CN109762773A - 一种树状类芽孢杆菌、固定化菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种树状类芽孢杆菌、固定化菌剂及其应用。本公开的树状类芽孢杆菌(Paenibacillus dendritiformis)的保藏编号为CGMCC No.14473。本公开还提供了一种固定化菌剂，该固定化菌剂含有如上所述的树状类芽孢杆菌作为有效成分。本公开还提供了如上所述的树状类芽孢杆菌和如上所述的固定化菌剂在降解土霉素及修复含有土霉素的水体、土壤和禽畜养殖废弃物中的应用。通过上述技术方案，本公开可以更加有效地去除土霉素，尤其能够在含有土霉素的水体中快速高效地去除土霉素，减少残留，并且采用本公开的固定化菌剂还具有便于施用、分离和可重复使用的优点。

Description

一种树状类芽孢杆菌、固定化菌剂及其应用

技术领域

本公开涉及一种树状类芽孢杆菌、固定化菌剂及其应用。

背景技术

四环素类抗生素是目前世界上应用最广泛的抗生素之一，占畜禽和水产养殖行业抗生素用量的50％以上。其中，土霉素(Oxytetracycline，OTC)因抗菌谱广、价格低廉，作为治疗用药及饲料添加剂在畜禽和水产养殖业中更是被广泛应用。土霉素的作用机制是干扰蛋白质的合成。其毒副作用较小，主要应用于呼吸道和肠道感染。作为饲料添加剂，具有良好抗菌效果的土霉素可有效抑制畜禽消化道内的有害微生物，提高畜禽成活率，增强畜禽食欲，提高饲料利用率，降低养殖成本，因此土霉素是我国使用最多的饲料抗生素添加剂之一。我国每年生产的土霉素达1万吨以上，占世界总产量的约65％。

我国畜禽养殖业中土霉素用量较大，每年可达到6000吨以上。由于土霉素具有吸收不完全的特点，因此其大量使用会造成环境中的大量蓄积。服药后畜禽粪便中的土霉素残留量可达到69-86％。而有报道显示，土霉素在粪肥中的半衰期为30天，粪肥腐熟5个月后仍然可检测出820μg/kg的含量，因此通过畜禽粪便还田的途径进入土壤、水体等环境的土霉素残留量也较大。同时，土霉素生产企业的废水、水产养殖废水、医院废水等也是环境中土霉素污染的重要来源。这些来源的土霉素在环境中大量蓄积，广泛存在于各种环境介质中。有研究表明，在天津的蔬菜种植地检测到的土霉素残留量达到124-2683μg/kg。同时，多个研究的结果也说明土霉素在水体中广泛残留。研究人员对贵阳阿哈湖水库、乌江渡水库多个点位地表水中的土霉素进行检测，发现其残留量达到0.2-8μg/L。陈永山等人在苕溪流域的底泥中检出土霉素的浓度达到276.6μg/kg。对广州的污水处理厂出水进行检测，土霉素浓度为0.11μg/L，说明污水处理措施对土霉素的去除效果不彻底。

大量的土霉素进入并蓄积在环境中，对环境和人类健康存在着严重威胁。土霉素会残留在动物体内，同时会从土壤进入作物，这些土霉素通过食物链进入人体并富集，对人类健康形成危害。人体内的土霉素积累量达到一定程度后，会造成人体慢性或急性中毒，对肝、肾、淋巴等器官造成损伤。土霉素可以通过抑制叶绿体合成酶的活性，从而抑制植物的生长。土霉素在植物根系中的积累量最大，因此其对根的影响最大，其次是茎和叶。土霉素对动物也有一定的危害，但毒性较低。土霉素对水生动物的生态毒性报道较多，对土壤动物的毒性较低。研究显示，土霉素能够明显抑制虹鳟鱼体内对疾病的抗体水平，降低吞噬细胞活性，减少淋巴细胞的数量。土壤中残留的土霉素会损害土壤中的微生物，导致微生物多性样降低，微生物群落平衡失调，从而影响土壤微生态平衡，最终使得土壤质量与肥力下降。土霉素在环境中的大量残留还会带来一个严重的问题，即耐药菌的产生和传播。自1940年四环素类抗生素被广泛使用以来，土壤中的四环素类抗性基因水平显著增加，2008年土壤中部分基因的含量甚至是70年代土壤中的基因含量的15倍。随着土霉素在畜禽业的大量使用和生产厂家的不断排放，土霉素引起严重的环境污染问题受到广泛关注。目前尚缺乏安全、有效、成本较低的降解土壤和水体中的土霉素的手段。

