CN105087421A - 酵母融合菌混菌剂及其制备方法和生产有机肥的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种酵母融合菌混菌剂及其制备方法和发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法。一种酵母融合菌混菌剂,其主要特点在于该混菌剂包括菌体和培养基:其中所述的菌体包括酵母融合菌F105、地衣芽孢杆菌B-36、土著圆褐固氮菌A-7、链霉菌S-11和康氏木霉菌(T.reesi)T-2;其中所述酵母融合菌的活菌数为总活菌数的25-40%,地衣芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30%,土著圆褐固氮菌的活菌数为总活菌数的15-30%,链霉菌的活菌数为总活菌数的15-30%。康氏木霉菌的活菌数为总活菌数的10-35%。

Description

酵母融合菌混菌剂及其制备方法和生产有机肥的方法
技术领域
本发明涉及一种酵母融合菌混菌剂及其制备方法和发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法。
背景技术
传统的微生物混菌剂制备所用的微生物菌种大多是从国家或地方菌种库或直接从自然界分离筛选出来的,其缺点是:1、微生物菌种的活性差;2、对有机物分解转化能力弱;3、这些菌种所制备的混菌剂活细胞数少,大多数在108个/克
传统的微生物混菌剂制备方法是将各种不同的菌种(好氧或厌氧)在各自不同的生长培养基中进行培养,然后再从各个菌种的培养基中刮取菌苔制成各个菌种的液体菌悬液,再转种于各自的液体培养基中,经通气或厌氧培养后离心沉淀制备菌体细胞沉淀物,将沉淀物再经喷雾干燥制成菌粉,然后将制备的各菌菌粉按不同比例混合,即为混菌剂。其缺点是:制备工艺复杂,培养菌周期长,成本高,活性差,应用受到限制。
传统的秸秆畜禽便生产有机肥的方法,是利用原料中的土著微生物来自然发酵降解有机物,但由于在制肥初期土著微生物的数量较少,这些微生物需经较长时间才能繁殖起来,并且,它们对有机物分解速度差异性也很大,因此,传统的秸秆畜禽便制肥方法周期很长,产生臭味大,且肥效低。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种酵母融合菌混菌剂。
本发明的又一目的在于提供一种酵母融合菌混菌剂制备方法。
本发明的还有一目的在于提供一种酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法。
尤其是利用基因工程技术对酵母菌进行原生质体融合制备新的酵母融合菌,用该酵母融合菌与地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌配伍制备混合菌剂的方法。并利用所述的酵母融合菌混菌剂对农业秸秆和畜禽便进行发酵生产生物有机肥,是一项将农业废弃物中的有机物进行快速生物转化的技术,是实现了废弃物利用变废为宝的技术目的。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种酵母融合菌混菌剂,其主要特点在于该混菌剂包括菌体和培养基:其中所述的菌体包括酵母融合菌(FusantbetweenCandidatropicalisandSaccharmycescevisiae)F105,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路号院3号中国科学院微生物研究所,保藏时间为2014年12月30日,保藏编号为CGMCCNO.10263;地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)B-36购自中国农业微生物菌种保藏中心编号为Accc11080;圆褐固氮菌(Azotobacterchroococum)LGN-09保藏在在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路号院3号中国科学院微生物研究所,保藏时间为2010年4月26日,保藏编号为CGMCCNO.3768、链霉菌(Streptomyces)S-11购自中国农业微生物菌种保藏中心编号为ACCC40044和康氏木霉菌(T.reesi)T-2为市场销售菌;其中所述酵母融合菌的活菌数为总活菌数的25-40%,地衣芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30%,圆褐固氮菌的活菌数为总活菌数的15-30%,链霉菌的活菌数为总活菌数的15-30%。康氏木霉菌的活菌数为总活菌数的10-35%。
所述的酵母融合菌混菌剂,还包括有混菌液体培养基及液体菌种的制备,在一升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g,碳酸钙1-2g,磷酸0.5-1ml,用1%石灰水调PH6.2-7.5,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子容量的1/4,然后经110-112℃,30-35分钟高压灭菌,冷却后分别取酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的琼脂斜面试管菌种在无菌条件下分别转种于液体三角烧瓶培养基中,经28-32℃,24-72h静置或上摇床振荡培养,或在发酵罐通气搅拌发酵培养,将其发酵菌液按其不同比例配制,即为酵母融合菌混菌剂。
所述的酵母融合菌混菌剂,所述的酵母融合菌的制备有如下步骤:将酒精酵母菌作母种的斜面菌转种和培养,在液体振荡培养14小时后,用EDTA-巯基乙醇进行预处理,使用1%的纤维素酶和1%蜗牛酶进行酶解脱壁,时间为2小时,温度33℃,得到酒精酵母原生质体;将热带假丝酵母菌作母种的斜面菌转种和培养,在液体振荡培养14小时后,用EDTA-巯基乙醇进行预处理,使用1.5%的纤维素酶和0.5%蜗牛酶进行酶解脱壁,时间为2.5小时,温度33℃,得到热带假丝酵母原生质体;将热带假丝酵母原生质体经0.1%碘乙酸灭活,与酒精酵母原生质体以1:1混合,将沉淀悬于35%聚乙二醇的促溶剂中,30℃水浴静止处理,pH6.0,时间为40min,融合菌液经高渗磷酸缓冲液反复冲洗,涂布于高渗基础培养基和高渗完全培养基平板培养基上,经30℃、7天培养,平板生长出酵母融合菌。
所述的酵母融合菌混菌剂,所述的圆褐固氮菌的制备有如下步骤:
(1)采样:圆褐固氮菌是从兰州市南北两区地区的暗灰钙土,淡灰钙土,红泥土和碱土的四种不同土壤类型和多个植物根区的0-10cm、10-20cm、20-30cm土壤深度的266份土样;
(2)分离培养:取10g新鲜土样加入盛有100ml无菌水的500ml三角烧瓶中,放摇床上振荡10min使土样均匀的分散在稀释液中成为土壤悬液,吸取1ml上清液加到9ml无菌水中,按10倍法依次稀释至10-4-10-6,各重复四次;在已灭菌的培养皿中倾注15-20ml阿须贝(Ashby)的固体琼脂培养基,待凝固后用移液枪吸取100ul土壤稀释液加到培养基表面,然后立即用涂布棒将稀释液涂抹均匀;用相同的方法将同一样本不同稀释度的稀释液从高稀释度到低稀释度依法涂抹;将接种稀释的培养皿倒置放在28-32℃恒温培养箱内培养2-3d后取出,挑取具有特征性的水溶性褐色色素,光滑凸起的圆褐固氮菌菌落,转种在阿须贝琼脂斜面试管培养基上,经28-32℃恒温培养2-3d,取出后即为圆褐固氮菌母钟,保存在4-8℃冰箱内备用。
(3)诱变:将母种再经紫外线(30s),亚硝基胍(NTG)诱变处理以及生化形态学鉴定,最后鉴定获得的菌种转种于阿须贝琼脂斜面试管培养基上,即得保藏菌种。
所述的酵母融合菌混菌剂的制备方法,其主要特点在于有如下步骤:
A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养:
a.酵母融合菌酵母膏琼脂斜面培养基的制备:
酵母膏0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白胨0.2-0.6%、琼脂粉1-3%、无菌水80-120ml,加热溶解后用1%的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5,经110-114℃,30-35分钟蒸汽灭菌,然后在无菌条件下分装于15*1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用:
b.地衣芽孢杆菌营养牛肉膏琼脂斜面培养基的制备:
蛋白胨含量重量百分比为0.25-1%,氯化钠的含量重量百分比为0.25-1%,牛肉膏的含量重量百分比为0.2-0.5%,琼脂粉的含量重量百分比为1-3%,其余为无菌水,该培养基的PH为6.5-7.5;
c.圆褐固氮菌阿须贝(Ashby)琼脂斜面培养基的制备:
甘露醇的含量重量百分比为0.8-1.2%,碳酸钙的含量重量百分比为0.2-0.8%,磷酸二氢钾的含量重量百分比为0.01-0.03%,硫酸镁(含七个结晶水)的含量重量百分比为0.01-0.03%,氯化钠的含量重量百分比为0.01-0.03%,硫酸钙(含两个结晶水)的含量重量百分比为0.005-0.015%,琼脂粉的含量重量百分比为1-3%,其余为无菌水,该培养基的PH为6.8-7.0;
d.链霉菌和康氏木霉菌马铃薯-蔗糖(PDA)琼脂斜面培养基的制备:
马铃薯的含量重量百分比为15-25%,蔗糖的含量重量百分比为1.5-2.5%,琼脂粉的含量重量百分比为1-3%,其余为无菌水该培养基的PH为5.5-6.5.
对以上酵母融合菌,地衣芽孢杆菌,圆褐固氮菌,链霉菌和康氏木霉菌五种菌,分别取母钟转种各自制备的固体试管斜面培养基上,经培养为一级菌种;
B液体培养基及液体菌种的制备
a液体培养基的制备:在一升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g,碳酸钙1-2g,磷酸0.5-1ml,用1%石灰水调pH6.2-7.5,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子容量的1/4,然后经110-112℃,30-35分钟高压灭菌,冷却后备用;
b分别取酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的一级菌种,在无菌条件下分别转种于液体三角烧瓶培养基中,经28-32℃,24-72h静置培养。其培养菌液为二级菌种;
c分别将酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的二级菌种,在无菌条件下转种于液体三角烧瓶培养基中,上摇床进行震荡培养,振幅100-120转/分钟,温度28-32℃时间24-72h,其培养液为三级菌种,根据需要继续逐级扩大培养;
d分别将重量百分比为酵母融合菌为25-40%、地衣芽孢杆菌15-30%、圆褐固氮菌15-30%、链霉菌15-30%、康氏木霉菌15-30%的三级菌种再扩大培养,五种液体菌可以同时转种在同一发酵罐中经28-32℃,18-24h通气搅拌发酵培养,其培养液为酵母融合菌混菌剂。
一种酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法,其主要特点在于将秸秆粉碎小于10mm,加入重量份为30-40的秸秆,重量份为40-50份的畜禽便,重量份为6-10的米糠,重量份为1.7-2.0的尿素和重量份为1.7-2.0的硫酸铵后混合,将混合的物料调含水量到50-65%,按混合物料的总重量加入2-5%的酵母融合菌混菌剂和0.008-0.010%的复合酶,经充分搅拌均匀,控制发酵料含水量50-65%用1%的石灰水调PH到6.2-7.8然后将混合料放在发酵床或发酵池或堆积水泥地板上,在料堆上盖塑料布防止水分蒸发和保温,经常温发酵,并时常观察料温和翻拌,经10-20d待腐熟后,经干燥粉碎后或粉状或造粒包装即得生物有机肥产品。
所述的酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法,所述的秸秆包括稻草、玉米秆、小麦秸、高粱秸、谷草秸、黄豆秸、大麦秸、蚕豆秸、豌豆秸、荞麦秸、花生藤、马铃薯藤、瓜类藤的任意一种或任意组合
所述的酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法,所述的畜禽便包括猪粪、牛粪、马粪、羊粪、兔粪、禽粪任意一种或任意组合,畜禽便含水量20-30%。
所述的酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法,所述的复合酶包括淀粉酶25-35%,纤维素酶25-35%.脂肪酶20-30%,蛋白酶15-25%。
使用酵母融合菌与地衣芽孢杆菌,圆褐固氮菌,链霉菌和康氏木霉菌科学配伍制备液体混菌剂的液体培养基的原料是以新鲜的豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水为基料添加少量无机盐经溶解后,不需高压灭菌。该混合菌剂制备液体菌剂时所用的液体培养基原料是食品工业产生的下脚料,在制备液体混合菌剂时,整个生产过程在发酵罐内进行,无“三废”污染,操作方便,生产工艺简单,节省了人力和能源。
