CN111069276A - 蚯蚓肠道内容物强化土壤中四环素类抗生素消减的方法 - Google Patents
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Abstract
蚯蚓肠道内容物强化土壤中四环素类抗生素消减的方法，首先选取具有明显环带并且活力较强的新鲜蚯蚓，对其体表清洗后，投放至人工配制的四环素类污染土壤中，保持避光和常温培养14天后，取出蚯蚓，再次进行体表清洗，放在培养皿中清肠，解剖获取新鲜蚯蚓肠道内容物；采集实际环境中不同类型四环素污染土壤，去除土壤中的草根、树叶、石头等杂质，再对土壤进行破碎筛分；然后向土壤中添加蚯蚓肠道内容物，进行人工培养30‑60天后完成修复。蚯蚓肠道内容物中含有大量四环素类抗生素降解菌群，接种蚯蚓肠道内生细菌既有利于土壤中四环素类抗生素的深度消减，同时蚯蚓肠道内生细菌外排定殖在土壤中也有利于修复后土著微生物生态功能多样性的快速恢复。
Description
技术领域
本发明属于抗生素污染土壤生物修复技术领域，尤其涉及蚯蚓肠道内容物强化土壤中四环素类抗生素消减去除的方法。
背景技术
抗生素是微生物在生长繁殖过程中产生的具有抵抗病原体、抑制或杀灭其他微生物的一类天然的次级代谢产物，对细菌感染具有非常好的治疗效果，其中，四环素作为广谱性抗生素，能够对革兰氏阳性菌、阴性菌及螺旋体、立克次体、衣原体、支原体及原虫等均产生有效抑制，因此被大量的应用到人类疾病的预防、畜禽养殖及水产养殖等领域。但是这些抗生素过量使用并不能完全被人体或动物代谢吸收，而是通过粪便的方式排出体外，这就导致作为承载粪便的土壤中残留了大量的抗生素母体化合物及次级代谢产物；同时，制药工厂、畜禽养殖厂、医疗废弃物处置废水等不合理排放，也会直接增加土壤中抗生素的污染。因此，土壤往往会成为自然界中抗生素贮存的重要介质。一方面，土壤中抗生素的残留会对土著的生物（植物、动物、微生物）产生直接的毒害作用，如作物产量降低、动物生理代谢异常、土著细菌失活等；另一方面抗生素的存在也会极大的扰动土壤中土著微生物群落的多样性与稳定性，给土壤生态系统的可持续发展及环境安全带来了较为严重的威胁。因此开展针对土壤中抗生素消减去除的研究具有重要的意义。
蚯蚓是陆地生态系统中生物量最大的无脊椎动物，可以直接接触和吞食土壤中残留的污染物，对土壤中的污染物较为敏感；并且蚯蚓因其分布范围广、繁殖周期短、体型较大等特点有利于开展土壤污染研究和监测工作，因此蚯蚓被视为土壤环境污染的指示生物。此外，蚯蚓肠道是接近于厌氧状态的微环境，肠道内容物中每克干重需氧菌和厌氧菌的数量大约是土壤中的12~40倍和10~4 000倍。由于特殊的生境体系，蚯蚓肠道内容物中的细菌群落具有富集碳、氮和磷元素的能力，其含量约为土壤的2~5倍，这使得蚯蚓肠道内容物中的菌群在促进土壤中有机污染物降解的过程中发挥了重要作用。然而目前对于蚯蚓肠道内容物菌群消减土壤中抗生素的研究相对较少，因此开展蚯蚓肠道内容物强化土壤中四环素类抗生素消减去除的方法十分必要。
目前，针对四环素消减的研究，很多是通过外加复合材料的方式。其中，申请号：201910364433.8提供了Ag掺杂纳米金属氧化物复合材料及其在光催化降解四环素中的应用技术，该技术首先要通过高温合成银掺杂纳米金属氧化物复合材料，然后将复合材料添加于含有四环素的溶液中，通过模拟太阳光进行光催化降解。但是该技术过程主要针对水体中四环四的降解，对于抗生素污染现象普遍的土壤中，难以在广泛区域内实施，应用前景不明确。申请号：201910277266.3提供了一种高效降解四环素的磷酸银/金属氧化物复合光催化的制备方法，该技术通过结合磷酸银和金属氧化物提高了表面对污染物的吸附性，然后通过光催化剂模拟太阳光实现对四环素的降解。但是该技术仅局限于水溶液中的四环素，并未说明对土壤中四环素的降解是否有相同的效果；同时已有较多的研究发现土壤中纳米金属会对土壤动物造成毒害作用，因此该技术可能会引起二次污染的潜在风险。
