CN107177533B - 一种嗜热菌复配菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种由嗜热脲芽孢杆菌剂、土芽孢杆菌剂、嗜热脱氮芽孢杆菌剂、红嗜热盐菌剂混合获得的嗜热菌复配菌剂，该菌剂是由上述5中菌剂经活化、培养、复配并优化后所获得。该复合菌剂具有生产周期短、有效活菌数高、保存周期长和能耐受60℃以上高温堆肥环境等优势，可避免复合菌剂中活性微生物在超高温好氧堆肥期间失活，较单一嗜热接种菌剂更具有适应性强和性能稳定的优势，在有机废弃物快速堆肥无害化方面具有广阔的应用前景。

Description

一种嗜热菌复配菌剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物菌剂领域，特别涉及一种应用于超高温好氧堆肥的嗜热菌复配菌剂及其制备方法与应用。

背景技术

堆肥化是目前最常用的无害化、资源化处理有机废弃物的有效方法。有机废弃物(如畜禽粪便、病死畜禽、秸秆、餐厨垃圾等)通常含有丰富的N、P及一定量的微量元素，经过好氧堆肥处理后，其中的致病菌、寄生虫被杀死，有机质分解转化为腐殖质，更利于植物吸收利用，是作物生长的最适宜肥料，然而在自然好氧堆肥条件下，受堆体内土著微生物种类及数量等因素限制的影响，堆肥初期升温缓慢，高温期持续时间短，往往存在发酵时间长、臭气污染严重且腐熟度低等问题。

通过在堆肥初期接种微生物制剂的方法可提高堆肥效率和成品质量，其机理有：1)提高堆肥初期微生物的群体，增强微生物的降解活性；2)缩短达到高温期的时间；3)接种分解有机物质能力强的微生物。目前，国内外对于堆肥接种技术的研究已有了较大的进展。研究表明，在堆肥过程中，人为接种分解有机物能力强的微生物，可提高堆料中有效微生物数量，加速堆肥材料的腐熟，且发酵过程中产生的高温，有利于消灭某些病原体、虫卵和杂草种子等。

目前，高温堆肥采用的微生物接种剂主要是中温好氧菌。顾希贤从22个垃圾堆肥、畜粪、土壤等样品中分离获得了198株纤维分解菌，从中筛选出2株繁殖速度快、粗纤维分解能力强的制成菌剂，并以0.05％-0.1％的比例接种于垃圾堆肥的二次发酵中；沈根祥等在蘑菇培养料中筛选出能促进冷性牛粪高温发酵的微生物菌群；李季等筛选出近10个具有不同功能作用、繁殖速度快的细菌、真菌、酵母菌，按照不同比例组合制成能广泛用于畜禽粪便、市政污泥等有机废物堆肥的VT菌剂。此外，公开号CN 101486969A、CN 101186879A、CN10169639A等专利公布了将多种芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、乳酸菌、光合菌、固氮菌、霉菌等组合制备的堆肥复合菌剂。然而这些微生物接种剂中的活性微生物通常为常温和中温微生物，在超高温堆肥60-80℃的高温环境中往往受到抑制甚至失去活性，大大降低了接种剂的功效，这些问题的产生促使了开展筛选适应超高温堆肥环境的嗜热菌株及接种菌剂制备的研究工作。

嗜热菌与常温和中温菌相比，具有更高的微生物代谢活性和有机物降解速率，在固体有机废弃物处理领域具有广阔的应用前景和科学价值。公开号CN 201510182884.1公布了一种餐厨垃圾厌氧消化快速启动和高效运行的菌剂，该菌剂里含有嗜热厌氧绳菌DSM14523、速生栖热分枝菌DSM8682、嗜热甲烷八叠球菌DSM1825等，但该菌剂主要应用于餐厨垃圾的厌氧消化处理；公开号CN 201210343220.5公布了一种嗜热栖热菌UTM802及其应用，其提供的嗜热栖热菌UTM802在堆肥达到60-80℃的高温环境中均生长良好，具有稳定的降解性能，能快速降解有机物质，加快堆肥进程。然而单一嗜热菌株难以适应多种有机废弃物的好氧堆肥处理，因此开发多种嗜热菌株复配的复合微生物接种剂应用于有机废弃物的超高温堆肥过程，可大大提高复合菌剂的适应范围，促进各类有机物质的降解速率，缩短堆肥处理时间，在有机废弃物堆肥化处理领域具有潜在的应用价值。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种应用于超高温好氧堆肥的嗜热菌株筛选以及复合菌剂制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种嗜热菌复配菌剂，其包含嗜热脲芽孢杆菌剂、土芽孢杆菌剂、嗜热脱氮芽孢杆菌剂、红嗜热盐菌剂和嗜热栖热菌剂中的至少一种，所述嗜热菌复配菌剂的含菌量大于1×10⁸CFU/g。

