆菌ZL-1 种子液；
所述牛肉膏蛋白胨液体培养基配制比例为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，余量为水，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；
S2、制备发酵菌液：按体积比1％的比例将种子液接种到发酵培养基中， 15℃摇床震荡培养48h，得到有效活菌数>1×108CFU/mL的烟草节杆菌ZL-1菌液；
所述发酵培养基配置比例为：葡萄糖3.0％(g/ml)、蛋白胨1.0％(g/ml)、淀粉3.5％(g/ml)、氯化钠1.0％(g/ml)，余量为水，pH7.0～7.2，121℃灭菌 20分钟；
进一步优化，对堆肥低温发酵菌剂进行应用效果评价，具体步骤为：
S1、在约为5～10℃的环境温度下，建立堆肥低温发酵菌剂效果评价实验。将新鲜牛粪与秸秆按质量比4:1充分混合，调解含水量约为60％，得牛粪堆体系。将烟草节杆菌ZL-1堆肥发酵菌剂按重量比0.5％接种于长1m、宽0.8m、高1.2m的牛粪堆肥体系中，同时设置未加菌剂的空白对照组。
S2、每天记录环境温度和堆体温度，堆体温度测量选用刺入式温度计，测量位置为堆体中心高度以下30cm，每天9:00和17:00测定一次堆体温度后取平均值。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一株新型烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)ZL-1，该微生物在低温环境中有良好的生物活性，同时具有产低温蛋白酶的功能。
2、本发明提供了一种包含烟草节杆菌ZL-1的堆肥低温发酵菌剂的制备方法及应用，以玉米芯粉作为载体制备的发酵菌剂，研究结果表明，加入堆肥发酵菌剂的堆体升温快、高温期延长，未加菌剂的对照组始终没有进入高温期，未达到堆肥无害化要求。由此可以证明，堆肥发酵菌剂可以提高堆肥发酵的速率，缩短发酵的周期，提高生物大分子的降解能力和生物有机肥的品质。
保藏说明
本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ZL-1，分 类命名为烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)，于2018年8月10日由中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号 CGMCC NO.16246。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1是本发明烟草节杆菌ZL-1的菌落形态图；
图2是本发明烟草节杆菌ZL-1降解酪蛋白效果图；
图3是本发明烟草节杆菌ZL-1的生长曲线图(15℃)；
图4是使用本发明制备的烟草节杆菌ZL-1的堆肥低温发酵菌剂在冬季牛粪堆肥实验的温度变化图。
具体实施方式
以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。
实施例1：烟草节杆菌ZL-1的分离筛选及鉴定
本发明的菌株分离自大连心乐乳业奶牛养殖厂的牛粪。
1.烟草节杆菌ZL-1的分离筛选
(1)称取采集的牛粪样品10g加入到装有90mL PBS缓冲液的三角瓶中，并加入无菌玻璃珠(有助于样品均匀分散在PBS缓冲液中)，在室温条件下、 180rpm摇床振荡20min，静置10min，制备菌悬液(即10-1牛粪样品稀释液)；然后用PBS缓冲液进行10倍梯度稀释，得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、 10-8稀释悬液，选取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的稀释悬液各100μL，均匀涂布到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，10℃恒温培养箱培养72h。在固体培养基平板上挑取形态不同的单菌落至新的固体培养基平板划线，在10℃恒温箱培养，如此重复三次，至微生物菌种纯化。将纯化的菌株转移到固体培养基斜面上，于4℃保存。
(2)经过分离纯化，共得到能够在10℃下生长的细菌5株，对5株细菌进行功能性复筛，将细菌单菌落接种于酪蛋白琼脂培养基。在10℃恒温箱培养培养72h，由实验结果可知，编号为ZL-1的菌株在培养基中产生了降解圈，证明此株细菌能够在低温环境中分泌酪蛋白酶(如图2)，因此对其进行进一步分子学鉴定。
所述牛肉膏蛋白胨固体培养基配制比例为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15g，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；
所述酪蛋白琼脂培养基配置比例为：每1000ml中含有酪蛋白10g、牛肉浸粉3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2g、琼脂15g、溴百里香酚兰0.05g， pH7.3～7.5，121℃灭菌20分钟；
2.烟草节杆菌ZL-1的分子生物学鉴定
烟草节杆菌ZL-1的分子生物学鉴定采用菌体直接扩增16S rDNA的方法。
具体步骤如下：
菌株基因组DNA的提取：取单菌落置于含有30μL无菌超纯水的PCR管中(PCR管已灭菌)，放入PCR仪中煮沸10min。
16S rDNA序列的PCR扩增：以提取的总DNA作为模板，以细菌16S rDNA基因的通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r (5'-TACCTTGTTACGACTT-3')对耐寒短杆菌16SrDNA基因进行PCR扩增。
