CN109609412B - 一种嗜热菌Bacillus smithii Ths1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环境微生物技术领域，具体公开一种嗜热菌Bacillus smithii Ths1及其应用。所述嗜热菌Bacillus smithii Ths1的菌株保藏号为CGMCC No.16868。本发明嗜热菌Bacillus smithii Ths1高温适应性强，适合的温度范围广，能够分泌大量的纤维素酶和蛋白酶，能够快速分解有机固体废弃物中的纤维素和蛋白类物质，加快有机固体废弃物的堆肥化进程，提高堆肥的有机质含量。

Description

一种嗜热菌Bacillus smithii Ths1及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一种嗜热菌Bacillus smithii Ths1及其应用。

背景技术

我国每年产生大量的有机固体废弃物，其中畜禽养殖废弃物40亿吨、秸秆8亿吨，而有机废物的有效利用率仅为50％左右，大量闲置的有机固体废弃物造成了严重的环境污染。然而，有机废弃物中含有丰富有机质、N、P、K及全面的微量元素，是巨大的资源宝库，因此，有机废弃物的资源化是同时解决我国有机废弃物污染和农业生产肥料资源匮乏两大难题的关键。

堆肥化是目前有机固体废弃物无害化处理与资源化利用的重要手段，其实质是有机固体废弃物在微生物的作用下分解代谢，促进有机固体废弃物向稳定的腐殖质转化的过程，转化过程中还会杀灭废弃物中的病原菌等有害生物。堆肥化不仅可解决有机固体废弃带来的环境污染，而且可以将有机固体废弃物转化为有机肥，对保持和提高土壤肥力、促进农业可持续发展具有重要意义。但是，传统的自然好氧堆肥条件下，受堆肥中土著微生物种类及数量等因素限制，堆肥化初期升温缓慢、发酵温度较低、高温持续时间短，存在发酵时间长、无害化不彻底、臭气污染严重、腐熟度低等问题。由于存在诸多缺点，该发酵技术不适合规模化有机固体废弃物的资源化处理。

近年来，虽有企业开发出适用的微生物接种剂来加快有机废弃物转化为有机肥的过程，但是受菌株本身生长条件的限制，无法在腐熟过程中产生的高温条件下快速生长，且受菌株本身代谢能力的限制，造成有机废弃物转化成有机肥的转化周期长，转化不彻底，臭气污染严重、发酵温度低以及高温持续时间短等情况。

发明内容

针对现有微生物接种剂高温适应性差、代谢能力差、有机物转化不彻底等问题，本发明提供一种嗜热菌Bacillus smithiiThs1及其应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种嗜热菌Bacillus smithii Ths1，菌株保藏号为CGMCC No.16868。

相对于现有技术，本发明提供的嗜热菌Bacillus smithii Ths1，是在65℃下筛选出来的，高温适应性强，适合的温度范围广，不同温度下用LB平板接种培养24h后，40-75℃范围内，均有大量菌落长出；同时本发明的嗜热菌Bacillus smithii Ths1能够分泌大量的纤维素酶和蛋白酶，能够快速分解有机固体废弃物中的纤维素和蛋白类物质。

进一步地，本发明还提供了嗜热菌Bacillus smithii Ths1在有机固体废弃物堆肥化中的应用。

相对于现有技术，本发明提供的嗜热菌Bacillus smithii Ths1制备的接种剂在有机固体废弃物堆肥化中的应用，可以加快有机固体废弃物的堆肥化过程，加快有机固体废弃物前期温度的升高，最高可达到85℃，高温维持时间较长，降低碳和氮的损失率，加快有机物料的腐熟转化，缩短了有机肥的后熟过程，使有机肥后熟期缩短到15天以内。

进一步地，本发明还提供所述的嗜热菌Bacillus smithii Ths1制备的接种剂，包括菌体吸附基质和嗜热菌Bacillus smithii Ths1干菌粉，菌体吸附基质可吸附菌体并有效提高嗜热菌Bacillus smithii Ths1活菌的保存时间。