优选的，本发明所述嗜热菌复配菌剂是由嗜热脲芽孢杆菌剂、土芽孢杆菌剂、嗜热脱氮芽孢杆菌剂、红嗜热盐菌剂和嗜热栖热菌剂按照体积比10-20:10-30:10-20:10-30:20-40混合获得。

优选的，本发明所述嗜热菌复配菌剂是由等量的嗜热脲芽孢杆菌剂、土芽孢杆菌剂、嗜热脱氮芽孢杆菌剂、红嗜热盐菌剂和嗜热栖热菌剂混合获得。

本发明所述嗜热菌复配菌剂的制备方法，其具体步骤如下：

(1)菌种活化：菌株分别接种于固体培养基，60℃培养24h，挑取单菌落接到斜面培养基，60℃培养24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液，接种液的活菌量均大于1×10⁸CFU/g；

(2)混合菌种复配：将步骤(1)获得的接种液混合获得复配接种液；

(3)一级种子液制备：按照体积比5％-10％的接种量向固体培养基中接入步骤(2)制备的复配接种液，在摇床转速180rpm，60℃培养16h，即为一级种子液；

(4)液体复合菌剂制备：按照体积比0.5％-2％的接种量向发酵培养基中接入步骤(3)制备的一级种子液，通气量为6m³/h，搅拌速度为180-220rpm，60℃培养16h，待液体菌剂中的活菌量大于1×10⁸CFU/g时即获得所述嗜热菌复配菌剂。

本发明所述嗜热菌复配菌剂在超高温好氧堆肥中的应用。

本发明申请中，技术术语“超高温”是指温度为60-80℃。

本发明的有益效果：本发明所提供的5株嗜热菌株(包括嗜热球形脲芽孢杆菌、嗜热脱氮芽孢杆菌、嗜热栖热菌和红嗜热盐菌)能在60-80℃超高温好氧堆肥环境中旺盛生长，其制成的液体复合菌剂中含有嗜热菌的有效活菌数大于1×10⁸CFU/g；该菌剂具有生产周期短、有效活菌数高、保存周期长等优势，并且可避免复合菌剂中活性微生物在超高温好氧堆肥期间失活，较单一嗜热接种菌剂更具有适应性强和性能稳定的优势。

具体实施方式

以下实施例涉及的菌株来源及培养基：

嗜热脲芽孢杆菌：中国专利201210222021.9公开的嗜热脲芽孢杆菌JD-50；

土芽孢杆菌：为文献“嗜热土芽孢杆菌GSEY01及其高温蛋白酶的初步研究”(廖艳江等，生物技术通报，2010)所公开的嗜热土芽孢杆菌GSEY01；

嗜热脱氮芽孢杆菌：为文献“嗜热脱氮芽孢杆菌产α-半乳糖苷酶影响因素的研究”(韦阳道等，中国酿造，2015)所公开的嗜热脱氮芽孢杆菌YWX5；

红嗜热盐菌：为文献“Establishment of a gene transfer system forRhodothermusmarinus”(Appl Microbiol Biotechnol,2005)所公开；

嗜热栖热菌：为中国专利201210343220.5所公开的嗜热栖热菌UTM802。

实施例中所涉及的培养基：

固体培养基(1L)：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，酵母粉2g，琼脂20g，加水定容至1L，调节pH7.2；

