CN110106101B

CN110106101B - 赫氏草螺菌、包含该菌株的微生物菌剂及其制备方法

Info

Publication number: CN110106101B
Application number: CN201910175065.2A
Authority: CN
Inventors: 徐永平; 陈岩; 张喆; 李晓宇
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN110106101A

Abstract

本发明公开了一株保藏编号为CGMCC NO.16248的赫氏草螺菌ZL‑3，以及含有此赫氏草螺菌ZL‑3的微生物菌剂，还提供了所述赫氏草螺菌或微生物菌剂在用于畜禽粪污低温快速启动复合微生物菌剂的制备中的应用，以及公开了含有赫氏草螺菌ZL‑3的堆肥快速发酵菌剂的制备方法。本发明菌剂可以有效缩短低温堆肥启动时间：赫氏草螺菌ZL‑3的微生物菌剂应用于牛粪堆肥的堆体中，与对照组相比可明显缩短堆体升温时间，进而缩短堆肥形成有机肥的周期，降低了管理成本和时间成本。本发明菌剂与现有低温启动复合微生物菌剂相比，可实现更好的固氮效果，从而为有机肥中氮素的保存提供更优的解决方案。

Description

赫氏草螺菌、包含该菌株的微生物菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种型赫氏草螺菌ZL-3菌株、包含该菌株的微生物菌剂及其制备方法与应用。

背景技术

赫氏草螺菌ZL-3(Herbaspirillum huttiense ZL-3)在分类学中属细胞生物(Cellular organisms)、细菌域(Bacteria)、细菌(Bacteria)；变形菌门(Proteobacteria)；β-变形菌(Betaproteobacteria)；伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales)；草酸杆菌科 (Oxalobacteraceae)；草螺菌属(Herbaspirillum)，在土壤和其他自然环境中分布广泛，是土壤和植物微生态优势种群之一。近年来，随着草螺菌研究的不断深入，发现草螺菌具有固氮或产生植物激素的功能并具有使宿主植物增产的潜能。从牛粪中分离得到的赫氏草螺菌ZL-3，具有低温固氮的能力，是堆肥技术应用得以保氮固氮的优秀功能菌株之一。

堆肥技术是一种成本低，可操作性强，生物风险小的畜禽粪污资源化利用方法。此项技术利用微生物代谢活动分解有机物，并凭借其剧烈活动产生的高温杀灭病原微生物和其他有害物质，最终形成安全绿色的生物有机肥。然而堆肥易受环境温度的影响，当环境温度较低时，堆体难以快速升温启动，导致粪污无法有效发酵。有研究表明，通过向堆体中加入特殊的外源微生物菌剂，可以实现加快堆体发酵速度，缩短发酵周期的目的。与此同时，国内外对于低温型微生物适冷性的研究表明，其独特的感应机制可以使其在低温环境正常代谢，发挥独特的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一株能够固氮能力的赫氏草螺菌ZL-3和微生物菌剂，该菌剂应用于畜禽粪污堆肥低温启动，加速堆体升温，有效缩短堆体升温时间，从而缩短堆肥周期，节约时间成本和管理成本。

为了达到上述目的，本发明提供了一种赫氏草螺菌，该赫氏草螺菌ZL-3于 2018年8月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，简称 CGMCC，保藏编号CGMCC NO.16248，分类命名为赫氏草螺菌(Herbaspirillum huttiense)。

CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所述赫氏草螺菌ZL-3用于畜禽粪污堆肥低温启动。

本发明所述赫氏草螺菌ZL-3用于环境温度5-15℃畜禽粪污堆肥低温启动，本发明所述赫氏草螺菌ZL-3是低温启动技术关键菌株。

上述畜禽粪污包括猪粪、鸡粪、牛粪、羊粪、貂粪中的一种或几种混合。

本发明还提供了一种包含上述赫氏草螺菌ZL-3的微生物菌剂，所述微生物菌剂包括赫氏草螺菌ZL-3。

上述微生物菌剂可用于畜禽粪污堆肥低温启动。

本发明还提供了一种包含上述赫氏草螺菌ZL-3的微生物菌剂的制备方法，具体步骤为：

S1、向种子液培养基中接种赫氏草螺菌ZL-3，10℃，培养24h，得到赫氏草螺菌ZL-3种子液，所述种子液中赫氏草螺菌ZL-3浓度为1.0～1.5× 10^7～8CFU/mL；按体积比2～5.0％的比例将所述种子液接种到大量发酵培养基中， 10℃，培养48h，得到赫氏草螺菌ZL-3发酵液；

