CN111069275A - 蚯蚓肠道内容物强化土壤中磺胺类抗生素消减的方法 - Google Patents

Abstract

蚯蚓肠道内容物强化土壤中磺胺类抗生素消减的方法，首先选取成熟的且具有明显环带的新鲜蚯蚓，对其体表清洗后，放在培养皿中清肠，然后按比例添加到人工配制的磺胺类污染土壤中，在避光和室温的条件下培养2周后，取出蚯蚓并再次进行体表清洗，解剖获取新鲜蚯蚓肠道内容物；采集自然环境中受到磺胺类抗生素污染的不同类型的土壤，去除土壤中的草根、树叶、石头等杂质，对土壤进行破碎筛分；然后向不同磺胺类抗生素污染土壤中按比例添加蚯蚓肠道内容物，进行人工培养1‑2月后完成修复。蚯蚓肠道内容物中含有高丰度的磺胺类抗生素降解菌群，外源添加肠道内容物不但对土壤中磺胺类抗生素的降解去除具有显著的效果，而且有利于修复后土著微生物生态功能多样性快速恢复。

Description

蚯蚓肠道内容物强化土壤中磺胺类抗生素消减的方法

技术领域

本发明属于抗生素污染土壤生物修复技术领域，尤其涉及蚯蚓肠道内容物强化土壤中磺胺类抗生素消减的方法。

背景技术

抗生素是细菌、真菌、放线菌等微生物在代谢过程中产生的能够抵抗病原体、干扰其他生活细胞发育功能的一类天然的化学物质，对细菌活性的抑制具有非常好的效果，其中，磺胺类抗生素是以氨苯磺胺为母体人工合成的广谱性抗生素，具有化学性质稳定、价格低廉、使用方便等特点，被广泛的用到人类及禽畜疾病的预防及治疗过程中。但是磺胺类抗生素的大量使用并不能完全被代谢吸收，其中，有30-90%的抗生素通过粪便、尿液等方式排出体外，而禽畜排泄物又作为有机肥料大量施用于农田中，进而造成农田及禽畜养殖场周边土壤中贮存大量的抗生素母体化合物及次级代谢产物。一方面，残留在土壤中的抗生素会对土著菌群结构及数量造成扰动，而经过长期的自恢复过程后，形成新的菌群结构，进而改变了土壤中原有碳、氮、磷、硫等元素的转化过程，影响土壤物质元素循环的周转速率、迁移途径与赋存形态。另一方面，在长期的抗生素胁迫下，为适应环境的改变，土著菌群也会产生相应的抵抗机制，进而衍生出抗生素抗性细菌。而抗性细菌体内携带的抗生素抗性基因可以通过水平转移或垂直传导的方式在食物链之间进行传播，使得致病菌获得抗性的几率增加，从而给人体健康及生态环境带来较大的负面影响。因此开展针对土壤中磺胺类抗生素消减去除的研究具有重要的意义。

蚯蚓是土壤中生物量最大的无脊椎动物，占土壤动物总量约60-80%，在维持陆地生态功能中起着重要的作用。蚯蚓通过体表吸收或摄食的方式在其体内积累土壤中残留的污染物，因此蚯蚓自身的生理状态能够间接反映土壤的污染情况；另外，蚯蚓还能够改善土壤理化性质、降解部分有机污染物，有力的促进土壤元素循环；其次，蚯蚓因其具有适应性强、分布范围广、繁殖周期短等特点被视为土壤生态系统污染的指示生物。此外，蚯蚓肠道中的养分元素含量及葡萄糖、有机酸等小分子有机物也远远高于土壤，其中碳、氮含量是土壤中的2-5倍，因此蚯蚓肠道特殊的环境塑造了独特的内生细菌群落，它们不但对蚯蚓自身新陈代谢及机能稳定具有重要调节作用，而且还有利于促进蚯蚓对土壤中有机物质及养分元素的分解转化。已有较多的研究表明，蚯蚓肠道中含有大量的厌氧菌，这些内生细菌可以通过生物降解、吸附转化、生物积累等方式对环境中的污染物进行积累或降解，且不产生二次污染，有利于土壤生态系统的稳定及环境的可持续发展。然而目前对于蚯蚓肠道内生菌群消减土壤中磺胺类抗生素的研究还鲜有报道，因此开展蚯蚓肠道内容物强化土壤中磺胺类抗生素消减去除的方法对污染土壤可持续修复治理具有重要的理论和现实意义。