斜面培养基：与固体培养基配方相同；

发酵培养基(1L)：红糖15g/L，硫酸铵1.0g/L，蛋白胨3g/L,酵母粉2g/L,氯化钠5g/L，加水定容至1L，调节pH7.2。

实施例1单一菌株与混合菌株的堆肥效果比较

本实施例中，5种菌分别为：嗜热脲芽孢杆菌A、土芽孢杆菌B、嗜热脱氮芽孢杆菌C、红嗜热盐菌D和嗜热栖热菌E，包括如下几个步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的5株嗜热菌株接种于固体培养基上，于60℃培养24h，挑取单菌落接到斜面培养基上，于60℃培养24h，用等量无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液，各接种液的活菌量均大于1×10⁸CFU/g；

(2)混合菌种复配：分别将步骤(1)获得的5株嗜热菌株接种液按照表1进行处理，得到嗜热菌接种液/复配接种液；

表1各菌株接种液体积比

处理编号	A	B	C	D	E
						1	100
2		100
						3			100
4				100
						5					100
6	50	50
						7		30	40	30
8	10	20	0	30	40
						9	10	20	10	30	30

(3)一级种子液制备：按照体积比5％-10％的接种量向固体培养基中接入步骤(2)制备的嗜热菌接种液或复配接种液，在摇床转速180r/min，60℃条件下培养16h，作为一级种子液；

(4)液体复合菌剂制备：按照体积比0.5％-2％的接种量向发酵培养基中接入步骤(3)制备的一级种子液，通气量为6m³/h，发酵罐搅拌速度为180-220r/min，60℃条件下培养16h，待液体菌剂中的活菌量大于1×10⁸CFU/g时即得到液体菌剂；

(5)以质量百分比计，将新鲜鸡粪85％和稻秸15％混合，获得原始物料，调整原始物料的含水量为55％，步骤(4)液体菌剂添加比例为0.025％(以原始物料质量百分比计)，获得发酵原料；然后将发酵原料转入密闭式滚筒堆肥装置中，进行超高温堆肥处理，具体堆肥方法如下：在1～2h内将发酵原料的温度升至80～85℃，并在该温度范围内继续发酵24h，并且在发酵期间对物料进行曝气供氧，总曝气量为每千克干物质(即物料在105℃的恒温下，充分干燥后的剩余物)通入0.3～1.2m³干空气(即去除水汽、液体之后的空气)。同时以不接种液体菌剂的超高温堆肥处理为对照，对照组物料组成、发酵温度、发酵时间均相同。

(6)发酵结束将物料从堆肥反应器取出摊开，待物料自然降至室温后，得到鸡粪堆肥产品，并且取样分析各处理堆肥产品总有机碳、总氮、氨氮含量；

物料含水率、总有机碳、总氮、铵态氮、可溶性有机碳含量的测定参照文献“添加腐熟猪粪对猪粪好氧堆肥效果的影响[J].，曹云等，农业工程学报，2015，31(21)：220－226”所公开的方法进行；小白菜种子发芽率的测定方法为：取5g鲜样加水50ml浸提30min于室温下200r/min振荡30min，用定性滤纸过滤，滤液用于种子发芽率的测定。在已灭菌的培养皿内垫2-3张滤纸，加入堆肥提取液8ml，以去离子水作为对照，均匀放入20粒小白菜种子，种子要求籽粒饱满，大小均匀一致。25-30℃培养24h后测定发芽率。

检测结果如表2所示：

表2各处理组肥料的理化性质及其提取液对小白菜的种子发芽率影响

从表2可以看出，超高温发酵24h后得到的堆肥产品含水率下降至30％以下。无论是接种单一菌剂还是混合菌剂，发酵后物料总有机碳含量比不接种菌株对照组的总有机碳含量略低，说明接种菌剂有利于提高堆肥物料有机碳的降解速率；接种菌剂处理的堆肥产品铵态氮含量明显低于未接种处理，可能的原因是接种的微生物将一部分氨氮同化为有机氮。尽管接种处理堆肥中总氮含量略低于不接种，但由于可溶性有机碳、铵态氮含量明显低于不接种对照组，其提取液对小白菜的种子发芽率明显高于对照组，并且随着接种菌剂的混合复杂程度呈现逐渐升高趋势，说明添加菌剂特别是添加混合菌剂有利于提高粪便堆肥产品的腐熟度。