PCR反应体系：2*Taq Master Mix 20μL，DNA模板3μL，上下游引物各 1μL，ddH2O25μL，PCR反应体系为50μL。
PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，循环35次；72℃5min。
PCR扩增的检测及测序：取(2)PCR扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR条带大小约为1500bp的PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA序列在NCBI上进行Blast比对，并选择同源性较高的序列用Neighbor-Joining法构建系统发育树。
结果表明，结合菌株的形态观察以及系统发育树中的同源性分析，菌株确定为烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)。
实施例2：
烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂的制备方法，包括步骤：
1.种子液的制备：将保存在斜面固体培养基上的烟草节杆菌ZL-1菌株 (CGMCCNO.16246)划线转接到固体培养基平板中，置于10℃恒温培养箱培养72h复壮。复壮得到的烟草节杆菌ZL-1单菌落，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，15℃摇床震荡培养48小时，得到烟草节杆菌ZL-1种子液，牛肉膏蛋白胨液体培养基配制比例为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，余量为水，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；
2.发酵液的制备：按体积比1％的比例将种子液接种到发酵培养基中，15℃摇床震荡培养48h得到菌液，培养好的菌液经平板细菌计数，有效活菌数达到 1.0×108CFU/mL以上备用。发酵培养基的配方为：葡萄糖3.0％(m/g)、蛋白胨1.0％(m/g)、淀粉3.5％(m/g)、氯化钠1.0％(m/g)，余量为水， pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；
3.制备发酵菌剂：以过40目筛的高温灭菌(121℃，20min)后的玉米芯粉为载体，将制得的烟草节杆菌ZL-1菌液与载体按体积质量比2:1(ml/g) 混合均匀，于室温晾干48h，至含水率小于等于25％，即得烟草节杆菌ZL-1 堆肥发酵菌剂。
实施例3：堆肥低温发酵菌剂应用的效果评价
1、在5～10℃的环境温度下，建立堆肥低温发酵菌剂效果评价实验。将新鲜牛粪与秸秆按质量比4:1充分混合，调解含水量约为60％，得牛粪堆肥体系。将烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂按重量比0.5％接种于长1m、宽0.8m、高1.2m的牛粪堆肥体系中，同时设置未加菌剂的空白对照组。
2、每天记录环境温度和堆体温度，堆体温度测量选用刺入式温度计，测量位置为堆体中心高度以下30cm，每天9:00和17:00测定一次堆体温度后取平均值。
3、实验不进行翻堆操作，并采用强制通风来保证堆肥各部分氧气均一。其中风机风量的选择应满足最大通气速率的要求，堆肥发酵过程中通风速率为 0.07～0.1m3/(min·m3)。每次通风时间为15min，当实验组堆体进入高温期(≥ 55℃)后，每隔三天对所有堆体通风一次。
研究结果如图4所示，在约为5～10℃的低温环境中，加入低温发酵菌剂的堆体升温快、温度高，第7天进入高温期并持续8-9天，最高温度63.4℃，达到了我国堆肥处理无害化标准(NY/T 1168-2006)，未加菌剂的对照组最高温度没有超过42℃，未达到堆肥无害化要求。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 大连理工大学
<120> 烟草节杆菌ZL-1及其堆肥低温发酵菌剂的制备方法与应用
<130> 20190227
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1385
<212> DNA
<213> Arthrobacter nicotianae
<400> 1
agagtgtgat cgtggctcag gaagtcctag caggtaggca gaaagtttgg tcaacggata 60
agtaacacgt gagtaacctg cccctgactc tgggataagc ccgggaaact gggtctaata 120
ccggatatga cttcctactg catggtgggt tgttgaaaga tttatcggtg ggggatggac 180
tcgcggccta tcagcttgtt ggtgaggtaa tggctcacca aggcgacgac gggtagccgg 240
cctgagaggg tgaccggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300
gcagtgggga atattgcaca atgggcggaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg 360
acggccttcg ggttgtaaac ctctttcagt agggaagaag cgaaagtgac ggtacctgca 420
gaagaagcgc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgtta 480
tccggattta ttgggcgtaa agagctcgta ggcggtttgt cgcgtctgcc gtgaaagtcc 540