优选地，所述菌体吸附基质为轻质碳酸钙。轻质碳酸钙作为菌体吸附基质可使嗜热菌Bacillus smithiiThs1活菌的冷冻保存时间达到一年以上。

进一步地，本发明还提供所述嗜热菌Bacillus smithii Ths1制备的接种剂的制备方法，该制备方法，至少包括以下步骤：

a、活化菌种；

b、液体培养；

c、种子液发酵；

d、扩大培养；

e、加入菌体吸附基质，浓缩干燥。

相对于现有技术，本发明提供的嗜热菌Bacillus smithii Ths1制备的接种剂的制备方法，得到的接种剂在有机固体废弃物发酵堆温达到40℃时即能迅速生长，使堆温快速升温、并较长时间维持在较高的发酵温度，从而大大加快堆肥化的发酵周期、加快有机物料的腐熟转化、提高堆肥的处理效率。

优选地，所述步骤a中的菌种活化方法为：将冷冻保存的嗜热菌Bacillus smithiiThs1菌株划线接种于LB平板上，55-65℃培养12-24h。

优选地，所述步骤b中液体培养过程为：从LB平板上刮取嗜热菌Bacillus smithiiThs1的菌苔接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，55-65℃、200r/min摇床培养12-24h。

优选地，所述步骤c中的种子液发酵过程为：将步骤b得到的嗜热菌Bacillussmithii Ths1培养液接种于PB液体培养基中，55-65℃、200r/min发酵20-30h；所述嗜热菌Bacillus smithii Ths1培养液的接种体积占PB液体培养基体积的5-10％。

优选地，所述步骤d中扩大培养的过程为：将步骤c发酵得到的嗜热菌Bacillussmithii Ths1种子液接种于PB液体培养基中，55-65℃、200r/min发酵24-48h；所述嗜热菌Bacillus smithii Ths1种子液的接种体积占PB液体培养基体积的2-5％。

优选地，所述步骤e中浓缩干燥过程采用喷雾干燥法。

附图说明

图1是本发明实施例1中筛选到的嗜热菌Bacillus smithii Ths1在显微镜下的形态图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种嗜热菌Bacillus smithii Ths1，菌株保藏号为CGMCC No.16868。其筛选过程为：从安徽省合肥小岗生物科技有限公司正常运行的立式发酵罐中采集堆肥样品(牛粪堆肥)，堆肥的温度约为70℃，称取10g高温堆肥样品至于装有90mL灭菌生理盐水的250mL三角瓶中(含玻璃珠)，置于摇床上震荡20min，吸取0.1ml堆肥样品，分别稀释10、100和1000倍并分别涂布于LB平板培养基上，于65℃培养箱中培养，24h后从平板上挑取菌落大小不同菌株，用LB平板进行5次划线分离纯化获得单克隆嗜热菌菌株，将菌株进行5次平板传代后，每个菌株挑取5个单菌落在65℃培养，确定菌株高温生长特性的遗传稳定性，获得稳定遗传的嗜热菌株。

将筛选出的嗜热菌划线接种于LB平板上，65℃培养48h后观察，嗜热菌菌落呈圆形、乳白色、边缘规则、中央突起，菌落平均直径为1.5-2.5mm，显微镜观察发现，嗜热菌为革兰氏阳性，菌体杆状、中生芽孢，如图1所示，其生长温度范围为40℃-75℃，最适生长温度55℃-65℃。

以筛选出嗜热菌的基因组为模板，用16S rRNA通用引物(上游引物27f：5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’和下游引物1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR，PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸8min。电泳检测扩增产物的纯度和大小，将扩增长度正确的PCR产物送上海生工进行测序，测序结果如SEQ ID NO:1所示，并在NCBI中进行BLAST，根据比对结果，该嗜热菌菌株与Bacillus smithii菌株的16S r RNA基因序列的相似性高达99％。

综上，根据菌落形态及生理特征和16S rRNA序列，可以确定本发明嗜热菌Ths1菌株属于Bacillus smithii，命名为Bacillus smithii Ths1，并于2018年12月04保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.16868。

