CN110195028B

CN110195028B - 一种堆肥低温复合发酵菌剂的制备方法及应用

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Publication number: CN110195028B
Application number: CN201910175380.5A
Authority: CN
Inventors: 徐永平; 张喆; 李晓宇; 侯扶琴; 陈红莉; 吴妍妍; 陈岩; 王丽丽; 王思佳
Original assignee: Xinjiang Western Animal Husbandry Co ltd; Dalian University of Technology
Current assignee: Xinjiang Western Animal Husbandry Co ltd; Dalian University of Technology
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN110195028A

Abstract

本发明提供了一种堆肥低温复合发酵菌剂的制备方法，包括步骤：S1、取有效活菌数>1×10⁸CFU/mL的烟草节杆菌ZL‑1菌液、耐寒短杆菌ZL‑2菌液、赫氏草螺菌ZL‑3菌液，按体积比1:1:1混合得发酵液；S2、将步骤S1所得发酵液与玉米芯粉按质量比2:1混合均匀，晾干至含水率≤25％，即得堆肥低温复合发酵菌剂。本发明制备的堆肥低温复合发酵菌剂可应用于新鲜粪便的秋冬季堆肥，解决寒冷环境中堆体难以启动发酵，粪便大量堆积所造成的环境污染问题。在5～10℃的环境中，加入堆肥低温复合发酵菌剂的堆体升温快、温度高，第3～4天进入高温期并持续8～10天，最高温度76.2℃，达到了我国堆肥处理无害化标准。

Description

一种堆肥低温复合发酵菌剂的制备方法及应用

技术领域

本发明农业生物技术领域，更具体地说，涉及一种堆肥低温复合发酵菌剂的制备方法及应用。

背景技术

堆肥技术是一种成本低，可操作性强，生物风险小的畜禽粪污资源化利用方法。利用此项技术可以在微生物的作用下使有机物发生生物降解，并凭借其剧烈活动产生的高温杀灭病原微生物和其他有害物质，最终形成安全绿色的有机肥。然而堆肥易受环境温度的影响，尤其在我国的新疆和东北地区，由于昼夜温差大，低温持续时间长，导致大量粪污无法有效发酵，给堆肥技术的应用带来巨大挑战。

现阶段，为解决冬季堆肥启稳保温的问题，多采用输入热蒸汽和热水的方法，或直接铺设加温装置来控制和增加堆肥的温度，但这些方法设备昂贵且耗电耗能，并非长久之计。有研究表明，通过向堆体中加入特殊的外源微生物菌剂，可以实现加快堆体发酵速度，缩短发酵周期的目的。与此同时，国内外对于低温型微生物适冷性的研究表明，其独特的感应机制可以使其在低温环境正常代谢，发挥独特的作用。

发明内容

本发明旨在提供一种技术性强、操作简单、成本低廉的方法，将筛选到的三株兼性嗜冷型细菌作为外源微生物接种到堆体中，利用其在低温环境中良好的生物活性代谢产热，从而实现堆体的快速升温，以达到缩短发酵周期，提高有机肥品质的目的。

为了达到上述发明目的，本发明提供了一种堆肥低温复合发酵菌剂，组成包括三株兼性嗜冷型细菌，所述兼性嗜冷型细菌分别为：

烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)ZL-1，保藏编号CGMCC NO.16246；耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)ZL-2，保藏编号CGMCC NO.16247；赫氏草螺菌(Herbaspirillum huttiense)ZL-3，保藏编号CGMCC NO.16248；

上述三株菌均为分离所得，并已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明还提供了一种包含上述微生物的具有快速升温功能堆肥低温复合发酵菌剂的制备方法，将三株兼性嗜冷型细菌的种子液接种到液体培养基进行培养发酵，将发酵液与高温灭菌玉米芯粉充分混合，自然晾干得到具有快速升温功能的堆肥低温复合发酵菌剂。

优选方式下，上述堆肥低温复合发酵菌剂的制备方法，包括步骤：

S1、取有效活菌数>1×10⁸CFU/mL的烟草节杆菌ZL-1菌液、耐寒短杆菌 ZL-2菌液、赫氏草螺菌ZL-3菌液，按体积比1:1:1混合得发酵液；

S2、将步骤S1所得发酵液与载体按质量比2:1混合均匀，晾干至含水率≤25％，即得堆肥低温复合发酵菌剂；所述载体为过40目筛的高温灭菌玉米芯粉。

优选方式下，步骤S1所述烟草节杆菌ZL-1菌液、耐寒短杆菌ZL-2菌液、赫氏草螺菌ZL-3菌液的制备方法，包括步骤：

S11、菌种活化：将菌体划线接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基，在10℃平板培养72h，划线接种活化培养3次形成单菌落；

