CN109293411A - 微生物腐熟剂的制备方法及其在降低畜禽粪便抗生素残留中的应用 - Google Patents

微生物腐熟剂的制备方法及其在降低畜禽粪便抗生素残留中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物腐熟剂的制备，特别是指一种微生物腐熟剂的制备方法及其在降低畜禽粪便抗生素残留中的应用。包括将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.16551接种于含有碳源、氮源和营养物质的培养基中发酵制成发酵液；发酵液制成地衣芽孢杆菌菌粉并将其添加到CN101905985A中制成的腐熟剂内制成混合物，然后向混合物中添加蛋白酶和纤维素酶混合均匀制得微生物腐熟剂。本发明解决了现有技术中地衣芽孢杆菌用于堆肥降低抗生素残留未见相关报道、工业化推广存在较大难度等问题。具有可有效降解畜禽粪便中的抗生素残留，菌种属于行业准则规定的免检菌种，微生物腐熟剂符合相关标准要求，工业推广价值较高等优点。

Description

微生物腐熟剂的制备方法及其在降低畜禽粪便抗生素残留中 的应用
技术领域
本发明属于微生物腐熟剂的制备，特别是指一种微生物腐熟剂的制备方法及其在降低畜禽粪便抗生素残留中的应用。
背景技术
禽畜粪便是规模化养殖的副产物，随着规模化养殖的不断发展，禽畜粪便污染已经成为三大环境污染源之一，将禽畜粪便经过高温堆肥制成高品质的有机肥，应用于种植业既解决了土壤有机质下降问题，修复了土壤生态环境，又解决了养殖业废弃物排放的污染问题。在禽畜粪便的无害化处理中，抗生素残留是限制其无害化处理的关键步骤之一。禽畜粪便中抗生素主要是禽畜饲料及大规模集约化养殖中普遍添加抗生素造成。抗生素进入畜禽体内后并不会被完全吸收，甚至有60％-90％经过消化道随着畜禽粪便排出体外，如果不进行无害化处理，其将随着肥料的使用进入土壤，进而被作物吸收，甚至还可以通过食物链的传导进而威胁到人类的饮食安全。
虽然国家推行绿色养殖，提倡减少抗生素的用量，但是想要推广养殖中零抗生素添加十分困难。使用抗生素已经成为养殖的必要手段，特别是人们常用的鸡粪、猪粪等有机肥，抗生素的含量也是骇人的。2015年中国科学院地球化学研究所公布的研究结果表明，2013年中国抗生素总使用量达到约16.2万吨，其中48％被用于人体医疗系统，另外高达52％的抗生素则直接被用于农业养殖。近日，国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会批准发布了《有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力霉素的含量测定(高效液相色谱法)》，上述标准于2017年3月1日实施，这是国内首次发布肥料中抗生素残留检测方法的国家标准，可见有机肥中抗生素残留越来越引起关注，解决禽畜粪便堆制有机肥中抗生素残留问题迫在眉睫。
研究表明抗生素分为生物降解和非生物降解，其中非生物降解过程主要包括光解和水解。由于受温度、水分、土层和水体深度等因素的影响，非生物降解所起作用较小。而生物降解由于容易操作效果好被越来越多的人采用。用于生物降解禽畜粪便抗生素的方法有堆肥、厌氧消化、高级氧化等方法，而堆肥法是禽畜粪便抗生素处理的主要方法。有研究表明温度是保证禽畜粪便抗生素降解率的主要条件之一。抗生素(尤其是四环素类抗生素)的降解主要发生在堆肥的高温阶段。通常提高堆肥温度的方法是从添加高温微生物菌株和调整堆肥工艺这两方面来提高物料温度和高温维持时间。目前用于好氧堆肥处置禽畜粪便抗生素残留的外源微生物主要有蜡样芽孢杆菌、假单胞菌、枯草芽孢杆菌等细菌和黑粉菌、粘性红圆酵母、白腐菌等真菌。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一。近年来，国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多。在医药、饲料加工、农药等行业取得了较好的研究成果。地衣芽孢杆菌制成活菌制剂用于种植业可以防治植物病害，用于养殖业可以维持动物肠道菌群平衡。另外，有些菌株还可以降解拟除虫菊酯类农药残留，用于环境污染的修复。在地衣芽孢杆菌用于堆肥中降低抗生素残留未见相关报道。