通过专利检索，并未发现有关蚯蚓肠道内容物强化土壤中四环素类抗生素消减去除的方法，与本发明最接近的现有技术是通过添加合成菌剂降解土壤中的四环素。申请号：201710115130.3提供了一种降解土壤中抗生素的混合菌剂及其制备方法，主要是通过筛选、分离、驯化出降解抗生素的菌株，然后将降解菌株如枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按照一定的比例制成混合液，以达到降解土壤中残留的多种抗生素的目的。已有较多的研究发现，芽孢杆菌属、葡萄球菌属、反硝化菌、磷酸盐还原菌、三价铁还原菌等均具有降解抗生素的能力，但是该菌剂只混合了两种降解菌，忽视了菌群的作用效果。而且，自然环境因素对菌群的影响很大。因此，不能保证该菌剂的广谱性使用。申请号：201810464767.8提供了一种降解土壤中抗生素的纳米肥料及其制备方法，该纳米肥料主要由磁性纳米四氧化三铁、介孔二氧化硅、根瘤菌、硝化细菌、节杆菌、裂解转糖基酶S1t、碳酶和植物胶制成，具有降解多种抗生素的特点。该方法人工制备工艺复杂，抗生素降解混合菌剂制备周期较长，生物制剂成本较高，且现实环境中有较多的具有降解抗生素能力的不可培养细菌，但是该纳米肥料只能添加可培养菌，做不到可培养和不可培养细菌的兼顾。此外，人工强化的功能菌群，在降解土壤中抗生素过程中产生的代谢产物可能存在二次生物污染的风险。
现有技术存在的主要缺陷是：缺乏同步消减去除土壤中多种四环素类抗生素的生物修复技术、现有的修复技术多是针对水体中抗生素的降解去除、常规复配的降解细菌组合难以高效深度降解去除土壤中抗生素、消减去除效果不高、修复效果容易失活，修复技术工艺繁琐、且存在二次生物污染的风险等，因而现有技术市场运用前景并不明朗。
缺陷产生的主要原因有：（1）近年来，出现了大批受到畜禽养殖厂、生活垃圾填埋场、医疗废弃物处理厂等在产企业、或企业关闭搬迁导致的高浓度四环素类抗生素污染土壤，而前期科技人员对此类抗生素污染土壤修复技术的关注和研发相对较少，大多关注的是受到抗生素污染水体环境修复技术的研发；（2）向土壤中添加外源抗生素降解菌的传统生物修复技术，依然会受到土著菌群优势生态位的影响，接种外源降解菌始终难以占据污染土壤的主导生态位，导致土壤中抗生素消减去除效率不高，修复效果容易失活；（3）接种降解菌修复技术，从菌株筛选到菌剂发酵、生产、放大工艺流程复杂，周期较长；（4）人为强化的抗生素降解菌群会给自然环境中土著微生物群落带来显著的多样性和稳定性扰动，其二次生物污染风险较高，且难以评估长期负面的生态影响。因此，研发工艺简便、消减效率高、生态安全的蚯蚓肠道内容物强化土壤中四环素类抗生素消减的修复技术，对于当下我国大量受到四环素类抗生素污染的土壤生物修复治理，具有重要的社会价值和科学意义。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种蚯蚓肠道内容物强化土壤中四环素类抗生素消减的方法，该方法可以强化土壤中四环素类抗生素的快速消减去除；兼顾可培养和不可培养的抗生素降解菌，维护并促进污染土壤中土著细菌群落的多样性和稳定性；同时该技术具备操作简单、成本低廉、无二次生物污染等优点。
技术方案：蚯蚓肠道内容物在强化土壤中四环素类抗生素消减中的应用。
上述应用的具体步骤为：首先选取具有明显环带并且活力较强的新鲜蚯蚓，对其体表清洗并排粪完全后，投放至10-100 mg/kg的四环素类污染土壤中，保持避光和常温培养14天后，取出蚯蚓，再次进行体表清洗，放在培养皿中清肠，解剖获取新鲜蚯蚓肠道内容物；采集实际环境中四环素污染土壤，去除土壤中的杂质，再对土壤进行破碎筛分；然后向土壤中添加蚯蚓肠道内容物，进行人工培养30-60天后完成修复。
优选的，首先选取具有明显环带，体重在3-5g的新鲜威廉环毛蚓，用中性PBS缓冲液清洗蚯蚓体表后备用。
优选的，在四环素类污染土壤培养蚯蚓之前，取蚯蚓，用中性PBS缓冲液清洗蚯蚓体表2-3遍，放在无菌培养皿中清肠6h；并插入冰浴暂存，静置10min，促使蚯蚓排粪完全。
