CN110616170A - 磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂及制备方法与应用 - Google Patents

磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂及制备方法与应用。本发明通过将磺胺类抗生素降解菌液、能量供给菌菌液、磁介质菌菌液、表面活性剂和发酵培养基混合，得到混合液；发酵，得到磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂。其中，磺胺类抗生素降解菌经能量供给菌伴生、耦合发酵可显著提高菌种降解效能，提高降解菌株在原位土壤环境中的定殖、增殖能力；表面活性剂和磁介质菌可帮助消解制剂施入土壤后化解水分张力和抗生素极性，增强磺胺类抗生素残留跟降解菌的亲和力，加快磺胺类抗生素残留的降解；磺胺类抗生素降解菌群能产生漆酶，对磺胺类抗生素降解有氧化底物广泛、能耗低、效率高、环境友好等优越性能。

Description

磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂及制备方法与 应用
技术领域
本发明属于环境保护中土壤有机污染物治理领域，特别涉及一种磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂及制备方法与应用。
背景技术
磺胺类抗生素是一类应用比较早的一类人工合成的抗菌药物，均具有对氨基苯磺酰胺结构，是对氨基苯甲酸的竞争性抑制因子，可以使四氢叶酸的合成代谢受影响，抑制了细菌的生长繁殖过程。磺胺类抗生素有广泛的抗菌谱，性能稳定，使用方便，高效，价格便宜，且便于长期储存，是几大类抗生素中较广泛应用于人类医药及兽药的物质。主要有磺胺类抗生素磺胺嘧啶(SD)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺甲恶唑(SMX)、磺胺噻唑(STZ)和磺胺二甲嘧啶(SMZ)等。磺胺类抗生素以人畜的排泄物为载体，通过各种途径进入到土壤中，引起土壤中各种磺胺类抗生素含量的变化。由于磺胺类抗生素多为弱酸弱碱性化合物，与土壤表现出较好的亲和力，极易在土壤中残留，已成为我国乃至全球所面临的新的重大环境问题。
磺胺类抗生素在土中的降解可分为微生物降解、光解和水解以及氧化还原降解，这些反应一般同时进行。磺胺类在土中间隙水中的非生物降解研究结果表明，土壤表面和水中磺胺类抗生素均可发生光解。但磺胺类抗生素比其他种类抗生素在土中的降解速率要慢。灭菌后的磺胺间甲氧嘧啶在避光情况下，半衰期为109.8d，未灭菌避光情况下较避光灭菌条件缩短了35.7％。说明，磺胺类抗生素的生物降解速率大于光解速率。因此，微生物降解抗生素是被世界公认的最具潜力的绿色手段，具有广阔的应用潜力。但目前，关于磺胺类抗生素的降解主要集中在光解和水解以及氧化还原降解，微生物降解鲜见报道。磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂的制备更是空白。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂。
本发明的又一目的在于提供所述磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂在磺胺类抗生素污染土壤修复中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂的制备方法，包括如下步骤：将磺胺类抗生素降解菌液、能量供给菌菌液、磁介质菌菌液、表面活性剂、发酵培养基和水混合，得到混合液；发酵，得到磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂。
所述的磺胺类抗生素降解菌优选为枯草芽胞杆菌枯草亚种(Bacillus subtilissubsp.subtilis)CICC 23830、假单胞菌(Pseudomonas sp.)JR-3(保藏编号为CGMCCNo.13023，于2016年9月21日保藏位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)、豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)-HA-J1、气单胞菌属(Aeromonas sp.)CICC 23565、赤红球菌(Rhodococcus ruber)CICC 23622、马红球菌(Rhodoccocus equi)ATCC 13557、微嗜酸寡氧单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)-BX3、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)CICC 2625、疣孢漆斑菌(Albifimbria verrucaria)CGMCC 3.1954和芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)-ZB-1中的一种或至少两种；优选为至少五种。
所述的能量供给菌优选为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ACCC04257、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)CICC 20079、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC 19183、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)SCTCC 100664和停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)CGMCC1.844中的一种或至少两种；
所述的磁介质菌优选为氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)-YN-3、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CICC 23919、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillumgryphiswaldense)-MSR-1和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)CICC 10828中的一种或至少两种。
