CN111304107B - 一种生物除臭制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物除臭制剂，其特征在于活性成分为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus‑9菌株，通过牧场试验结果显示，本发明所述的生物除臭制剂能够极其显著降低猪场圈舍的氨气浓度，有广泛的应用前景。在降低养殖场，尤其是猪场氨气的排放具有良好的效果。本发明的生物制剂产品原料易得，工艺简单，适合规模化生产；同时本发明的生物制剂可以通过喷洒、动物饮水添加和/或饲料添加等简易方式使用，可以有效地节省劳动成本和基础建设成本。
Description
技术领域
本发明属于畜牧工程领域，具体涉及一种适用于畜禽养殖场的生物除臭制剂及其制备和应用。
背景技术
随着国家不断出台对畜牧生产者越来越严厉的政策法规，环境保护成为养殖场面临的最大生产问题，而众多的养殖场中，猪场的环保问题最为突出。生猪排放的氨气和硫化氢等气体和猪粪是猪场臭味的主要来源，因为环境不达标，周围群众反映强烈，养殖场的关停整治等时有发生。这些气体物质不仅仅影响人类的健康，而且很容易吸附在呼吸道粘膜上，并且有腐蚀性，长期以往的话就会对粘膜造成伤害，导致猪的防疫变差，容易患病。同时，氨气进入体内后，会妨碍营养物质的吸收，并且会使病菌的生活环境变得更加舒适，滋生细菌，给畜牧养殖场造成极大的损失，因此畜牧业生产的持续发展需要一种高效、低成本的解决方案来减少氨气等臭气的排放。
目前出现了一些依靠物理吸附等方法的养殖场除臭方法，但这些方法均需要较大成本的基础建设配套，较难以有效推广。而针对于减少和去除养殖场臭味的微生物除臭剂，或者功能性饲料制剂种类仍较少，用户可选择性窄、使用方法单一、使用效果也不够理想，因此急需开发一种高效、低成本、安全的生物除臭剂或者除臭饲料添加剂在源头上减少氨气和臭气的排放。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物除臭制剂产品，其活性成分为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株。
所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株来源于CN106957805A公开的菌株，于2016年11月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 13337。
所述的生物除臭制剂，优选为液体或固体粉末状形态。
本发明的另一个目的在于提供一种生物除臭制剂的制备方法，具体包括配制培养基步骤，甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵液制备步骤和生物制剂产品制备步骤。
所述的生物除臭制剂的制备方法，配制培养基步骤具体包括种子培养基和基础发酵培养基配制。优选的，配制培养基步骤具体包括：（1）种子培养基制备，种子培养基包括蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L；（2）基础发酵培养基制备包括磷酸氢二钠8.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、氯化钠0.5g/L、红糖50g/L和七水合硫酸镁0.492g/L，其中pH值为6.8～7.0。
所述的生物除臭制剂的制备方法，甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵液制备步骤包括：经过菌种保存，菌种活化，摇瓶培养和发酵罐发酵后获得甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵液。优选的，甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵液制备步骤具体包括：（1）菌种保存：将LB培养基中OD600达到1.5时的菌液与50%的无菌甘油以1:1的比例在1.5mlEP管中混合均匀，封口膜封口；短期保存放置于-20℃保存，长期保存放置于-80℃低温保存；（2）菌种活化：将保存的菌种以1:100的比列接种于5mlLB培养基中，37℃ 220rpm培养10h；（3）摇瓶培养：取1ml种子液接种于盛有100ml LB培养基的250ml锥形瓶中（接种量为1%），培养条件与菌种活化步骤相同；（4）发酵罐培养：将摇瓶中的发酵种子液接种到含有基础发酵培养基的200L发酵罐中进行发酵罐培养，获得甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵液。