优选的，在培养14天后，清肠的蚯蚓用25%无水乙醇将蚯蚓浸泡2min，观察蚯蚓在无水乙醇中的生理状态，当蚯蚓停止扭动身躯并逐渐静止，但仍能观察到蚯蚓心脏轻微跳动时，取出蚯蚓，用滤纸擦去蚯蚓体表无水乙醇，之后放置在冰上敞口的培养皿中2min，使蚯蚓体表的无水乙醇充分挥发。
优选的，向新鲜蚯蚓肠道内容物中加入1mL的PBS缓冲液，再采用涡旋仪将内容物混合均匀，涡旋仪的转速为1500rpm，涡旋时间为10s。
优选的，解剖获取新鲜蚯蚓肠道内容物的时间控制在5min之内。
优选的，按照土壤与蚯蚓肠道内容物的质量比500:1-1000:1进行混合。
优选的，接种蚯蚓肠道内容物进入四环素污染土壤后，培养30-60天，完成整体修复过程。
本发明的工作原理是：1、活力强劲的成熟威廉腔环毛蚓，具有较强的土壤环境适应能力，体内群落体系多样性丰富；2. 将威廉腔环毛蚓投加至10-100 mg/kg的人工配制四环素类抗生素污染土壤，该污染浓度不会对蚯蚓产生急性毒性，且可以迅速强化蚯蚓肠道中内生菌群的定向演变，促进具有四环素类降解菌的主动筛选和进化，促进四环素类抗生素降解菌成为蚯蚓肠道中内生细菌群落的优势菌群；3. 解剖提取获得完成蚯蚓肠道内容物，不仅含有人工可分离培养的四环素降解菌，同时也含有大量非可直接培养的四环素降解菌，并且肠道内容物是由大量脂类、蛋白、有机质等组成的混合体系，也有助于蚯蚓肠道内生细菌在土壤颗粒微域环境中的长期定殖和稳定存在，促进肠道内容物中四环素降解菌长久发挥作用；4. 肠道内容物中含有大量碳氮磷硫等土著菌群必须的养分元素，有利于土著菌群和肠道内生菌的良性繁殖与协同促进土壤中四环素的消减去除。
有益效果： 本发明针对土壤中四环素类抗生素的污染，提供了一种蚯蚓肠道内容物强化消减去除的方法。其具有的主要优点是：1、修复材料蚯蚓肠道内容物资源获取便利，成本低廉，修复技术工艺操作简便，利于推广。2、该方法同时兼顾了可培养与非可培养四环素降解菌的应用，较大程度的促进土壤中四环素类抗生素的强化消减。3、有助于土壤中多种不同四环素类抗生素的深度消减。4.由于蚯蚓肠道内容物本身源于自然，是蚯蚓在土壤环境中，自身肠道作用下产生的代谢物料，因而没有二次生物污染的风险。5. 该方法对于当前我国大批受到畜禽养殖厂、生活垃圾填埋场、医疗废弃物处理厂等在产企业、或企业关闭搬迁导致的高浓度四环素类抗生素污染土壤修复治理，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为蚯蚓解剖后肠道内容物展示图；
图2为威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中盐酸四环素消减图；
图3为威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中盐土霉素消减图；
图4为威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中四环素类总量抗生素消减图。
具体实施方式
以下具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中盐酸四环素消减的方法
选取具有明显环带、活力较强的新鲜威廉腔环毛蚓蚯蚓，每条体重在3-5 g之间，清洗体表后，备用。称取相应重量的盐酸四环素分析纯标准品，溶解于纯水中，添加至相应清洁土壤，将盐酸四环素溶液与土壤颗粒均匀混合后，制备成浓度为10 mg/kg盐酸四环素污染土壤。将上述清洗完毕的100条威廉腔环毛蚓，投加至100 kg的10 mg/kg盐酸四环素类污染土壤中，保持避光和常温培养14天后，取出蚯蚓，再次用中性PBS缓冲液清洗蚯蚓体表2-3遍，放在无菌培养皿中清肠6h；并插入冰浴暂存，静置10min，促使蚯蚓排粪完全。随后用25wt.%无水乙醇将蚯蚓浸泡2min，观察蚯蚓在无水乙醇中的生理状态，当蚯蚓停止扭动身躯并逐渐静止，但仍能观察到蚯蚓心脏轻微跳动时，取出蚯蚓，用滤纸擦去蚯蚓体表无水乙醇，之后放置在冰上敞口的培养皿中2min，使蚯蚓体表的无水乙醇充分挥发。解剖蚯蚓的位置从雄孔下方开始，直到肛门位置结束，沿着中间偏左或者偏右的位置进行解剖，解剖时腹部朝上。解剖完蚯蚓，采用不锈钢小刀沿蚯蚓口部至肛门方向进行刮剥获取肠道内容物，并转移至离心管中，插入冰浴暂存，为保证蚯蚓肠道内容物的新鲜，时间控制在10s之内。向暂存蚯蚓内容物的离心管中加入1mL的PBS缓冲液，再采用涡旋仪将内容物混合均匀，涡旋仪的转速为1500rpm，涡旋时间为10s。从麻醉蚯蚓开始，到获取肠道内容物结束，时间控制在5min之内。