目前，关于蚯蚓修复污染土壤的研究，大多是针对土壤重金属的修复，如：申请号CN201910531836.7、CN201621257475.X和CN201410238253.2中提到的方法均是营造蚯蚓适合生存的环境，然后将蚯蚓与重金属污染土壤进行混合培养一段时间，直到污染土壤中重金属浓度降低。还有少部分关于利用蚯蚓消减土壤中有机污染物的专利，如：申请号：CN201210173048.3、CN201010147193.5和CN200910184601.1分别将蚯蚓投放到污染土壤中，后期添加不同的蚯蚓基质保证蚯蚓活力，进而达到降低土壤中有机污染物（五氯苯酚、滴滴涕、菲和芘）的效果。然而，目前尚未发现与蚯蚓肠道内容物强化降解土壤中抗生素的专利。经过检索，发现关于磺胺类抗生素消减的研究，很多是通过外加吸附剂或氧化剂的方式。其中，申请号：201610448595.6提供了玉米秸秆生物炭及利用其去除水中磺胺类抗生素的方法的技术，该技术首先要在高温无氧的条件下将玉米秸秆烧制成生物炭，然后利用玉米秸秆生物炭特有的吸附性能吸附水体中的磺胺类抗生素，但是该技术中烧制生物炭的过程较为繁琐、复杂，并且吸附抗生素的生物炭可能会对环境造成二次污染。申请号：201710136203.7提供了一种禽畜粪便生物炭的制备及其去除水中磺胺类抗生素的方法，该技术将禽畜粪便通过高温裂解制成生物炭，并将该生物炭作为吸附剂吸附水体中的磺胺类抗生素，去除率大于50%。但是由于抗生素的大量使用，禽畜粪便中含有大量的未被禽畜完全代谢吸收的抗生素，而该技术并未考虑禽畜粪便中抗生素是否完全去除，因此在使用禽畜粪便制成的生物质炭的过程中可能存在二次污染的风险。申请号：201711389799.8提供了一种去除禽畜养殖废水中磺胺类抗菌剂的方法，该方法将三价铁盐、螯合剂和氧化钙同时加入含有磺胺类抗生素的水体中，在酸性条件下，利用添加物的强氧化性氧化水体中的抗生素，但是该方法营造了较强酸性的环境（pH值为3-4），不符合大部分的自然水体的环境，且该技术只适用于水体环境，难以在土壤环境中推广。

通过专利检索发现与本发明最接近的现有技术是通过添加合成菌剂降解磺胺类抗生素。申请号：CN201710474535.6介绍了一株耐受磺胺类抗生素毒性的无色杆菌(Achromobacter sp.)及其在污水处理中的应用的方法，主要是利用该无色杆菌的抗磺胺类抗生素的性能，当水体中存在磺胺类抗生素时，依然能够保持完整的细胞结构和高效的好氧反硝化能力，具有减弱磺胺类抗生素对污水脱氮系统的作用。但是该方法主要是对水体进行脱氮，去除抗生素的效果并不理想。申请号：201710115130.3提供了一种降解土壤中抗生素的混合菌剂及其制备方法，主要是将抗生素降解菌株（枯草芽孢杆菌J5P2、假单胞菌J2）的菌液制成混合液，以达到降解土壤中残留的多种抗生素的目的。但是该方法提供的菌剂只混合了两种降解菌，而没有考虑到土著菌群的作用效果，因此，不能确保该方法的广泛使用。申请号：201610912546.3介绍了蔗渣固定化细菌修复农田土壤中磺胺甲恶唑污染修的方法，采用蔗渣为载体固定化阴沟肠杆菌菌属，构建高效稳定的农业废料固定化细菌体系，但是该方法需要制备菌悬液并且固定在蔗渣上，过程较为繁琐，且菌种单一，去除效果有限。

