CN107586745B

CN107586745B - 一种畜禽粪便堆肥除臭保氮菌株、菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107586745B
Application number: CN201710997226.7A
Authority: CN
Inventors: 尹红梅; 刘标; 刘惠知; 雷平; 许隽; 杜东霞; 王震; 许丽娟; 陈微; 吴迎奔
Original assignee: HUNAN PROVINCE MICROBIOLOGY INSTITUTE
Current assignee: HUNAN PROVINCE MICROBIOLOGY INSTITUTE
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2037-10-20
Also published as: CN107586745A

Abstract

本发明公开了一种畜禽粪便堆肥除臭保氮菌株、菌剂及其制备方法和应用。该菌株为巨大芽孢杆菌DF‑2，是从腐熟的畜禽粪便堆肥中分离得到，制备得到的菌剂接种到猪场废水中，反应15d后对NH₃、H₂S的去除率分别达89.5％、82.7％，脱臭效果明显，且对废水中的有机物有明显的降解效果，反应15d时COD的去除率达91.2％；通过实际堆肥，与不接菌剂的试验处理比较，用该菌剂生产猪粪堆肥只需18～22天，比传统堆肥缩短腐熟进程2‑3倍，且能明显减少氨气的排放，较空白对照组相比，氨气释放量降低65％左右，氮素积累增加30％以上。因此，通过该菌剂的作用，猪粪堆肥能达到快速腐熟并降低氨气挥发，从而减少恶臭的产生及氮素损失。

Description

一种畜禽粪便堆肥除臭保氮菌株、菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物处理固体废弃物资源化领域，具体涉及一种畜禽粪便堆肥除臭保氮菌株、菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

随着畜禽养殖业的快速发展,畜禽养殖废弃物大量堆积，导致严重的环境污染，也影响养殖场的卫生防疫和人体健康。禽畜粪便是畜禽养殖废弃物的主要来源，2010年我国畜禽粪便的排放量约为45亿吨，远远超过同期工业固体废弃物的排放量，据估计到2020年我国养殖业产生的畜禽粪便将超过60亿吨，大量的畜禽粪便如果得不到及时有效的处理，将严重占用和污染农田、水体，产生恶臭并造成污染。畜禽粪便中含有大量的有机质及丰富的氮、磷、钾，还有铜、镁、硫、铁、锌等微量元素，是制造有机肥的优质原料，它在农业上应用不仅可以提高作物产量，还能促进土壤团粒结构的形成，使土壤松软，增加土壤的透气性，改善土壤的理化性状，促进土壤微生物的活性，加速土壤中物质循环和腐殖质的形成，是农业可持续发展的宝贵资源。好氧堆肥技术由于工艺简单、能耗低、投资少，被广泛运用于禽畜粪便的处理，但是传统的好氧堆肥容易产生恶臭，氮素损失严重，不仅污染大气，而且降低了肥料中的养分含量。当前除臭和保氮技术是国内外研究畜禽粪便堆肥的重点和热点，但是迄今为止成效甚微。

畜禽粪便堆肥中臭气最主要成分是NH₃和H₂S，故在堆肥过程中控制臭气的产生和NH₃的挥发是堆肥除臭保氮的关键。目前我国针对堆肥过程中保氮与除臭方法可以分为三类：物理法、化学方法以及生物法。化学法具有臭气去除率高，占地少等优点，但成本较高，需要相对应的药剂进行处理，且易产生二次污染；物理法仅能吸附和掩蔽恶臭气体，不能解决根本问题；而生物法是通过微生物的生理代谢将臭味成分进行分解和转化，从而根本上达到脱臭的目的。生物法具有运行费用低、应用广泛、适合处理多种恶臭气体的优点。

生物法的最大难题是较难获得除臭保氮效率高、脱臭周期短的菌种。因此，筛选自然界中现存的高效、广谱除臭保氮菌意义重大。

发明内容

本发明目的旨在提供一种能快速腐熟畜禽粪便，且能显著降低畜禽粪便堆肥过程中臭气物质的产生，增加氮素含量的除臭保氮菌株、菌剂及其制备方法和应用。所述的巨大芽抱杆菌DF-2于2017年7月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.14446；巨大芽孢杆菌为发明人从腐熟的畜禽粪便堆肥中分离得到，对畜禽粪便堆肥具有快速腐熟，且有很好的除臭保氮效果。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种畜禽粪便堆肥除臭保氮菌株巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)DF-2，保藏编号为CGMCC No.14446。