所述的生物除臭制剂的制备方法，优选的，所述的发酵罐发酵步骤的发酵条件为：初始pH值保持为6.8-7.2，进一步优选为7.0；甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）GBacillus-9菌株的生长温度为28-40℃，进一步优选为37℃；发酵罐的装液量为发酵罐体积的60%-65%，接种量为1%-2%，进一步优选为1%。
所述的生物除臭制剂的制备方法，优选的，甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵过程中可根据发酵液装液量，在培养基中加入消泡剂；发酵时间为7～10h，进一步优选为8h；发酵罐转速达为150rpm-300rpm，200 rpm为最佳。
所述的生物除臭制剂的制备方法，优选的，生物制剂产品制备步骤包括取自发酵罐的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵液直接作为生物制剂的液态产品；或者或者进一步将取自发酵罐的芽孢杆菌GBacillus-9菌株发酵液与玉米淀粉混匀，进行喷雾干燥后，获得固体粉末状生物制剂产品。具体优选，将取自发酵罐的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵液与玉米淀粉以1L：100g的比例混匀，用搅拌器匀速搅拌，进行喷雾干燥，进口温度为180℃，出口温度为90℃，收集固体粉末生物制剂产品。
本发明的另一个目的在于提供一种活性成分为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）GBacillus-9菌株的生物除臭制剂产品的应用，所述的应用包括可通过喷洒和/或饮用和/或饲料添加等方式在养殖场使用。
所述的一种活性成分为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株的生物除臭制剂产品的应用，喷洒包括：直接将液态的芽孢杆菌GBacillus-9菌株发酵液用水稀释，稀释比例在1:30-50之间，在养殖场直接喷洒养殖圈、排水沟等产生臭味的区域；
所述的一种活性成分为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株的生物除臭制剂产品的应用，饮用包括：直接将液体的本品兑水供畜禽日常饮用，将本用水稀释，稀释比例在1:100-200之间，供畜禽自然饮用。
所述的一种活性成分为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株的生物除臭制剂产品的应用，饲料添加包括：将喷干的本品添加到畜禽的日粮中，添加量0.3-0.5%，每日饲味。
所述的一种活性成分为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株的生物除臭制剂产品的应用，优选的喷洒养殖区与日粮添加配合使用效果最佳。
有益效果：本发明提供一种生物除臭制剂，所述的生物除臭制剂活性成分为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株，具有抑菌活性，现有技术中并未有直接将该菌株应用至养殖场或动物饲料添加剂来进行除臭的公开报道。
本发明提供的生物除臭制剂，其活性成分为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）GBacillus-9菌株，并不包含灰略红链霉菌、黄孢原毛平革菌、枯草芽孢杆菌等其他菌株，因此，本申请的新型无需通过与灰略红链霉菌、黄孢原毛平革菌、枯草芽孢杆菌等菌株进行复合即可达到高效除臭的效果，相比现有技术中的必须采用复合菌剂的方案，具有更低成本和明显的工业化前景。
通过发酵罐中菌株的生产曲线测试，结果显示在接种8h后即进入生长稳定期，10小时候进入衰亡期。因此，采用7～8h的发酵液的菌种最为合适，此时甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株处于对数生长末期，此时既可以保持较高的细胞活力，又可获得较多的细胞数，因而，通过较短的生产周期即可获得本发明的生物制剂产品。
本发明的生物除臭制剂以该菌株制得为活性成分，经过大量实验探索，明确了其在生物除臭方面的效用，填补了现有技中的空白。通过牧场实验结果显示，本发明所述的生物除臭制剂能够极其显著降低猪场圈舍的氨气浓度，有广泛的应用前景。在降低养殖场，尤其是猪场氨气的排放具有良好的效果。本发明的生物制剂产品原料易得，工艺简单，适合规模化生产；同时本发明的生物制剂可以通过喷洒、动物饮水添加和/或饲料添加等简易方式使用，可以有效地节省劳动成本和基础建设成本。
具体实施方式
产品制备实施例
一、配制培养基
1.培养基
1.1 种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