所述牛肉膏蛋白胨固体培养基配制比例为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15g，余量为水，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；所述菌体为烟草节杆菌ZL-1、耐寒短杆菌ZL-2、赫氏草螺菌ZL-3中的一种；

S12、制作种子液：步骤S1所得单菌落，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，15℃摇床震荡培养48～60小时，得到种子液；

所述牛肉膏蛋白胨液体培养基配制比例为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；

S13、制作发酵液：按体积比1％的比例将步骤S12所得种子液分别接种到发酵培养基中，15℃摇床震荡培养48～60h，得到有效活菌数>1×10⁸CFU/mL的菌液；所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖3.0％(g/ml)、蛋白胨1.0％ (g/ml)、淀粉3.5％(g/ml)、氯化钠1.0％(g/ml)，余量为水；pH至 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。

优选方式下，步骤S2所述玉米芯粉能通过40目筛。

本发明还提供了所述堆肥低温复合发酵菌剂在无害化堆肥中的应用。

优选方式下，上述应用为使用所述堆肥低温复合发酵菌剂在5～10℃发酵堆肥。

进一步优化，对具有快速升温功能堆肥低温复合发酵菌剂进行应用效果评价，具体步骤为：

S1、在约为5～10℃的环境温度下，建立牛粪堆肥评价体系。将新鲜牛粪与秸秆按质量比4:1充分混合，调解含水量约为60％。将具有快速升温功能的堆肥低温复合发酵菌剂按重量比0.5％接种于长1m、宽0.8m、高1.2m的牛粪堆肥体系中，同时设置未加菌剂的空白对照组。

S2、每天记录环境温度和堆体温度，堆体温度测量选用刺入式温度计，测量位置为堆体中心高度以下30cm，每天9:00和17:00测定一次堆体温度后取平均值。

与现有技术相比，本发明的优势和积极效果为：

1、本发明提供了三株兼性嗜冷型细菌，包括烟草节杆菌ZL-1,耐寒短杆菌 ZL-2以及赫氏草螺菌ZL-3，三株细菌均从动物粪便和冻土中筛选得到，三株细菌在低温环境中拥有良好的生物活性。

2、本发明采用三种菌株联合作用，三株细菌本身具有协同作用，互不抵抗，通过其在低温环境中的代谢活动，分解有机物并产生热量带动堆体的升温，为堆体土著微生物提供代谢必要的环境温度，从而实现堆体的低温启动和堆肥的无害化处理

3、本发明通过向堆肥中接入外源微生物，提供了一种技术性强、操作简单、成本低廉的方法，用以解决寒冷环境中堆肥堆体难以启动发酵，粪便大量堆积所造成的环境污染问题。研究结果表明，加入复合菌剂的堆体升温快、温度高，未加菌剂的对照组始终没有进入高温期，未达到堆肥无害化要求。由此可以证明，具有快速升温功能堆肥复合菌剂可以达到缩短发酵周期，提高有机肥品质的目的。

本发明通过菌株的设计有效解决堆肥低温启动困难问题，实现在5-10℃条件启动堆肥发酵。

保藏说明

本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ZL-1，分类命名为烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)，于2018年8月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号 CGMCC NO.16246。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ZL-2，分类命名为耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)，于2018年8月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC NO.16247。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ZL-3，分类命名为赫氏草螺菌(Herbaspirillum huttiense)，于2018年8月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号 CGMCC NO.16248。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1是本发明中烟草节杆菌ZL-1的菌落形态图；

图2是本发明中耐寒短杆菌ZL-2的菌落形态图；

图3是本发明中赫氏草螺菌ZL-3的菌落形态图；

图4是使用本发明制备的堆肥复合菌剂在冬季牛粪堆肥实验的温度变化图。

具体实施方式

以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

实施例1：烟草节杆菌、耐寒短杆菌和赫氏草螺菌的活化培养

1、本发明的菌株分离自大连心乐乳业奶牛养殖厂的牛粪以及大连理工大学的冻土层中，经过分离纯化和生物学鉴定，最终确定为烟草节杆菌 (Arthrobacternicotianae)，耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)，赫氏草螺菌(Herbaspirillum huttiense)。将三株细菌保存于-80℃冰箱。