所述的发酵培养基的组成如下：糖蜜粉20～25g/L、质量百分比45％的氨基酸粉3～7g/L、骨粉1～3g/L、蛋白胨1～3g/L、麦麸1～3g/L、马铃薯浸出汁2～4g/L、甜玉米汁1～3g/L、葡萄糖1～3g/L、磷酸氢二钾1～3g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、磷酸氢二铵0.4～0.6g/L、七水硫酸亚铁1～3g/L、七水硫酸镁0.1～0.5g/L、一水硫酸锰0.05～0.15g/L、磁铁矿粉0.05～0.15g/L、Fe3O4磁性纳米颗粒0.5～1.5g/L、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子1～3g/L，水为溶剂，pH自然；优选如下：糖蜜粉22g/L、质量百分比45％的氨基酸原粉5g/L、骨粉2g/L、蛋白胨2g/L、麦麸2g/L、马铃薯浸出汁3g/L、甜玉米汁2g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二铵0.5g/L、七水硫酸亚铁2g/L、七水硫酸镁0.3g/L、一水硫酸锰0.1g/L、磁铁矿粉(磁性物含量≥95％；-325目粒度含量≥85％、水份<8％)0.1g/L、Fe3O4磁性纳米颗粒1g/L、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子2g/L，水为溶剂，pH自然。
所述的混合物的组成按质量百分比计，如下：菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的磺胺类抗生素降解菌菌液5～16％、菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的能量供给菌菌液2～8％、菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的磁介质菌菌液1～5％、表面活性剂1～6％、发酵培养基5～16％、水余量；优选如下：菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的磺胺类抗生素降解菌菌液8～16％、菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的能量供给菌菌液2～8％、菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的磁介质菌菌液1～5％、表面活性剂1～6％、发酵培养基5～16％、水余量。
更优选的，所述的磺胺类抗生素降解菌菌液的菌体浓度为1.2×1012cfu/mL。
所述的能量供给菌菌液的菌体浓度为1×1012cfu/mL。
所述的磁介质菌菌液的菌体浓度为1×1012cfu/mL。
所述的表面活性剂优选为脂肪酸甲酯磺酸钠(MES)、十二烷基苯磺酸与2-氨基乙醇的1:1型化合物(C20H37NO4S，CAS:268-36-07-7)、十二烷基硫酸钠(C12H25NaO4S)和吐温20中的一种或至少两种。
所述的表面活性剂为两种以上形成的混合物时，各组分质量份数相同。
所述的磺胺类抗生素降解菌菌液优选通过包含如下步骤的方法得到：
①将所述的磺胺类抗生素降解菌通过振荡培养，培养至对数增长期；
②再于30～40℃，120～150r/min条件下继续培养4～6天；
或是通过包含如下步骤的方法得到：
A、将所述的磺胺类抗生素降解菌通过振荡培养，培养至对数增长期；
B、然后通过含磺胺类抗生素的培养基进行驯化培养；
C、驯化得到的菌培养至对数增长期；
D、再于30～40℃，120～150r/min条件下继续培养4～6天。
所述的磺胺类抗生素降解菌为混合菌时，是将磺胺类抗生素降解菌中的各个菌分别通过振荡培养，培养至对数增长期，如步骤①、步骤A、步骤C；有驯化步骤时，是将各个菌分别进行驯化，如步骤B；然后按等体积比混合再继续培养，如步骤②、步骤D。
步骤①和步骤A中所述的培养的条件优选为于28～30℃，130～150r/min条件下培养48～72h。
步骤①和步骤A中所述的培养中的培养基为LB液体培养基或YPD液体培养基。LB液体培养基适合于细菌的培养，YPD液体培养基适合于酵母的培养。
步骤B中所述含磺胺类抗生素的培养基的组成如下：磺胺类抗生素410～460mg/L、土150～200g/L，水余量；更优选组成如下：磺胺类抗生素413～460mg/L、土167g/L，水余量。
所述的磺胺类抗生素包括磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑。
所述的驯化培养的条件优选为于28～30℃，130～150r/min条件下培养6～10天。
所述的驯化培养的次数为3～8次；优选为5～6次。
步骤C中所述的培养的条件优选为于28～32℃，110～130r/min条件下培养60～72h；更优选为于28～32℃，120r/min条件下培养60～72h。
步骤②和步骤D中所述的继续培养的条件优选为于32～37℃，130～150r/min条件下继续培养4～6天；更优选为于32～36℃，140～150r/min条件下继续培养5～6天。
所述的能量供给菌菌液优选通过如下方法得到：用CM 0002改良培养基将能量供给菌培养至对数增长期，再于28～30℃，130～150r/min条件下培养4～5天，得到能量供给菌菌液；CM 0002改良培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、乳糖10g/L、pH 7.0～7.5；更优选为通过如下方法得到：用CM 0002改良培养基将能量供给菌培养至对数增长期，再于28～30℃，150r/min条件下培养5天，得到能量供给菌菌液。
所述的能量供给菌为混合菌液时，是将各个菌分别培养至对数增长期，然后按等体积比混合，再于28～30℃，130～150r/min条件下培养4～5天；更优选为再于28～30℃，150r/min条件下培养5天。