盐酸四环素污染土壤，采集自南京浦口横梁奶牛场，牛粪堆积池塘周边，土壤理化性质：pH值6.9，有机质含量48.4 g kg-1，全氮3.7 g kg-1，有效态氮86.1 mg kg-1，全磷1.7g kg-1，有效磷82.2 mg kg-1。土壤机械组成为含有11.2wt.%沙粒，68.5 wt.%壤粒，20.3wt.%黏粒。土壤中盐酸四环素污染浓度为69.5 ± 3.4 mg kg-1。采用5点采样法获取盐酸四环素污染土壤，并去除土壤中的草根、树叶、石头等杂质，再对土壤进行破碎筛分，得到粒径不超过2 mm的土粒100 kg；然后土壤与蚯蚓内容物质量比1000:1，进行蚯蚓肠道内容物的均匀添加，保持周围温度25℃，维持土壤的含水率在25-30%，培养30天后，土壤中盐酸四环素残留浓度是3.3 ± 0.8 mg kg-1，消减去除率为95.3±3.6%（图2）；与此同时，参考对比试验，未添加蚯蚓肠道内容物的处理，同步平行培养30天后，土壤中盐酸四环素残留浓度是38.2 ± 3.7 mg kg-1，消减去除率仅为45.1±2.2%（图2）；此外还发现，在添加了蚯蚓肠道内容物的处理下，30天后，土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数、Shannon-Weaver指数和Simpson指数在修复后达到5.2±0.4，3.8±0.6和4.3±0.3，均较原始污染土壤的对应指数（3.5±0.4、2.2±0.2和3.2±0.4）显著升高（p<0.05），说明添加蚯蚓肠道内容物后，土壤土著菌群环境微生物生态多样性和稳定性得到了显著的恢复和改善，证明该技术是一种生态环境友好，消减去除效率高效的修复方法。
实施例2 威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中土霉素消减的方法
选取具有明显环带、活力较强的新鲜威廉腔环毛蚓蚯蚓，每条体重在3-5 g之间，清洗体表后，备用。称取相应重量的土霉素分析纯标准品，溶解于纯水中，添加至相应清洁土壤，将土霉素溶液与土壤颗粒均匀混合后，制备成浓度为10 mg/kg土霉素污染土壤。将上述清洗完毕的100条威廉腔环毛蚓，投加至100 kg的10 mg/kg土霉素污染土壤中，保持避光和常温培养14天后，取出蚯蚓，再次用中性PBS缓冲液清洗蚯蚓体表2-3遍，放在无菌培养皿中清肠6h；并插入冰浴暂存，静置10min，促使蚯蚓排粪完全。随后用25%无水乙醇将蚯蚓浸泡2min，观察蚯蚓在无水乙醇中的生理状态，当蚯蚓停止扭动身躯并逐渐静止，但仍能观察到蚯蚓心脏轻微跳动时，取出蚯蚓，用滤纸擦去蚯蚓体表无水乙醇，之后放置在冰上敞口的培养皿中2min，使蚯蚓体表的无水乙醇充分挥发。解剖蚯蚓的位置从雄孔下方开始，直到肛门位置结束，沿着中间偏左或者偏右的位置进行解剖，解剖时腹部朝上。解剖完蚯蚓，采用不锈钢小刀沿蚯蚓口部至肛门方向进行刮剥获取肠道内容物，并转移至离心管中，插入冰浴暂存，为保证蚯蚓肠道内容物的新鲜，时间控制在10s之内。向暂存蚯蚓内容物的离心管中加入1mL的PBS缓冲液，再采用涡旋仪将内容物混合均匀，涡旋仪的转速为1500rpm，涡旋时间为10s。从麻醉蚯蚓开始，到获取肠道内容物结束，时间控制在5min之内。