酵母融合菌混菌剂发酵秸秆和畜禽便生产生物有机肥是遵循能量流、物质流和伩息流的“三流循环理论”,在有氧条件下,酵母融合菌混菌剂中的各菌体通过自身的代谢活动,氧化、还原、合成的发酵过程,配合添加的复合酶(淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶)的水解和催化作用,淀粉酶可以催化淀粉分解成低分子糖类,如葡萄糖、麦芽糖;纤维素酶可以催化纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质;脂肪酶可以催化畜禽便中的油脂分解成脂肪酸和甘油,蛋白酶可以催化畜禽便中的蛋白质分解成氨基酸和肽,经过此过程促进秸秆畜禽便中的有机物质被分解后供酵母融合菌混菌剂中的各菌体的利用和降解。在发酵腐熟10-20d期间,混菌剂各菌体在发酵秸秆畜禽便的过程中温度的变化可分为三个阶段。30-40℃为中温阶段1-2d、45-65℃为高温阶段4-6d、25-45℃为降温阶段4-12d。在混菌剂发酵过程初至中期(低、中温阶段)单糖、脂肪酸和碳水化合物等可溶性有机物质首先被嗜温性微生物(酵母融合菌、圆褐固氮菌等)分解,嗜温性微生物在转换和利用化学能的过程中,有一部分变成热能,由于堆料有良好的保温作用,温度不断上升,温度提升的主要原因是混菌剂中的菌体通过自身的代谢活动使秸秆畜禽便的有机质分解时所产生的热能,随着温度的上升,嗜温性微生物更为活跃并大量繁殖,这样又导致更多有机质降解和释放更多的热能。当发酵过程中温度升至45℃以上,即将进入高温阶段,嗜温性微生物的活性开始下降,取而代之是嗜热性微生物(如地衣芽孢杆菌、链霉菌、康氏木霉菌等)这些嗜热性微生物能把复杂的和一些难分解的有机物如半纤维素、纤维素、蛋白质和木质素开始强烈分解,同时这些高温菌所产生的高温能量可使堆温升至60℃以上,保持4-6d能有效杀灭致病菌、寄生虫、虫卵、孢子如肠道致病菌中的伤寒杆菌、沙门氏杆菌、志贺氏痢疾杆菌,以及结核杆菌和无钩条虫等。同时,在腐熟过程后期,混合菌剂中的链霉菌和地衣芽孢杆菌产生的许多抗生素类物质,也可抑制和杀灭病原微生物。经过高温阶段秸秆和畜禽便的有机物质大部分被分解,嗜热性微生物因缺乏适当的营养物质而停止生长,其生物活性下降,发热量减少,发酵温度下降,腐熟过程进入降温阶段嗜温性微生物又开始活跃,继续对秸秆畜禽便残余较难降解的有机物质作进一步分解,腐殖质不断增多且稳定化。在降温阶段,当温度降至25-30℃的时候用翻拌机翻拌物料,可提供充足的氧气供微生物继续繁殖,促进温度提升再进入高温阶段45-60℃,使较难降解的有机物进一步分解和消耗,在10-20d发酵腐熟期间经过2-3次翻拌后秸秆和畜禽便中的有机物已被微生物大量消耗及完全分解,同时经过多天的持续高温下有害病毒被高温杀灭,可达到腐殖质稳定化及无害化的效果。
本发明所述的培养基的种类可以在很大范围内改变,五种菌的固体试管斜面培养基制备,为能够用于培养酵母融合菌(FusantbetweenCandidatropicalisandSaccharmycescevisiae)F105,地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)B-36,圆褐固氮菌(Azotobacterchroococum)LGN-09,链霉菌(Streptomyces)S-11,和康氏木霉菌(T.reesi)T-2例如以下培养基的一种或几种,如用于培养酵母融合菌的酵母膏或麦芽汁培养基,用于培养地衣芽孢杆菌中的营养牛肉膏或营养牛肉汁培养基,用于培养圆褐固氮菌的阿须贝培养基,用于培养链霉菌和康氏木霉菌的马铃薯-蔗糖培养基。
本发明的有益效果:发明人采用先进的单亲灭活原生质体融合技术,对热带假丝酵母(Candidatropicalis)968和酒精酵母(Saecharomycescervsiar)2.399两亲本菌株做融合,构建新的基因工程菌,这些融合菌即具有双亲的生物特征,又具有优于双亲的活性酶,絮凝性和耐高温的生物特征。能充分利用豆腐、粉丝、玉米淀粉和洋芋淀粉废水中的有机的营养物质进行生长繁殖,利用2014年12月30日,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCCNO10263的酵母融合菌F105,配伍地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌五菌组合。地衣芽孢杆菌具有适应性强,耐受性好,易生长,能将土壤中的不溶性磷和钾元素转化为有效磷和速效钾供农作物生长;圆褐固氮菌能将大气中的游离氮固定为有机物可利用的有机氮;链霉菌除能产生蛋白酶、纤维素酶还能产生抗生素,可抑制土壤或固料中的致病菌;康氏木霉菌能够分泌纤维素酶将土壤或固料中的纤维素转化为淀粉和糖为植物生长提供营养,经科学配比和独特的发酵工艺,使其菌剂中各菌体在生长过程中产生的有用物质及其分泌物质成为各自或相互生长的基料和原料,通过相互间的共生增殖关系,形成了一个复杂而稳定的微生态系统,发挥了多功能优势。
酵母融合菌、配伍地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌在新鲜的豆腐、粉丝、玉米、洋芋淀粉产生的废水中,添加少量的无机盐,直接发酵制备液体菌剂,既节省了培养基的原料,减少原料配置和高压灭菌的工序,节省了能源,也解决了这些行业治污的难题,是一项变废为宝,一举多得的生物技术。
酵母融合菌、配伍地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌混菌剂即可作为秸秆畜禽便生产生物有机肥的发酵剂和植物生长剂,也可作为有机废水处理净化剂。
附图说明:
图1为本发明酵母融合菌混菌剂的制备工艺流程示意图。
图2为本发明生物有机肥制备工艺流程示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。
