CN111423994B - 一种应用于畜禽粪便发酵的菌剂组合及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种应用于畜禽粪便发酵的菌剂组合及其制备和使用方法，属于堆肥领域，本发明利用布氏乳杆菌，地衣芽孢杆菌BNQ‑5，植物乳杆菌BNQ‑32，产朊假丝酵母四种混合益生菌，在四种增效发酵培养混合培养，得到专用于鸡粪、猪粪、羊粪和牛粪的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号四种菌剂，制备过程中新型保护剂的选用及优选菌液吸附物料的选择，使得这些菌剂堆肥升温快，腐熟效果好，不仅适用于南方温暖天气，更适用于北方寒冷天气下的堆肥发酵。有助于养殖户选择更有针对性的发酵菌剂，实现对畜禽粪便的快速发酵腐熟。

Description

一种应用于畜禽粪便发酵的菌剂组合及其制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物菌剂技术领域，具体涉及一种应用于畜禽粪便发酵菌剂组合及其制备和使用方法。
背景技术：
随着畜牧业的发展，畜禽养殖模式逐渐转向规模化、集约化养殖。而畜禽类粪便大量产生，正在成为一项新的主要污染源。未经处理的粪便直接进入农田，不仅严重影响环境，产生有毒臭气和温室气体，还会携带的各种致病微生物和虫卵，严重威胁环境安全。数据显示，我国每年畜禽养殖粪污产生量约38亿吨，随着我国对环境管理越来越规范化，这项新的污染源正在成为制约行业发展的一个重要因素。如何改善畜禽养殖环境、妥善处理废弃物防止污染是亟待解决的问题。
高温堆肥具有成本低廉、能有效杀灭病原菌、改善畜禽粪便的物理性状、无二次污染等优点，是一种比较理想的处理畜禽粪便的方式。近些年，越来越多通过在堆肥过程中加入外源腐熟菌剂，通过这类微生物菌剂的加入，使得升温更快，腐熟更彻底，得到的堆肥品质也更好。
但在北方地区，由于气候寒冷，多数微生物处于休眠状态，冬季堆肥发酵过程基本处于停滞状态，严重影响了正常的粪便处理。
目前，市场上应用的菌剂，多为一种菌剂多种用途，一种菌剂往往既用于农业有机废弃物堆肥处理，又用于养殖场有机废弃物堆肥处理以及畜禽粪便堆肥处理等。因而在实际使用中存在针对性不强，效率不高。尤其在低温环境下，菌剂根本无法发挥作用，所以，不断尝试探求新的应用于畜禽粪便发酵的菌种组合，开发更有针对性，更高效的畜禽粪便发酵菌剂显得尤为重要，也更有实际意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种专门应用于畜禽粪便发酵的菌剂组合，该菌剂组合包含：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号菌剂，分别应用于鸡粪、牛粪、猪粪、羊粪的堆肥发酵。该菌剂采用了增效培养液扩增发酵，引入地衣芽孢杆菌BNQ-5和植物乳杆菌BNQ-32两种低温菌种为菌剂组分，新型保护剂及复合菌液吸附物料的使用，使得该种专用微生物菌剂对畜禽粪便腐熟效果更好。该菌剂组合不仅适合南方温暖天气使用，更适合北方寒冷环境下的堆肥腐熟。
本发明通过以下技术方案实现：
1.本发明提供了一种应用于畜禽粪便发酵的菌剂组合，其特征在于，该菌剂组合是由四种益生菌：布氏乳杆菌，地衣芽孢杆菌BNQ-5，植物乳杆菌BNQ-32，产朊假丝酵母，在四种增效培养液中混合发酵，使用含有茶多糖的新型菌体保护剂，并采用优选菌液吸附物料，制成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号四种菌剂，有效活菌数量不低于1.0×1010CFU/g，分别应用于鸡粪、牛粪、猪粪、羊粪的堆肥发酵，该菌剂组合既适用于南方温暖天气堆肥发酵，更适用于北方严寒天气堆肥发酵，可以在-30℃以下环境温度中正常发酵升温。
2. 一种应用于畜禽粪便发酵菌剂组合的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌种活化复壮：
①菌种：布氏乳杆菌，地衣芽孢杆菌BNQ-5，植物乳杆菌BNQ-32，产朊假丝酵母；
②基础培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，吐温80 1g/L，硫酸镁0.60g/L，硫酸锰0.25g/L, pH 6.2-6.4，121℃，灭菌20min；
③将布氏乳杆菌，地衣芽孢杆菌BNQ-5，植物乳杆菌BNQ-32，产朊假丝酵母培养活化，30-35℃，静置培养24h，制成混合发酵菌液。
（2）菌液扩大培养：
①增效培养液：向步骤（1）基础培养基组分中分别加入10%-15%的鸡粪干粉，10%-15%猪粪干粉，10%-15%羊粪干粉，10%-15%牛粪干粉，对应得到四种增效培养液：Ⅰ号培养液，Ⅱ号培养液，Ⅲ号培养液，Ⅳ号培养液；
②放大发酵过程：将步骤（1）中的混合发酵菌液按照0.5-1：20比例分别加在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号培养液中培养，30-35℃，静置培养24h，分别得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号发酵菌液；
（3）离心处理：将步骤（2）的四种发酵菌液离心得到上清液和菌泥；