现有技术存在的主要缺陷是：现有的去除磺胺类抗生素的方法大多是通过高温煅烧等手段，存在工艺复杂、成本高且去除不彻底等问题。而且现有技术大多是针对水体中抗生素的去除，关于土壤中的研究还相对较少。目前去除土壤中磺胺类抗生素的技术往往是采用外添加菌剂的方法，普通的常规菌剂一般混合菌株种类较少，弱化了菌群的作用效果，且去除率不理想，因此现有的消减土壤中磺胺类抗生素的技术手段并不完善。

缺陷产生的主要原因有：1、近年来，随着禽畜养殖也的迅猛发展，大量的抗生素被用在禽畜养殖的全过程，加上医疗废水和污水处理厂不合理的处理方式，导致土壤及水环境中残留大量的抗生素，但是由于土壤污染具有隐蔽性、滞后性和累积性等特点，因而前期的科研工作大多是针对水环境中磺胺类抗生素的去除，土壤抗生素污染的修复治理则相对较晚。2、对于磺胺类抗生素的修复，有较多的研究是采用添加生物质炭的方法，但是生物质炭煅烧工艺相对繁琐、成本较高，不适合大量使用。3、土壤中接种降解菌剂，容易受到占据优势生态位土著菌群的影响，导致降解菌剂去除土壤中抗生素的效果不佳，并且降解菌在土壤中存活率较低，降解时间短，需反复添加使用。4、人为强化的磺胺类抗生素降解菌生产周期较长，并且会对土著细菌群落的结构组成产生影响。因此，研发成本低廉、工艺简单、绿色环保、去除率高的生物修复技术，对我国土壤生态的可持续发展具有重要的意义。

发明内容

解决的技术问题：蚯蚓肠道内容物强化土壤中磺胺类抗生素消减的方法，该方法可以高效去除土壤中残留的磺胺类抗生素，避免了复杂的工艺流程和高成本的工艺材料；使用菌群消减土壤中的抗生素，去除率较高，无二次污染，并且维护磺胺类抗生素污染土壤中细菌群落的多样性和稳定性，同时避免了土著菌群带来的影响。

技术方案：蚯蚓肠道内容物在强化土壤中磺胺类抗生素消减中的应用。

具体步骤为：首先选取成熟的且具有明显环带的新鲜蚯蚓，对其体表清洗后，放在培养皿中清肠，然后添加到人工配制的磺胺类抗生素污染的土壤中，其中磺胺类抗生素的浓度为10-100 mg/kg，在避光和室温的条件下培养2周后，取出蚯蚓并再次进行体表清洗，解剖获取新鲜蚯蚓肠道内容物；采集自然环境中受到磺胺类抗生素污染的不同类型土壤，去除杂质，对土壤进行破碎筛分；然后向不同磺胺类抗生素污染土壤中按比例添加蚯蚓肠道内容物，所述土壤与蚯蚓肠道内容物的质量比为1000:1-5000:1，进行人工培养1-2月后完成修复。

优选的，新鲜蚯蚓的体重在4±1g，清洗时选用0.9%的生理盐水。

生理盐水清洗后，放在无菌培养皿中清肠6h后蚯蚓清肠完全。

上述解剖获取新鲜蚯蚓肠道内容物的步骤为：待蚯蚓停止排粪后，用50%无水乙醇将蚯蚓浸泡2min，观察蚯蚓在无水乙醇中的生理状态，当蚯蚓停止扭动身躯并逐渐静止，但仍能观察到蚯蚓心脏跳动时，取出蚯蚓，再次用0.9%的生理盐水清洗蚯蚓体表2-3遍，用滤纸擦去蚯蚓体表0.9%的生理盐水；解剖蚯蚓的位置从雄孔下方开始，直到肛门位置结束，沿着中间偏左或者偏右的位置进行解剖，解剖时腹部朝上；解剖完蚯蚓，采用不锈钢小刀沿蚯蚓环带下方至肛门方向获取肠道内容物，并转移至离心管中，插入冰浴暂存，为保证蚯蚓肠道内容物的新鲜，时间控制在10s之内；向暂存蚯蚓内容物的离心管中加入0.5mL的PBS缓冲液，再采用涡旋仪将内容物混合均匀，涡旋仪的转速为1000rpm，涡旋时间为10s。