一种畜禽粪便堆肥除臭保氮菌剂，由上述的菌株发酵培养制备得到。

所述的菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)斜面菌种活化

取冰箱保存斜面菌种，无菌操作接种于新鲜试管斜面培养基中，30℃恒温培养过夜，培养基：蛋白胨1％，NaCl 0.5％，酵母膏0.5％，琼脂1.5％～2.0％，其余为水，pH 7.2-7.5；

2)摇瓶种子培养

摇瓶培养基为步骤1)所述的斜面培养基中不加琼脂，具体操作：取活化的新鲜斜面菌种一环，接种于摇瓶种子液体培养基中，装量为100mL/500mL，转速为200～220rpm,30～32℃恒温培养28～32h后，80℃水浴热处理10分钟；

3)发酵罐培养

发酵罐中培养基装量为总体积的40～50％，接种量占培养基体积的0.1～0.3％，发酵温度30～32℃，通空气，200～220rpm搅拌培养，通空气体积与发酵液体积的比值0.9:1～1:1，罐压0.03～0.05MPa；发酵终点为芽孢数不低于总菌数的90％，且发酵液的活菌数在8.0×10⁹～1.2×10¹⁰cfu/mL之间；发酵罐培养基各组分:淀粉20.0～30.0g/L,豆饼粉10.0～15.0g/L,KH₂PO₄ 2.0～2.5g/L,Na₂HPO₄ 0.5～1.0g/L、MgSO₄.7H₂O 0.8～1.2g/L,CaCO₃0.5～0.8g/L,pH 7.2～7.5；

4)固体吸附

发酵液用麦麸按1:2～1:3的重量比例吸附，吸附后低温抽湿干燥，粉碎，粉剂产品含菌量在2.0×10⁹～6.0×10⁹cfu/g之间。

本发明所述的巨大芽抱杆菌DF-2用于养猪废水的除臭以及COD的去除。

本发明所述的巨大芽抱杆菌DF-2用于畜禽粪便堆肥除臭保氮和腐熟。

本发明所述的菌剂用于养猪废水的除臭以及COD的去除。

本发明所述的菌剂用于畜禽粪便堆肥除臭保氮和腐熟。具体是将新鲜禽畜粪便经脱水干燥且粉碎后，与调理剂按照重量比4:1进行混合，或者根据物料理化性质调整C/N比例，使C/N比例为20～25之间；所述调理剂为统糠、锯木屑中的一种或两种；将菌剂、禽畜粪便、调理剂加水混合均匀，水分含量50-60％，pH值自然，菌剂接种量为0.3％；堆肥量为1吨。

本发明的有益效果：

本发明菌剂由单个菌株制备而成，制备方便，成本低廉，应用范围较广；该发明菌剂接种到堆肥后，能迅速生长繁殖，适应堆肥中的高温环境，快速分解堆肥中的有机物；堆肥期间能有效抑制腐败、有害细菌的生长，改善有机物的分解途径，减少氨气的释放量，增加氮素含量；本发明菌剂DF-2接种到猪场废水中，反应15d后对NH₃、H₂S的去除率分别达89.5％、82.7％，脱臭效果明显，且对废水中的有机物有明显的降解效果，反应15d时COD的去除率达91.2％；通过实际堆肥，与不接菌剂的试验处理比较，用该菌剂生产猪粪堆肥只需18～22天，比传统堆肥缩短腐熟进程2-3倍，且能明显减少氨气的排放，较空白对照组相比，氨气释放量降低65％左右，氮素积累增加30％以上。因此，通过该菌剂的作用，猪粪堆肥能达到快速腐熟并降低氨气挥发，从而减少恶臭的产生及氮素损失。

此外，本发明所述巨大芽抱杆菌DF-2对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等病原微生物有明显抑制作用。

本发明菌株的保藏信息如下：

分类命名：巨大芽抱杆菌Bacillus megaterium，

保藏编号：CGMCC No.14446，

保藏时间：2017年7月20日，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为本发明实施例中T1、T2、T3及对照组CK堆温变化；

图2为本发明实施例中T1、T2、T3及对照组CK堆体中氨气的释放(ppm)。

具体实施方式

以下实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：脱臭微生物的筛选

1、脱臭菌株初筛

从腐熟的畜禽粪便堆肥样品中分离微生物至牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g/L,蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15-20g/L,pH7.4-7.6)中，将分离菌株分别接种至筛选培养基中(离心、灭菌后的猪场废水，pH自然)中，根据发酵液是否达到无臭进行筛选，共筛选到3株脱臭菌株DF-1、DF-2、DF-3，纯化菌株并斜面保存。