（4）保护剂及吸附物料加入：将菌泥量10%的茶多糖和10%的脱脂奶粉用适量的离心上清液混匀，向混匀液中加入10%的吸附物料，连同得到的菌泥，缓慢搅拌10分钟，使菌泥均匀吸附在吸附物料上；
（5）低温干燥：将4种吸附有菌液的吸附物料置于低温干燥箱中，35-45℃烘干，得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号菌剂。
步骤（2）中的鸡粪干粉、猪粪干粉、羊粪干粉及牛粪干粉是将鸡粪、牛粪、猪粪、羊粪分别晾晒，烘干，粉碎，灭菌得到粉碎原料。
步骤（3）中的茶多糖是茶多酚生产过程中，将茶多酚被萃取后的水相，经浓缩、干燥、粉碎、灭菌，得到茶多糖粉末。
步骤（4）中的吸附物料是将玉米淀粉和麸皮等比例混合，磨碎成粉，过30目筛，经灭菌、烘干得到。
按照以上方法得到的Ⅰ号菌剂，适用于鸡粪，Ⅱ号菌剂适用于猪粪，Ⅲ号菌剂适用于羊粪，Ⅳ号菌剂适用于牛粪。
上述菌剂使用时，根据粪便中水分含量的多少和当地资源情况，选择性的向粪便中加入秸秆、锯末、稻壳、草炭土、沼渣或沼液中的两种或两种以上的辅料，辅料添加量在保证堆肥C/N为20:1同时，使得堆肥含水量在55-65%之间，再将菌剂均匀洒在粪便上，逐步放大混匀，保持菌剂和粪便堆料比例为1.25±0.1：1000左右即可。
实际应用中，对于一些畜禽混合粪便，可以按照适合比例将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号四种菌剂按比例混合使用，根据实际使用效果调整比例，可以提升对粪便的腐熟效果。
通过以上过程，可以实施本发明，得到一种专一性强，温度适应范围广的菌剂组合。
本发明使用的微生物菌种地衣芽孢杆菌BNQ-5，植物乳杆菌BNQ-32，是在北方冬季粪便自然发酵条件下，经过连续低温培养、筛选、分离、驯化得到的，这些菌种在低温环境下有着很强的代谢能力。
本发明涉及的地衣芽孢杆菌BNQ-5，菌株Bacillus licheniformis和植物乳杆菌BNQ-32，菌株Lactobacillus Plantarum已于2020年01月16日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号分别为CGMCCNO.19358,CGMCC NO.19359,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，邮编：100101 电话：86-10-64807355
本发明涉及的布氏乳杆菌Lactobacillus buchneri和产朊假丝酵母Candidautilis，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号分别为：CICC 20293和CICC 1314。
本组合菌剂发明过程中，进行了一系列发酵筛选实验，并进行了相关的检测分析，现将部分实验内容和结果介绍如下：
实验涉及的原料及方法：
实验用畜禽粪便有，鸡粪、猪粪、牛粪、羊粪和混合粪便，混合粪便是由鸡粪、猪粪、牛粪及羊粪四种粪便等比均匀混合。种子发芽指数测定方法：蒸馏水和堆肥发酵物料按照10：1的比例浸泡过夜，浸提液滤纸过滤得滤液，利用滤液在25℃，湿度80%，培养种子24小时。所用种子为油菜籽。
菌种分别单独培养发酵实验：布氏乳杆菌，地衣芽孢杆菌BNQ-5，植物乳杆菌BNQ-32，产朊假丝酵母四种菌体分别活化复壮，并发酵得到四种单一菌种的发酵液，然后进行混合发酵堆肥实验，两种混合发酵效果最好的是地衣芽孢杆菌BNQ-5和产朊假丝酵母组合，堆肥发酵第7天升温到60℃，第10天，粪臭味消失，堆肥20天， 24小时种子发芽指数为79±2%。
三种混合发酵效果最好的是地衣芽孢杆菌BNQ-5、产朊假丝酵母和植物乳杆菌BNQ-32组合，堆肥发酵时，第6天升温到60℃，第8天，粪臭味消失，堆肥20天， 24小时种子发芽指数为84±2%，
加入布氏乳杆菌，四种菌液混合得到发酵液进行堆肥发酵时，第4天升温到60℃，第6天，粪臭味消失，堆肥20天， 24小时种子发芽指数为90±2%，
以上实验对比结果显示，四种菌液组合，堆肥发酵效果最优。
菌株混合培养发酵试验：将四种菌混合培养得到的发酵液，同样条件下，进行粪便发酵实验，第3天升温到60℃，第4天，粪臭味消失，堆肥20天，种子发芽指数为91±2%。
因而混合培养发酵液发酵效果要优于单独培养。
增效培养液影响实验：将扩大培养发酵液中添加相应粪便得到的菌剂，与没有添加粪便的培养液对比，结果显示，加了粪便驯化的菌剂堆肥升温时间变短，原先要3-4天完成升温，添加后，缩短了将近1天时间。
茶多糖保护剂使用实验：添加茶多糖保护剂后，得到的菌剂中活菌数量为1.10±0.05×1010CFU/g，去除茶多糖保护剂时，为8.1±0.12×109CFU/g，活菌数降低。堆肥发酵试验也显示，添加茶多糖保护剂后，发酵起始阶段有益菌增殖速度加快，粪堆升温时间由原来的48±2小时缩短到46±2小时。
由玉米淀粉和麸皮组成的吸附物料，不仅有效的吸附了菌液，有利于菌剂的制备，对菌剂在干燥及储存过程中菌体的保护也起着重要的保护作用。