实施例2最佳菌种配比的确定

本实施例中，5种菌分别为：嗜热脲芽孢杆菌A、土芽孢杆菌B、嗜热脱氮芽孢杆菌C、红嗜热盐菌D和嗜热栖热菌E，包括如下几个步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的5株嗜热菌株接种于固体培养基上，于60℃培养24h，挑取单菌落接到斜面培养基上，于60℃培养24h，用等量无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液；各接种液的活菌量大于1×10⁸CFU/g

(2)混合菌种复配：分别将步骤(1)获得的5株嗜热菌株接种液按照表3的比例进行混合，得到嗜热菌复配接种液；

表3各菌株接种液体积比

处理编号	A	B	C	D	E
						1	10	10	20	20	40
2	10	20	30	20	20
						3	20	30	10	10	30
4	10	20	10	30	30
						5	20	10	20	30	20
6	20	20	20	20	20

(3)一级种子液制备：按照体积比5％-10％的接种量向固体培养基中接入步骤(2)制备的嗜热菌复配接种液，在摇床转速180r/min，60℃条件下培养16h，作为一级种子液；

(4)液体复合菌剂制备：按照体积比0.5％-2％的接种量向固体培养基中接入步骤(3)制备的一级种子液，通气量为6m³/h，发酵罐搅拌速度为180-220r/min，60℃条件下培养16h，液体菌剂中总的活菌量大于1×10⁸CFU/g时即得到液体菌剂；

(5)以质量百分比计，将新鲜鸡粪85％和稻秸15％，混合获得原始物料，调整原始物料的含水量为55％后，按照液体菌剂添加比例为0.025％(以占原始物料质量百分比计)，然后将发酵原料转入密闭式滚筒堆肥装置中，进行超高温堆肥发酵，具体步骤为：1～2h内将发酵原料的温度升至80～85℃，并在该温度范围内继续发酵24h，并且在发酵期间对物料进行曝气供氧，总曝气量为每千克干物质(即物料在105℃的恒温下，充分干燥后的剩余物)通入0.3～1.2m3干空气(即去除水汽、液体之后的空气)。同时以不接种液体菌剂的超高温堆肥处理为对照，对照组物料组成、发酵温度、发酵时间均相同。

(6)发酵结束将物料从堆肥反应器取出摊开，待物料自然降至室温后，得到鸡粪堆肥产品，并且取样分析各处理堆肥产品总有机碳、总氮、氨氮含量；

物料含水率、总有机碳、总氮、铵态氮、可溶性有机碳含量的测定参照文献“添加腐熟猪粪对猪粪好氧堆肥效果的影响[J].，曹云等，农业工程学报，2015，31(21)：220－226.”进行；小白菜种子发芽率的测定方法为：取5g鲜样加水50ml浸提30min于室温下200r/min振荡30min，用定性滤纸过滤，滤液用于种子发芽率的测定。在已灭菌的培养皿内垫2-3张滤纸，加入堆肥提取液8ml，以去离子水作为对照，均匀放入20粒小白菜种子，种子要求籽粒饱满，大小均匀一致。25-30℃培养24h后测定发芽率。

检测结果如表4所示：

表4各处理组肥料的理化性质及其提取液对小白菜的种子发芽率影响

从表4可以看出，超高温发酵24h后得到的堆肥产品含水率下降至30％以下。综合堆肥物料理化指标及种子发芽率看，以5株菌剂添加比例为1:1:1:1:1的处理组6的堆肥腐熟效果为最佳。故后续以5株菌剂添加比例为1:1:1:1:1开展进一步研究。