S2、将步骤S1制得的发酵液与植物性载体按体积质量比1:2(mL/g)混合均匀；晾干至含水率小于等于25％，即得包含赫氏草螺菌ZL-3的微生物菌剂；

所得混合物中发酵液与植物性载体的配比达到0.5mL/g，每克载体中所含有的细菌数量10⁸个/克。

优选方式下，步骤S1所述的种子液培养基的组成为：蛋白胨1.6％(m/V)、酵母粉1.0％(m/V)、氯化钠0.5％(m/V)，pH值7.0～7.2；

所述大量发酵培养基的组成为：葡萄糖2.8％(m/V)、蛋白胨1.0％(m/V)、酵母膏0.5％(m/V)、磷酸二氢钾0.35％(m/V)和碳酸钙0.25％(m/V)，pH值7.2。

本发明上述“m/V”即“g/ml”。

优选方式下，步骤S2所述植物性载体为40目的玉米芯粉或稻壳粉。

综上，与现有产品相比，本发明具有的优点是：

1、本发明菌剂可以有效缩短低温堆肥启动时间：赫氏草螺菌ZL-3的微生物菌剂应用于牛粪堆肥的堆体中，与对照组相比可明显缩短堆体升温时间，进而缩短堆肥形成有机肥的周期，降低了管理成本和时间成本。

2、本发明菌剂与现有低温启动复合微生物菌剂相比，可实现更好的固氮效果，从而为有机肥中氮素的保存提供更优的解决方案。

3、本发明中：本发明微生物菌剂是由赫氏草螺菌ZL-3和载体材料(选自40 目的玉米芯粉或稻壳粉中的一种)组成，无任何有毒有害成分。微生物发酵条件控制简单，载体成本低廉，故该菌剂具有良好的市场应用前景。

保藏说明

本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ZL-3，分类命名为赫氏草螺菌(Herbaspirillum huttiense)，于2018年8月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，简称CGMCC，保藏编号 CGMCC NO.16248。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1是本发明中赫氏草螺菌ZL-3的菌落形态图。

具体实施方式

以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

实施例1：赫氏草螺菌ZL-3的分离筛选及鉴定

本发明的菌株分离自大连心乐乳业奶牛养殖厂的牛粪中。

1.赫氏草螺菌ZL-3的分离筛选

(1)称取采集的牛粪样品10g加入到装有90mL PBS缓冲液的三角瓶中，并加入无菌玻璃珠(有助于样品均匀分散在PBS缓冲液中)，在室温条件下、180 rpm摇床振荡20min，静置10min，制备菌悬液(即10-1冻土层土壤稀释液)；然后用PBS缓冲液进行10倍梯度稀释，得到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8稀释悬液，选取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的稀释悬液各100μL，均匀涂布到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，10℃恒温培养箱培养48h。在固体培养基平板上挑取形态不同的单菌落至新的固体培养基平板划线，在10℃恒温箱培养，如此重复三次，至微生物菌种纯化。将纯化的菌株转移到固体培养基斜面上，于4℃保存。

(2)经过分离纯化，共得到能够在10℃下生长的细菌5株，对5株细菌进行功能性复筛，将细菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，在10℃恒温箱培养培养48h，对其进行进一步分子学鉴定。

所述牛肉膏蛋白胨固体培养基配制比例为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15g，pH7.0～7.2，灭菌20分钟；