优选的，从麻醉蚯蚓开始，到获取肠道内容物结束，时间控制在5min之内。

上述采集自然环境中受到磺胺类抗生素污染的不同类型土壤的步骤为：依据5点采样法或S型采样法获取不同类型磺胺类污染农田土壤，并去除土壤中的草根、树叶、石头杂质，再对土壤进行破碎筛分，得到粒径小于100目的土粒。

优选的，上述土壤与蚯蚓肠道内容物的质量比为5000:1、2500:1或1000:1。

优选的，上述人工培养过程中保持周围温度25±2℃，并且维持土壤的含水率在20±2%。

本发明的工作原理是：1、成熟的威廉腔环蚓体重一般在3-5g，其肠道菌群多样性较为丰富、菌群结构较为稳定，避免了因蚯蚓个体差异而造成土壤磺胺类抗生素去除率有较大的误差。2、根据文献OECD1984，土壤与蚯蚓的重量比为125:1-250:1，而蚯蚓与肠道内容物的重量比大约为5:1-20:1，因此确定土壤与蚯蚓内容物质量比1000:1-5000:1。3、蚯蚓肠道为完全厌氧环境，肠道内容物中含有大量的厌氧菌，有利于土壤中磺胺类抗生素的强化消减。4、蚯蚓肠道中的养分元素含量及葡萄糖、有机酸等小分子有机物远远高于土壤，有助于肠道内生菌在土壤中的定殖，促进肠道内生菌在土壤中长久稳定的发挥作用，并且有利于和土著菌群协同降解土壤中的磺胺类抗生素。

有益效果： 本发明针对土壤中磺胺类抗生素的污染，提供了一种蚯蚓肠道内容物强化消减去除的方法。其具有的主要优点是：1、使用的材料是蚯蚓肠道内容物，避免了复杂的工艺流程和高成本的工艺材料，并且可以高效去除土壤中残留的多种磺胺类抗生素。2、利用蚯蚓肠道菌群消减土壤中的抗生素，不会产生二次污染，兼顾了可培养和不可培养降解菌的应用，有利于维护磺胺类抗生素污染土壤中细菌群落的多样性和稳定性，同时避免了土著菌群带来的影响，可最大程度的促进土壤中磺胺类抗生素的降解。3、该方法具有普适性，可以在多种类型的土壤中应用。该方法对于禽畜粪便堆放、医疗废水排放及污水处理厂不合理处理方式等造成的磺胺类抗生素污染土壤的生物修复具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为蚯蚓解剖后肠道内容物展示图；