2、牛肉膏蛋白胨固体培养基制作方法:

烟草节杆菌、耐寒短杆菌和赫氏草螺菌活化培养基包括以下组分：牛肉膏 3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15g，补足水至1000mL。将上述各组分混匀并调节pH到7.0～7.2，pH偏高采用盐酸液进行调节，pH偏低采用氢氧化钠溶液调节，121℃高温灭菌20分钟，冷却至70～80℃倒平板，每只平板倒入量约 15ml，冷却30分钟备用。

3、将烟草节杆菌ZL-1、耐寒短杆菌ZL-2和赫氏草螺菌ZL-3从-80℃冰箱中取出，在室温中解冻，采用平板划线的方式将上述细菌分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基，在10℃培养72h，活化培养3次形成单菌落，使菌种复壮，分别获得复壮的烟草节杆菌ZL-1、耐寒短杆菌ZL-2和赫氏草螺菌ZL-3；烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)ZL-1的菌落形态如图1所示；耐寒短杆菌 (Brevibacterium frigoritolerans)ZL-2的菌落形态如图2所示；赫氏草螺菌 (Herbaspirillum huttiense)ZL-3的菌落形态图如图3所示。

实施例2：堆肥低温复合发酵菌剂的制备

S2、将步骤S1所得发酵液与载体按质量比2:1混合均匀，于室温晾干48h 至含水率≤25％，即得堆肥低温复合发酵菌剂；所述载体为过40目筛的121℃灭菌20min后的玉米芯粉；

其中，步骤S1所述烟草节杆菌ZL-1菌液的制备方法，包括步骤：

1、制备种子液：在无菌工作台中将实施例1所得复壮的烟草节杆菌ZL-1 单菌落接种到200ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入15℃摇床培养48h，即得到烟草节杆菌ZL-1种子液；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，余量为水，pH7.0～7.2，121℃灭菌20 分钟；

2、制备发酵菌液：按体积比1％的比例将烟草节杆菌ZL-1种子液接种到发酵培养基中，15℃培养48～60h，得烟草节杆菌ZL-1菌液，经平板细菌计数，有效活菌数达到1.0×10⁸CFU/mL以上备用；所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖3.0％(g/ml)、蛋白胨1.0％(g/ml)、淀粉3.5％(g/ml)、氯化钠1.0％ (g/ml)，余量为水，上述材料充分搅拌溶解后，调整pH至7.0～7.2，121℃高温灭菌20分钟，分装备用。

步骤S1所述耐寒短杆菌ZL-2菌液的制备方法，包括步骤：

1、制备种子液：在无菌工作台中将实施例1所得复壮的耐寒短杆菌ZL-2 单菌落接种到200ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入15℃摇床培养48h，即得到耐寒短杆菌ZL-2种子液；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，余量为水，pH7.0～7.2，121℃灭菌20 分钟；

2、制备发酵菌液：按体积比1％的比例将耐寒短杆菌ZL-2种子液接种到发酵培养基中，15℃培养48～60h，得耐寒短杆菌ZL-2菌液，经平板细菌计数，活菌数达到1.0×10⁸CFU/mL以上备用；所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖3.0％(g/ml)、蛋白胨1.0％(g/ml)、淀粉3.5％(g/ml)、氯化钠1.0％ (g/ml)，余量为水，上述材料充分搅拌溶解后，调整pH至7.0～7.2，121℃高温灭菌20分钟，分装备用。

步骤S1所述赫氏草螺菌ZL-3菌液的制备方法，包括步骤：

1、制备种子液：在无菌工作台中将实施例1所得复壮的赫氏草螺菌ZL-3 单菌落接种到200ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入15℃摇床培养60h，即得到赫氏草螺菌ZL-1种子液；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，余量为水，pH7.0～7.2，121℃灭菌20 分钟；