王学文公布了一种复合微生物菌粉的制备方法及其在脱除畜禽粪便中抗生素的应用，福建农林大学周顺桂等将几种嗜热微生物复合，用于快速消减有机固体废物中抗生素，王学文所用菌株黑曲霉和蜡样芽胞杆菌分别属于在农业部《微生物肥料生物安全通用技术准则》(NY/T 1109-2017)中规定中的第二级和第三级菌种，如果大面积推广需要作相关的毒理学和致病性试验。而周桂顺公布的专利文献中的微生物也均不在准则规定的免检之列。这势必影响上述专利技术的推广应用。大量多品种的菌株复合是否会产生相应的副作用不得而知。另外，上述文献虽公布了对抗生素的降解效果，但均未提供相应检测方法，其降解效果的科学性及准确性有待商榷。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种微生物腐熟剂的制备方法及其在降低畜禽粪便抗生素残留中的应用。
本发明的整体技术构思是：
微生物腐熟剂的制备方法，该方法包括如下工艺步骤：
A、将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.16551接种于含有碳源、氮源和营养物质的培养基中发酵制成发酵液；
B、将步骤A中制备的发酵液制成地衣芽孢杆菌菌粉；
C、将步骤B中制成的地衣芽孢杆菌粉添加到CN101905985A中制成的腐熟剂内制成混合物，然后向混合物中添加蛋白酶和纤维素酶混合均匀，制得微生物腐熟剂。
微生物腐熟剂在降低畜禽粪便抗生素残留中的应用。
本发明中的培养基的灭菌按照常规方法进行。因其属于现有技术，申请人对此不再赘述。
本发明中的地衣芽孢杆菌申请人已于2018年9月29日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.16551，该保藏机构位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该保藏机构的简称为CGMCC。
本发明中的地衣芽孢杆菌CGMCC No.16551是申请人2017年自禽畜粪便和食用菌菌糠物料堆肥的堆体分离得到，其合适生长温度为45℃左右，能耐受80℃的高温，其培养特征及理化特性如下：
革兰氏阳性，菌落粗糙，湿润，边缘较整齐，呈灰黄色，芽孢中生，椭圆，在葡萄糖培养基上产酸、产气，V.P反应阳性，接触酶阳性，在7％氯化钠中生长，G+C含量为43％-47％。菌体大小为0.6μm-0.8μm×1.5μm-3μm。
本发明的具体技术构思还有：
将发酵液制成菌粉的优选的技术方案是，所述的步骤B是向步骤A中制备的发酵液内加入质量百分含量为3.0％-4.0％的磷酸二氢钠作为保护剂，在50-100转/分钟转速条件下搅拌1-1.5小时；再加入质量百分含量为3.0％-4.0％的氯化钙，在50-100转/分钟转速条件下搅拌1-1.5小时，絮凝菌体，添加载体轻质碳酸钙后经喷雾干燥制成菌粉。经申请人采用稀释涂平板法检测，所得菌粉含菌量可达3×1010cfu/g以上。
所述的步骤C中蛋白酶的添加量为400U/g-600U/g，纤维素酶的添加量为50U/g-150U/g。所制备的微生物腐熟剂成品含菌量≥5×108cfu/g，其中地衣芽孢杆菌≥2×108cfu/g；水分≤25％；细度≥80％；pH＝7.0-7.5。该微生物腐熟剂的各项指标均高于GB20287-2006指标的要求。
所述的步骤A中的地衣芽孢杆菌的发酵包括如下步骤：
将地衣芽孢杆菌经过扩大培养后，将地衣芽孢杆菌种子接种于发酵培养基进行通气发酵。
为便于实现工业化生产，取得更好的发酵结果，优选的技术方案是，所述步骤A中的地衣芽孢杆菌的扩大培养及通气发酵包括如下工艺步骤：
Ⅰ、由试管斜面菌种制备克氏瓶斜面种子
将试管斜面菌种接种到克氏瓶斜面种子培养基中制备克氏瓶种子，其中试管斜面菌种的培养条件为：试管斜面种子培养基选用肉汤培养基，在温度40℃-45℃的条件下恒温培养36-48小时制成试管斜面菌种；克氏瓶斜面种子的培养条件为：按每瓶60-80ml的量将克氏瓶斜面种子培养基装入250ml克氏瓶中，在温度40℃-45℃的条件下恒温培养36-48小时制成克氏瓶斜面种子；