图2为威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中磺胺嘧啶消减图；

图3为威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中磺胺甲恶唑消减图；

图4为威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中磺胺类总量抗生素消减图。

具体实施方式

以下具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中磺胺嘧啶消减的方法

选取具有明显环带、活力较强的新鲜威廉腔环毛蚓蚯蚓，每条体重在4 ± 1 g之间，清洗体表后，备用。称取相应重量的磺胺嘧啶分析纯标准品，溶解于纯水中，添加至相应清洁土壤，将磺胺嘧啶溶液与土壤颗粒均匀混合后，制备成浓度为100 mg/kg磺胺嘧啶污染土壤。将上述清洗完毕的100条威廉腔环毛蚓，投加至100 kg的100 mg/kg磺胺嘧啶污染土壤中，保持避光和常温25±2℃培养14天后，取出蚯蚓，用0.9%的生理盐水清洗蚯蚓体表2-3遍，放在无菌培养皿中清肠6h，促使蚯蚓清肠完全；并插入冰浴暂存，静置10 min，促使蚯蚓排粪完全。待蚯蚓停止排粪后，用50%无水乙醇将蚯蚓浸泡2 min，观察蚯蚓在无水乙醇中的生理状态，当蚯蚓停止扭动身躯并逐渐静止，但仍能观察到蚯蚓心脏轻微跳动时，取出蚯蚓后再次用0.9%的生理盐水清洗蚯蚓体表2-3遍，用滤纸擦去蚯蚓体表0.9%的生理盐水。解剖蚯蚓的位置从雄孔下方开始，直到肛门位置结束，沿着中间偏左或者偏右的位置进行解剖，解剖时腹部朝上。解剖完蚯蚓，采用不锈钢小刀沿蚯蚓环带下方至肛门方向获取肠道内容物，并转移至离心管中，插入冰浴暂存，为保证蚯蚓肠道内容物的新鲜，时间控制在10s之内。向暂存蚯蚓内容物的离心管中加入0.5 mL的PBS缓冲液，再采用涡旋仪将内容物混合均匀，涡旋仪的转速为1000 rpm，涡旋时间为10s。从麻醉蚯蚓开始，到获取肠道内容物结束，时间控制在5min之内。

磺胺嘧啶污染土壤，采集自南京横溪某有机肥生产厂，发酵池周边，土壤理化性质：pH值6.2，有机质含量41.5g kg^-1，全氮3.9 g kg^-1，有效态氮102.5 mg kg^-1，全磷2.2 gkg^-1，有效磷97.4 mg kg^-1。土壤机械组成为含有10.8wt.%沙粒，65.4 wt.%壤粒，23.8 wt.%黏粒。土壤中磺胺嘧啶污染浓度为126.1 ±7.2 mg kg^-1。采用5点采样法获取磺胺嘧啶污染土壤，并去除土壤中的草根、树叶、石头等杂质，再对土壤进行破碎筛分，得到粒径不超过2mm的土粒100 kg；然后土壤与蚯蚓内容物质量比分别设置为10000:1、5000:1和1000:1，进行蚯蚓肠道内容物的均匀添加，保持周围温度25℃，维持土壤的含水率在20±2%，培养30天后，不同土壤/内容物投加比例下（10000:1、5000:1和1000:1），土壤中磺胺嘧啶残留浓度分别是52.2 ± 4.3 mg kg^-1、5.1 ± 1.2 mg kg^-1、4.8 ± 2.1mg kg^-1，说明当投加比为10000:1时，土壤中磺胺嘧啶消减效率较低，而投加比为1000:1时，其磺胺嘧啶消减效率与投加比为5000:1的效率无显著差异，因而综合考虑去除效率因素与投加成本因素，建议采用土壤/内容物投加比例为5000:1的处理，在该处理条件下，土壤中磺胺嘧啶消减去除率为95.9±2.3%（图2）；与此同时，参考对比试验，未添加蚯蚓肠道内容物的处理，同步平行培养30天后，土壤中磺胺嘧啶残留浓度是58.9 ± 2.2 mg kg^-1，消减去除率仅为53.3±2.7%（图2）；此外还发现，在添加了蚯蚓肠道内容物的处理下，30天后，土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数、Shannon-Weaver指数和Simpson指数在修复后达到4.9±0.2，3.5±0.4和4.1±0.4，均较原始污染土壤的对应指数（3.2±0.2、2.6±0.3和3.7±0.2）显著升高（p<0.05），说明添加蚯蚓肠道内容物后，土壤土著菌群环境微生物生态多样性和稳定性得到了显著的恢复和改善，证明该技术是一种生态环境友好，消减去除效率高效的修复方法。