发明内容

为了克服现有抗生素污染处理方法存在的成本高、去除效率低等缺陷，本发明提供了一种树状类芽孢杆菌。

本公开的发明人分离了一株树状类芽孢杆菌，发现其可以高效地去除土霉素，可以实现土霉素类抗生素污染及含有土霉素的禽畜养殖废弃物的高效处理及，由此得到了本发明。

为了实现上述目的，本公开提供一种树状类芽孢杆菌，该树状类芽孢杆菌(Paenibacillus dendritiformis)的保藏编号为CGMCC No.14473。。

本公开第二方面提供一种树状类芽孢杆菌的固定化菌剂，所述固定化菌剂包括固定化材料和负载于所述固定化材料上的保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌。

可选地，每克所述固定化菌剂中，保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌的活菌数为10⁸～10⁹cfu。

可选地，所述固定化菌剂形成为直径3～4mm的固定化微球；

所述固定化微球的所述固定化材料含有固体吸附剂和包埋剂，所述固体吸附剂为活性炭，所述包埋剂为含有海藻酸钠和聚乙烯醇的水凝胶；以所述固定化微球的总重量为基准，所述活性炭的重量含量为1.75～2.00％，所述海藻酸钠的重量含量为0.25～0.35％，所述聚乙烯醇的重量含量为12～13％。

可选地，所述包埋剂为重量含量比为1：(34～52)的海藻酸钠和聚乙烯醇。

可选地，所述固定化微球通过如下步骤制备：

(1)将保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌接种于液体培养基中，在37℃下培养至对数期，菌液经固液分离、洗涤后得到湿菌体；

(2)将所述湿菌体与所述固体吸附剂进行混合吸附，得到吸附了菌体的吸附剂；

(3)将所述包埋剂制成包埋剂凝胶后与所述吸附了菌体的吸附剂混合，将得到的混合物加入到交联剂中，静置进行交联得到树状类芽孢杆菌的固定化微球；

其中，相对于1重量份所述湿菌体，所述固体吸附剂的用量为0.52～0.82重量份，所述包埋剂凝胶的用量为4～5重量份。

可选地，所述包埋剂为海藻酸钠和聚乙烯醇，步骤(3)包括：将海藻酸钠水溶液和聚乙烯醇水溶液分别加热制成凝胶后混合，然后将得到的混合凝胶与所述吸附菌体的吸附剂混合。

可选地，步骤(2)所述的吸附的时间为7～10min；步骤(3)所述的交联包括：在4～6℃下静置进行交联10～14h后洗涤，得到所述树状类芽孢杆菌的固定化微球，所述交联剂为含有质量浓度3.5～4％的CaCl₂的饱和硼酸溶液，所述交联剂的pH为7～8。

本公开第三方面提供本公开第一方面所述的树状类芽孢杆菌或本公开第二方面所述的固定化菌剂在降解土霉素中的应用。

本公开第四方面提供本公开第一方面所述的树状类芽孢杆菌或本公开第二方面所述的固定化菌剂在修复含有土霉素的水体、土壤和禽畜养殖废弃物中的应用。

通过上述技术方案，本公开的保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌能够快速、高效地降解土霉素，去除率可达90％以上。该树状类芽孢杆菌及含有该菌的固定化菌剂能够应用于被土霉素污染的水体、土壤环境的修复，以及畜禽养殖废弃物的处理，从而降低土霉素残留对环境的影响，提高畜禽养殖废弃物资源化的安全性和使用范围，固定化菌剂有利于在使用时保持高活菌浓度、提高降解土霉素的速率、降低土霉素残留量，并且固定化菌剂还具有便于施用、分离和可重复使用的优点。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1为保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌(TF1)与其它树状类芽孢杆菌属成员之间的进化分析(基于16S rDNA序列分析)。

生物材料保藏

本发明的树状类芽孢杆菌是本发明的发明人从北京某生猪养殖场采集的农田土壤样品中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCC No.14473，保藏日期为2017年7月31日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为树状类芽孢杆菌(Paenibacillusdendritiformis)。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开的发明人从采集自北京某生猪养殖场的农田土壤样品中分离培养出一种新的菌种，经鉴定该菌属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus Ash,Priest&Collin)，被命名为树状类芽孢杆菌(Paenibacillus dendritiformis)。该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2017年7月31日，保藏编号为CGMCC No.14473。