gaggctcaac ctcggatctg cggtgggtac gggcagacta gagtgatgta ggggagactg 600
gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag gaacaccgat ggcgaaggca 660
ggtctctggg catttactga cgctgaggag cgaaagcatg gggagcgaac aggattagat 720
accctggtag tccatgccgt aaacgttggg cactaggtgt gggggacatt ccacgttttc 780
cgcgccgtag ctaacgcatt aagtgccccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact 840
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg cggattaatt cgatgcaacg 900
cgaagaacct taccaaggct tgacatgtgc cagaccgctc cagagatggg gtttcccttc 960
ggggctggtt cacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1020
agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgttcca tgttgccagc acgtagtggt ggggactcat 1080
gggagactgc cggggtcaac tcggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1140
tatgtcttgg gcttcacgca tgctacaatg gccggtacaa tgggttgcga tactgtgagg 1200
tggagctaat ccctaaaagc cggtctcagt tcggattggg gtctgcaact cgaccccatg 1260
aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag caacgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1320
tgtacacacc gcccgtcaag tcacgaaagt tggtaacacc cgaagccgat ggcctaacca 1380
ccttg 1385

Claims (6)

1.一株烟草节杆菌，其特征在于，该烟草节杆菌，菌株名为ZL-1，分类命名为烟草节杆菌Arthrobacter nicotianae，于2018年8月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏CGMCC，保藏编号CGMCC NO.16246；
其基因序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种应用权利要求1所述烟草节杆菌ZL-1制备堆肥低温发酵菌剂的方法，其特征在于，包括步骤：将烟草节杆菌ZL-1菌液与载体按体积质量比2:1(mL/g)混合均匀，晾干至含水率≤25％，即得烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂；
其中，所述载体为经过121℃高温灭菌20min的玉米芯粉；所述烟草节杆菌ZL-1保藏编号为CGMCC NO.16246，所述烟草节杆菌ZL-1菌液中有效活菌数>1×108CFU/mL。
3.根据权利要求2所述烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂的制备方法，其特征在于，所述玉米芯粉能通过40目筛。
4.根据权利要求2所述烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂的制备方法，其特征在于，所述烟草节杆菌ZL-1菌液的制备方法，包括步骤：
S1、制备种子液：取烟草节杆菌ZL-1单菌落，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，15℃培养48小时，得到烟草节杆菌ZL-1种子液；
所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，余量为水，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；
S2、制备发酵菌液：按体积比1％的比例将种子液接种到发酵培养基中，15℃培养48h，得到有效活菌数>1×108CFU/mL的烟草节杆菌ZL-1菌液；
所述发酵培养基为：葡萄糖3.0％(g/ml)、蛋白胨1.0％(g/ml)、淀粉3.5％(g/ml)、氯化钠1.0％(g/ml)，余量为水，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
5.权利要求2-4任一方法制备的烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂在无害化处理堆肥中的应用。
6.根据权利要求5所述烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂在无害化处理堆肥中的应用，其特征在于，使用所述烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂在5～10℃发酵堆肥。
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