实施例2 威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中磺胺甲恶唑消减的方法

选取具有明显环带、活力较强的新鲜威廉腔环毛蚓蚯蚓，每条体重在4 ± 1 g之间，清洗体表后，备用。称取相应重量的磺胺甲恶唑分析纯标准品，溶解于纯水中，添加至相应清洁土壤，将磺胺甲恶唑溶液与土壤颗粒均匀混合后，制备成浓度为100 mg/kg磺胺甲恶唑污染土壤。将上述清洗完毕的100条威廉腔环毛蚓，投加至100 kg的100 mg/kg磺胺甲恶唑污染土壤中，保持避光和常温25±2℃培养14天后，取出蚯蚓，用0.9%的生理盐水清洗蚯蚓体表2-3遍，放在无菌培养皿中清肠6h，促使蚯蚓清肠完全；并插入冰浴暂存，静置10 min，促使蚯蚓排粪完全。待蚯蚓停止排粪后，用50%无水乙醇将蚯蚓浸泡2min，观察蚯蚓在无水乙醇中的生理状态，当蚯蚓停止扭动身躯并逐渐静止，但仍能观察到蚯蚓心脏轻微跳动时，取出蚯蚓后再次用0.9%的生理盐水清洗蚯蚓体表2-3遍，用滤纸擦去蚯蚓体表0.9%的生理盐水。解剖蚯蚓的位置从雄孔下方开始，直到肛门位置结束，沿着中间偏左或者偏右的位置进行解剖，解剖时腹部朝上。解剖完蚯蚓，采用不锈钢小刀沿蚯蚓环带下方至肛门方向获取肠道内容物，并转移至离心管中，插入冰浴暂存，为保证蚯蚓肠道内容物的新鲜，时间控制在10s之内。向暂存蚯蚓内容物的离心管中加入0.5mL的PBS缓冲液，再采用涡旋仪将内容物混合均匀，涡旋仪的转速为1000rpm，涡旋时间为10s。从麻醉蚯蚓开始，到获取肠道内容物结束，时间控制在5min之内。

磺胺甲恶唑污染土壤，采集自安徽省马鞍山市和县某畜禽养殖厂，畜禽粪便池塘周边，土壤理化性质：pH值5.9，有机质含量36.1g kg^-1，全氮4.8 g kg^-1，有效态氮99.3 mgkg^-1，全磷2.7 g kg^-1，有效磷81.1 mg kg^-1。土壤机械组成为含有9.3wt.%沙粒，66.2 wt.%壤粒，24.5 wt.%黏粒。土壤中磺胺甲恶唑污染浓度为322.6 ± 14.3 mg kg^-1。采用5点采样法获取磺胺甲恶唑污染土壤，并去除土壤中的草根、树叶、石头等杂质，再对土壤进行破碎筛分，得到粒径不超过2 mm的土粒100 kg；然后土壤与蚯蚓内容物质量比分别设置为5000:1、2500:1和1000:1，进行蚯蚓肠道内容物的均匀添加，保持周围温度25℃，维持土壤的含水率在20±2%，培养60天后，不同土壤/内容物投加比例下（5000:1、2500:1和1000:1），土壤中磺胺甲恶唑残留浓度分别是87.4 ± 3.6 mg kg^-1、12.6 ± 2.1 mg kg^-1、11.3 ± 4.2mgkg^-1，说明当投加比为5000:1时，土壤中磺胺甲恶唑消减效率较低，而投加比为1000:1时，其磺胺甲恶唑消减效率与投加比为2500:1的效率无显著差异，因而综合考虑去除效率因素与投加成本因素，建议采用土壤/内容物投加比例为2500:1的处理，在该处理条件下，土壤中磺胺甲恶唑残留浓度是12.6 ± 2.1 mg kg^-1，消减去除率为96.1±3.4%（图3）；与此同时，参考对比试验，未添加蚯蚓肠道内容物的处理，同步平行培养60天后，土壤中磺胺甲恶唑残留浓度是97.6 ± 5.9 mg kg^-1，消减去除率仅为69.7±5.5%（图2）；此外还发现，在添加了蚯蚓肠道内容物的处理下，60天后，土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数、Shannon-Weaver指数和Simpson指数在修复后达到4.1±0.5，3.9±0.1和3.4±0.2，均较原始污染土壤的对应指数（2.9±0.3、2.7±0.2和3.3±0.3）显著升高（p<0.05），说明添加蚯蚓肠道内容物后，土壤土著菌群环境微生物生态多样性和稳定性得到了显著的恢复和改善，证明该技术是一种生态环境友好，消减去除效率高效的修复方法。