1.2基础发酵培养基：磷酸氢二钠8.5g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵1g/L，氯化钠0.5g/L，红糖50g/L，七水合硫酸镁0.492g/L，其中pH值为6.8～7.0。
1.3仪器设备：控温摇床、高压灭菌锅、电子天平、无菌操作台、紫外分光光度计
2. 甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵液制备
2.1培养方法
2.1.1菌种保存方法：将种子培养基中OD600达到1.5时的菌液与50%的无菌甘油以1:1的比例在1.5mlEP管中混合均匀，封口膜封住，短期保存放置于-20℃冰箱，长期保存放置于-80℃低温冰箱。
2.1.2菌种活化方法：将保存的菌种以1:100的比列接种于5ml种子培养基中，37℃220rpm培养10h。
2.1.3摇瓶培养：取1ml种子液接种于盛有100ml 种子培养基的250ml锥形瓶中（接种量为1%），培养条件同上。
2.1.4发酵罐培养：将摇瓶中的发酵种子液接种到200L发酵罐中（基础发酵培养基）。接种时先将将管内压力降为0MPa，点燃接种口酒精棉，打开接种口将发酵种子液倒入发酵罐中，盖紧接种口。
3.发酵条件
3.1生长曲线：通过发酵罐中菌株的生产曲线测试，接种8h后进入稳定期，10小时候进入衰亡期，因此，采用7～8h的菌液作为菌种较为合适，此时甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株处于对数生长末期，此时甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株既可以保持较高的细胞活力，又可获得较多的细胞数。
3.2初始pH：在初始pH为6.8～7.2范围内解淀粉芽孢杆菌均可良好的生长，在PH为7.0时生长最好，说明甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株对pH的适应性较宽，但随着pH增大或是降低，活菌数呈下降趋势。
3.3发酵温度：甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株在28℃～40℃均可保持良好的生长，其最适生长温度为37℃。8
3.4接种量与装液量：甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株为需氧菌，生长中需要大量的氧气，发酵过程中会产生大量气泡，因此装液量为发酵罐体积的60%～65%，接种量为1%适合其生长。
3.5消泡剂：甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵过程中会产生大量的气泡，需要以1:2000（V/V装液量）的比例在培养基中加入消泡剂。
3.6发酵时间：甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株在生长过程中会分泌抑菌物质抑制其自身的生长，因此在接种后8～10h，OD600达到2.0～2.5时可停止发酵。
3.7发酵转速：甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵过程中转速过快或是过慢都会抑制其自身的生长，在转速达到200rpm为最佳。
3.8补料：甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株在发酵过程中会产多种物质，改变发酵液的pH，因此发酵过程中需要关注发酵液的pH变化，及时补碱或补酸。
三、生物制剂产品制备
1. 液态产品：取自发酵罐的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵液直接作为生物制剂的液态产品；
2. 固体粉末产品：进一步将取自发酵罐的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）GBacillus-9菌株发酵液与玉米淀粉以1L：100g的比例混匀，用搅拌器匀速搅拌，进行喷雾干燥，进口温度为180℃，出口温度为90℃，收集固体粉末状生物制剂产品。
牧场实验实施例
试验（1）：选择两个条件相同的猪圈，一组喷洒本发明所述的液态产品，一组喷洒清水。喷洒方法为直接将液态的产品用水稀释，稀释比例在1:30-50之间，在养殖场直接喷洒整个猪圈，每次喷洒时间为下午6点，对照组喷洒等量的清水。喷洒当天记为1天，从喷洒前一天（第0天）开始检测圈舍内氨气（氨气检测仪）的浓度，监测点均匀分布在圈舍内，设置12个监测点，每天定时检测氨气的含量，持续5天。