本公开提供一种树状类芽孢杆菌，该树状类芽孢杆菌(Paenibacillusdendritiformis)的保藏编号为CGMCC No.14473。

提取该保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌(TF1)基因组DNA，使用16srDNA基因通用引物进行PCR扩增，利用序列比对方法进行分子鉴定，将该菌鉴定为类芽孢杆菌属(Paenibacillus Ash,Priest&Collin)，命名为树状类芽孢杆菌(Paenibacillusdendritiformis)。16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示，为：

CCACCGACTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGACTGGCTTTTTAGGATTCGCTCCGCCTCGCGGCTTCGCTTCCCGTTGTACCAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACTCTAGAGTGCCCAACTCAATGCTGGCAACTAAAGTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCTCTGCCCCGAAGGGAAGCCCTATCTCTAGGACGGTCAGAGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGTGTTAACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCACACAGTTTCCGATGCGACCCGGAGTTGAGCCCCGGGTTTAAACACCAGACTTACATGACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGGCTTTCTTCTCAGGTACCGTCACCTATGGAACAGTTACTCTCCATAGCGTTCTTCCCTGGCAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTGCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGTAGGTCCATCCATAAGCGGCAGATTGCTCCGCCTTTCCCGATTCCCTCATGCGAGGAAATCGCCTATCCGGTATTAGCCCACGTTTCCGTGAGTTATCCCGGTCTTAAGGGCAGGTTACCTACGTATTACTCACCCGTCCGCCGCTAAGCATCAGGAGTGCAAGCACTCCATCAACTCCGCTCGAC

基于16S rDNA序列分析，保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌(TF1)与其它树状类芽孢杆菌属成员之间的进化分析如图1所示。

本公开的树状类芽孢杆菌可以在常规的细菌培养基中存活并生长繁殖。本公开如上所述的树状类芽孢杆菌是一株非常优异的抗生素降解菌，能够非常高效快速地土霉素。

本公开第二方面提供一种树状类芽孢杆菌的固定化菌剂，所述固定化菌剂包括固定化材料和负载于所述固定化材料上的保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌。

其中，固定化菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌的活菌数可以为10⁸-10¹¹cfu，优选情况下，每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌的活菌数可以为10⁸-10⁹cfu。

根据本公开，固定化菌剂的具体种类没有特别要求，在一种具体实施方式中，为了便于施用和分离、提高降解效果，所述固定化菌剂可以为由负载有树状类芽孢杆菌的固定化材料形成的固定化微球；固定化微球的尺寸没有特殊要求，优选为直径为3～4mm的固定化微球，进一步优选直径为3～3.5mm。

其中，所述固定化材料可以含有固体吸附剂和包埋剂；

进一步地，为了提高固定化材料的负载微生物的性能，所述固体吸附剂优选为活性炭；所述包埋剂优选为含有海藻酸钠和聚乙烯醇的水凝胶。

进一步地，以所述固定化微球的总重量为基准，所述活性炭的重量含量可以为1.75～2.00％，优选为1.85～2％；所述海藻酸钠的重量含量可以为0.25～0.35％，优选为0.25～0.30％；所述聚乙烯醇的重量含量可以为12～13％，优选为12.5～13％。

在本公开优选的一种具体实施方式中，所述包埋剂可以为重量含量比为1：(34～52)的海藻酸钠和聚乙烯醇，优选地包埋剂可以为重量含量比为1：42～45的海藻酸钠和聚乙烯醇，这一实施方式中，包埋剂可以形成适度交联的凝胶层，该凝胶层包裹于固体吸附剂表面，能够改善固定化微球的亲水性并保持固定化微球中微生物持续发挥降解能力，有利于在水体等环境中促进土霉素降解。在这一实施方式中，可以将海藻酸钠水溶液和聚乙烯醇水溶液分别加热制成凝胶后混合，然后将得到的混合凝胶与所述吸附菌体的吸附剂混合。