Ⅱ、将克氏瓶斜面种子接种到发酵培养基中发酵
取步骤Ⅰ中制得克氏瓶斜面种子2-3个，每瓶加无菌水50-100ml制成菌悬液，采用火环或压差法将菌悬液接种到发酵罐内灭菌后的发酵培养基中进行发酵；
发酵过程的工艺条件为：发酵温度40℃-45℃，通风量为：0-4小时0.3vvm-0.5vvm，4-8小时0.7vvm-0.9vvm，8-20小时1.0vvm-1.2vvm，20小时后0.8vvm-1.0vvm，发酵过程中搅拌转速为150-250转/分钟；发酵至当不低于95％的营养体形成芽孢时即可终止发酵。
所述的步骤Ⅰ中的克氏瓶斜面种子培养基由如下单位质量份的组分组成：
葡萄糖0.3-1；蛋白胨0.5-1；磷酸氢二钾0.5-1；硫酸铵0.1-0.5；酵母膏0.3-0.5；硫酸镁0.1-0.5；琼脂15-22；水1000；pH＝7.2。
所述的步骤Ⅱ中的发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
淀粉0.3％-1.0％；豆饼粉0.03％-0.1％；碳酸钙0.1％-0.2％；蔗糖0.1％-0.5％；硫酸铵0.05％-0.15％；磷酸氢二钾0.1％-0.5％；硫酸镁0.08％-0.3％；酵母膏0.03％-0.15％；氢氧化钾0.01％-0.05％；消泡剂0.005％-0.02％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4。
本发明中的微生物腐熟剂在应用时的具体步骤如下：
a、将禽畜粪便和纤维类物质按照C/N比＝25-35:1的比例混合，按物料总重的0.5％-1.5％添加硫酸铵，调pH值到中性，调节水分至45％-55％；其中禽畜粪便选用新鲜牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪中的一种或两种以上的混合物；纤维类物质选用花生秧、玉米秸秆、棉花秸秆中的一种或两种以上的混合物；
b、将步骤a中混合好的物料投入发酵槽，堆成料堆；
c、按0.4％-0.6％的比例向步骤b制成的料堆中加入微生物腐熟剂，混合均匀后开始发酵，当料堆温度达到80℃维持3天后开始第一次翻堆，温度再次达到80℃，维持2-3天开始第二次翻堆，温度下降到40℃结束发酵。
为检测本发明中微生物腐熟剂对于畜禽粪便中抗生素的降解效果以及其他技术效果，申请人进行了如下试验：
1、试验物料
禽畜粪便：新鲜牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪中的一种或两种以上的混合物。
纤维类物质：花生秧、玉米秸秆、棉花秸秆中的一种或两种以上的混合物。
2、原料配比试验设计
试验分两组，对照组使用为CN101905985A制得的腐熟剂，试验组使用本发明中的微生物腐熟剂，其余步骤相同。
首先将禽畜粪便和纤维类物质按照C/N比＝25-35的比例调整物料添加量，按物料总重的0.5％-1.5％添加硫酸铵，调pH值到中性，调节水分至45％-55％。
3、投料
将混合好的物料投入发酵槽，发酵槽高1.5m，料高100cm-120cm，发酵池长48m，轨道式翻堆机翻料。物料混匀后五点取样法取样，测定初始抗生素含量。物料的初始pH、水分、C/N、水溶性有机碳和种子发芽指数(GI)。
4、发酵控制
按0.4％-0.6％的比例分别加入两种腐熟剂，将物料混合均匀，开始发酵，温度达到80℃以上维持3天后开始第一次翻堆，温度再次达到80℃，维持2-3天第二次翻堆，温度下降到40℃左右时，结束发酵，取样测定。
5、指标测定
发酵结束测定腐熟指标。分别在两次翻堆后及发酵结束测定抗生素含量计算降解率。腐熟指标测定pH、水分、C/N、水溶性有机碳和种子发芽指数(GI)。
水分含量按GB/T8576-2010测定；按照农业部标准NY525-2012方法测定pH和有机质。由有机质换算出纯C的量，粗蛋白换算出纯N的量，计算其C/N比值；种子发芽指数(GI)参照国标GBT23486－2009附录A执行。水溶性有机碳(WSOC)按1:5料水比浸提后，利用岛津TOC仪测定。抗生素测定方法按GBT32951-2016测定。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