土霉素污染土壤，采集自南京天井洼垃圾填埋场表层覆土，土壤理化性质：pH值6.1，有机质含量32.1 g kg-1，全氮2.4 g kg-1，有效态氮55.3 mg kg-1，全磷1.3 g kg-1，有效磷55.1 mg kg-1。土壤机械组成为含有14.7wt.%沙粒，69.2 wt.%壤粒，16.1 wt.%黏粒。土壤中土霉素污染浓度为125.2 ± 8.6 mg kg-1。采用5点采样法获取土霉素污染土壤，并去除土壤中的草根、树叶、石头等杂质，再对土壤进行破碎筛分，得到粒径不超过2 mm的土粒100 kg；然后土壤与蚯蚓内容物质量比800:1，进行蚯蚓肠道内容物的均匀添加，保持周围温度25℃，维持土壤的含水率在25-30%，培养45天后，土壤中土霉素残留浓度是6.9 ± 1.2mg kg-1，消减去除率为94.5±4.3%（图3）；与此同时，参考对比试验，未添加蚯蚓肠道内容物的处理，同步平行培养45天后，土壤中土霉素残留浓度是72.7 ± 2.9 mg kg-1，消减去除率仅为41.9±2.6%（图3）；此外还发现，在添加了蚯蚓肠道内容物的处理下，45天后，土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数、Shannon-Weaver指数和Simpson指数在修复后达到4.8±0.3，3.2±0.2和3.8±0.2，均较原始污染土壤的对应指数（2.7±0.2、2.1±0.1和2.6±0.3）显著升高（p<0.05），说明添加蚯蚓肠道内容物后，土壤土著菌群环境微生物生态多样性和稳定性得到了显著的恢复和改善，证明该技术是一种生态环境友好，消减去除效率高效的修复方法。
实施例3 威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中盐酸四环素、土霉素、金霉素同步于消减的方法
选取具有明显环带、活力较强的新鲜威廉腔环毛蚓蚯蚓，每条体重在3-5 g之间，清洗体表后，备用。称取相应重量的盐酸四环素、土霉素、金霉素分析纯混合标准品，溶解于纯水中，添加至相应清洁土壤，将上述三类标准溶液与土壤颗粒均匀混合后，制备成浓度为10mg/kg盐酸四环素+10 mg/kg土霉素+10 mg/kg金霉素的复合抗生素污染土壤。将上述清洗完毕的100条威廉腔环毛蚓，投加至100 kg的上述四环素类复合污染土壤中，保持避光和常温培养14天后，取出蚯蚓，再次用中性PBS缓冲液清洗蚯蚓体表2-3遍，放在无菌培养皿中清肠6h；并插入冰浴暂存，静置10min，促使蚯蚓排粪完全。随后用25%无水乙醇将蚯蚓浸泡2min，观察蚯蚓在无水乙醇中的生理状态，当蚯蚓停止扭动身躯并逐渐静止，但仍能观察到蚯蚓心脏轻微跳动时，取出蚯蚓，用滤纸擦去蚯蚓体表无水乙醇，之后放置在冰上敞口的培养皿中2min，使蚯蚓体表的无水乙醇充分挥发。解剖蚯蚓的位置从雄孔下方开始，直到肛门位置结束，沿着中间偏左或者偏右的位置进行解剖，解剖时腹部朝上。解剖完蚯蚓，采用不锈钢小刀沿蚯蚓口部至肛门方向进行刮剥获取肠道内容物，并转移至离心管中，插入冰浴暂存，为保证蚯蚓肠道内容物的新鲜，时间控制在10s之内。向暂存蚯蚓内容物的离心管中加入1mL的PBS缓冲液，再采用涡旋仪将内容物混合均匀，涡旋仪的转速为1500rpm，涡旋时间为10s。从麻醉蚯蚓开始，到获取肠道内容物结束，时间控制在5min之内。
盐酸四环素、土霉素、金霉素复合污染土壤，采集自南京横溪某有机肥发酵厂，土壤理化性质：pH值6.4，有机质含量55.7 g kg-1，全氮4.9 g kg-1，有效态氮112.2 mg kg-1，全磷2.3 g kg-1，有效磷93.4 mg kg-1。土壤机械组成为含有9.7 wt.%沙粒，71.2 wt.%壤粒，19.1 wt.%黏粒。土壤中盐酸四环素污染浓度为50.3 ± 5.2 mg kg-1，土霉素污染浓度为78.2 ± 5.1 mg kg-1，金霉素84.8 ± 4.2 mg kg-1，土壤总四环素类抗生素浓度是213.3 ± 14.5 mg kg-1。