所述的将能量供给菌培养至对数增长期中的培养条件为：于28～30℃，130～150r/min条件下震荡培养48～72h；更优选为：于28～29℃，140r/min条件下震荡培养68～72h。
所述的磁介质菌菌液优选通过如下方法得到：用CM 0002改良培养基将磁介质菌培养至对数增长期，再于28～30℃，130～150r/min条件下培养4～5天，得到磁介质菌菌液；CM 0002改良培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、乳糖10g/L、pH 7.0～7.5；更优选通过如下方法得到：用CM 0002改良培养基将磁介质菌培养至对数增长期，再于28～30℃，150r/min条件下培养4～5天。
所述的磁介质菌为混合菌液时，是将各个菌分别培养至对数增长期，然后按等体积比混合，再于28～30℃，130～150r/min条件下培养4～5天。
所述的将磁介质菌培养至对数增长期中的培养条件为：于28～30℃，130～150r/min条件下震荡培养48～72h；更优选为于28～29℃，140r/min条件下震荡培养60～72h。
所述的发酵的条件优选为于32～38℃，100～120r/min下，每隔4h强制通无菌空气30min，通气量是发酵罐容积的0.5～2倍/分钟，连续发酵5～8天。
所述的发酵培养基在加入菌之前需先灭菌，灭菌的条件优选为于115～121℃灭菌15～30min；更优选为于121℃灭菌20～30min。
一种磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂，通过上述制备方法得到。
所述磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂在环境修复中的应用，特别适用于磺胺类抗生素污染土壤修复中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明为磺胺类抗生素污染土壤的原位消解提供了一种高效复合微生物消解制剂，较单一降解菌株对土壤环境具有更强的缓冲性能，降解效能更强，作用时间更持久。
(2)本发明的磺胺类抗生素降解菌经能量供给菌伴生、耦合发酵可显著提高菌种降解效能，提高降解菌株在原位土壤环境中的定殖、增殖能力。
(3)本发明的表面活性剂和磁介质菌可帮助消解制剂施入土壤后化解水分张力和抗生素极性，增强磺胺类抗生素残留跟降解菌的亲和力，加快磺胺类抗生素残留的降解。
(4)本发明的磺胺类抗生素降解菌群能产生漆酶，对磺胺类抗生素降解有氧化底物广泛、能耗低、效率高、环境友好等优越性能。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明保护范围并不限于所述内容。
所用菌株可由四川省微生物资源平台菌种保藏中心(SICC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)获得；其中，ATCC菌株可由美国模式菌种中心获得，或通过北纳生物获得。
Fe3O4磁性纳米颗粒、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子由西安瑞禧生物科技有限公司提供。
LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。
发酵初始培养基配方：糖蜜粉22g/L、质量百分比45％的氨基酸原粉5g/L、骨粉(粗制骨粉粉碎)2g/L、蛋白胨2g/L、麦麸2g/L、马铃薯浸出汁3g/L、甜玉米汁2g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二铵0.5g/L、七水硫酸亚铁2g/L、七水硫酸镁0.3g/L、一水硫酸锰0.1g/L、磁铁矿粉(磁性物含量≥95％；-325目粒度含量≥85％、水份<8％)0.1g/L、Fe3O4磁性纳米颗粒1g/L、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子2g/L，水为溶剂，pH自然。
马铃薯浸出汁：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁待用。
甜玉米汁：将甜玉米直接压榨得到的汁液。
液体CM 0002改良培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、乳糖10g/L、pH 7.0～7.5。
实施例1
(1)磺胺类抗生素降解菌群的制备
分别将枯草芽胞杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)CICC23830、假单胞菌(Pseudomonas sp)JR-3、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)-HA-J1(已在文献“贺艳艳.红树林沉积物中磺胺间甲氧嘧啶(SMMX)降解菌的筛选及其降解性能研究.《广东海洋大学》，2015”中公开)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)CICC 23565、赤红球菌(Rhodococcus ruber)CICC 23622、马红球菌(Rhodococcus equi)ATCC 13557、微嗜酸寡氧单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)-BX3(已在文献“张清明.氟磺胺草醚降解菌BX3的分离、鉴定与降解特性研究.华北农学报，2013(3)”公开)、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)CICC 2625、疣孢漆斑菌(Albifimbria verrucaria)CGMCC 3.1954、芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)-ZB-1(已在文献“B Liang,P Lu,H Li,,et al.Biodegradation offomesafen by strain Lysinibacillus sp.ZB-1isolated from soil.[J].Chemosphere,2009,77(11):1614-1619.”中公开)中单个降解菌经LB液体培养基培养至对数期(培养在29℃，150r/min震荡条件下进行)，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。将各单一降解菌种子原液按照等体积比混合均匀置于摇床37℃，130r/min液体发酵4天制备形成磺胺类抗生素降解菌群，有效活菌菌体总浓度约为1.2×1012cfu/mL。