本申请创造性地采用了耐高温地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCCNo.16551作为生产菌种制备菌粉，通过优化发酵培养基以及发酵条件，进而复配CN101905985A中制成的腐熟剂并添加适量的酶制剂制成的微生物腐熟剂，通过堆积发酵后堆体腐熟的各项技术指标效果好，有效降解畜禽粪便中的抗生素残留，生产菌种属于行业准则规定的免检菌种，所生产的微生物腐熟剂符合相关的标准要求，具有较高的工业推广价值和广阔的市场前景。经申请人按照GBT32951-2016记载的方法进行检测，本申请中制备的微生物腐熟剂对于土霉素、金霉素、四环素、强力霉素的降解率均取得了不低于90％的较好效果，相比CN101905985A中制成的腐熟剂对于抗生素的降解效果有明显提升。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求限定的内容为准。任何依据说明书对本发明进行的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
A、将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.16551接种于含有碳源、氮源和营养物质的培养基中发酵制成发酵液；
B、将步骤A中制备的发酵液制成地衣芽孢杆菌菌粉；
C、将步骤B中制成的地衣芽孢杆菌粉添加到CN101905985A中制成的腐熟剂内制成混合物，然后向混合物中添加蛋白酶和纤维素酶混合均匀，制得微生物腐熟剂。
本实施例中的培养基的灭菌按照常规方法进行。因其属于现有技术，申请人对此不再赘述。
微生物腐熟剂在降低畜禽粪便抗生素残留中的应用。
将发酵液制成菌粉的技术方案是，所述的步骤B是向步骤A中制备的发酵液内加入质量百分含量为3.0％-4.0％的磷酸二氢钠作为保护剂，在50-100转/分钟转速条件下搅拌1-1.5小时；再加入质量百分含量为3.0％-4.0％的氯化钙，在50-100转/分钟转速条件下搅拌1-1.5小时，絮凝菌体，添加载体轻质碳酸钙后经喷雾干燥制成菌粉。经申请人检测，所得菌粉含菌量可达3×1010cfu/g以上。
所述的步骤C中蛋白酶的添加量为400U/g-600U/g，纤维素酶的添加量为50U/g-150U/g。所制备的微生物腐熟剂成品含菌量≥5×108cfu/g，其中地衣芽孢杆菌≥2×108cfu/g；水分≤25％；细度≥80％；pH＝7.0-7.5。该微生物腐熟剂的各项指标均高于GB20287-2006指标的要求。
所述的步骤A中的地衣芽孢杆菌的发酵包括如下步骤：
将地衣芽孢杆菌经过扩大培养后，将地衣芽孢杆菌种子接种于发酵培养基进行通气发酵。
所述步骤A中的地衣芽孢杆菌的扩大培养及通气发酵包括如下工艺步骤：
Ⅰ、由试管斜面菌种制备克氏瓶斜面种子
将试管斜面菌种接种到克氏瓶斜面种子培养基中制备克氏瓶种子，其中试管斜面菌种的培养条件为：试管斜面种子培养基选用肉汤培养基，在温度40℃的条件下恒温培养36小时制成试管斜面菌种；克氏瓶斜面种子的培养条件为：按每瓶60ml的量将克氏瓶斜面种子培养基装入250ml克氏瓶中，在温度40℃的条件下恒温培养36小时制成克氏瓶斜面种子；
Ⅱ、将克氏瓶斜面种子接种到发酵培养基中发酵
取步骤Ⅰ中制得克氏瓶斜面种子2个，每瓶加无菌水50ml制成菌悬液，采用火环或压差法将菌悬液接种到发酵罐内灭菌后的发酵培养基中进行发酵；
发酵过程的工艺条件为：发酵温度40℃，通风量为：0-4小时0.3vvm，4-8小时0.7vvm，8-20小时1.0vvm，20小时后0.8vvm，发酵过程中搅拌转速为150转/分钟；发酵至当不低于95％的营养体形成芽孢时即可终止发酵。
所述的步骤Ⅰ中的克氏瓶斜面种子培养基由如下单位质量份的组分组成：
葡萄糖0.3；蛋白胨0.5；磷酸氢二钾0.5；硫酸铵0.1；酵母膏0.3；硫酸镁0.1；琼脂15；水1000；pH＝7.2。