堆肥粪便C/N比及水分调整实验：C/N比不适宜，粪便中含水量过低或者过高，都会出现升温缓慢，堆肥效果差。通过添加秸秆、锯末、稻壳及草炭土等辅料调节C/N比为20：1，含水量在55%-65%，既改善粪堆通气效果，又保证了发酵过程中适宜 的湿度水分，使得菌剂在堆肥中能充分发挥作用，提高了堆肥发酵品质。
分析对比以上实验结果，本发明中菌剂组合制备优势在于：
①本菌剂中四种菌株的联合使用，以及混合培养发酵的方式，使得四种菌实现了更好的协同，达到优势互补，使得堆肥发酵效果更好。菌剂制备过程采用混合培养方式，过程更简单，不易感染杂菌，简化了工艺。
②增效培养液的设计，使得菌剂在制备过程中得到驯化，得到的菌剂针对性更强，使用效果也更好。
③茶多糖保护剂的使用，不仅使得菌剂活菌数量得以保持，由于茶多糖中富含生长因子及多种营养成分，对菌剂在堆肥初始阶段的菌种增殖和堆肥升温也有益处。
④玉米淀粉及麸皮吸附物料的使用，使得菌剂在干燥和后期保藏过程中，菌体得到更好的保护，确保了成品菌剂中的活菌数量高于1.0×1010CFU/g。
⑤菌剂使用时，根据当地资源情况，选择性添加秸秆、锯末、稻壳、草炭土、沼液或沼渣等辅料，一方面调节C/N比及含水量，另一方面充分利用了这些辅料通气性好的特点，使得发酵更彻底，效果更好。
通过本发明得到的菌剂组合有益效果在于：
①本发明得到的四种菌剂，分别针对鸡、猪、羊、牛粪，针对性强，效率更高。
②由于本菌剂所用的地衣芽孢杆菌BNQ-5和植物乳杆菌BNQ-32，都筛选自北方寒冷地区，所以本菌剂组合更适合北方寒冷地区使用。
因而本发明的堆肥发酵菌剂制备工艺路线及得到的菌剂具有很好的应用前景和推广价值。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明，这些实施例，不仅介绍了本发明中菌剂组合的制备和使用过程，还通过与市售发酵菌剂的使用效果对比，进一步介绍了本发明菌剂组合的有益效果。本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种应用于畜禽粪便发酵菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）菌种活化复壮：
①菌种：布氏乳杆菌，地衣芽孢杆菌BNQ-5，植物乳杆菌BNQ-32，产朊假丝酵母；
②基础培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，吐温80 1g/L，硫酸镁0.60g/L，硫酸锰0.25g/L, pH 6.2-6.4，121℃，灭菌20min；
③将布氏乳杆菌，地衣芽孢杆菌BNQ-5，植物乳杆菌BNQ-32，产朊假丝酵母培养活化， 35℃，静置培养24h，制成复合发酵菌液。
（2）菌液扩大培养：
①增效培养液：向步骤（1）中的基础培养基组分中分别加入10%的鸡粪干粉，10%猪粪干粉，10%羊粪干粉，10%牛粪干粉，对应得到四种增效培养液：Ⅰ号培养液，Ⅱ号培养液，Ⅲ号培养液，Ⅳ号培养液；
②放大发酵过程：将步骤（1）中的复合发酵菌液按照0.5：20比例分别加在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号培养液中培养，35℃，静置培养24h，分别得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号发酵菌液；
（3）离心处理：将步骤（2）的四种发酵菌液离心得到上清液和菌泥；
（4）保护剂及吸附物料加入：将菌泥量10%的茶多糖和10%的脱脂奶粉用适量的离心上清液混匀，向混匀液中加入10%的吸附物料，连同得到的菌泥，缓慢搅拌10分钟，让菌泥均匀吸附在吸附物料上；
（5）低温干燥：将4种吸附有菌液的吸附物料置于低温干燥箱中，35-45℃烘干，得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号菌剂。
步骤（2）中的鸡粪干粉、猪粪干粉、羊粪干粉及牛粪干粉是将鸡粪、牛粪、猪粪、羊粪分别晒干，粉碎，灭菌烘干得到的干粉原料。
步骤（3）中的茶多糖是茶多酚生产过程中，将茶多酚被萃取后的水相，经浓缩、干燥、粉碎、灭菌，得到茶多糖粉末。
步骤（4）中的吸附辅料是将玉米淀粉和麸皮等比例混合，磨碎成粉，过30目筛，经灭菌、烘干得到。
按照以上方法得到的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号菌剂。
发酵结束后，检测菌剂活菌总数分别为1.18×1010CFU/g，1.15×1010CFU/g，1.15×1010CFU/g，1.12×1010CFU/g。
实施例2：
一种应用于畜禽粪便发酵菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）复合菌种活化复壮：同实施例1
（2）菌液扩大培养：
①增效培养液：向步骤（1）中的基础培养基组分中分别加入15%的鸡粪干粉，15%猪粪干粉，15%羊粪干粉，15%牛粪干粉，对应得到四种增效培养液：Ⅰ号培养液，Ⅱ号培养液，Ⅲ号培养液，Ⅳ号培养液；
②放大发酵过程：将步骤（1）中的复合发酵菌液按照1：20比例分别加在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号培养液中培养，其他同实施例1；
（3）离心处理：同实施例1；
（4）保护剂及吸附物料的加入：同实施例1；
（5）低温干燥：同实施例1。