实施例2

实施例1中筛选出来的嗜热菌Bacillus smithii Ths1，可以用来制备接种剂，该接种剂包括菌体吸附基质和嗜热菌Bacillus smithii Ths1菌粉，接种剂的制备方法具体包括以下工艺步骤：

a、活化菌种：将-80℃保存的嗜热菌Bacillus smithii Ths1菌株划线接种于LB平板上，60℃培养24h。

b、液体培养：用接种环刮去嗜热菌Bacillus smithii Ths1的菌苔并接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，60℃、200r/min摇床培养24h。

c、种子液发酵：将步骤b得到的嗜热菌Bacillus smithii Ths1培养液接种于10L种子罐中，60℃、200r/min发酵24h；发酵培养基为PB培养基，嗜热菌Bacillus smithiiThs1培养液的接种体积占PB液体培养基体积的5％。

d、扩大培养：将步骤c发酵得到的嗜热菌Bacillus smithiiThs1种子液接种于PB液体培养基中，60℃、200r/min发酵24h；其中嗜热菌Bacillus smithii Ths1种子液的接种体积占PB液体培养基体积的3％。

e、加入菌体吸附基质，浓缩干燥：以轻质碳酸钙为菌体吸附基质进行喷雾干燥，获得嗜热菌Bacillus smithii Ths1的接种剂菌粉。

实施例3

实施例1中筛选出来的嗜热菌Bacillus smithii Ths1，可以用来制备接种剂，该接种剂包括菌体吸附基质和嗜热菌Bacillus smithii Ths1干菌粉，接种剂的制备方法具体包括以下工艺步骤：

a、活化菌种：将-80℃保存的嗜热菌Bacillus smithii Ths1菌株划线接种于LB平板上，65℃培养12h。

b、液体培养：用接种环刮去嗜热菌Bacillus smithiiThs1的菌苔并接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，65℃、200r/min摇床培养12h。

c、种子液发酵：将步骤b得到的嗜热菌Bacillus smithii Ths1培养液接种于10L种子罐中，65℃、200r/min发酵24h；发酵培养基为PB培养基，嗜热菌Bacillus smithiiThs1培养液的接种体积占PB液体培养基体积的10％。

d、扩大培养：将步骤c发酵得到的嗜热菌Bacillus smithiiThs1种子液接种于PB液体培养基中，65℃、200r/min发酵48h；其中嗜热菌Bacillus smithiiThs1种子液的接种体积占PB液体培养基体积的5％。

e、加入菌体吸附基质，浓缩干燥：以轻质碳酸钙为吸附基质进行喷雾干燥，获得嗜热菌Bacillus smithiiThs1的接种剂菌粉。

实施例4

实施例1中筛选出来的嗜热菌Bacillus smithii Ths1，可以用来制备接种剂，该接种剂包括菌体吸附基质和嗜热菌Bacillus smithiiThs1干菌粉，接种剂的制备方法具体包括以下工艺步骤：

a、活化菌种：将-80℃保存的嗜热菌Bacillus smithii Ths1菌株划线接种于LB平板上，55℃培养24h。

b、液体培养：用接种环刮去嗜热菌Bacillus smithii Ths1的菌苔并接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，55℃、200r/min摇床培养24h。

c、种子液发酵：将步骤b得到的嗜热菌Bacillus smithii Ths1培养液接种于10L种子罐中，55℃、200r/min发酵24h；发酵培养基为PB培养基，嗜热菌Bacillus smithiThs1培养液的接种体积占PB液体培养基体积的10％。

d、扩大培养：将步骤c发酵得到的嗜热菌Bacillus smithiiThs1种子液接种于PB液体培养基中，55℃、200r/min发酵36h；其中嗜热菌Bacillus smithii Ths1种子液的接种体积占PB液体培养基体积的2％。

e、加入菌体吸附基质，浓缩干燥：以轻质碳酸钙为吸附基质进行喷雾干燥，获得嗜热菌Bacillus smithii Ths1的接种剂菌粉。

实施例5

实施例2中获得的嗜热菌Bacillus smithii Ths1的接种剂菌粉，用于鸡粪与秸秆的混合物的堆肥化，混合物中鸡粪与秸秆的质量比为1：5，具体使用方法为：在鸡粪与秸秆的混合物中撒入占混合物质量0.5％的接种剂，调节混合物的含水量达到60％，发酵期间每3天翻堆一次，温度超过60℃后每天翻堆，等堆温降到40℃以下，测定堆肥的C/N比、有机质、种子发芽指数来标判定堆肥的腐熟度。