采用5点采样法获取四环素类复合抗生素污染土壤，并去除土壤中的草根、树叶、石头等杂质，再对土壤进行破碎筛分，得到粒径不超过2 mm的土粒100 kg；然后土壤与蚯蚓内容物质量比500:1，进行蚯蚓肠道内容物的均匀添加，保持周围温度25℃，维持土壤的含水率在25-30%，培养60天后，土壤中盐酸四环素残留浓度是1.4 ± 0.5 mgkg-1，消减去除率为97.2±1.7%；土霉素残留浓度是4.2 ± 0.6 mg kg-1，消减去除率为94.6±4.8%；金霉素残留浓度是5.1 ± 0.4 mg kg-1，消减去除率为93.9±4.2%，土壤中总量四环素类抗生素残留浓度为10.7 ± 1.5 mg kg-1，消减去除率为94.9±3.5%（图4）；与此同时，参考对比试验，未添加蚯蚓肠道内容物的处理，同步平行培养60天后，土壤中总量四环素类抗生素残留浓度为142.2 ± 7.2 mg kg-1，消减去除率仅为33.3±4.6%（图4）；此外还发现，在添加了蚯蚓肠道内容物的处理下，60天后，土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数、Shannon-Weaver指数和Simpson指数在修复后达到5.5±0.3，4.4±0.3和3.9±0.2，均较原始污染土壤的对应指数（3.8±0.2、2.6±0.3和2.7±0.3）显著升高（p<0.05），说明添加蚯蚓肠道内容物后，土壤土著菌群环境微生物生态多样性和稳定性得到了显著的恢复和改善，证明该技术是一种生态环境友好，消减去除效率高效的修复方法。
Claims (9)
1.蚯蚓肠道内容物在强化土壤中四环素类抗生素消减中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于首先选取具有明显环带并且活力较强的新鲜蚯蚓，对其体表清洗并排粪完全后，投放至10-100 mg/kg的四环素类污染土壤中，保持避光和常温培养14天后，取出蚯蚓，再次进行体表清洗，放在培养皿中清肠，解剖获取新鲜蚯蚓肠道内容物；采集实际环境中四环素污染土壤，去除土壤中的杂质，再对土壤进行破碎筛分；然后向土壤中添加蚯蚓肠道内容物，进行人工培养30-60天后完成修复。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于首先选取具有明显环带，体重在3-5g的新鲜威廉环毛蚓，用中性PBS缓冲液清洗蚯蚓体表后备用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于在四环素类污染土壤培养蚯蚓之前，取蚯蚓，用中性PBS缓冲液清洗蚯蚓体表2-3遍，放在无菌培养皿中清肠6h；并插入冰浴暂存，静置10min，促使蚯蚓排粪完全。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于在培养14天后，清肠的蚯蚓用25%无水乙醇将蚯蚓浸泡2min，观察蚯蚓在无水乙醇中的生理状态，当蚯蚓停止扭动身躯并逐渐静止，但仍能观察到蚯蚓心脏轻微跳动时，取出蚯蚓，用滤纸擦去蚯蚓体表无水乙醇，之后放置在冰上敞口的培养皿中2min，使蚯蚓体表的无水乙醇充分挥发。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于向新鲜蚯蚓肠道内容物中加入1mL的PBS缓冲液，再采用涡旋仪将内容物混合均匀，涡旋仪的转速为1500rpm，涡旋时间为10s。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于解剖获取新鲜蚯蚓肠道内容物的时间控制在5min之内。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于按照土壤与蚯蚓肠道内容物的质量比500:1-1000:1进行混合。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于接种蚯蚓肠道内容物进入四环素污染土壤后，培养30-60天，完成整体修复过程。
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| CN111069276B (zh) | 2021-12-07 |
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