按照以上方法得到的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号菌剂。
发酵结束后，检测菌剂活菌总数分别为1.16×1010CFU/g，1.11×1010CFU/g，1.13×1010CFU/g，1.10×1010CFU/g。
以下实施例是上述制备的菌剂组合的实际使用实验，同时，从市场购买了一种专用肥料发酵复合菌剂进行对比实验。
市售专用肥料发酵复合菌剂，标注适用范围为：适用于不同环境下各种畜禽粪便、作物秸秆、藤蔓、树叶杂草、糠渣、蔗渣等废弃物堆肥和发酵腐熟。
为了更好的验证该本发明菌剂组合在不同环境下的发酵效果，分别在南方地区和北方冬季部分养殖场进行了以下对比实验。
购买菌剂的使用方法，按照该菌剂使用说明书操作。
对比实验中检测和记录的结果有：温度，从堆肥30小时开始，每两小时测一次肥堆内部温度，记录肥堆到达60℃所需小时数，同时辨识粪堆臭气散发情况。在粪堆臭味消失后，每天检测一次肥堆温度，中途肥堆温度超过70℃时，要翻堆处理，待到粪堆温度降低，趋于稳定时，堆肥结束，记录堆肥结束时间。检测堆肥的种子发芽指数。
实施例3——实施例10中1、2、3组实验对比表明，在权利要求范围内的堆肥水分（55%-65%）、菌剂添加量（1.25±0.1：1000）以及所述辅料的选择，都能达到预期的发酵效果。故可认为3组实验结果是平行的。
实施例3：
实验地点：南方养猪场，环境温度22℃±4
6吨猪粪，检测含水量为80.5%，分成6堆，每堆1吨，编号1、2、3、4、5、6堆；
1、2、3组为发明菌剂实验组，向1、2、3堆猪粪中加入切碎的秸秆、锯末混合物，使得三堆猪粪的C/N比为20:1，水分分别为55%，60%和65%；然后按照总堆肥质量的1.15：1000，1.25：1000，1.35：1000分别加入Ⅱ号菌剂，先和少量的猪粪混匀，再逐步混匀到整个猪粪堆中，堆肥发酵。
实验结果：
1号肥堆：46小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间62小时，第13天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数94%；
2号肥堆：42小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间64小时，第12天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数91%；
3号肥堆：48小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间66小时，第13天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数90%。
4、5、6组为市购菌剂对比组，参照使用说明；
实验结果：
4号肥堆：50小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间74小时，第15天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数91%；
5号肥堆：56小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间76小时，第14天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数95%；
6号肥堆：52小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间70小时，第15天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数87%。
表1菌剂Ⅱ号和市购菌剂发酵实验数据对比
猪粪 升温时间h 臭气消失h 堆肥结束d 发芽指数%
发明实验组 45.3±2.5a 64.0±1.6a 12.7±0.5a 91.7±1.7
市购对比组 52.6±2.5b 73.3±2.5b 14.7±0.5b 91.0±3.3
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05），没有标注表示差异不显著（P＞0.05）
实施例4：
实验地点：南方养鸡场，环境温度24℃±4
6吨鸡粪，检测含水量为50.5%，分成6堆，每堆1吨，编号1、2、3、4、5、6堆；
调节实验组鸡粪水分和碳氮比的辅料是切碎的秸秆、沼液、沼渣混合物，加入的是Ⅰ号菌剂，其他同实施例3。
实验结果：
1号肥堆：48小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间64小时，第13天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数89%；
2号肥堆：46小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间66小时，第14天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数94%；