2、脱臭菌株复筛

将3株优势菌株DF-1、DF-2、DF-3接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养到对数期后，离心收集菌体，再将菌体加入少许无菌水制成菌悬液。取100mL预处理灭菌后的猪场废水放入500mL三角瓶中，加入菌悬液，使细胞密度为1.0×10⁷CFU/mL。同时设置不加菌的猪场废水作为空白对照组CK。接种后于30℃，180rpm的摇床中培养，每隔5d检测粪水中NH₃与H₂S的去除情况。

复筛结果如表1、2、3所示，高效优势菌株DF-1、DF-2、DF-3接种到猪场废水中，DF-2的效果最好，反应15天后对NH₃、H₂S的去除率分别为89.5％、82.7％，脱臭效果明显；且对废水中的有机物有明显的降解效果，反应15天时COD的去除率达91.2％。

3、脱臭菌株鉴定

形态鉴别：DF-2菌落淡黄色，菌落圆形，边缘整齐，表面光滑，隆起。革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，芽孢为椭圆形。

16S rDNA序列分析：以菌株DF-2的基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA基因通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.5kb的16S rDNA序列，其16S rDNA序列如序列1所示。该序列通过BLAST与NCBI GenBank数据库中已报道序列进行同源性比对，结果显示，DF-2与巨大芽孢杆菌的同源性达99％，结合形态学特征，鉴定DF-2为巨大芽抱杆菌(Bacillusmegaterium)。

本发明所述巨大芽抱杆菌DF-2对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌病原微生物有明显抑制作用，结果见表4,5。

表1脱臭菌对猪场废水中NH₃的去除率(％)

表2脱臭菌对猪场废水中H₂S的去除率(％)

表3脱臭菌对猪场废水中COD的去除率(％)

表4巨大芽孢杆菌DF-2对大肠杆菌的体外抑制效果

注：A为大肠杆菌单独培养含菌数(个)，B为大肠杆菌与巨大芽孢杆菌共培养后的大肠杆菌含菌数(个)。

表5巨大芽孢杆菌DF-2对金黄色葡萄球菌的体外抑制效果

注：A为金黄色葡萄球菌单独培养含菌数(个)，B为金黄色葡萄球菌与巨大芽孢杆菌共培养后的金黄色葡萄球菌含菌数(个)。

实施例2：菌剂制备

斜面菌种活化：取冰箱保存斜面菌种，无菌操作接种于新鲜试管斜面培养基中，30℃恒温培养过夜，制成新鲜试管斜面菌种。斜面培养基：蛋白胨1％，NaCl0.5％，酵母膏0.5％，琼脂1.5％～2.0％，其余为水，pH 7.2-7.5。

摇瓶种子培养：取活化的新鲜斜面菌种一环，无菌操作接种于摇瓶种子液体培养基中，装量为100mL/500mL，转速为200～220rpm,30～32℃恒温培养28～32h后，80℃水浴热处理10分钟，即可。所述的摇瓶种子的培养基是在斜面培养基中不加琼脂。

发酵罐培养：发酵罐中培养基装量为总体积的40～50％，接种量占培养基体积的0.1～0.3％，发酵温度30～32℃，通空气搅拌培养(200～220rpm)，通气体积比0.9:1～1:1，罐压保持在0.03-0.05MPa，接种后根据泡沫情况适当调整排气量和罐压，防止逃液。当泡沫逐渐消失后，加大通气量。每6小时取样镜检一次。发酵终点为芽孢数占总菌数的90％以上。放罐样用平板计数法测定总菌数。发酵液的含菌数在8.0×10⁹－1.2×10¹⁰cfu/ml之间。发酵罐培养基:淀粉20.0～30.0g/L,豆饼粉10.0～15.0g/L,KH₂PO₄ 2.0～2.5g/L g,Na₂HPO₄0.5～1.0g/L、MgSO₄.7H₂O 0.8～1.2g/L,CaCO₃ 0.5～0.8g/L,pH 7.2～7.5。

固体吸附：发酵液用麦麸按1:2～1:3的重量比例吸附，吸附后低温抽湿干燥，粉碎，测定含菌量后，入库保存。粉剂产品含菌量在2.0×10⁹－6.0×10⁹cfu/g之间。