对比例1

用草炭代替实施例2中步骤e中的轻质碳酸钙作为菌体吸附基质，其它方法与实施例2相同。

对比例2

用嗜热脂肪芽孢杆菌代替实施例2中的嗜热菌Bacillus smithii Ths1来制作接种剂，其它方法与实施例2相同，用得到的接种剂代替实施例5中的嗜热菌Bacillussmithii Ths1接种剂，其他堆肥化过程与实施例5相同。

对比例3

用从土壤中分离出的斯密氏芽孢杆菌Bs21代替实施例2中的嗜热菌BacillussmithiiThs1来制作接种剂，其它方法与实施例2相同，用得到的接种剂代替实施例5中的嗜热菌Bacillus smithii Ths1接种剂，其他堆肥化过程与实施例5相同。

对比例4

用市售常温腐熟菌剂代替实施例5中的嗜热菌Bacillus smithiiThs1接种剂，其他堆肥化过程与实施例5相同。

对实施例1筛选得到的嗜热菌Bacillus smithiiThs1的温度适应性进行检测，具体的是将实施例1筛选出的嗜热菌Bacillus smithiiThs1菌株划线培养于LB培养基上，分别在28℃、37℃、40℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃保湿培养，48h观察LB培养基上菌落的生长情况，其中40℃、45℃、55℃、65℃、75℃培养的LB平板上均有菌落出现，以55℃和65℃两个温度生长最为旺盛，表明Ths1菌株的最适生长温度为55℃-65℃之间，生长温度的范围为40℃-75℃，有着较广的温度适应性。

对实施例1筛选得到的嗜热菌Bacillus smithii Ths1的纤维素酶活性和蛋白酶的能力进行定性检测，将筛选获得的嗜热菌Bacillus smithii Ths1在LB培养基上、65℃培养箱中活化培养24h，之后分别接种于含有刚果红的羧甲基纤维素平板和SCM培养基(含单一碳源10g/L酪蛋白)，测量65℃恒温培养3天后嗜热菌Bacillus smithii Ths1在刚果红的羧甲基纤维素平板上的菌落直径和水解圈的直径，同时观察嗜热菌Bacillus smithiiThs1在SCM培养基上的生长情况，用嗜热脂肪芽孢杆菌和斯密氏芽孢杆菌Bs21作为对照组，检测方法与嗜热菌Bacillus smithii Ths1的检测方法相同，检测结果如表1所示。

表1

根据检测结果发现，嗜热菌Bacillus smithii Ths1菌株在刚果红羧甲基纤维素平板上培养3天时菌落直径为0.62cm、水解圈直径1.18cm，D/d值为1.90，具有高温分泌纤维素酶的能力。同时，该菌可以在以酪蛋白为唯一碳源的SCM培养基上生长，具有高温分泌蛋白酶的活性。

对实施例2-4和对比例1中获得的接种剂的冷冻保存菌体的存活率进行检测，在不同保存时间点，分别取10g实施例2和对比例1的接种剂加入到含有100mL无菌水的摇瓶中，震荡处理30min，稀释10倍，按微生物稀释平板记数法进行计数，每克接种剂中菌体存活数量检测结果见表2。

表2

由上表检测结果发现，实施例2-4中的接种剂的菌体保存的存活率较高，说明轻质碳酸钙作为吸附基质，可以延长嗜热菌Bacillus smithii Ths1的存活时间，提高嗜热菌Bacillus smithii Ths1菌体保存的存活率。

对实施例5和对比例2-4的堆肥化过程进行检测，检测结果如表3所示。

表3

整个堆肥化过程包括腐熟过程和后熟过程，腐熟过程是从接入接种剂开始到高温期结束后堆肥降至40℃的过程；后熟过程是从腐熟过程结束后开始到堆肥中的C/N比不再变化为止。

表3中的高温期为堆肥化过程中温度超过55℃的时期；有机质含量(％)和C/N比为腐熟过程结束后，堆肥中有机质含量(％)和C/N比；种子发芽指数为腐熟过程完成之后，肥料浸提液浸种后测定的小麦种子的发芽率；空白对照为不加接种剂处理的堆肥化过程。