2.赫氏草螺菌ZL-3的分子生物学鉴定

赫氏草螺菌ZL-3的分子生物学鉴定采用菌体直接扩增16S rRNA的方法。具体步骤如下：

(1)菌株基因组DNA的提取：取单菌落置于含有30μL无菌超纯水的PCR 管中(PCR管已灭菌)，放入PCR仪中煮沸10min。

(2)16S rDNA序列的PCR扩增：以提取的总DNA作为模板，以细菌 16S r DNA基因的通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和1492r(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')对赫氏草螺菌16SrDNA基因进行PCR扩增。

PCR反应体系：2*Taq Master Mix 20μL，DNA模板3μL，上下游引物各1μL，ddH₂O 25μL，PCR反应体系为50μL。 PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s， 72℃延伸90s，循环40次；72℃5min。

(3)PCR扩增的检测及测序：取(2)PCR扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR条带大小约为1500bp的PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA序列在NCBI上进行Blast 比对，并选择同源性较高的序列用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

结果表明，结合菌株的形态观察以及系统发育树中的同源性分析，菌株确定为赫氏草螺菌(Herbaspirillum huttiense)。

实施例2：微生物菌剂的制备

(1)种子液的制备：将保存在NA斜面上赫氏草螺菌ZL-3菌株划线转接到NA 平板中，置于10℃恒温培养箱培养48h，用灭菌的接种环挑取单菌落接种到种子液培养基中，10℃摇床振荡培养48h得到种子液。种子液培养基的配方为：种子液培养基的组成为：蛋白胨1.6％(m/V)、酵母粉1.0％(m/V)、氯化钠0.5％(m/V)，pH值7.0～7.2；

牛肉膏蛋白胨液体培养基配制比例为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，pH7.0～7.2。

(2)发酵液的制备：按5.0％的比例(体积比)将培养好的种子液接种到大量发酵培养基中，10℃，培养48h，得到发酵液,培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到1.0×10⁹CFU/mL以上备用。大量发酵培养基的配方为：葡萄糖2.8％(m/V)、蛋白胨1.0％(m/V)、酵母膏0.5％(m/V)、磷酸二氢钾0.35％(m/V)和碳酸钙0.25％(m/V)，pH值7.2。

(3)菌剂的制备：以过40目筛的稻壳粉为载体，按1:2的质量体积比，将(2) 所制备的发酵液与载体充分混合均匀，使其达到0.5mL/g(约10⁸个/克)，然后于室内晾干，菌剂含水率25％以下，制成微生物复合菌剂存放在阴凉干燥处备用。

实施例3：堆肥低温启动菌剂应用的效果评价

(1)在约为5-10℃的环境温度下，建立堆肥低温启动菌剂效果评价实验。将新鲜牛粪与秸秆按质量比4:1充分混合，调解含水量约为60％。将堆肥低温启动菌剂按重量比0.5％接种于长1m，宽0.8m，高1.2m的牛粪堆肥体系中，设定两组重复；并设定空白对照组。

(2)每天记录环境温度和堆体温度，堆体温度测量采用刺入式温度计和热敏电偶进行同时测量。五点测量法，堆体中心高度以下30cm，每天9:00和17:00 测定一次堆体温度后取平均值。

(3)静态堆肥法，强制通风来保证堆体氧气充足。通风速率为0.07～0.1 m³/(min·m³)。每次通风时间为15min；通风频率，隔两天通一次风，或根据实际堆体温度变化通风。

(4)研究结果表明，在约为5-10℃的低温环境中，加入复合菌剂的堆体升温启动速度快，第5-6天即可进入高温期，最高温度65.5℃。高温期可维持5-7 天，符合堆肥处理无害化标准(NY/T 1168-2006)。对照组最高温度40.2℃，未达到堆肥无害化要求。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 赫氏草螺菌、包含该菌株的微生物菌剂及其制备方法

<130> 20190227

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> Herbaspirillum huttiense

<400> 1

tagcatgcgc agcttaacat gcagtcgaac ggcagcatag gagcttgctc ctgatggcga 60

gtggcgaacg ggtgagtaat atatcggaac gtgccctaga gtgggggata actagtcgaa 120

agactagcta ataccgcata cgatctacgg atgaaagtgg gggatcgcaa gacctcatgc 180

tcctggagcg gccgatatct gattagctag ttggtggggt aaaagcctac caaggcaacg 240

atcagtagct ggtctgagag gacgaccagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300

ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga caatgggggc aaccctgatc cagcaatgcc 360

gcgtgagtga agaaggcctt cgggttgtaa agctcttttg tcagggaaga aacggtagta 420

gcgaataact attactaatg acggtacctg aagaataagc accggctaac tacgtgccag 480

cagccgcggt aatacgtagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg 540

caggcggttg tgtaagtcag atgtgaaatc cccgggctca acctgggaat tgcatttgag 600

actgcacggc tagagtgtgt cagagggggg tagaattcca cgtgtagcag tgaaatgcgt 660

agatatgtgg aggaataccg atggcgaagg cagccccctg ggataacact gacgctcatg 720

cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg 780

tctactagtt gtcgggtctt aattgacttg gtaacgcagc taacgcgtga agtagaccgc 840

ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg 900

tggatgatgt ggattaattc gatgcaacgc gaaaaacctt acctaccctt gacatggatg 960

gaatcccgaa gagatttggg agtgctcgaa agagaaccat cacacaggtg ctgcatggct 1020

gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtca 1080

ttagttgcta cgaaagggca ctctaatgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140

gatgacgtca agtcctcatg gcccttatgg gtagggcttc acacgtcata caatggtaca 1200

tacagagggc cgccaacccg cgagggggag ctaatcccag aaagtgtatc gtagtccgga 1260

ttggagtctg caactcgact ccatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgt 1320

cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagcgggttt 1380

taccagaagt gggtagccta accgcaagga gggcgctcac cacgtaggat agtccc 1436

Claims

1.一种赫氏草螺菌（Herbaspirillum huttiense）ZL-3，其特征在于，该赫氏草螺菌，菌株名为 ZL-3，分类命名为赫氏草螺菌，于2018年8月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，简称 CGMCC，保藏编号 CGMCC NO.16248。

2.根据权利要求 1 所述赫氏草螺菌 ZL-3 的应用，其特征在于，用于在环境温度 5-15℃畜禽粪污堆肥低温启动。

3.根据权利要求 2 所述赫氏草螺菌 ZL-3 的应用，其特征在于，所述畜禽粪污包括猪粪、鸡粪、牛粪、羊粪、貂粪中的一种或几种混合。

4.一种包含权利要求 1 所述赫氏草螺菌 ZL-3 的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括赫氏草螺菌 ZL-3。

5.根据权利要求 4所述包含权利要求 1 所述赫氏草螺菌 ZL-3 的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

S1、向种子液培养基中接种赫氏草螺菌 ZL-3，10℃，培养 24h，得到赫氏草螺菌ZL-3种子液，所述种子液中赫氏草螺菌 ZL-3 浓度为 1.0～1.5×10^7～8CFU/mL；按体积比 2～5.0％的比例将所述种子液接种到大量发酵培养基中，10℃，培养 48h，得到赫氏草螺菌ZL-3 发酵液；

S2、将步骤 S1 制得的发酵液与植物性载体按体积质量比 1:2(mL/g)混合均匀；晾干至含水率小于等于 25％，即得包含赫氏草螺菌 ZL-3 的微生物菌剂；所述植物性载体中含有的细菌数量为10⁸个/克。

6.根据权利要求 5所述的制备方法，其特征在于，步骤 S1 所述的种子液培养基的组成为：蛋白胨 1.6％(m/V)、酵母粉 1.0％(m/V)、氯化钠 0.5％(m/V)，pH 值 7.0～7.2；所述大量发酵培养基的组成为：葡萄糖 2.8％(m/V)、蛋白胨 1.0％(m/V)、酵母膏0.5％(m/V)、磷酸二氢钾 0.35％(m/V)和碳酸钙 0.25％(m/V)，pH 值 7.2。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤 S2 所述植物性载体为40 目的玉米芯粉或稻壳粉。