(2)能量供给菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ACCC04257、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)CICC 20079、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC 19183、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)SCTCC 100664、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)CGMCC1.844分别以同样的接种量加入同样体积的液体CM 0002改良培养基(pH7.0)，30℃、140r/min震荡培养48h，再以等体积比混合均匀置于摇床30℃，150r/min液体发酵4天制备形成能量供给菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
(3)磁介质菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)-YN-3(已在文献“张剑.不同矿物对氧化亚铁硫杆菌YN-3中磁小体形成的影响.中南大学硕士学位论文”公开)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CICC23919、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)-MSR-1(DSM6361，Brunswick，德国菌种保藏中心)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)CICC10828分别以同样的接种量加入同样体积的液体CM 0002改良培养基(pH7.0)，30℃、140r/min震荡培养48h，再以等体积比混合均匀置于摇床30℃，150r/min液体发酵4天制备形成磁介质菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
(4)降解磺胺类抗生素的复合微生物消解制剂的制备
按照质量百分比在3000L微生物发酵罐中加入5％(w/w)发酵初始培养基组分和66％自来水进行彻底灭菌(121℃灭菌30min)。灭菌后待发酵罐培养基温度降至所需培养温度时在无菌条件下分别接种所需10％(w/w)的磺胺类抗生素降解菌群、8％(w/w)的能量供给菌菌液和5％(w/w)的磁介质菌菌液和6％(w/w)表面活性剂[脂肪酸甲酯磺酸钠(MES)、十二烷基苯磺酸与2-氨基乙醇的1:1型化合物(C20H37NO4S，CAS:26836-07-7)和吐温20，各成分按相同质量进行混合]，得到发酵液2800L。38℃、100r/min搅拌培养，每隔4h强制通无菌空气30min，通气量是发酵罐容积的2倍体积/min，连续发酵5天，有效活菌菌体总浓度约为1.2×1012cfu/mL。发酵产物经检测符合GB20287-2006《农用微生物菌剂》标准，即制得磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂。
实施例2
(1)磺胺类抗生素降解菌群的制备
分别将枯草芽胞杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)CICC23830、气单胞菌属(Aeromonassp.)CICC 23565、赤红球菌(Rhodococcus ruber)CICC23622、马红球菌(Rhodoccocusequi)ATCC 13557、疣孢漆斑菌(Albifimbria verrucaria)CGMCC 3.1954等五种降解菌分别用LB培养至对数期，培养在30℃、130r/min震荡条件下进行，得到各菌培养液。接着，进行驯化：A、分别取200μL各菌培养液于250mL三角瓶中，其中已装有高浓度磺胺噻唑(440mg/L)土壤悬浮液(土壤悬浮液是土水按质量比1:5配比，灭菌得到)100mL，进行野生驯化10天(驯化条件为28℃，140r/min震荡条件下进行)；B、取200μL野生驯化液重复步骤A 6次后在LB液体培养基中28℃、120r/min震荡培养72h制备形成单一降解菌种子原液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL；C、将各单一降解菌种子原液按照等体积比混合均匀置于摇床32℃，150r/min液体发酵6天制备形成磺胺噻唑降解菌群，有效活菌菌体总浓度约为1.2×1012cfu/mL。
(2)能量供给菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ACCC 04257加入液体CM 0002改良培养基(pH7.5)，28℃、140r/min震荡培养72h，再于摇床28℃，150r/min液体发酵5天制备形成能量供给菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
(3)磁介质菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)CICC10828加入液体CM 0002改良培养基(pH7.5)，28℃、140r/min震荡培养72h，再置于摇床28℃，150r/min液体发酵5天制备形成磁介质菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
(4)降解磺胺噻唑的复合微生物消解制剂的制备