实施例3 威廉腔环毛蚓肠道内容物强化土壤中磺胺甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑同步消减去除的方法

选取具有明显环带、活力较强的新鲜威廉腔环毛蚓蚯蚓，每条体重在4 ± 1 g之间，清洗体表后，备用。称取相应重量的磺胺甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑分析纯混合标准品，溶解于纯水中，添加至相应清洁土壤，将上述三类标准溶液与土壤颗粒均匀混合后，制备成浓度为10 mg/kg磺胺甲氧嘧啶+10 mg/kg磺胺嘧啶+10 mg/kg磺胺甲恶唑的复合抗生素污染土壤。将上述清洗完毕的100条威廉腔环毛蚓，投加至100 kg的上述磺胺类复合污染土壤中，保持避光和常温培养14天后，取出蚯蚓，用0.9%的生理盐水清洗蚯蚓体表2-3遍，放在无菌培养皿中清肠6h，促使蚯蚓清肠完全；并插入冰浴暂存，静置10 min，促使蚯蚓排粪完全。待蚯蚓停止排粪后，用50%无水乙醇将蚯蚓浸泡2min，观察蚯蚓在无水乙醇中的生理状态，当蚯蚓停止扭动身躯并逐渐静止，但仍能观察到蚯蚓心脏轻微跳动时，取出蚯蚓后再次用0.9%的生理盐水清洗蚯蚓体表2-3遍，用滤纸擦去蚯蚓体表0.9%的生理盐水。解剖蚯蚓的位置从雄孔下方开始，直到肛门位置结束，沿着中间偏左或者偏右的位置进行解剖，解剖时腹部朝上。解剖完蚯蚓，采用不锈钢小刀沿蚯蚓环带下方至肛门方向获取肠道内容物，并转移至离心管中，插入冰浴暂存，为保证蚯蚓肠道内容物的新鲜，时间控制在10s之内。向暂存蚯蚓内容物的离心管中加入0.5mL的PBS缓冲液，再采用涡旋仪将内容物混合均匀，涡旋仪的转速为1000rpm，涡旋时间为10s。从麻醉蚯蚓开始，到获取肠道内容物结束，时间控制在5min之内。

磺胺甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑复合污染土壤，采集自无锡城郊某养猪厂猪粪堆积池周边土壤，土壤理化性质：pH值6.1，有机质含量32.1 g kg^-1，全氮2.8 g kg^-1，有效态氮67.3 mg kg^-1，全磷2.1 g kg^-1，有效磷81.2 mg kg^-1。土壤机械组成为含有13.1wt.%沙粒，73.4 wt.%壤粒，13.5 wt.%黏粒。土壤中磺胺甲氧嘧啶污染浓度为28.6 ± 3.4mg kg^-1，磺胺嘧啶污染浓度为46.4 ± 4.1 mg kg^-1，磺胺甲恶唑193.4 ± 8.6 mg kg^-1，土壤总磺胺类抗生素浓度是268.4 ± 16.1 mg kg^-1。采用5点采样法获取磺胺类复合抗生素污染土壤，并去除土壤中的草根、树叶、石头等杂质，再对土壤进行破碎筛分，得到粒径不超过2 mm的土粒100 kg；然后土壤与蚯蚓内容物质量比分别设置为2500:1、1000:1和500:1，进行蚯蚓肠道内容物的均匀添加，保持周围温度25℃，维持土壤含水率在25-30%，培养60天后，不同土壤/内容物投加比例下（2500:1、1000:1和500:1），土壤中总磺胺类抗生素残留浓度分别是93.6 ± 2.5 mg kg^-1，7.1 ± 1.1 mg kg^-1和5.7 ± 2.4 mg kg^-1。说明当投加比为2500:1时，土壤中总磺胺类抗生素消减效率较低，而投加比为500:1时，其磺胺甲恶唑消减效率与投加比为1000:1的效率无显著差异，因而综合考虑去除效率因素与投加成本因素，建议采用土壤/内容物投加比例为1000:1的处理，在该处理条件下，土壤中磺胺甲氧嘧啶残留浓度是0.7 ± 0.2 mg kg^-1，消减去除率为97.6 ± 0.6%；磺胺嘧啶残留浓度是2.1± 0.3 mg kg^-1，消减去除率为95.5 ± 2.6%；磺胺甲恶唑残留浓度是4.3 ± 0.6 mg kg^-1，消减去除率为97.8 ± 3.1%，土壤中总量磺胺类抗生素消减去除率为97.4 ± 2.5%（图4）；与此同时，参考对比试验，未添加蚯蚓肠道内容物的处理，同步平行培养60天后，土壤中总量磺胺类抗生素残留浓度为113.4 ± 9.6 mg kg^-1，消减去除率仅为57.7 ± 3.2%（图4）；此外还发现，在添加了蚯蚓肠道内容物的处理下，60天后，土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数、Shannon-Weaver指数和Simpson指数在修复后达到4.2 ± 0.2，3.9 ±0.2和3.4 ± 0.3，均较原始污染土壤的对应指数（3.2 ± 0.2、2.9 ± 0.1和2.5 ± 0.3）显著升高（p<0.05），说明添加蚯蚓肠道内容物后，土壤土著菌群环境微生物生态多样性和稳定性得到了显著的恢复和改善，证明该技术是一种生态环境友好，消减去除效率高效的修复方法。