实施例3：除臭菌剂在畜禽粪便堆肥中的应用

1.畜禽粪便堆肥制作

将新鲜猪粪便与调理剂等配料按照重量比4:1进行混合，或者根据物料理化性质调整C/N比例，使C/N比例为20～25之间。

上述所述的新鲜猪粪便经脱水干燥且粉碎后用，所述调理剂为统糠、锯木屑等。

在堆肥槽内将本发明产品、猪粪便、调理剂加水混合均匀，水分含量55％左右，pH值自然，菌剂接种量为0.3％。各组堆肥量为1吨左右。试验期20d，后续处理5d。试验期前15天每2天机械翻动一次，后熟处理期不翻动。

2.试验分组

试验CK组为对照组，不接种除臭菌剂；试验T1组，接种市售的除臭菌剂1(枯草芽孢杆菌)，含菌量为5.0×10⁹cfu/g；试验T2组，接种市售的除臭菌剂2(由枯草芽孢杆菌，干酪乳杆菌组成)，含菌量为3.5×10⁹cfu/g；试验T3组，接种实施例2中巨大芽孢杆菌DF-2除臭剂，含菌量在4.0×10⁹cfu/g。

3.实验结果如下

1)温度

在好氧堆肥过程中，温度是影响微生物活动和堆肥工艺过程的关键因素。高温可杀死病原菌，在适当的温度范围内有机质降解最快，同时需要在适当的情况下进行水分的去除和堆温的下降来结束堆腐，因此，堆体温度的高低决定堆肥速度的快慢。各试验组的温度变化趋势如图1所示，大致分为3个阶段即升温阶段、高温阶段、降温阶段。各试验组的温度变化趋势基本相同，但在50℃以上维持时间不同，T1、T2、T3及对照组CK高温保持的时间分别为4d、9d、12d、14d。其中添加自制菌剂巨大芽孢杆菌DF-2的试验组T3升温快，高温维持的时间长，能有效促进堆肥腐熟。

2)氨气释放

各处理组的氨气释放量如图2所示。所有试验组在堆肥期间的氨气产生量最高峰出现在第5天，T1、T2、T3氨气释放量分别为42.7ppm、48.5ppm、36.3ppm。对照处理氨气最高峰在第10天，为104.5ppm。与对照相比，添加除臭菌剂的处理有效的减少的氨气的挥发，其中T3组对氨气释放的抑制效果最好，较T1、T2、CK组氨气最大释放量分别降低了14.3％、25.2％、65.3％。硫化氢的挥发是堆肥臭气产生的主要原因之一，但在此试验期间，整个堆肥处理过程中未能检测到硫化氢释放。

3)氮素变化情况

从表6可以看出，堆肥结束时所有试验组T1、T2、T3总氮含量都增加，增加率分别为21.60％、20.52％、30.69％，T3总氮增加率最高，而对照组降低了4.05％；所有试验组T1、T2、T3与对照组CK的NH4⁺-N都有不同程度下降,损失率分别为28.46％、29.81％、19.77％、35.45％，T3试验组NH4⁺-N损失率最低；试验组与对照组NO₃ ^--N都有增长的趋势，其中试验组T3的增长率最高达56.14％，T1、T2的增长率分别为41.81％、40.74％，CK组为21.43％。从以上数据可看出，接种除臭微生物菌剂能有效地减少氮素的损失，提高堆肥中总氮含量，有效地促进堆肥除臭保氮，其中接种自制的微生物除臭菌剂巨大芽孢杆菌DF-2除臭保氮效果最好。

表6堆肥前后不同处理含氮物质变化

4)种子发芽指数

堆肥产品的种子发芽指数是评价堆肥产品是否腐熟的重要指标之一。一般认为，当种子发芽指数大于80％时，说明堆肥产品对植物无毒性，完全达到腐熟。从表7可以看出，随着堆肥的进行，各组的GI逐渐增大，至堆肥结束时，各试验组的GI均大于110％，均达到完全腐熟，其中T3组在第7d时GI值就达86.3％，而对照组在堆肥结束时的GI仅为75.8％，没有达到腐熟标准。这表明，在堆肥中添加的微生物菌剂可以加速堆体的腐熟，尤其是添加自制的微生物菌剂巨大芽孢杆菌DF-2的堆肥腐熟速度最快,有效缩短堆肥腐熟时间。