2、制备发酵菌液：按体积比1％的比例将赫氏草螺菌ZL-3种子液接种到发酵培养基中，15℃培养48～60h，得赫氏草螺菌ZL-3菌液，经平板细菌计数，活菌数达到1.0×10⁸CFU/mL以上备用；所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖3.0％(g/ml)、蛋白胨1.0％(g/ml)、淀粉3.5％(g/ml)、氯化钠1.0％ (g/ml)，余量为水，上述材料充分搅拌溶解后，调整pH至7.0～7.2，121℃高温灭菌20分钟，分装备用。

实施例3：堆肥低温复合发酵菌剂应用的效果评价

1、在5～10℃的环境温度下，建立冬季牛粪堆肥评价体系。将新鲜牛粪与秸秆按质量比4:1充分混合，调解含水量约为60％，得牛粪堆肥体系。将本发明制备的堆肥低温复合发酵菌剂按重量比0.5％接种于长1m、宽0.8m、高1.2m 的牛粪堆肥体系中，同时设置未加菌剂的空白对照组。

2、每天记录环境温度和堆体温度，堆体温度测量选用刺入式温度计，测量位置为堆体中心高度以下30cm，每天9:00和17:00测定一次堆体温度后取平均值。

3、实验不进行翻堆操作，并采用强制通风来保证堆肥各部分氧气均一。其中风机风量的选择应满足最大通气速率的要求，堆肥发酵过程中通风速率为 0.07～0.1m³/(min·m³)，每次通风时间为15min当实验组堆体进入高温期(≥ 55℃)后，每隔三天对所有堆体通风一次。。

研究结果如图4所示，在约为5～10℃的低温环境中，加入复合菌剂的堆体升温快、温度高，第3～4天进入高温期并持续8～10天，最高温度76.2℃，达到了我国堆肥处理无害化标准(NY/T 1168-2006)，未加菌剂的对照组最高温度没有超过42℃，未达到堆肥无害化要求。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种堆肥低温复合发酵菌剂，其特征在于，由三株兼性嗜冷型细菌组成，所述兼性嗜冷型细菌分别为：

烟草节杆菌 (Arthrobacter nicotianae) ZL-1，保藏编号CGMCC NO.16246；耐寒短杆菌 (Brevibacteriumfrigoritolerans) ZL-2，保藏编号CGMCC NO.16247；赫氏草螺菌(Herbaspirillum huttiense) ZL-3，保藏编号CGMCC NO.16248；

上述三株菌已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.权利要求1所述堆肥低温复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于，将所述三株兼性嗜冷型细菌的种子液接种到液体培养基进行培养发酵，将发酵液与高温灭菌玉米芯粉充分混合，自然晾干得到具有快速升温功能的堆肥低温复合发酵菌剂。

3.根据权利要求2所述堆肥低温复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：

S1、分别取有效活菌数>1×10⁸CFU/mL的烟草节杆菌ZL-1菌液、耐寒短杆菌ZL-2菌液、赫氏草螺菌ZL-3菌液，按体积比1:1:1混合得发酵液；

S2、将步骤S1所得发酵液与载体按质量比2:1混合均匀，晾干至含水率≤25%，即得堆肥复合菌剂；

所述载体为经过121℃高温灭菌20min的玉米芯粉。

4.根据权利要求3所述堆肥低温复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于，步骤S1所述菌液的制备方法，包括步骤：

S11、菌种活化：将菌体划线接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基，在10℃培养72h，划线接种活化培养3次形成单菌落；

所述菌体为烟草节杆菌ZL-1、耐寒短杆菌ZL-2、赫氏草螺菌ZL-3中的一种；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15g，pH 7.0~7.2，121℃灭菌20分钟；

S12、制作种子液：取步骤S11所得单菌落，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，15℃培养48~60小时，得到种子液；

所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，余量为水，pH 7.0~7.2，121℃灭菌20分钟；

S13、制作发酵液：按体积比1%的比例将步骤S12所得种子液接种到发酵培养基中，15℃培养48~60h，得到有效活菌数>1×10⁸CFU/mL的菌液；所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖3.0%（g/ml）、蛋白胨1.0%（g/ml）、淀粉3.5%（g/ml）、氯化钠1.0%（g/ml），余量为水；pH 7.0~7.2，121℃灭菌20分钟。

5.根据权利要求3所述堆肥低温复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于，步骤S2所述玉米芯粉能通过40目筛。

6.权利要求2-5任一方法制备的堆肥低温复合发酵菌剂在无害化堆肥中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，使用所述堆肥低温复合发酵菌剂在5~10℃发酵堆肥。