从表3可以看出，堆肥接种嗜热菌Bacillus smithii Ths1接种剂后，最高温度可达85℃，达到高温期的时间为发酵后第3d，超过55℃的高温期为10d；腐熟过程结束后堆肥中有机质含量达到60％以上，C/N为12.2，有机质含量显著高于对比例且C/N比低，说明含N量高，腐熟较彻底，大大缩短后熟过程周期，后熟过程缩短至15天以内，加快整个堆肥化的进程；腐熟过程完成后测定不同堆肥处理的种子发芽指数，嗜热菌Bacillus smithiiThs1处理堆肥中种子发芽指数高达98.4％。说明嗜热菌Bacillus smithiiThs1接种剂可明显促进堆肥前期发酵升温，并提高堆肥温度、加快有机物料的腐熟转化，降低发酵过程中的N损失，加快堆肥化的进程。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省科学院生物研究所

<120> 一种嗜热菌Bacillus smithii Ths1及其应用

<130> 2019

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1351

<212> DNA

<213> Bacillus smithii Ths1 的16S rRNA 的基因序列

<400> 1

ttgctttttg aaagttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggcaacct gcctgcaaga 60

cggggataac tccgggaaac cggggctaat accggataat atcttccttc gcatgaagga 120

aggttgaaag gcggcgcaag ctgccgcttg cagatgggcc cgcggcgcat tagctagttg 180

gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac 240

actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa 300

tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagcgaaga aggtcttcgg atcgtaaagc 360

tctgttgtca gggaagaaca agtaccgttc gaacagggcg gtaccttgac ggtacctgac 420

cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 480

tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggtctct taagtctgat gtgaaagccc 540

acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggagagcg 600

gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg 660

gctctctggt ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat 720

accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagagggctt ccacccttta 780

gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc 840

aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 900

gaagaacctt accaggtctt gacatccttc gctacctcta gagatagagg gttccccttc 960

gggggacgga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1020

taagtcccgc aacgagcgca acccttgacc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta 1080

aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1140

tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa agggtcgcga aaccgcgagg 1200

tggagccaat cccaaaaaac cattctcagt tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg 1260

aagccggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1320

gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt t 1351

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 16S rRNA 通用引物 27f

<400> 2

agagtttgat cctggctc 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 16S rRNA 通用引物 1492r

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一种嗜热菌Bacillus smithii Ths1，菌株保藏号为CGMCC No.16868。

2.权利要求1所述嗜热菌Bacillus smithii Ths1在有机固体废弃物堆肥化中的应用。

3.权利要求1所述嗜热菌Bacillus smithii Ths1制备的接种剂，其特征在于：包括菌体吸附基质和嗜热菌Bacillus smithiiThs1菌粉。

4.如权利要求3所述嗜热菌Bacillus smithii Ths1制备的接种剂，其特征在于：所述菌体吸附基质为轻质碳酸钙。

5.权利要求3或4所述接种剂的制备方法，其特征在于：包括如下工艺步骤：

a、活化菌种；

b、液体培养；

c、种子液发酵；

d、扩大培养；

e、加入菌体吸附基质，浓缩干燥。

6.如权利要求5所述的接种剂制备方法，其特征在于：所述步骤a中的菌种活化方法为：将冷冻保存的嗜热菌Bacillus smithii Ths1菌株划线接种于LB平板上，55-65℃培养12-24h。

7.如权利要求5所述的接种剂制备方法，其特征在于：所述步骤b中液体培养过程为：从LB平板上刮取嗜热菌Bacillus smithii Ths1的菌苔接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，55-65℃、200r/min摇床培养12-24h。

8.如权利要求5所述的接种剂制备方法，其特征在于：所述步骤c中的种子液发酵过程为：将步骤b得到的嗜热菌Bacillus smithii Ths1培养液接种于PB液体培养基中，55-65℃、200r/min发酵20-30h；所述嗜热菌Bacillus smithii Ths1培养液的接种体积占PB液体培养基体积的5-10%。

9.如权利要求5所述的接种剂制备方法，其特征在于：所述步骤d中扩大培养的过程为：将步骤c发酵得到的嗜热菌Bacillus smithii Ths1种子液接种于PB液体培养基中，55-65℃、200r/min发酵24-48h；所述嗜热菌Bacillus smithii Ths1种子液的接种体积占PB液体培养基体积的2-5%。

10.如权利要求5所述的接种剂制备方法，其特征在于：所述步骤e中浓缩干燥过程采用喷雾干燥法。

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