根据本公开，固定化微球可以采用常规方法制备，在一种实施方式中固定化微球可以通过如下步骤制备：(1)将保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌接种于液体培养基中，在37℃下培养至对数期，菌液经固液分离、洗涤后得到湿菌体；(2)将所述湿菌体与所述固体吸附剂进行混合吸附，得到吸附了菌体的吸附剂；(3)将所述包埋剂制成包埋剂凝胶后与所述吸附了菌体的吸附剂混合，将得到的混合物加入到所述交联剂中，静置进行交联得到树状类芽孢杆菌的固定化微球。采用上述方法，树状类芽孢杆菌能够均匀地吸附于固体吸附剂上，并通过在固体吸附剂表面包裹包埋剂，使其具有适宜的亲水性和物质交换能力，有助于促进吸附在固体吸附剂上的树状类芽孢杆菌持续地发挥快速高效降解土霉素的能力。

进一步地，为了提高固定化微球的稳定性和降解效率，相对于1重量份所述湿菌体，所述固体吸附剂的用量可以为2～3重量份，优选为2.17重量份，所述包埋剂凝胶的用量可以为3～5重量份，优选为4重量份。

进一步地，步骤(2)所述的吸附的时间可以为7～10min，优选为8min，以提高微生物的吸附程度。

进一步地，步骤(3)所述的交联可以包括：在4～6℃下静置进行交联10～14h后洗涤，例如在4℃下静置进行交联12h后洗涤，得到所述树状类芽孢杆菌的固定化微球，所述交联剂优选为含有质量浓度为3.5～4％的CaCl₂的饱和硼酸溶液，例如为含有4％CaCl₂的饱和硼酸溶液，所述交联剂的pH可以为7～8，优选为7.4。在上述优选的条件下，可以得到交联程度适宜的包埋剂凝胶层。

根据本公开，所述液体培养基的种类可以为各种能够用于培养树状类芽孢杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基、LB培养基等常用培养基作上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(Microbiology Culture MediaManual)的记载制备得到。例如，培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，其含有1-5g/L的牛肉膏、5-20g/L的蛋白胨和3-8g/L的氯化钠。其中，菌种的培养条件没有特别的限制，可以为树状类芽孢杆菌培养过程中常用条件，例如采用摇床震荡培养，培养温度可以为28-37℃，培养时间可以为1-3天。其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125℃和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10-30分钟。其中，菌种的培养条件没有特别的限制，可以为树状类芽孢杆菌培养过程中常用条件，例如采用摇床震荡培养，培养温度可以为28-37℃，培养时间可以为1-3天。

本公开第三方面提供本公开第一方面所述的树状类芽孢杆菌或本公开第二方面所述的固定化菌剂在降解土霉素中的应用。其中，可以包括将本公开的树状类芽孢杆菌和/或含有该菌的固定化菌剂施用于含有土霉素的液态介质和/或固态介质中，其中土霉素在介质中的浓度可在较大范围内变化，例如为5～200mg/kg。

本公开第四方面提供本公开第一方面所述的树状类芽孢杆菌或本公开第二方面所述的固定化菌剂在修复含有土霉素的水体、土壤和禽畜养殖废弃物中的应用。

根据本公开，树状类芽孢杆菌及其微生物菌剂在处理禽畜养殖废弃物中的应用方法没有特别的要求，例如包括降低禽畜养殖废弃物中的土霉素含量和/或将禽畜养殖废弃物资源化利用，具体地，可以包括将禽畜养殖废弃物进行堆肥发酵，具体地例如，可以为将畜禽养殖废弃物与本公开的树状类芽孢杆菌和/或微生物菌剂按比例混合均匀，调整水分后将搅拌均匀的垫料堆积发酵。进一步地，相对于1kg畜禽养殖废弃物，树状类芽孢杆菌的用量可以为10⁸～10¹¹cfu，优选为10⁹～10¹⁰cfu。使用时，可以将畜禽养殖废弃物按比例堆积好，再将菌剂均匀地撒在畜禽养殖废弃物垫料上，充分混合直至完全混匀。其中，畜禽养殖废弃物可包括常规的禽畜粪便，例如为猪粪便、牛粪便、鸡粪和羊粪便中的一种或几种。用于发酵的畜禽养殖废弃物的C/N比可以为25～40，优选为28～35。进一步地，为了保证用于发酵的禽畜养殖废弃物的C/N比在适宜范围内，可以将秸秆、锯末、稻壳和麸皮中的至少一种与禽畜养殖废弃物混合堆肥发酵。