3号肥堆：44小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间68小时，第14天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数91%。
4、5、6组为市购菌剂对比组，参照使用说明；
实验结果：
4号肥堆：54小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间74小时，第15天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数89%；
5号肥堆：50小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间70小时，第15天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数93%；
6号肥堆：56小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间76小时，第16天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数91%。
表2菌剂Ⅰ号和市购菌剂发酵实验数据对比
鸡粪 升温时间h 臭气消失h 堆肥结束d 发芽指数%
发明实验组 46.0±1.6a 66.0±1.6a 13.7±0.5a 91.3±2.0
市购对比组 53±2.5b 73±2.5b 15.3±0.5b 91.0±1.6
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05），没有标注表示差异不显著（P＞0.05）
实施例5
实验地点：南方养羊户，环境温度25℃±4
6吨羊粪，检测含水量为65.5%，分成6堆，每堆1吨，编号1、2、3、4、5、6堆；
调节实验组羊粪水分和碳氮比的辅料是切碎的秸秆、稻壳和草炭土混合物，加入的是Ⅲ号菌剂，其他同实施例3。
实验结果：
1号肥堆：46小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间64小时，第14天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数90%；
2号肥堆：42小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间62小时，第13天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数94%；
3号肥堆：44小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间64小时，第13天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数89%。
4、5、6组为市购菌剂对比组，参照使用说明；
实验结果：
4号肥堆：52小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间74小时，第16天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数88%；
5号肥堆：50小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间72小时，第15天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数93%；
6号肥堆：56小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间68小时，第15天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数91%。
表3菌剂Ⅲ号和市购菌剂发酵实验数据对比
羊粪 升温时间h 臭气消失h 堆肥结束d 发芽指数%
发明实验组 44.0±1.6a 63.3±0.9a 13.3±0.5a 91.0±2.1
市购对比组 52.7±2.5b 71.3±2.5b 15.3±0.5b 90.7±2.0
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05），没有标注表示差异不显著（P＞0.05）
实施例6
实验地点：南方养牛场，环境温度20℃±4
6吨牛粪，检测含水量为83.3%，分成6堆，每堆1吨，编号1、2、3、4、5、6堆；
调节实验组羊粪水分和碳氮比的辅料是切碎的秸秆、锯末、稻壳和草炭土混合物，加入的是Ⅳ号菌剂，其他同实施例3。
实验结果：
1号肥堆：44小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间64小时，第13天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数94%；
2号肥堆：42小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间66小时，第13天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数91%；