所述的步骤Ⅱ中的发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
淀粉0.3％；豆饼粉0.03％；碳酸钙0.1％；蔗糖0.1％；硫酸铵0.05％；磷酸氢二钾0.1％；硫酸镁0.08％；酵母膏0.03％；氢氧化钾0.01％；消泡剂0.005％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4。
本实施例中的微生物腐熟剂在应用时包括如下步骤：
a、将禽畜粪便和纤维类物质按照C/N比＝25-35:1的比例混合，按物料总重的0.5％-1.5％添加硫酸铵，调pH值到中性，调节水分至45％-55％；其中禽畜粪便选用新鲜牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪中的一种或两种以上的混合物；纤维类物质选用花生秧、玉米秸秆、棉花秸秆中的一种或两种以上的混合物；
b、将步骤a中混合好的物料投入发酵槽，堆成料堆；发酵槽高1.5m，发酵槽长48m，料高100cm-120cm，轨道式翻堆机翻料。
c、按0.4％-0.6％的比例向步骤b制成的料堆中加入微生物腐熟剂，混合均匀后开始发酵，当料堆温度达到80℃维持3天后开始第一次翻堆，温度再次达到80℃，维持2-3天开始第二次翻堆，温度下降到40℃结束发酵。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
所述步骤A中的地衣芽孢杆菌的扩大培养及通气发酵包括如下工艺步骤：
Ⅰ、由试管斜面菌种制备克氏瓶斜面种子
将试管斜面菌种接种到克氏瓶斜面种子培养基中制备克氏瓶种子，其中试管斜面菌种的培养条件为：试管斜面种子培养基选用肉汤培养基，在温度45℃的条件下恒温培养48小时制成试管斜面菌种；克氏瓶斜面种子的培养条件为：按每瓶80ml的量将克氏瓶斜面种子培养基装入250ml克氏瓶中，在温度45℃的条件下恒温培养48小时制成克氏瓶斜面种子；
Ⅱ、将克氏瓶斜面种子接种到发酵培养基中发酵
取步骤Ⅰ中制得克氏瓶斜面种子3个，每瓶加无菌水100ml制成菌悬液，采用火环或压差法将菌悬液接种到发酵罐内灭菌后的发酵培养基中进行发酵。
所述的步骤Ⅰ中的克氏瓶斜面种子培养基由如下单位质量份的组分组成：
葡萄糖1；蛋白胨1；磷酸氢二钾1；硫酸铵0.5；酵母膏0.5；硫酸镁0.5；琼脂22；水1000；pH＝7.2。
所述的步骤Ⅱ中的发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
淀粉1.0％；豆饼粉0.1％；碳酸钙0.2％；蔗糖0.5％；硫酸铵0.15％；磷酸氢二钾0.5％；硫酸镁0.3％；酵母膏0.15％；氢氧化钾0.05％；消泡剂0.02％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4。
其余内容与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
所述步骤A中的地衣芽孢杆菌的扩大培养及通气发酵包括如下工艺步骤：
Ⅰ、由试管斜面菌种制备克氏瓶斜面种子
将试管斜面菌种接种到克氏瓶斜面种子培养基中制备克氏瓶种子，其中试管斜面菌种的培养条件为：试管斜面种子培养基选用肉汤培养基，在温度42℃的条件下恒温培养42小时制成试管斜面菌种；克氏瓶斜面种子的培养条件为：按每瓶70ml的量将克氏瓶斜面种子培养基装入250ml克氏瓶中，在温度42℃的条件下恒温培养42小时制成克氏瓶斜面种子；
Ⅱ、将克氏瓶斜面种子接种到发酵培养基中发酵
取步骤Ⅰ中制得克氏瓶斜面种子2个，每瓶加无菌水75ml制成菌悬液，采用火环或压差法将菌悬液接种到发酵罐内灭菌后的发酵培养基中进行发酵。
所述的步骤Ⅰ中的克氏瓶斜面种子培养基由如下单位质量份的组分组成：
葡萄糖0.6；蛋白胨0.7；磷酸氢二钾0.7；硫酸铵0.3；酵母膏0.4；硫酸镁0.3；琼脂18；水1000；pH＝7.2。
所述的步骤Ⅱ中的发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