根据本公开，抗生素污染可以包括抗生素污染的土壤和/或抗生素污染的水体，具体地包括含有土霉素的水体和/或含有土霉素土壤。其中，土霉素在抗生素污染的土壤中的浓度可在较大范围内变化，例如为5～200mg/kg；土霉素在抗生素污染的水体中的浓度可在较大范围内变化，例如为1～50mg/L。

其中，本公开的含有树状类芽孢杆菌的固定化微球应用于含有土霉素的水体的方法可以包括：先将微球在含土霉素的废水中曝气活化24h，废水水温30±2℃，曝气量0.3m³/h。然后，在水温30±2℃，废水pH值6.8-7.4,曝气量0.3m³/h，固定化微球填充率10％，水力停留时间48h的条件下，对含10mg/L土霉素的养殖废水进行连续处理。

以下结合实施例进一步详细说明本发明，但是本发明的范围并不限制于以下实施例中。

实施例1

将上述保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌从保藏斜面接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液。

1)将保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌(TF1)接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37℃培养至对数期；

2)将步骤1)得到的菌液在5000rpm条件下离心10min收集菌体，用无菌水洗涤菌体沉淀，重复两次，得到湿菌体；

3)将步骤2)得到的菌泥与活性炭进行混合，吸附8min；

4)将聚乙烯醇和海藻酸钠水溶液分别加热制成凝胶，以重量含量比1:43.33混和海藻酸钠凝胶和聚乙烯醇凝胶，再将混合凝胶与吸附菌泥的活性碳充分混匀；

5)微球中活性炭百分含量为1.5％，海藻酸钠浓度为0.3％，聚乙烯醇浓度为13％，湿菌体与包埋剂的质量比例为1：4；

6)将步骤4)得到的混合物，用50mL注射器缓慢滴入交联剂(4％浓度CaCl₂的硼酸饱和，pH＝7.4)中。于4℃静置交联12h得到直径为3-4mm的固定化微球，取出固定化微球用灭菌生理盐水冲洗3次，4℃下保存备用；

其中，每克固定化微球中，保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌的活菌数为10⁸～10⁹cfu。

实施例2

采用实施例1的种子液，将菌液经无菌过滤，冷冻干燥后分别得到微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为10¹⁰～10¹¹cfu。

实施例3

采用实施例1的方法和材料，不同的是，步骤(3)中，以重量含量比1:60混和海藻酸钠凝胶和聚乙烯醇凝胶，再将混合凝胶与吸附菌泥的活性碳充分混匀。每克本实施例的固定化微球中，保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌的活菌数为10⁸～10⁹cfu。

实施例4

采用实施例1的方法和材料，不同的是，步骤(5)中，微球中活性炭百分含量为0.8％，海藻酸钠浓度为0.1％，聚乙烯醇浓度为10％，湿菌体与包埋剂的质量比例为1：4。每克本实施例固定化微球中，保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌的活菌数为10⁸～10⁹cfu。

对比例1

将对购自鹤壁恒达生物科技有限公司的商品名称为猪粪发酵剂的嗜热、耐热细菌复合菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液待用。采用实施例1的方法将对比例1的菌株制备成固定化微球，记为对比例1的固定化微球，其中，每克固定化微球中，商品名称为猪粪发酵剂的嗜热、耐热细菌菌的活菌数为10⁸～10⁹cfu。

对比例2

将与本申请的保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌一起分离的1株树状类芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，所得的菌液分别记为对比例2的种子液。

采用实施例1的方法分别将对比例2的菌株制备成固定化微球，记为对比例2的固定化微球，其中，每克固定化微球中，对应菌株的活菌数分别为10⁸～10⁹cfu。

测试实施例1：测定菌株对土霉素的降解率

将斜面保藏的实施例1和对比例1～2的种子液分别接种到含10mg/L土霉素的无机盐液体培养基中，设置不加菌液的处理作为空白对照组。37℃、150rpm摇床振荡培养，48h后检测液体培养基中的土霉素的浓度，计算不同菌株的降解率，结果如表1所示。

表1

	浓度(mg/L)	降解率(％)
			实施例1	0.658	93.42
对比例1	2.437	75.63
			对比例2	3.149	68.51

测试实施例2：测定菌剂对水体中的土霉素的降解率

1)分别将实施例1、3、4和对比例1～2的固定化微球在含10mg/L土霉素的废水中曝气活化24h，废水水温30±2℃，曝气量0.3m³/h；

2)在水温30±2℃，废水pH值6.8-7.4,曝气量0.3m³/h，固定化微球填充率10％，水力停留时间48h的条件下，对含10mg/L土霉素的养殖废水进行连续处理；