实施例3不同堆肥原料组成的堆肥效果比较

本实施例中，5种菌分别为：嗜热脲芽孢杆菌A、土芽孢杆菌B、嗜热脱氮芽孢杆菌C、红嗜热盐菌D和嗜热栖热菌E，包括如下几个步骤：

操作步骤(1)-(4)与实施例2中相同，不同之处是5株菌剂添加比例为1:1:1:1:1，制备得到嗜热菌复配接种液；复配接种液的活菌量大于1×10⁸CFU/g；

(5)以质量百分比计，按照表5中堆肥物料配比进行混合，获得原始物料，调整原始物料的含水量为55％后，接入步骤(4)获得的液体菌剂，其添加比例为0.025％(以占原始物料质量百分比计)，获得发酵原料；然后将发酵原料分别转入密闭式滚筒堆肥装置，1～2h内将发酵原料的温度升至80～85℃，并在该温度范围内继续发酵24h，并且在发酵期间对物料进行曝气供氧，总曝气量为每千克干物质(即物料在105℃的恒温下，充分干燥后的剩余物)通入0.3～1.2m3干空气(即去除水汽、液体之后的空气)。

表5各处理组堆肥原料组成方案

(6)发酵结束将物料取出摊开，待物料自然降至室温后，得到畜禽粪便堆肥产品，并且取样分析各处理堆肥产品总有机碳、总氮、氨氮含量；

物料含水率、总有机碳、总氮、铵态氮、可溶性有机碳含量的测定参照文献“添加腐熟猪粪对猪粪好氧堆肥效果的影响[J]”(曹云等，农业工程学报，2015，31(21)：220－226.)所公开的检测方法进行；小白菜种子发芽率的测定方法为：取5g鲜样加水50ml浸提30min于室温下200r/min振荡30min，用定性滤纸过滤，滤液用于种子发芽率的测定。在已灭菌的培养皿内垫2-3张滤纸，加入堆肥提取液8ml，以去离子水作为对照，均匀放入20粒小白菜种子，种子要求籽粒饱满，大小均匀一致。25-30℃培养24h后测定发芽率。

检测结果如表6所示：

表6各处理组肥料的理化性质及其提取液对小白菜的种子发芽率影响

从表6可以看出，不论堆肥原料组成和配比存在差异，但接种混合菌剂后采用密闭式滚筒堆肥方式，经24h后堆肥物料的腐熟效果差异较小，表明经复配后的混合菌剂对畜禽粪便类物料堆肥的适应性较强。

Claims (4)

1.一种嗜热菌复配菌剂，其特征在于，所述嗜热菌复配菌剂是由嗜热脲芽孢杆菌Ureibacillus thermosphaericus、土芽孢杆菌Geobacillus.sp GSEY01、嗜热脱氮芽孢杆菌Geobacillus thermodenitrificans、红嗜热盐菌Rhodothermus marinus 和嗜热栖热菌Thermus thermophilus混合获得；所述嗜热菌复配菌剂的含菌量大于1×10⁸ CFU/g。

2.根据权利要求1所述嗜热菌复配菌剂，其特征在于，所述嗜热菌复配菌剂是由等量的嗜热脲芽孢杆菌、土芽孢杆菌、嗜热脱氮芽孢杆菌、红嗜热盐菌和嗜热栖热菌混合获得。

3.如权利要求1或2所述嗜热菌复配菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1） 菌种活化：菌株分别接种于固体培养基，60℃培养24h，挑取单菌落接到斜面培养基，60℃培养24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液，接种液的活菌量均大于1×10⁸ CFU/g；

（2）混合菌种复配：将步骤（1）获得的接种液混合获得复配接种液；

（3）一级种子液制备：按照体积比5%-10%的接种量向固体培养基中接入步骤（2）制备的复配接种液，在摇床转速180rpm，60℃培养16h，即为一级种子液；

（4）液体复合菌剂制备：按照体积比0.5%-2%的接种量向发酵培养基中接入步骤（3）制备的一级种子液，通气量为6m³/h，搅拌速度为180-220 rpm，60℃培养16h，待液体菌剂中的活菌量大于1×10⁸ CFU/g时即获得所述嗜热菌复配菌剂。

4.根据权利要求1或2所述嗜热菌复配菌剂在超高温好氧堆肥中的应用。