按照质量百分比在3000L微生物发酵罐中加入16％(w/w)发酵初始培养基组分和55％自来水进行彻底灭菌(121℃灭菌20min)。灭菌后待发酵罐培养基温度降至所需培养温度时在无菌条件下分别接种所需10％的磺胺类抗生素降解菌群、8％的能量供给菌菌液和5％的磁介质菌菌液和6％表面活性剂[十二烷基硫酸钠(C12H25NaO4S，CAS:151-21-3)和吐温20，各成分按相同质量进行混合]，得到发酵液2800L。32℃、120r/min搅拌培养，每隔4h强制通无菌空气30min，通气量是发酵罐培养液容积的0.5倍体积/min，连续发酵8天，有效活菌菌体总浓度约为1.2×1012cfu/mL。发酵产物经检测符合GB20287-2006《农用微生物菌剂》标准，即制得磺胺噻唑污染土壤原位微生物消解制剂。
实施例3
(1)磺胺类抗生素降解菌群的制备
分别将枯草芽胞杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)CICC23830、假单胞菌(Pseudomonas sp)JR-3、气单胞菌属(Aeromonassp.)CICC 23565、马红球菌(Rhodoccocus equi)ATCC 13557、微嗜酸寡氧单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)-BX3、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)CICC 2625、芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)-ZB-1等单个降解菌分别用LB液体培养基培养至对数期，培养在28℃、140r/min震荡条件下进行，得到各菌培养液。接着，进行驯化：A、取200μL各菌培养液于250mL三角瓶中，其中已装有灭菌的土水比1:5(质量比)的土壤悬浮液100mL，含高浓度磺胺甲基嘧啶(460mg/L)，进行野生驯化8天(驯化条件为29℃、150r/min震荡条件下进行)；B、取250μL野生驯化液重复步骤A5次后在LB液体培养基中32℃、120r/min震荡培养60h制备形成单一降解菌种子原液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL；C、将各单一降解菌种子原液按照等体积比混合均匀置于摇床35℃，140r/min液体发酵5天制备形成磺胺甲基嘧啶降解菌群，有效活菌菌体总浓度约为1.2×1012cfu/mL。
(2)能量供给菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ACCC 04257、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC 19183、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)CGMCC1.844等分别以同样的接种量加入同样体积的液体CM0002改良培养基(pH7.5)，29℃、140r/min震荡培养70h，再以等体积比混合均匀置于摇床29℃、150r/min液体发酵5天制备形成能量供给菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
(3)磁介质菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillumgryphiswaldense)-MSR-1和氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)-YN-3分别以同样的接种量加入同样体积的液体CM 0002改良培养基(pH7.5)，29℃、140r/min震荡培养60h，再以等体积比混合均匀置于摇床29℃、150r/min液体发酵5天制备形成磁介质菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
(4)降解磺胺甲基嘧啶的复合微生物消解制剂的制备
按照质量百分比在5000L微生物发酵罐中加入8％(w/w)发酵初始培养基组分和72％自来水进行彻底灭菌(121℃灭菌25min)。灭菌后待发酵罐培养基温度降至所需培养温度时在无菌条件下分别接种所需16％的磺胺类抗生素降解菌群、2％的能量供给菌菌液、1％的磁介质菌菌液和1％表面活性剂[脂肪酸甲酯磺酸钠(MES)、十二烷基苯磺酸与2-氨基乙醇的1:1型化合物(C20H37NO4S，CAS:26836-07-7)、十二烷基硫酸钠(C12H25NaO4S，CAS:151-21-3)]，得到发酵液4600L。35℃、110r/min，每隔4h强制通无菌空气30min，通气量是发酵罐容积的1倍体积/min，连续发酵7天，有效活菌菌体总浓度约为1.2×1012cfu/mL。发酵产物经检测符合GB20287-2006《农用微生物菌剂》标准，即制得磺胺甲基嘧啶污染土壤原位微生物消解制剂。
实施例4
(1)磺胺类抗生素降解菌群的制备
分别将气单胞菌属(Aeromonas sp.)CICC 23565、赤红球菌(Rhodococcus ruber)CICC23622、马红球菌(Rhodoccocusequi)ATCC 13557)、微嗜酸寡氧单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)-BX3、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)CICC2625、疣孢漆斑菌(Albifimbria verrucaria)CGMCC 3.1954等单个降解菌分别用LB液体培养基培养至对数期，培养在30℃、150r/min震荡条件下进行，得到各菌培养液。接着，进行驯化：A、取200μL各菌培养液于250mL三角瓶于250mL三角瓶中，其中已装有灭菌的土水比1:5(质量比)的土壤悬浮液100mL，含高浓度磺胺甲基嘧啶(413mg/L)，进行野生驯化6天(驯化条件为30℃、130r/min震荡条件下进行)；B、取200μL野生驯化液重复步骤A 6次后在LB液体富集培养基中32℃、120r/min震荡培养68h制备形成单一降解菌种子原液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL；C、将各单一降解菌种子原液按照等体积比混合均匀置于摇床36℃、140r/min液体发酵5天制备形成磺胺甲恶唑降解菌群，有效活菌菌体总浓度约为1.2×1012cfu/mL。