将等活菌数当量的实施例2的微生物菌剂加入到上述废水中；

在同样条件下，以空白固定化微球作为空白对照。

3)72h后，测定废水中的土霉素浓度，计算土霉素降解率，结果列于表2。

表2

由表1和表2的数据可知，与对比例1-2相比，实施例1使用保藏编号为CGMCCNo.14473的树状类芽孢杆菌及含有该菌的微生物菌剂能够更快速有效地降解土霉素，减少土霉素残留。与实施例2的微生物菌剂相比，实施例1的固定化微球对于含有土霉素的水体有更快速且长效的降解作用。与实施例3和实施例4相比，采用本公开优选的包埋剂为重量含量比为1：(34～52)的海藻酸钠和聚乙烯醇，及以固定化微球的总重量为基准，所述活性炭的重量含量为1.75～2.00％，所述海藻酸钠的重量含量为0.25～0.35％，所述聚乙烯醇的重量含量为12～13％的情况下，本公开的树状类芽孢杆菌CGMCC No.14473的固定化微球对土霉素的降解效率更高，降解更彻底。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种树状类芽孢杆菌，其特征在于，该树状类芽孢杆菌(Paenibacillusdendritiformis)的保藏编号为CGMCC No.14473。

2.一种树状类芽孢杆菌的固定化菌剂，其特征在于，所述固定化菌剂包括固定化材料和负载于所述固定化材料上的保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的固定化菌剂，其中，每克所述固定化菌剂中，保藏编号为CGMCCNo.14473的树状类芽孢杆菌的活菌数为10⁸～10⁹cfu。

4.根据权利要求2所述的固定化菌剂，其中，所述固定化菌剂形成为直径为3～4mm的固定化微球；

所述固定化微球含有固体吸附剂和包埋剂，所述固体吸附剂为活性炭，所述包埋剂为含有海藻酸钠和聚乙烯醇的水凝胶；以所述固定化微球的总重量为基准，所述活性炭的重量含量为1.75～2.0％，所述海藻酸钠的重量含量为0.25～0.35％，所述聚乙烯醇的重量含量为12～13％。

5.根据权利要求4所述的固定化菌剂，其中，所述包埋剂为重量含量比为1：(34～52)的海藻酸钠和聚乙烯醇。

6.根据权利要求4或5所述的固定化菌剂，其中，所述固定化微球通过如下步骤制备：

(1)将保藏编号为CGMCC No.14473的树状类芽孢杆菌接种于液体培养基中，在37℃下培养至对数期，菌液经固液分离、洗涤后得到湿菌体；

(2)将所述湿菌体与所述固体吸附剂进行混合吸附，得到吸附了菌体的吸附剂；

(3)将所述包埋剂制成包埋剂凝胶后与所述吸附了菌体的吸附剂混合，将得到的混合物加入到交联剂中，静置进行交联得到树状类芽孢杆菌的固定化微球；

其中，相对于1重量份所述湿菌体，所述固体吸附剂的用量为0.52～0.82重量份，所述包埋剂凝胶的用量为4～5重量份。

7.根据权利要求6所述的固定化菌剂，其中，所述包埋剂为海藻酸钠和聚乙烯醇，步骤(3)包括：将海藻酸钠水溶液和聚乙烯醇水溶液分别加热制成凝胶后混合，然后将得到的混合凝胶与所述吸附菌体的吸附剂混合。

8.根据权利要求6所述的固定化菌剂，其中，步骤(2)所述的吸附的时间为7～10min；步骤(3)所述的交联包括：在4～6℃下静置进行交联10～14h后洗涤，得到所述树状类芽孢杆菌的固定化微球，所述交联剂为含有质量浓度3.5～4％的CaCl₂的饱和硼酸溶液，所述交联剂的pH为7～8。

9.权利要求1所述的树状类芽孢杆菌或权利要求2～8中任意一项所述的固定化菌剂在降解土霉素中的应用。

10.权利要求1所述的树状类芽孢杆菌或权利要求2～8中任意一项所述的固定化菌剂在修复含有土霉素的水体、土壤和禽畜养殖废弃物中的应用。