试验（2）：选择两个条件相同的猪圈，一组圈舍饮水槽中加入本发明所述的液态产品，一组饮用清水作为对照。将液态的产品用水稀释，稀释比例在1:200，供猪自由饮水。饮用水中添加本发明所述的液态产品当天记为1天，从饲喂前一天（第0天）开始检测圈舍内氨气（氨气检测仪）的浓度，监测点均匀分布在圈舍内，设置12个监测点，每天定时检测氨气的含量，持续5天。
试验（3）：选择两个条件相同的猪圈，一组圈舍猪的饲料中添加本发明所述的喷干粉产品，一组添加等量的淀粉作为对照。日粮中添加该产品的量为0.3%，开始饲喂该产品当天记为第1天，从饲喂前一天（第0天）开始检测圈舍内氨气（氨气检测仪）的浓度，监测点均匀分布在圈舍内，设置12个监测点，每天定时检测氨气的含量，持续5天。
试验（4）：选择两个条件相同的猪圈，一组圈舍饮水槽中加入本发明所述的液态产品，同时喷洒本发明所述的液态产品，对照组饮用和喷洒清水。喷洒很饮用方法如上试验（1）和（2）。从饲喂前一天（第0天）开始检测圈舍内氨气（氨气检测仪）的浓度，监测点均匀分布在圈舍内，设置12个监测点，每天定时检测氨气的含量，持续5天。
试验（5）：选择两个条件相同的猪圈，一组圈舍猪的饲料中添加本发明所述的喷干粉产品，同时喷洒本发明所述的液态产品；对照组饲料中添加等量淀粉，喷洒清水。饲喂和喷洒方法如试验（1）和试验（3）。从饲喂前一天（第0天）开始检测圈舍内氨气（氨气检测仪）的浓度，监测点均匀分布在圈舍内，设置12个监测点，每天定时检测氨气的含量，持续5天。
实验结果：（1）试验（1）中，相较于对照组，喷洒本产品能够显著降低猪圈内氨气的浓度，喷洒后的第3、4、5天，氨气的浓度分别降低了55%、65%和70%左右；（2）试验（2）中，相较于对照组，饮用本发明中的产品一周后，圈舍内氨气的浓度降低了63%以上；（3）试验（3）中，相较于对照组，饲料中添加本发明中的喷干粉后，圈舍内氨气的浓度降低了68%以上；（4）试验（4）中，相较于对照组，饮用本发明中的产品，同时喷洒，圈舍内氨气的浓度降低了89%以上；（5）试验（5）中，相较于对照组，饲料中添加本发明中的喷干粉后，另外加上喷洒，圈舍内氨气的浓度降低了86%以上，极其显著降低了圈舍中氨气的浓度；（6）结合试验（4）和（5）数据表明喷洒养殖区和日粮添加配合使用效果较高，能够较大幅度降低圈舍中氨气的浓度。
Claims (9)
1.一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）在制备生物除臭制剂上的应用，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌为GBacillus-9菌株，保藏号为CGMCC No.13337，通过喷洒养殖区、喷洒养殖区和饮用或喷洒养殖区和饲料添加方式在养殖场使用。
2.如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌在制备生物除臭制剂上的应用，其特征在于，喷洒养殖区与日粮添加配合使用。
3.如权利要求1或2所述的甲基营养型芽孢杆菌在制备生物除臭制剂上的应用，其特征在于，所述的生物除臭制剂为液体或固体粉末状形态。
4.如权利要求3所述的甲基营养型芽孢杆菌在制备生物除臭制剂上的应用，其特征在于，所述的生物除臭制剂的制备方法，包括配制培养基步骤，甲基营养型芽孢杆菌GBacillus-9菌株发酵液制备步骤和生物制剂产品制备步骤。
5.如权利要求4所述的甲基营养型芽孢杆菌在制备生物除臭制剂上的应用，其特征在于，配制培养基步骤具体包括种子培养基和基础发酵培养基制备步骤。
6.如权利要求4所述的甲基营养型芽孢杆菌在制备生物除臭制剂上的应用，其特征在于，甲基营养型芽孢杆菌GBacillus-9菌株发酵液制备步骤包括：经过菌种保存，菌种活化，摇瓶培养和发酵罐发酵后获得甲基营养型芽孢杆菌GBacillus-9菌株发酵液。
7.如权利要求6所述的甲基营养型芽孢杆菌在制备生物除臭制剂上的应用，其特征在于，所述的发酵罐发酵步骤的发酵条件为：初始pH值为7.0；甲基营养型芽孢杆菌GBacillus-9菌株的生长温度为37℃；发酵罐的装液量为发酵罐体积的60%-65%，接种量为1%。
8.如权利要求6所述的甲基营养型芽孢杆菌在制备生物除臭制剂上的应用，其特征在于，甲基营养型芽孢杆菌GBacillus-9菌株发酵过程中根据发酵液装液量，在培养基中加入消泡剂；发酵时间为8h；发酵罐转速为200 rpm。
9.如权利要求4所述的甲基营养型芽孢杆菌在制备生物除臭制剂上的应用，其特征在于，生物制剂产品制备步骤包括取自发酵罐的甲基营养型芽孢杆菌GBacillus-9菌株发酵液直接作为生物制剂的液态产品；或者进一步将取自发酵罐的芽孢杆菌GBacillus-9菌株发酵液与玉米淀粉混匀，进行喷雾干燥后，获得固体粉末状生物制剂产品。
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