实施例1:一种酵母融合菌混菌剂,其特征在于该混菌剂包括菌体和培养基:其中所述的菌体包括酵母融合菌(FusantbetweenCandidatropicalisandSaccharmycescevisiae)F105,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路号院3号中国科学院微生物研究所,保藏时间为2014年12月30日,保藏编号为CGMCCNO.10263;地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)B-36购自中国农业微生物菌种保藏中心编号为Accc11080;圆褐固氮菌(Azotobacterchroococum)LGN-09保藏在在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路号院3号中国科学院微生物研究所,保藏时间为2010年4月26日,保藏编号为CGMCCNO.3768、链霉菌(Streptomyces)S-11购自中国农业微生物菌种保藏中心编号为ACCC40044和康氏木霉菌(T.reesi)T-2为市场销售菌;其中所述酵母融合菌的活菌数为总活菌数的25-40%,地衣芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30%,圆褐固氮菌的活菌数为总活菌数的15-30%,链霉菌的活菌数为总活菌数的15-30%。康氏木霉菌的活菌数为总活菌数的10-35%。
实施例2:所述的酵母融合菌混菌剂,还包括有混菌液体培养基在一升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g,碳酸钙1-2g,磷酸0.5-1ml,用1%石灰水调PH6.2-7.5,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子容量的1/4,然后经110-112℃,30-35分钟高压灭菌,冷却后分别取酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的琼脂斜面试管菌种在无菌条件下分别转种于液体三角烧瓶培养基中,经28-32℃,24-72h静置或上摇床振荡培养,或在发酵罐通气搅拌发酵培养,将其发酵菌液按其不同比例配制,即为酵母融合菌混菌剂。
实施例3:一种酵母融合菌的制备有如下步骤:将酒精酵母菌作为母种的斜面转种和培养,在液体培养基经振荡培养14小时后,用EDTA-巯基乙醇进行预处理,使用1.5的纤维素酶和0.5的蜗牛酶进行酶解脱壁,时间为2.5小时,温度33℃,得到酒精酵母原生质体;将热带假丝酵母菌作为母种的斜面转种和培养:在液体培养基经振荡培养14小时后,用EDTA-巯基乙醇进行预处理,使用1.5%纤维素酶0.5%蜗牛酶进行酶解脱壁,时间为2.5小时,温度33℃,得到热带假丝酵母原生质体;将热带假丝酵母原生质体经0.1%碘乙酸灭活,然后与酒精酵母原生质体以1:1混合,将沉淀物悬于35%聚乙二醇(PEG)的促溶剂中,30℃水浴静置处理,pH6.0,时间为40分钟,融合菌液经高渗磷酸缓冲液(PBS)液反复冲洗,涂布于高渗基础培养基(MMS)和高渗完全培养基(YPDS)的平板培养基上,经30℃,7天培养,平板培养基上生长出酵母融合菌。
所述的酵母融合菌的酵母膏琼脂斜面培养基为:酵母膏0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白胨0.2-0.6%、琼脂粉1-3%、无菌水80-120ml,加热溶解后,用1%的氢氧化钠调PH值至5.5-6.5,经110~114℃,30-35分钟蒸汽灭菌,然后在无菌条件下分装于15x1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用。
实施例4:所述的酵母融合菌混菌剂,所述的圆褐固氮菌的制备有如下步骤:
(1)采样:圆褐固氮菌是从兰州市南北两区地区的暗灰钙土,淡灰钙土,红泥土和碱土的四种不同土壤类型和多个植物根区的0-10cm、10-20cm、20-30cm土壤深度的266份土样;
(2)分离培养:取10g新鲜土样加入盛有100ml无菌水的500ml三角烧瓶中,放摇床上振荡10min使土样均匀的分散在稀释液中成为土壤悬液,吸取1ml上清液加到9ml无菌水中,按10倍法依次稀释至10-4-10-6,各重复四次;在已灭菌的培养皿中倾注15-20ml阿须贝(Ashby)的固体琼脂培养基,待凝固后用移液枪吸取100ul土壤稀释液加到培养基表面,然后立即用涂布棒将稀释液涂抹均匀;用相同的方法将同一样本不同稀释度的稀释液从高稀释度到低稀释度依法涂抹;将接种稀释的培养皿倒置放在28-32℃恒温培养箱内培养2-3d后取出,挑取具有特征性的水溶性褐色色素,光滑凸起的圆褐固氮菌菌落,转种在阿须贝琼脂斜面试管培养基上,经28-32℃恒温培养2-3d,取出后即为圆褐固氮菌母钟,保存在4-8℃冰箱内备用。
(3)诱变:将母种再经紫外线(30s),亚硝基胍(NTG)诱变处理以及生化形态学鉴定,最后鉴定获得的菌种转种于阿须贝琼脂斜面试管培养基上,即得保藏菌种。
实施例5:所述的酵母融合菌混菌剂的制备方法,有如下步骤:
A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养:
a.酵母融合菌酵母膏琼脂斜面培养基的制备:
酵母膏0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白胨0.2-0.6%、琼脂粉1-3%、无菌水80-120ml,加热溶解后用1%的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5,经110-114℃,30-35分钟蒸汽灭菌,然后在无菌条件下分装于15*1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用:
b.地衣芽孢杆菌营养牛肉膏琼脂斜面培养基的制备:
蛋白胨含量重量百分比为0.25-1%,氯化钠的含量重量百分比为0.25-1%,牛肉膏的含量重量百分比为0.2-0.5%,琼脂粉的含量重量百分比为1-3%,其余为无菌水,该培养基的PH为6.5-7.5;
c.圆褐固氮菌阿须贝(Ashby)琼脂斜面培养基的制备:
甘露醇的含量重量百分比为0.8-1.2%,碳酸钙的含量重量百分比为0.2-0.8%,磷酸二氢钾的含量重量百分比为0.01-0.03%,硫酸镁(含七个结晶水)的含量重量百分比为0.01-0.03%,氯化钠的含量重量百分比为0.01-0.03%,硫酸钙(含两个结晶水)的含量重量百分比为0.005-0.015%,琼脂粉的含量重量百分比为1-3%,其余为无菌水,该培养基的pH为6.8-7.0;
d.链霉菌和康氏木霉菌马铃薯-蔗糖琼脂(PDA)琼脂斜面培养基的制备:
马铃薯的含量重量百分比为15-25%,蔗糖的含量重量百分比为1.5-2.5%,琼脂粉的含量重量百分比为1-3%,其余为无菌水该培养基的pH为5.5-6.5.