表7不同菌剂对种子发芽指数的影响

序列表

<110> 湖南省微生物研究院

<120> 一种畜禽粪便堆肥除臭保氮菌株、菌剂及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1459

<212> DNA

<213> 巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 1

atgggggggg gggctaatac atggcaggtc gagcgaactg attagaagct tgcttctatg 60

acgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggcaacctg cctgtaagac tgggataact 120

tcgggaaacc gaagctaata ccggatagga tcttctcctt catgggagat gattgaaaga 180

tggtttcggc tatcacttac agatgggccc gcggtgcatt agctagttgg tgaggtaacg 240

gctcaccaag gcaacgatgc atagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300

gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt 360

ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttag 420

ggaagaacaa gtacgagagt aactgctcgt accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaacttac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggaattat 540

tgggcgtaaa gcgcgcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagccca cggctcaacc 600

gtggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag agaaaagcgg aattccacgt 660

gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcgg ctttttggtc 720

tgtaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780

ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc cgccctttag tgctgcagct 840

aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 900

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960

ccaggtcttg acatcctctg acaactctag agatagagcg ttccccttcg ggggacagag 1020

tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080

acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag catttagttg ggcactctaa ggtgactgcc 1140

ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200

ctacacacgt gctacaatgg atggtacaaa gggctgcaag accgcgaggt caagccaatc 1260

ccataaaacc attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agctggaatc 1320

gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380

ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcgttgg agtaaccgta aggagctagc 1440

ccgctttaag gttggaccc 1459

Claims

1.一种畜禽粪便堆肥除臭保氮菌株巨大芽抱杆菌（Bacillus megaterium）DF-2，保藏编号为CGMCC No.14446。

2.一种畜禽粪便堆肥除臭保氮菌剂，其特征在于，由权利要求1所述的菌株发酵培养制备得到。

3.权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）斜面菌种活化

取冰箱保存斜面菌种，无菌操作接种于新鲜试管斜面培养基中，30℃恒温培养过夜，培养基：蛋白胨1%，NaCl 0.5%，酵母膏0.5%，琼脂1.5%～2.0%，其余为水，pH 7.2-7.5；

2）摇瓶种子培养

摇瓶培养基为步骤1）所述的斜面培养基中不加琼脂，具体操作：取活化的新鲜斜面菌种一环，接种于摇瓶种子液体培养基中，装量为100 mL／500 mL，转速为200～220rpm, 30～32℃恒温培养28～32 h后，80℃水浴热处理10分钟；

3）发酵罐培养

发酵罐中培养基装量为总体积的40～50%，接种量占培养基体积的0.1～0.3%，发酵温度30～32^OC，通空气，200～220 rpm搅拌培养，通空气体积与发酵液体积的比值0.9:1～1:1，罐压0.03～0.05 MPa；发酵终点为芽孢数不低于总菌数的90%，且发酵液的活菌数在8.0×10⁹～1.2×10¹⁰cfu/mL之间；发酵罐培养基各组分: 淀粉20.0～30.0g/L, 豆饼粉10.0～15.0 g/L, KH₂PO₄ 2.0～2.5 g/L, Na₂HPO₄ 0.5～1.0 g/L、MgSO₄.7H₂O 0.8 ～1.2 g/L,CaCO₃ 0.5～0.8 g/L, pH 7.2～7.5；

4）固体吸附

发酵液用麦麸按1:2～1:3的重量比例吸附，吸附后低温抽湿干燥，粉碎，粉剂产品含菌量在2.0×10⁹～6.0×10⁹ cfu/g之间。

4.权利要求1所述的巨大芽抱杆菌DF-2用于养猪废水除臭以及COD去除的用途。

5.权利要求1所述的巨大芽抱杆菌DF-2用于畜禽粪便堆肥除臭保氮和腐熟的用途。

6.权利要求2所述的菌剂用于养猪废水除臭以及COD去除的用途。

7.权利要求2所述的菌剂用于畜禽粪便堆肥除臭保氮和腐熟的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，

将新鲜禽畜粪便经脱水干燥且粉碎后，与调理剂按照重量比4:1进行混合，或者根据物料理化性质调整C/N比例，使C/N比例为20～25之间；所述调理剂为统糠、锯木屑中的一种或两种；将菌剂、禽畜粪便、调理剂加水混合均匀，水分含量50-60％，pH值自然，菌剂接种量为0.3%；堆肥量为1吨。