3号肥堆：48小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间62小时，第12天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数89%。
4、5、6组为市购菌剂对比组，参照使用说明；
实验结果：
4号肥堆：54小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间74小时，第15天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数94%；
5号肥堆：54小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间70小时，第14天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数92%；
6号肥堆：50小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间68小时，第15天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数87%。
表4菌剂Ⅳ号和市购菌剂发酵实验数据对比
牛粪 升温时间h 臭气消失h 堆肥结束d 发芽指数%
发明实验组 44.7±2.5a 64.0±1.6a 12.7±0.5a 91.3±2.0
市购对比组 52.7±1.9b 70.7±2.5b 14.7±0.5b 91.0±2.9
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05），没有标注表示差异不显著（P＞0.05）
以上实施例3——实施例6的实验结果显示，与市购菌剂对比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号菌剂分别有效的缩短了鸡粪、猪粪、羊粪和牛粪堆肥升温时间、臭气消失时间和堆肥结束时间，发明菌剂优于市购菌剂。
以下实施例是冬季在北方养殖场进行的。
实施例7：
实验地点：冬季北方养猪场，夜间最低温度-30±5℃
6吨猪粪，检测含水量为78.5%，分成6堆，每堆1吨，编号1、2、3、4、5、6堆；
调节实验组猪粪水分和碳氮比的辅料是切碎的秸秆、锯末、沼液、沼渣和草炭土混合物，其他同实施例3。
实验结果：
1号肥堆：50小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间66小时，第34天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数91%；
2号肥堆：52小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间70小时，第33天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数92%；
3号肥堆：54小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间68小时，第35天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数92%。
4、5、6组为市购菌剂对比组，堆肥发酵方法参照使用说明；
实验结果：
4号肥堆：60小时，肥堆温度28℃，第15天25℃，第30天24℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度20℃，堆肥的种子发芽指数45%；
5号肥堆：60小时，肥堆温度26℃，第15天20℃，第30天25℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度22℃，堆肥的种子发芽指数35%；
6号肥堆：60小时，肥堆温度20℃，第15天22℃，第30天25℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度23℃，堆肥的种子发芽指数40%。
实施例8：
实验地点：北方养鸡场，夜间最低温度-30±5℃
6吨鸡粪，检测含水量为48.5%，分成6堆，每堆1吨，编号1、2、3、4、5、6堆；
调节实验组鸡粪水分和碳氮比的辅料是切碎的秸秆、锯末、沼液、沼渣混合物，其他同实施例4。
实验结果：
1号肥堆：52小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间68小时，第33天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数93%；
2号肥堆：48小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间72小时，第35天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数90%；
3号肥堆：50小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间70小时，第34天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数91%。