对以上酵母融合菌,地衣芽孢杆菌,圆褐固氮菌,链霉菌和康氏木霉菌五种菌,分别取母钟转种各自制备的固体试管斜面培养基上,经培养为一级菌种;
B液体培养基及液体菌种的制备
a液体培养基的制备:在一升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g,碳酸钙1-2g,磷酸0.5-1ml,用1%石灰水调pH6.2-7.5,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子容量的1/4,然后经110-112℃,30-35分钟高压灭菌,冷却后备用;
b分别取酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的一级菌种,在无菌条件下分别转种于液体三角烧瓶培养基中,经28-32℃,24-72h静置培养。其培养菌液为二级菌种;
c分别将酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的二级菌种,在无菌条件下转种于液体三角烧瓶培养基中,上摇床进行震荡培养,振幅100-120转/分钟,温度28-32℃时间24-72h,其培养液为三级菌种,根据需要继续逐级扩大培养;
d分别将重量百分比为酵母融合菌为25-40%、地衣芽孢杆菌15-30%、圆褐固氮菌15-30%、链霉菌15-30%、康氏木霉菌15-30%的三级菌种再扩大培养,五种液体菌可以同时转种在同一发酵罐中经28-32℃,18-24h通气搅拌发酵培养,其培养液为酵母融合菌混菌剂。
实施例6:一种酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法,将秸秆粉碎小于10mm,加入重量份为30-40的秸秆,重量份为40-50份的畜禽便,重量份为6-10的米糠,重量份为1.7-2.0的尿素和重量份为1.7-2.0的硫酸铵后混合,将混合的物料调含水量到50-65%,按混合物料的总重量加入2-5%的酵母融合菌混菌剂和0.008-0.010%的复合酶,经充分搅拌均匀,控制发酵料含水量50-65%用1%的石灰水调pH到6.2-7.8然后将混合料放在发酵床或发酵池或堆积水泥地板上,在料堆上盖塑料布防止水分蒸发和保温,经常温发酵,并时常观察料温和翻拌,经10-20d待腐熟后,经干燥粉碎后或粉状或造粒包装即得生物有机肥产品。
实施例7:见图1,所述的酵母融合菌混菌剂的制备方法
(1)试管液体菌的培养,取新鲜的豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml,加入(NH4)2SO4O.1g,CaCO30.1g,H3PO40.05ml,充分溶解后调节PH至6.2-7.2,分装于15*1.5cm的干燥试管中,经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,分别接种酵母融合菌F105、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌于试管液体培养基中,经28-32℃培养24-48小时,即为试管液体菌种(一级菌种)
(2)三角烧瓶液体菌中的培养
取新鲜的豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml,加入(NH4)2SO41g,CaCO31g,H3PO40.5ml,充分溶解后调节PH至6.2-7.2,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子总量的1/4,经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,将试管液体菌种接种在液体三角烧杯培养基中,经28-32℃培养24-48小时静置培养,即为液体三角烧杯菌种(二级菌种)
(3)液体扩大培养生产菌种
取新鲜的豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml,加入(NH4)2SO410g,CaCO310gH3PO45ml,充分溶解后调节PH至6.2-7.2,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子总量的1/4,经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,将二级菌种接种在液体三角烧杯培养基中,上摇床震荡培养,振幅为100-120r/min,经温度28-32℃培养18-24小时发酵培养,其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养,上发酵罐,所用新鲜豆腐废水不灭菌,将重量百分比为酵母融合菌为40%、地衣芽孢杆菌为15%,圆褐固氮菌为15%、链霉菌为15%、康氏木霉菌为15%五菌培养菌液接入发酵罐后,经28~32℃培养18~24小时,通气搅拌发酵培养,其发酵液即为酵母融合菌F105、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌、康氏木霉菌液体混合菌剂,活细胞数为0.5~1.5x109个/ml;
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例8:见图1,所述的酵母融合菌混菌剂的制备方法
(1)试管液体菌种的培养,取新鲜粉丝废水100ml,加入(NH4)2SO40.1g,CaCO30.1g,H3PO40.05ml,充分溶解后调节pH至6.2~7.2,分装于15x1.2cm的干燥试管中,经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,分别接种酵母融合菌T105、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌、康氏木霉菌于试管液体培养基中,经28~32℃培养24~48小时,即为试管液体菌种(一级菌种)。
(2)三角烧瓶液体菌种的培养
取新鲜粉丝废水1000ml,加入(NH4)2SO4lg,CaCO31g,H3PO40.5ml,充分溶解后调节PH至6.2~7.2,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子总量的1/4,然后经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中,经28~32℃培养24~48小时,静置培养即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)。
(3)液体扩大培养生产菌种:
取新鲜粉丝废水10000ml,加入(NH4)2SO4l0g,CaCO310g,H3PO45ml,充分溶解后调节PH至6.2~7.2,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子总量的1/4,然后经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中,上摇床振荡培养,振幅为100~120r/min,经温度28~32℃培养18~24小时发酵培养,其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养,上发酵罐,所用新鲜粉丝废水不灭菌,将重量百分比为酵母融合菌为25%、地衣芽孢杆菌为30%,圆褐固氮菌为15%、链霉菌为15%、康氏木霉菌为15%五菌培养液接入后,经28~32℃培养18~24小时,通气搅拌发酵培养,其成熟的发酵液即为酵母融合菌F105、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌、康氏木霉菌液体混合菌剂,活细胞数为0.5~1.5x109个/ml;
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例9:见图1,所述的酵母融合菌混菌剂的制备方法