淀粉0.6％；豆饼粉0.06％；碳酸钙0.15％；蔗糖0.3％；硫酸铵0.1％；磷酸氢二钾0.3％；硫酸镁0.2％；酵母膏0.09％；氢氧化钾0.03％；消泡剂0.01％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4。
其余内容与实施例1相同。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
所述步骤A中的地衣芽孢杆菌的扩大培养及通气发酵包括如下工艺步骤：
Ⅰ、由试管斜面菌种制备克氏瓶斜面种子
将试管斜面菌种接种到克氏瓶斜面种子培养基中制备克氏瓶种子，其中试管斜面菌种的培养条件为：试管斜面种子培养基选用肉汤培养基，在温度44℃的条件下恒温培养46小时制成试管斜面菌种；克氏瓶斜面种子的培养条件为：按每瓶65ml的量将克氏瓶斜面种子培养基装入250ml克氏瓶中，在温度44℃的条件下恒温培养46小时制成克氏瓶斜面种子；
Ⅱ、将克氏瓶斜面种子接种到发酵培养基中发酵
取步骤Ⅰ中制得克氏瓶斜面种子3个，每瓶加无菌水60ml制成菌悬液，采用火环或压差法将菌悬液接种到发酵罐内灭菌后的发酵培养基中进行发酵。
所述的步骤Ⅰ中的克氏瓶斜面种子培养基由如下单位质量份的组分组成：
葡萄糖0.4；蛋白胨0.9；磷酸氢二钾0.9；硫酸铵0.2；酵母膏0.35；硫酸镁0.2；琼脂16；水1000；pH＝7.2。
所述的步骤Ⅱ中的发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
淀粉0.5％；豆饼粉0.04％；碳酸钙0.1；蔗糖0.2％；硫酸铵0.08％；磷酸氢二钾0.2％；硫酸镁0.1％；酵母膏0.08％；氢氧化钾0.02％；消泡剂0.008％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4。
其余内容与实施例1相同。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
所述步骤A中的地衣芽孢杆菌的扩大培养及通气发酵包括如下工艺步骤：
Ⅰ、由试管斜面菌种制备克氏瓶斜面种子
将试管斜面菌种接种到克氏瓶斜面种子培养基中制备克氏瓶种子，其中试管斜面菌种的培养条件为：试管斜面种子培养基选用肉汤培养基，在温度45℃的条件下恒温培养36小时制成试管斜面菌种；克氏瓶斜面种子的培养条件为：按每瓶75ml的量将克氏瓶斜面种子培养基装入250ml克氏瓶中，在温度45℃的条件下恒温培养36小时制成克氏瓶斜面种子；
Ⅱ、将克氏瓶斜面种子接种到发酵培养基中发酵
取步骤Ⅰ中制得克氏瓶斜面种子2个，每瓶加无菌水90ml制成菌悬液，采用火环或压差法将菌悬液接种到发酵罐内灭菌后的发酵培养基中进行发酵。
所述的步骤Ⅰ中的克氏瓶斜面种子培养基由如下单位质量份的组分组成：
葡萄糖0.9；蛋白胨0.9；磷酸氢二钾0.9；硫酸铵0.4；酵母膏0.3-0.5；硫酸镁0.4；琼脂20；水1000；pH＝7.2。
所述的步骤Ⅱ中的发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
淀粉0.9％；豆饼粉0.09％；碳酸钙0.18％；蔗糖0.4％；硫酸铵0.12％；磷酸氢二钾0.4％；硫酸镁0.25％；酵母膏0.125％；氢氧化钾0.04％；消泡剂0.015％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4。
其余内容与实施例1相同。
申请人按照前述的方法对于实施例1-5所制备的微生物腐熟剂的腐熟指标以及抗生素降解效果进行了检测，检测结果如表1、表2。
表1堆体腐熟指标变化
表2发酵过程物料中抗生素残留降解率对比表

Claims (9)

1.微生物腐熟剂的制备方法，其特征在于该方法包括如下工艺步骤：
A、将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.16551接种于含有碳源、氮源和营养物质的培养基中发酵制成发酵液；
B、将步骤A中制备的发酵液制成地衣芽孢杆菌菌粉；
C、将步骤B中制成的地衣芽孢杆菌粉添加到CN101905985A中制成的腐熟剂内制成混合物，然后向混合物中添加蛋白酶和纤维素酶混合均匀，制得微生物腐熟剂。