4、5、6组为市购菌剂对比组，堆肥发酵方法参照使用说明；
实验结果：
4号肥堆：60小时，肥堆温度20℃，第15天22℃，第30天25℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度25℃，堆肥的种子发芽指数38%；
5号肥堆：60小时，肥堆温度25℃，第15天30℃，第30天25℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度25℃，堆肥的种子发芽指数42%；
6号肥堆：60小时，肥堆温度30℃，第15天26℃，第30天22℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度20℃，堆肥的种子发芽指数44%。
实施例9：
实验地点：北方冬季养羊场，夜间最低温度-30±5℃
6吨羊粪，检测含水量为65.5%，分成6堆，每堆1吨，编号1、2、3、4、5、6堆；
调节实验组羊粪水分和碳氮比的辅料是切碎的秸秆、稻壳、沼液和草炭土混合物，加入Ⅲ号菌剂，其他同实施例3。
实验结果：
1号肥堆：48小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间72小时，第35天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数91%；
2号肥堆：50小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间68小时，第34天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数92%；
3号肥堆：50小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间68小时，第34天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数90%。
4、5、6组为市购菌剂对比组，堆肥发酵方法参照使用说明；
实验结果：
4号肥堆：60小时，肥堆温度30℃，第15天24℃，第30天26℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度20℃，堆肥的种子发芽指数42%；
5号肥堆：60小时，肥堆温度25℃，第15天22℃，第30天21℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度25℃，堆肥的种子发芽指数39%；
6号肥堆：60小时，肥堆温度27℃，第15天25℃，第30天27℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度26℃，堆肥的种子发芽指数47%。
实施例10
实验地点：北方冬季养牛场，夜间最低温度-30±5℃
6吨牛粪，检测含水量 为83.3%，分成6堆，每堆1吨，编号1、2、3、4、5、6堆；
调节实验组牛粪水分和碳氮比的辅料是切碎的秸秆、锯末、稻壳和草炭土混合物，加入Ⅳ号菌剂，其他同实施例3。
实验结果：
1号肥堆：44小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间64小时，第33天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数94%；
2号肥堆：42小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间66小时，第35天，肥堆温度28℃，堆肥的种子发芽指数91%；
3号肥堆：48小时，肥堆温度60℃，臭气消失时间62小时，第36天，肥堆温度30℃，堆肥的种子发芽指数89%。
4、5、6组为市购菌剂对比组，堆肥发酵方法参照使用说明；
实验结果：
4号肥堆：60小时，肥堆温度32℃，第15天25℃，第30天20℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度22℃，堆肥的种子发芽指数42%；
5号肥堆：60小时，肥堆温度26℃，第15天23℃，第30天20℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度25℃，堆肥的种子发芽指数40%；
6号肥堆：60小时，肥堆温度30℃，第15天26℃，第30天35℃一直臭气较重，第50天，肥堆温度23℃，堆肥的种子发芽指数45%。
实施例7—实施例10的实验结果显示，发明菌剂和市购菌剂堆肥效果差异明显，专用于鸡粪、猪粪、羊粪和牛粪的发明菌剂，在北方冬季严寒的恶劣环境下，堆肥升温快，持续时间长，腐熟效果好，保持较好的发芽指数。而市购菌剂在低温环境下，升温困难，只发生了初步发酵升温，未实现堆肥的彻底腐熟，发酵失败。

Claims (9)