(1)试管液体菌种的培养,取新鲜玉米淀粉废水,经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml,加入(NH4)2SO40.lg,CaCO30.1g,H3PO40.05ml,充分溶解后调节PH至6.2~7.2,分装于15x1.2cm的干燥试管中,经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,分别接种酵母融合菌F105、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌、康氏木霉菌于试管液体培养基中,经28~32℃培养24~48小时,即为试管液体菌种(一级菌种)。
(2)三角烧瓶液体菌种的培养
取新鲜玉米废水,经煮沸10分钟自然沉定取上清液1000ml,加入(NH4)2SO4lg,CaCO31g,H3PO40.5ml,充分溶解后调节PH至6.2~7.2,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子总量的1/4,然后经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中,经28~32℃培养18~24小时,静置培养即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)。
(3)液体扩大培养生产菌种
取新鲜玉米沉淀废水,经煮沸10分钟自然沉定取上清液10000ml,加入(NH4)2SO4l0g,CaCO310g,H3PO45ml,充分溶解后调节PH至6.2~7.2,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子总量的1/4,然后经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中,上摇床振荡培养,振幅为100~120r/min,经温度28~32℃培养18~24小时发酵培养,其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养,上发酵罐,所用新鲜玉米淀粉废水不灭菌,将重量百分比为酵母融合菌为35%、地衣芽孢杆菌为20%,圆褐固氮菌为15%、链霉菌为15%、康氏木霉菌为15%五菌培养液接入后,经28~32℃培养18~24小时,通气搅拌发酵培养,其成熟的发酵液即为F105酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌、康氏木霉菌液体混合菌剂,活细胞数为0.5~1.5x109个/ml;
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例10:见图1,所述的酵母融合菌混菌剂的制备方法
(1)试管液体菌种的培养,取新鲜洋芋淀粉废水,经煮沸10分钟自然沉定取上清液100ml,加入(NH4)2SO40.lg,CaCO30.1g,H3PO40.05ml,充分溶解后调节PH至6.2~7.2,分装于15x1.2cm的干燥试管中,经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,分别接种酵母融合菌F105、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌、康氏木霉菌于试管液体培养基中,经28~32℃培养24~48小时,即为试管液体菌种(一级菌种)。
(2)三角烧瓶液体菌种的培养:
取新鲜洋芋淀粉废水,经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml,加入(NH4)2SO4lg,CaCO31g,H3PO40.5ml,充分溶解后调节PH至6.2~7.2,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子总量的1/4,然后经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中,经28~32℃培养24~48小时,静置培养即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)。
(3)液体扩大培养生产菌种:
取新鲜洋芋淀粉废水,经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml,加入(NH4)2SO4l0g,CaCO310g,H3PO45ml,充分溶解后调节PH至6.2~7.2,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子总量的1/4,然后经112℃,30分钟高压灭菌,冷却至32℃,将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中,上摇床振荡培养,振幅为100~120r/min,经温度28~32℃培养18~24小时发酵培养,其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养,上发酵罐,所用新鲜洋芋淀粉废水不灭菌,将重量百分比为酵母融合菌为25%、地衣芽孢杆菌为15%,圆褐固氮菌为30%、链霉菌为15%、康氏木霉菌为15%五菌培养液接入后,经28~32℃培养18~24小时,通气搅拌发酵培养,其成熟的发酵液即为酵母融合菌F105、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌、康氏木霉菌液体混合菌剂,活细胞数为0.5~1.5x109个/ml;
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例11:见图2,酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥料的方法,酵母融合混菌剂发酵小麦秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法,包括以下步骤:首先取小麦秸秆粉碎小于10mm,在45kg的小麦秸秆中,加入43kg的牛粪,8kg米糠、2kg的尿素和2kg的硫酸铵后混合,将混合的物料调含水量到50-65%,按混合物料的重量加入2%酵母融合菌混菌剂和0.008%的复合酶,充分搅拌均匀,用1%的石灰水调PH到6.2,经好氧发酵13天,经检测腐熟后无臭味,经干燥粉碎后或粉状或造粒,分装,即得生物有机肥产品。
所述的混合菌剂由酵母融合菌30%、地衣芽孢杆菌为20%,圆褐固氮菌为20%、链霉菌为15%、康氏木霉菌为15%。
所述的纤维素酶30%,淀粉酶20%,脂肪酶20%、酸性蛋白酶30%组成。
其产品质量:
有机质(以干基汁)25%;水分30%;PH7.5有效活菌数0.6亿个/克。
实施例12:见图2,一种酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥及其方法,包括以下步骤:
20kg的黄豆秸秆或蚕豆秸秆或豌豆秸秆,30kg玉米秸秆中加入40kg猪粪便、10kg米糠、1.0kg的尿素和2.0kg的硫酸铵后混合,将混合的物料调含水量到50-65%,按混合物料的重量加入3%混菌剂和0.009%的复合酶,充分搅拌均匀,控制发酵料含水56%,用1%的石灰水调PH到6.6,经好氧发酵14天,经检测腐熟后无臭味,经干燥粉碎后或粉状或造粒,分装即得生物有机肥产品。
所述的混合菌剂由酵母融合菌30%、地衣芽孢杆菌为20%,圆褐固氮菌为20%、链霉菌为15%、康氏木霉菌为15%组成。
所述的复合酶由纤维素酶30%、淀粉酶25%、脂肪酶20%、酸性蛋白酶25%的酶组成。
其产品质量:有机质(以干基汁)26%;水分28%;PH7.2;有效活菌数0.8亿个/克。
实施例13:见图2,一种酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥及其方法,包括以下步骤:
在30kg的大麦秸秆、20kg的玉米秸秆中加入26kg的羊粪、20kg的鸡粪、9kg米糠、1.0kg的尿素和2.0kg的硫酸铵后混合,将混合的物料调含水量到60%,按混合物料的重量加入0.4%混菌剂和0.008%的复合酶,充分搅拌均匀,用1%的石灰水调PH到6.2,经好氧发酵15天,经检测腐熟后无臭味,经干燥粉碎后或粉状或造粒,分装,即得生物有机肥产品。
所述的混合菌剂由酵母融合菌20%、地衣芽孢杆菌为20%,圆褐固氮菌为20%、链霉菌为20%、康氏木霉菌为20%组成。
所述的复合酶由纤维素酶30%、淀粉酶25%、脂肪酶20%、酸性蛋白酶25%的酶组成。
其产品质量:有机质(以干基汁)32%;水分30%;PH6.8;有效活菌数0.5亿个/克。
实施例14:见图2,一种酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥及其方法,包括以下步骤:
在25kg的马铃薯藤秸秆或花生藤或甘薯藤或瓜类藤蔓,25kg玉米秸秆中加入26kg牛粪、20kg的马粪、8kg米糠、1.5kg的尿素和1.50kg的硫酸铵后混合,将混合的物料调含水量到50-65%,按混合物料的重量加入0.5%混菌剂和0.010%的复合酶,充分搅拌均匀,用1%的石灰水调PH到6.2,经好氧发酵14天,经检测腐熟后无臭味,经干燥粉碎后或粉状或造粒,分装,即得生物有机肥产品。
所述的混合菌剂由酵母融合菌30%、地衣芽孢杆菌为20%,圆褐固氮菌为20%、链霉菌为15%、康氏木霉菌为15%组成。
所述的复合酶由纤维素酶30%、淀粉酶25%、脂肪酶20%、酸性蛋白酶25%酶组成。
其产品质量:
有机质(以干基汁)30%;水分28%;PH6.6;有效活菌数0.7亿个/克。
实施例15:见图2,一种酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥及其方法,包括以下步骤:
在41kg的马铃薯藤秸秆或花生藤或甘薯藤或瓜类藤蔓,25kg玉米秸秆中加入10kg牛粪、10kg的兔粪、7kg米糠、1.7kg的尿素和1.7kg的硫酸铵后混合,将混合的物料调含水量到50-65%,按混合物料的重量加入2%混菌剂和0.090%的复合酶,充分搅拌均匀,用1%的石灰水调PH到6.2,经好氧发酵12天,经检测腐熟后无臭味,经干燥粉碎后或粉状或造粒,分装,即得生物有机肥产品。
所述的混合菌剂由酵母融合菌25%、地衣芽孢杆菌为20%,圆褐固氮菌为20%、链霉菌为20%、康氏木霉菌为15%组成。
所述的复合酶由纤维素酶25%、淀粉酶25%、脂肪酶25%、酸性蛋白酶25%酶组成。
其产品质量:
有机质(以干基汁)26%;水分25%;PH6.4;有效活菌数0.7亿个/克。
实施例16:见图2,一种酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥及其方法,包括以下步骤:
在40kg的玉米秸秆或蚕豆秸秆,25kg的玉米秸秆中加入10kg的牛粪、12kg鹌鹑粪或鸽子粪、8kg米糠、1.7kg的尿素和1.7kg的硫酸铵后混合,将混合的物料调含水量到60%,按混合物料的重量加入3%混菌剂和0.010%的复合酶,充分搅拌均匀,用1%的石灰水调PH到6.2,经好氧发酵15天,经检测腐熟后无臭味,经干燥粉碎后或粉状或造粒,分装,即得生物有机肥产品。
所述的混合菌剂由酵母融合菌30%、地衣芽孢杆菌为30%,圆褐固氮菌为15%、链霉菌为15%、康氏木霉菌为10%组成。
所述的复合酶由纤维素酶30%、淀粉酶25%、脂肪酶20%、酸性蛋白酶25%酶组成。
其产品质量:
有机质(以干基汁)28%;水分26%pH7.4;有效活菌数0.8亿个/克。
生物有机肥的效果
1、在施用含有大量有活性的酵母融合菌混菌剂和复合酶的生物有机肥的产品到农田中,即将大量有活性的微生物和活性酶带入土壤,同时也给土壤中的土著微生物提供了大量的养分和丰富的酶促基质,促进了土壤土著微生物的生长和繁殖,提高了土壤的活性。
2、生物有机肥中的微生物和酶在分解、转化、合成作物所需的养分,在提高作物品质方面具有特殊的、不可替代的作用。使用这种肥料能减少化学污染,减轻作物病虫害,抑制重金属、亚硝酸盐等有害物质,从而提高了作物的产量和品质。
3、提高了土壤的肥力
生物有机肥施入农田后,在丰富有机质和活性微生物及酶的作用下,有机养分不断分解转化为植物能吸收利用的有效养分,同时也将被土壤固定的一些养分释放出来。例如微生物能分解含磷化合物,使土壤固定的磷释放出来。微生物还能固定土壤中易流失的养分,如土壤游离氮可被圆褐固氮菌所固定供植物吸收利用。在甘肃靖远县某一无公害蔬菜生产示范基地的黄瓜和番茄茬口取样测定土壤微生物数量,结果表明,在施用化肥的土壤微生物数量最低,黄瓜地6.69x109个/g;番茄地4.5x109个/g;而施用本产品生物有机肥的土壤微生物活菌数量最高,黄瓜地15.9x109个/g;番茄地17.8x109个/g,而施用沤肥的土壤略高于施用化肥的土壤,黄瓜地7.5x109个/g;番茄地7.3817.8x109个/g,由此可见生物有机肥对增加土壤微生物活菌数量和改善土壤理化性状,提高土壤肥力有着重要作用。
4提高蔬菜的产量和品质:
本生物有机肥产品经在甘肃省榆中县某一无公害蔬菜生产示范基地的蔬菜种植上使用,其实验结果为大白菜增产58.9-62.3%,糖含量增加26%,VC含量增加3.6%;番茄增产36.2-43.1%,其中含糖量增加了8.6%;马铃薯增产28.6-41.3%,其中蛋白质含量增加了40.2%.同时也改善了土壤的生物活性,施用此产品土壤中有效微生物活菌数量为15.9x109-17.8x109个/克,比施用化肥和沤肥的土壤微生物数量多2.3-2.8倍,对增加土壤养分和改善土壤理化性状,对提高土壤肥力发挥了重要作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种酵母融合菌混菌剂,其特征在于该混菌剂包括菌体和培养基:其中所述的菌体包括酵母融合菌(FusantbetweenCandidatropicalisandSaccharmycescevisiae)F105,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路号院3号中国科学院微生物研究所,保藏时间为2014年12月30日,保藏编号为CGMCCNO.10263;地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)B-36购自中国农业微生物菌种保藏中心编号为Accc11080;圆褐固氮菌(Azotobacterchroococum)LGN-09保藏在在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路号院3号中国科学院微生物研究所,保藏时间为2010年4月26日,保藏编号为CGMCCNO.3768、链霉菌(Streptomyces)S-11购自中国农业微生物菌种保藏中心编号为ACCC40044和康氏木霉菌(T.reesi)T-2为市场销售菌;其中所述酵母融合菌的活菌数为总活菌数的25-40%,地衣芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30%,圆褐固氮菌的活菌数为总活菌数的15-30%,链霉菌的活菌数为总活菌数的15-30%。康氏木霉菌的活菌数为总活菌数的10-35%。
2.如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂,其特征在于还包括有混菌液体培养基及液体菌种的制备,在一升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g,碳酸钙1-2g,磷酸0.5-1ml,用1%石灰水调pH6.2-7.5,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子容量的1/4,然后经110-112℃,30-35分钟高压灭菌,冷却后分别取酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的琼脂斜面试管菌种在无菌条件下分别转种于液体三角烧瓶培养基中,经28-32℃,24-72h静置或上摇床振荡培养,或在发酵罐通气搅拌发酵培养,将其发酵菌液按其不同比例配制,即为酵母融合菌混菌剂。