Claims (9)

1.蚯蚓肠道内容物在强化土壤中磺胺类抗生素消减中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于具体步骤为：首先选取成熟的且具有明显环带的新鲜蚯蚓，对其体表清洗后，放在培养皿中清肠，然后添加到人工配制的磺胺类抗生素污染的土壤中，其中磺胺类抗生素的浓度为10-100 mg/kg，在避光和室温的条件下培养2周后，取出蚯蚓并再次进行体表清洗，解剖获取新鲜蚯蚓肠道内容物；采集自然环境中受到磺胺类抗生素污染的不同类型土壤，去除杂质，对土壤进行破碎筛分；然后向不同磺胺类抗生素污染土壤中按比例添加蚯蚓肠道内容物，所述土壤与蚯蚓肠道内容物的质量比为1000:1-5000:1，进行人工培养1-2月后完成修复。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于新鲜蚯蚓的体重在4±1g，清洗时选用0.9%的生理盐水。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于生理盐水清洗后，放在无菌培养皿中清肠6h后蚯蚓清肠完全。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述解剖获取新鲜蚯蚓肠道内容物的步骤为：待蚯蚓停止排粪后，用50%无水乙醇将蚯蚓浸泡2min，观察蚯蚓在无水乙醇中的生理状态，当蚯蚓停止扭动身躯并逐渐静止，但仍能观察到蚯蚓心脏跳动时，取出蚯蚓，再次用0.9%的生理盐水清洗蚯蚓体表2-3遍，用滤纸擦去蚯蚓体表0.9%的生理盐水；解剖蚯蚓的位置从雄孔下方开始，直到肛门位置结束，沿着中间偏左或者偏右的位置进行解剖，解剖时腹部朝上；解剖完蚯蚓，采用不锈钢小刀沿蚯蚓环带下方至肛门方向获取肠道内容物，并转移至离心管中，插入冰浴暂存，为保证蚯蚓肠道内容物的新鲜，时间控制在10s之内；向暂存蚯蚓内容物的离心管中加入0.5mL的PBS缓冲液，再采用涡旋仪将内容物混合均匀，涡旋仪的转速为1000rpm，涡旋时间为10s。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于从麻醉蚯蚓开始，到获取肠道内容物结束，时间控制在5min之内。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述采集自然环境中受到磺胺类抗生素污染的不同类型土壤的步骤为：依据5点采样法或S型采样法获取不同类型磺胺类污染农田土壤，并去除土壤中的草根、树叶、石头杂质，再对土壤进行破碎筛分，得到粒径小于100目的土粒。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述土壤与蚯蚓肠道内容物的质量比为5000:1、2500:1或1000:1。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述人工培养过程中保持周围温度25±2℃，并且维持土壤的含水率在20±2%。

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