(2)能量供给菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ACCC04257、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)CICC 20079、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)CGMCC1.844等分别以同样的接种量加入同样体积的液体CM0002改良培养基(pH7.2)，29℃、140r/min震荡培养68h，再以等体积比混合均匀置于摇床30℃、150r/min液体发酵5天制备形成能量供给菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
(3)磁介质菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CICC23919、氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)-YN-3、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)CICC 10828(原始编号：YN01)等分别以同样的接种量加入同样体积的液体CM 0002改良培养基(pH7.2)，28℃、140r/min震荡培养72h，再以等体积比混合均匀置于摇床30℃、150r/min液体发酵4天制备形成磁介质菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
(4)降解磺胺甲嘧啶的复合微生物消解制剂的制备
按照质量百分比在3000L微生物发酵罐中加入6％(w/w)发酵初始培养基组分和75％自来水进行彻底灭菌(121℃灭菌30min)。灭菌后待发酵罐培养基温度降至所需培养温度时在无菌条件下分别接种所需8％的磺胺甲恶唑降解菌群、6％的能量供给菌菌液、3％的磁介质菌菌液和2％表面活性剂[十二烷基苯磺酸与2-氨基乙醇的1:1型化合物(C20H37NO4S，CAS:26836-07-7)、十二烷基硫酸钠(C12H25NaO4S，CAS:151-21-3)]，得到发酵液2800L。34℃、100r/min，每隔4h强制通无菌空气30min，通气量是发酵罐容积的1.5倍体积/min，连续发酵7天，有效活菌菌体总浓度约为1.2×1012cfu/mL。发酵产物经检测符合GB20287-2006《农用微生物菌剂》标准，即制得磺胺甲恶唑污染土壤原位微生物消解制剂。
实施例5
(1)磺胺类抗生素降解菌的制备
将假单胞菌(Pseudomonas sp)JR-3用LB液体培养基培养至对数期，培养在28℃、140r/min震荡条件下进行，得到该菌培养液。接着，进行驯化：A、取200μL该菌培养液于250mL三角瓶中，其中已装有灭菌的土水比1:5(质量比)的土壤悬浮液100mL，含高浓度磺胺甲基嘧啶(460mg/L)，进行野生驯化8天(驯化条件为29℃、150r/min震荡条件下进行)；B、取250μL野生驯化液重复步骤A 5次后在LB液体培养基中32℃、120r/min震荡培养60h制备形成降解菌种子原液，菌体浓度约为1.2×1012cfu/mL。
(2)能量供给菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ACCC 04257加入液体CM 0002改良培养基(pH7.5)，29℃、140r/min震荡培养70h制备形成能量供给菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
(3)磁介质菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)-YN-3加入液体CM 0002改良培养基(pH7.5)，29℃、140r/min震荡培养60h制备形成磁介质菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
(4)降解磺胺甲基嘧啶的复合微生物消解制剂的制备
按照质量百分比在5000L微生物发酵罐中加入8％(w/w)发酵初始培养基组分和72％自来水进行彻底灭菌(121℃灭菌25min)。灭菌后待发酵罐培养基温度降至所需培养温度时在无菌条件下分别接种所需16％的磺胺类抗生素降解菌、2％的能量供给菌菌液、1％的磁介质菌菌液和1％表面活性剂[脂肪酸甲酯磺酸钠(MES)、十二烷基苯磺酸与2-氨基乙醇的1:1型化合物(C20H37NO4S，CAS:26836-07-7)、十二烷基硫酸钠(C12H25NaO4S，CAS:151-21-3)]，得到发酵液4600L。35℃、110r/min，每隔4h强制通无菌空气30min，通气量是发酵罐容积的1倍体积/min，连续发酵7天，有效活菌浓度约为1×1012cfu/mL。发酵产物经检测符合GB20287-2006《农用微生物菌剂》标准，即制得磺胺甲基嘧啶污染土壤原位微生物消解制剂。应用实例
经过预实验，本发明所用的磺胺类抗生素降解菌对磺胺类抗生素(磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑)具有降解作用，能量供给菌和磁介质菌对磺胺类抗生素基本不具有降解作用。
采用田间小区试验开展磺胺类抗生素污染土壤原位消解研究。供试土壤理化性状为：pH6.30、有机质(OM)1.5％、碱解氮(AN)79.0mg/kg、有效磷(AP)102.0mg/kg、速效钾(AK)130mg/kg，粘壤土。磺胺类抗生素(磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑)均购自SIGMA-ALDRICH公司。试验开始时先用甲醇分别配制浓度为500mg/L的4种磺胺类抗生素的母液，之后分别与水按照一定比例稀释后淋施于各处理小区土壤至表层土壤(0～15cm)4种磺胺类抗生素终浓度约为5mg/kg，保持小区土壤田间湿润状态。试验设11个处理：
处理1，淋施20L/亩自来水；
处理2，淋施实例1中步骤(1)所得的降解菌群，用量20L/亩；
处理3，淋施实例1中步骤(4)所得的复合微生物消解制剂，用量20L/亩；
处理4，淋施实例2中步骤(1)所得的降解菌群，用量20L/亩；
处理5，淋施实例2中步骤(4)所得的复合微生物消解制剂，用量20L/亩；
处理6，淋施实例3中步骤(1)所得的降解菌群，用量20L/亩；
处理7，淋施实例3中步骤(4)所得的复合微生物消解制剂，用量20L/亩；