3.如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂,其特征在于所述的酵母融合菌的制备有如下步骤:将酒精酵母菌作母种的斜面菌转种和培养,在液体振荡培养14小时后,用EDTA-巯基乙醇进行预处理,使用1%的纤维素酶和1%蜗牛酶进行酶解脱壁,时间为2小时,温度33℃,得到酒精酵母原生质体;将热带假丝酵母菌作母种的斜面菌转种和培养,在液体振荡培养14小时后,用EDTA-巯基乙醇进行预处理,使用1.5%的纤维素酶和0.5%蜗牛酶进行酶解脱壁,时间为2.5小时,温度33℃,得到热带假丝酵母原生质体;将热带假丝酵母原生质体经0.1%碘乙酸灭活,与酒精酵母原生质体以1:1混合,将沉淀悬于35%聚乙二醇的促溶剂中,30℃水浴静止处理,pH6.0,时间为40min,融合菌液经高渗磷酸缓冲液反复冲洗,涂布于高渗基础培养基和高渗完全培养基平板培养基上,经30℃、7天培养,平板生长出酵母融合菌。
4.如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂,其特征在于所述的圆褐固氮菌的制备有如下步骤:
(1)采样:圆褐固氮菌是从兰州市南北两区地区的暗灰钙土,淡灰钙土,红泥土和碱土的四种不同土壤类型和多个植物根区的0-10cm、10-20cm、20-30cm土壤深度的266份土样;
(2)分离培养:取10g新鲜土样加入盛有100ml无菌水的500ml三角烧瓶中,放摇床上振荡10min使土样均匀的分散在稀释液中成为土壤悬液,吸取1ml上清液加到9ml无菌水中,按10倍法依次稀释至10-4-10-6,各重复四次;在已灭菌的培养皿中倾注15-20ml阿须贝(Ashby)的固体琼脂培养基,待凝固后用移液枪吸取100ul土壤稀释液加到培养基表面,然后立即用涂布棒将稀释液涂抹均匀;用相同的方法将同一样本不同稀释度的稀释液从高稀释度到低稀释度依法涂抹;将接种稀释的培养皿倒置放在28-32℃恒温培养箱内培养2-3d后取出,挑取具有特征性的水溶性褐色色素,光滑凸起的圆褐固氮菌菌落,转种在阿须贝琼脂斜面试管培养基上,经28-32℃恒温培养2-3d,取出后即为圆褐固氮菌母钟,保存在4-8℃冰箱内备用。
(3)诱变:将母种再经紫外线(30s),亚硝基胍(NTG)诱变处理以及生化形态学鉴定,最后鉴定获得的菌种转种于阿须贝琼脂斜面试管培养基上,即得保藏菌种。
5.如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂的制备方法,其特征在于有如下步骤:
A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养:
a.酵母融合菌酵母膏琼脂斜面培养基的制备:
酵母膏0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白胨0.2-0.6%、琼脂粉1-3%、无菌水80-120ml,加热溶解后用1%的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5,经110-114℃,30-35分钟蒸汽灭菌,然后在无菌条件下分装于15*1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用:
b.地衣芽孢杆菌营养牛肉膏琼脂斜面培养基的制备:
蛋白胨含量重量百分比为0.25-1%,氯化钠的含量重量百分比为0.25-1%,牛肉膏的含量重量百分比为0.2-0.5%,琼脂粉的含量重量百分比为1-3%,其余为无菌水,该培养基的PH为6.5-7.5;
c.圆褐固氮菌阿须贝(Ashby)琼脂斜面培养基的制备:
甘露醇的含量重量百分比为0.8-1.2%,碳酸钙的含量重量百分比为0.2-0.8%,磷酸二氢钾的含量重量百分比为0.01-0.03%,硫酸镁(含七个结晶水)的含量重量百分比为0.01-0.03%,氯化钠的含量重量百分比为0.01-0.03%,硫酸钙(含两个结晶水)的含量重量百分比为0.005-0.015%,琼脂粉的含量重量百分比为1-3%,其余为无菌水,该培养基的PH为6.8-7.0;
d.链霉菌和康氏木霉菌马铃薯-蔗糖(PDA)琼脂斜面培养基的制备:
马铃薯的含量重量百分比为15-25%,蔗糖的含量重量百分比为1.5-2.5%,琼脂粉的含量重量百分比为1-3%,其余为无菌水该培养基的PH为5.5-6.5.
对以上酵母融合菌,地衣芽孢杆菌,圆褐固氮菌,链霉菌和康氏木霉菌五种菌,分别取母钟转种各自制备的固体试管斜面培养基上,经28-32℃,24-72h培养为一级菌种;
B液体培养基及液体菌种的制备
a液体培养基的制备:在一升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g,碳酸钙1-2g,磷酸0.5-1ml,用1%石灰水调PH6.2-7.5,分装于500ml三角烧瓶中,分装量为瓶子容量的1/4,然后经110-112℃,30-35分钟高压灭菌,冷却后备用;
b分别取酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的一级菌种,在无菌条件下分别转种于液体三角烧瓶培养基中,经28-32℃,24-72h静置培养。其培养菌液为二级菌种;
c分别将酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的二级菌种,在无菌条件下转种于液体三角烧瓶培养基中,上摇床进行震荡培养,振幅100-120转/分钟,温度28-32℃时间24-72h,其培养液为三级菌种,根据需要继续逐级扩大培养;
d分别将重量百分比为酵母融合菌为25-40%、地衣芽孢杆菌15-30%、圆褐固氮菌15-30%、链霉菌15-30%、康氏木霉菌15-30%的三级菌种再扩大培养,五种液体菌可以同时转种在同一发酵罐中经28-32℃,18-24h通气搅拌发酵培养,其培养液为酵母融合菌混菌剂。
6.一种酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法,其特征在于将秸秆粉碎小于10mm,加入重量份为30-40的秸秆,重量份为40-50份的畜禽便,重量份为6-10的米糠,重量份为1.7-2.0的尿素和重量份为1.7-2.0的硫酸铵后混合,将混合的物料调含水量到50-65%,按混合物料的总重量加入2-5%的酵母融合菌混菌剂和0.008-0.010%的复合酶,经充分搅拌均匀,控制发酵料含水量50-65%用1%的石灰水调PH到6.2-7.8然后将混合料放在发酵床或发酵池或堆积水泥地板上,在料堆上盖塑料布防止水分蒸发和保温,经常温发酵,并时常观察料温和翻拌,经10-20d待腐熟后,经干燥粉碎后或粉状或造粒包装即得生物有机肥产品。
7.如权利要求6所述的酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法,其特征在于所述的秸秆包括稻草、玉米秆、小麦秸、高粱秸、谷草秸、黄豆秸、大麦秸、蚕豆秸、豌豆秸、荞麦秸、花生藤、马铃薯藤、瓜类藤的任意一种或任意组合。
8.如权利要求6所述的酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法,其特征在于所述的畜禽便包括猪粪、牛粪、马粪、羊粪、兔粪、禽粪任意一种或任意组合,畜禽便含水量20-30%。
9.如权利要求6所述的酵母融合菌混菌剂发酵秸秆畜禽便生产生物有机肥的方法,其特征在于所述的复合酶包括淀粉酶25-35%,纤维素酶25-35%.脂肪酶20-30%,蛋白酶15-25%。
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