1.一种应用于畜禽粪便发酵的菌剂组合，其特征在于，该菌剂组合是由四种益生菌：布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri），地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BNQ-5，植物乳杆菌（Lactobacillus Plantarum）BNQ-32，产朊假丝酵母（Candida utilis），在四种增效培养液中混合发酵，采用菌体保护剂和菌液吸附物料，制成分别针对鸡粪、猪粪、羊粪和牛粪发酵的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号四种菌剂，所述地衣芽孢杆菌BNQ-5、植物乳杆菌BNQ-32已送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号分别为CGMCC NO.19358、CGMCCNO.19359，所述布氏乳杆菌和产阮假丝酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号分别为：CICC No. 20293和CICC No.1314。
2.根据权利要求1所述的一种应用于畜禽粪便发酵的菌剂组合，其特征在于，所述的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号菌剂中有效活菌数不小于1.0×1010CFU/g。
3.一种应用于畜禽粪便发酵菌剂组合的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种活化复壮：
①菌种：布氏乳杆菌，编号为CICC 20293，地衣芽孢杆菌BNQ-5，编号为CGMCCNO.19358，植物乳杆菌BNQ-32，编号为CGMCC NO.19359，产朊假丝酵母，编号为CICC 1314；
②基础培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，吐温80 1g/L，硫酸镁0.60g/L，硫酸锰0.25g/L,pH 6.2-6.4，121℃，灭菌20min；
③将布氏乳杆菌，地衣芽孢杆菌BNQ-5，植物乳杆菌BNQ-32，产朊假丝酵母混合培养活化，30-35℃，静置培养24h，制成混合发酵菌液；
(2)菌液扩大培养：
①增效培养液：向步骤(1)基础培养基组分中分别加入10％-15％的鸡粪干粉，10％-15％猪粪干粉，10％-15％羊粪干粉，10％-15％牛粪干粉，对应得到四种增效培养液：Ⅰ号培养液，Ⅱ号培养液，Ⅲ号培养液，Ⅳ号培养液；
②放大发酵过程：将步骤(1)中的混合发酵菌液按照0.5-1：20比例分别加在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号培养液中培养，35℃，静置培养24h，分别得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号发酵菌液；
(3)离心处理：将步骤(2)的四种发酵菌液离心分别得到上清液和菌泥；
(4)保护剂及吸附物料加入：将菌泥量1/10的茶多糖和1/10的脱脂奶粉用适量的离心上清液混匀，向混匀液中加入10％的吸附物料，连同得到的菌泥，缓慢搅拌10分钟，使菌泥均匀吸附在吸附物料上；
(5)低温干燥：将4种吸附有菌液的吸附物料置于低温干燥箱中，低温烘干，得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号菌剂。
4.根据权利要求3所述的一种应用于畜禽粪便发酵菌剂组合的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的鸡粪干粉、猪粪干粉、羊粪干粉及牛粪干粉是将鸡粪、猪粪、羊粪、牛粪分别晾晒，烘干，粉碎，灭菌得到粉碎原料。
5.根据权利要求3所述的一种应用于畜禽粪便发酵菌剂组合的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的茶多糖是茶多酚生产过程中，将茶多酚被萃取后的水相，经浓缩、干燥、粉碎、灭菌，得到茶多糖粉末。
6.根据权利要求3所述的一种应用于畜禽粪便发酵菌剂组合的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的吸附物料是由玉米淀粉和麸皮等比例混合，磨碎成粉，过30目筛，经灭菌、烘干得到。
7.一种按照权利要求3所述制备方法制备得到菌剂的使用方法，其特征在于，所述Ⅰ号菌剂适用于鸡粪，Ⅱ号菌剂适用于猪粪，Ⅲ号菌剂适用于羊粪，Ⅳ号菌剂适用于牛粪。
8.根据权利要求7所述的菌剂的使用方法，其特征在于，所述Ⅰ号菌剂使用方法为：根据粪便中水分含量的多少和当地资源情况，选择性的向粪便中加入秸秆、锯末、稻壳、草炭土、沼渣或沼液中的两种或两种以上的辅料，辅料添加量在保证堆肥C/N为20:1同时，使得粪便含水量在55-65％之间，再将菌剂均匀洒在粪便上，逐步放大混匀，保持菌剂和粪便堆料比例为1.25±0.1：1000左右即可，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号菌剂使用方法同Ⅰ号菌剂。
9.根据权利要求7或8所述的菌剂的使用方法，其特征在于，对于畜禽混合粪便，按照适合比例将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号菌剂混合使用。
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