处理8，淋施实例4中步骤(1)所得的降解菌群，用量20L/亩；
处理9，淋施实例4中步骤(4)所得的复合微生物消解制剂，用量20L/亩；
处理10，淋施实例5中步骤(1)所得的降解菌，用量20L/亩；
处理11，淋施实例5中步骤(4)所得的微生物消解制剂，用量20L/亩；
每处理小区面积2m2，3次重复，随机排列。试验实施6天后采集各处理小区土壤样品。试验实施8天后采集处理1、处理6、处理7、处理10、处理11小区土壤样品，检测各处理小区土壤中磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲恶唑的含量(具体操作见“周爱霞,苏小四,高松,等.高效液相色谱测定地下水、土壤及粪便中4种磺胺类抗生素[J].分析化学,2014,42(3):397-402”)。
试验实施6天后各处理小区土壤样品结果如表1所示，可见，与对照处理比较，分别增施实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5中步骤(1)所得降解菌群的处理2、处理4、处理6、处理8、处理10土壤中磺胺噻唑降解率介于69.6～75.5％、磺胺甲基嘧啶降解率介于68.5～79.1％、磺胺二甲基嘧啶降解率介于64.9～80.7％、磺胺甲恶唑降解率介于67.8～77.0％，差异达到极显著水平(P＜0.01)；分别增施实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5中步骤(4)所得复合微生物消解制剂的处理3、处理5、处理7、处理9、处理11土壤中磺胺噻唑降解率介于86.9～96.3％、磺胺甲基嘧啶降解率介于83.7～95.2％、磺胺二甲基嘧啶降解率介于85.5～93.5％、磺胺甲恶唑降解率介于83.4～92.9％，差异达到极显著水平(P＜0.01)。
表1不同实施实例产品对4种磺胺类抗生素6d的降解效果(mg/kg)
注：表中数据为三个土壤样品测定的平均值，同一行数值后不同小写字母表示处理间差异性显著(P<0.05)，不同大写字母表示处理间差异性显著(P<0.01)。
试验实施8天后处理1、处理6、处理7、处理10和处理11小区土壤样品结果如表2所示，可见，与对照处理1比较，分别增施实施例3、实施例5中步骤(1)所得降解菌群的处理6、处理10土壤中磺胺噻唑降解率分别为89.3％和77.7％，磺胺甲基嘧啶降解率分别为90.0％和82.1％，磺胺二甲基嘧啶降解率分别为91.7％和82.1％，磺胺甲恶唑降解率分别为84.2％和77.0％，差异达到极显著水平(P＜0.01)；分别增施实施例3、实施例5中步骤(4)所得复合微生物消解制剂的处理7、处理11土壤中磺胺噻唑降解率分别为97.6％和88.9％，磺胺甲基嘧啶降解率分别为98.1％和88.2％，磺胺二甲基嘧啶降解率分别为97.4％和92.1％，磺胺甲恶唑降解率分别为95.1％和81.5％，差异达到极显著水平(P＜0.01)。说明复合微生物降解菌剂较单一降解菌剂在磺胺类抗生素残留土壤中更容易定殖增殖，降解效能更强，作用时间更持久。
表2不同实施实例产品对4种磺胺类抗生素8d的降解效果(mg/kg)
注：表中数据为三个土壤样品测定的平均值，同一行数值后不同小写字母表示处理间差异性显著(P<0.05)，不同大写字母表示处理间差异性显著(P<0.01)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将磺胺类抗生素降解菌液、能量供给菌菌液、磁介质菌菌液、表面活性剂、发酵培养基和水混合，得到混合液；发酵，得到磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂。
2.根据权利要求1所述的磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂的制备方法，其特征在于：
所述的磺胺类抗生素降解菌为枯草芽胞杆菌枯草亚种(Bacillus subtilissubsp.subtilis)CICC 23830、假单胞菌(Pseudomonas sp.)JR-3、豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)-HA-J1、气单胞菌属(Aeromonas sp.)CICC 23565、赤红球菌(Rhodococcus ruber)CICC 23622、马红球菌(Rhodoccocus equi)ATCC 13557、微嗜酸寡氧单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)-BX3、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)CICC 2625、疣孢漆斑菌(Albifimbria verrucaria)CGMCC 3.1954和芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)-ZB-1中的一种或至少两种；
所述的能量供给菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ACCC 04257、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)CICC 20079、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC 19183、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)SCTCC 100664和停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)CGMCC1.844中的一种或至少两种；
所述的磁介质菌为氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)-YN-3、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CICC 23919、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillumgryphiswaldense)-MSR-1和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)CICC 10828中的一种或至少两种；