2.根据权利要求1所述的微生物腐熟剂的制备方法，其特征在于所述的步骤B是向步骤A中制备的发酵液内加入质量百分含量为3.0％-4.0％的磷酸二氢钠作为保护剂，在50-100转/分钟转速条件下搅拌1-1.5小时；再加入质量百分含量为3.0％-4.0％的氯化钙，在50-100转/分钟转速条件下搅拌1-1.5小时，絮凝菌体，添加载体轻质碳酸钙后经喷雾干燥制成菌粉。
3.根据权利要求1或2所述的微生物腐熟剂的制备方法，其特征在于所述的步骤C中蛋白酶的添加量为400U/g-600U/g，纤维素酶的添加量为50U/g-150U/g。
4.根据权利要求1所述的微生物腐熟剂的制备方法，其特征在于所述的步骤A中的地衣芽孢杆菌的发酵包括如下步骤：
将地衣芽孢杆菌经过扩大培养后，将地衣芽孢杆菌种子接种于发酵培养基进行通气发酵。
5.根据权利要求1或4所述的微生物腐熟剂的制备方法，其特征在于所述步骤A中的地衣芽孢杆菌的扩大培养及通气发酵包括如下工艺步骤：
Ⅰ、由试管斜面菌种制备克氏瓶斜面种子
将试管斜面菌种接种到克氏瓶斜面种子培养基中制备克氏瓶种子，其中试管斜面菌种的培养条件为：试管斜面种子培养基选用肉汤培养基，在温度40℃-45℃的条件下恒温培养36-48小时制成试管斜面菌种；克氏瓶斜面种子的培养条件为：按每瓶60-80ml的量将克氏瓶斜面种子培养基装入250ml克氏瓶中，在温度40℃-45℃的条件下恒温培养36-48小时制成克氏瓶斜面种子；
Ⅱ、将克氏瓶斜面种子接种到发酵培养基中发酵
取步骤Ⅰ中制得克氏瓶斜面种子2-3个，每瓶加无菌水50-100ml制成菌悬液，采用火环或压差法将菌悬液接种到发酵罐内灭菌后的发酵培养基中进行发酵；
发酵过程的工艺条件为：发酵温度40℃-45℃，通风量为：0-4小时0.3vvm-0.5vvm，4-8小时0.7vvm-0.9vvm，8-20小时1.0vvm-1.2vvm，20小时后0.8vvm-1.0vvm，发酵过程中搅拌转速为150-250转/分钟；发酵至当不低于95％的营养体形成芽孢时即可终止发酵。
6.根据权利要求5所述的微生物腐熟剂的制备方法，其特征在于所述的步骤Ⅰ中的克氏瓶斜面种子培养基由如下单位质量份的组分组成：
葡萄糖0.3-1；蛋白胨0.5-1；磷酸氢二钾0.5-1；硫酸铵0.1-0.5；酵母膏0.3-0.5；硫酸镁0.1-0.5；琼脂15-22；水1000；pH＝7.2。
7.根据权利要求5所述的微生物腐熟剂的制备方法，其特征在于所述的步骤Ⅱ中的发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
淀粉0.3％-1.0％；豆饼粉0.03％-0.1％；碳酸钙0.1％-0.2％；蔗糖0.1％-0.5％；硫酸铵0.05％-0.15％；磷酸氢二钾0.1％-0.5％；硫酸镁0.08％-0.3％；酵母膏0.03％-0.15％；氢氧化钾0.01％-0.05％；消泡剂0.005％-0.02％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4。
8.根据权利要求1-7所述的微生物腐熟剂在降低畜禽粪便抗生素残留中的应用。
9.根据权利要求8所述的微生物腐熟剂在降低畜禽粪便抗生素残留中的应用，其特征在于包括如下工艺步骤：
a、将禽畜粪便和纤维类物质按照C/N比＝25-35：1的比例混合，按物料总重的0.5％-1.5％添加硫酸铵，调pH值到中性，调节水分至45％-55％；其中禽畜粪便选用新鲜牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪中的一种或两种以上的混合物；纤维类物质选用花生秧、玉米秸秆、棉花秸秆中的一种或两种以上的混合物；
b、将步骤a中混合好的物料投入发酵槽，堆成料堆；
c、按0.4％-0.6％的比例向步骤b制成的料堆中加入微生物腐熟剂，混合均匀后开始发酵，当料堆温度达到80℃维持3天后开始第一次翻堆，温度再次达到80℃，维持2-3天开始第二次翻堆，温度下降到40℃结束发酵。
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