所述的表面活性剂为脂肪酸甲酯磺酸钠、十二烷基苯磺酸与2-氨基乙醇的1:1型化合物、十二烷基硫酸钠和吐温20中的一种或至少两种；
所述的发酵培养基的组成如下：糖蜜粉20～25g/L、质量百分比45％的氨基酸粉3～7g/L、骨粉1～3g/L、蛋白胨1～3g/L、麦麸1～3g/L、马铃薯浸出汁2～4g/L、甜玉米汁1～3g/L、葡萄糖1～3g/L、磷酸氢二钾1～3g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、磷酸氢二铵0.4～0.6g/L、七水硫酸亚铁1～3g/L、七水硫酸镁0.1～0.5g/L、一水硫酸锰0.05～0.15g/L、磁铁矿粉0.05～0.15g/L、Fe3O4磁性纳米颗粒0.5～1.5g/L、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子1～3g/L，水为溶剂，pH自然。
3.根据权利要求1所述磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂的制备方法，其特征在于：所述的混合物的组成按质量百分比计，如下：菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的磺胺类抗生素降解菌菌液5～23％、菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的能量供给菌菌液0～8％、菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的磁介质菌菌液0～5％、表面活性剂1～6％、发酵培养基5～16％、水余量。
4.根据权利要求1所述磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂的制备方法，其特征在于：
所述的磺胺类抗生素降解菌菌液通过包含如下步骤的方法得到：
①将所述的磺胺类抗生素降解菌通过振荡培养，培养至对数增长期；
②再于30～40℃，120～150r/min条件下继续培养4～6天；
或是通过包含如下步骤的方法得到：
A、将所述的磺胺类抗生素降解菌通过振荡培养，培养至对数增长期；
B、然后通过含磺胺类抗生素的培养基进行驯化培养；
C、驯化得到的菌培养至对数增长期；
D、再于30～40℃，120～150r/min条件下继续培养4～6天；
所述的能量供给菌菌液通过如下方法得到：用CM 0002改良培养基将能量供给菌培养至对数增长期，再于28～30℃，130～150r/min条件下培养4～5天，得到能量供给菌菌液；CM0002改良培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、乳糖10g/L、pH 7.0～7.5；
所述的磁介质菌菌液通过如下方法得到：用CM 0002改良培养基将磁介质菌培养至对数增长期，再于28～30℃，130～150r/min条件下培养4～5天，得到磁介质菌菌液；CM 0002改良培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、乳糖10g/L、pH 7.0～7.5。
5.根据权利要求4所述磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂的制备方法，其特征在于：
所述的磺胺类抗生素降解菌为混合菌时，是将磺胺类抗生素降解菌中的各个菌分别通过振荡培养，培养至对数增长期；有驯化步骤时，是将各个菌分别进行驯化；然后按等体积比混合再继续培养；
所述的能量供给菌为混合菌液时，是将各个菌分别培养至对数增长期，然后按等体积比混合，再于28～30℃，130～150r/min条件下培养4～5天；
所述的磁介质菌为混合菌液时，是将各个菌分别培养至对数增长期，然后按等体积比混合，再于28～30℃，130～150r/min条件下培养4～5天。
6.根据权利要求4所述磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂的制备方法，其特征在于：
步骤①和步骤A中所述的培养的条件为于28～30℃，130～150r/min条件下培养48～72h；
步骤①和步骤A中所述的培养中的培养基为LB液体培养基；
步骤B中所述含磺胺类抗生素的培养基的组成如下：磺胺类抗生素410～460mg/L、土150～200g/L，水余量；
所述的驯化培养的条件为于28～30℃，130～150r/min条件下培养6～10天；
步骤C中所述的培养的条件为于28～32℃，110～130r/min条件下培养60～72h；
步骤②和步骤D中所述的继续培养的条件为于32～37℃，130～150r/min条件下继续培养4～6天；
所述的将能量供给菌培养至对数增长期中的培养条件为：于28～30℃，130～150r/min条件下震荡培养48～72h；
所述的将磁介质菌培养至对数增长期中的培养条件为：于28～30℃，130～150r/min条件下震荡培养48～72h。
7.根据权利要求6所述磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂的制备方法，其特征在于：所述的磺胺类抗生素为磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲恶唑中的至少一种；
所述的驯化培养的次数为3～8次。
8.根据权利要求1所述磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂的制备方法，其特征在于：所述的发酵的条件为于32～38℃，100～120r/min下，每隔4h强制通无菌空气30min，通气量是发酵罐容积的0.5～2倍/分钟，连续发酵5～8天。
9.一种磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的制备方法得到。
10.权利要求9所述磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂在环境修复中的应用。
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