CN114958691A - 一种热噬淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及微生物技术领域，具体公开了一种热噬淀粉芽孢杆菌及其应用，该热噬淀粉芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24739，保藏日期为2022年4月21日。以及利用上述热噬淀粉芽孢杆菌制备的粪便腐熟菌剂和有机肥。使用本申请提供的热噬淀粉芽孢杆菌制成的粪便腐熟菌剂对粪便进行腐熟处理，可以提高粪便腐熟的效率并杀死粪便中的病原菌和虫卵，粪便的腐熟程度高，制成的有机肥毒害作用小，营养物质丰富，种子发芽指数符合国家标准，在农业生产中的具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，更具体地说，涉及一种热噬淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
随着畜禽养殖业的迅速发展，畜禽粪便带来的环保问题日益突出，如果转化为有机肥料，一方面解决了环保问题，另一方面还能够减少化学肥料的使用，提高耕地质量。
目前粪便的腐熟处理中，腐熟效率低、腐熟不彻底等因素制约着粪便的资源化利用效率，解决以上问题对于粪便的资源化利用具有重要意义，市场前景广阔。
传统的自然发酵方法存在升温慢、腐熟不彻底等问题，而且发酵周期长，这样不仅效率低下，还会给环境造成二次污染。
采用沼气池处理技术进行大规模处理，很难达到有机肥的标准。并且单纯采用沼气池进行处理发酵，发酵物中的杂菌、虫卵较多，制成相应的肥料也会成为农作物感染病虫害的主要污染源，不利于农作物的萌发与生长，同时还会给田地造成污染。
发明内容
为了降低腐熟不彻底的粪便对农作物生长的不利影响、提高种子发芽指数，本申请提供一种热噬淀粉芽孢杆菌及其应用，该热噬淀粉芽孢杆菌可以在65～75℃的高温环境下对粪便进行腐熟，提高了腐熟的速度，增加了腐熟的程度，同时可以有效杀灭粪便中的有害菌以及虫卵，制成的有机肥营养丰富，毒害作用小，种子发芽指数高，符合NY/T525-2021的标准。
第一方面，本申请提供一种热噬淀粉芽孢杆菌，采用如下技术方案：
一种热噬淀粉芽孢杆菌，所述热噬淀粉芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24739，保藏日期为2022年4月21日。
本申请中提供的热噬淀粉芽孢杆菌是从鸡粪堆肥中通过梯度升温筛选得到，其可以在65～75℃的高温环境下进行正常的生理代谢并对粪便进行腐熟，应用于粪便的腐熟中，可以减少腐熟所需的时间并提高腐熟的程度。在高温环境下进行腐熟还可以有效杀死粪便中的有害菌以及虫卵，减少有害菌代谢对土壤中有机质的消耗以及对农作物生长的影响，制得的肥料的盐离子浓度适宜，毒害作用小，种子发芽指数高，营养丰富，满足NY/T525-2021的标准，并能够改良土壤的性质。
本申请中，所述种子发芽指数是种子的活力指标，其测定方式参照NY/T525-2021中的规定，具体的计算公式为：
F＝(A1×A2/B1×B2)×100％，
式中，F-种子发芽指数(％)；
A1-有机肥料的浸提液培养的种子中发芽粒数占放入总粒数的百分比(％)；
A2-有机肥料的浸提液培养的全部种子的平均根长数值(mm)；
B1-水培养的种子中发芽粒数占放入总粒数的百分比(％)；
B2-水培养的全部种子的平均根长数值(mm)。
种子发芽指数能够综合反映堆肥对植物的毒性，可用于评价堆肥产品的腐熟度，具有灵敏、可靠的优点。通常，种子发芽指数大于70％，即可认为堆肥对种子基本无毒性。而采用本申请中的热噬淀粉芽孢杆菌对粪便进行腐熟处理，对制成的有机肥进行检测，通过试验分析可知，利用有机肥测得的种子发芽指数符合国家标准，表明其对农作物无毒害作用，具有应用于实际农业生产中的价值。
第二方面，本申请提供一种上述热噬淀粉芽孢杆菌的培养方法，采用如下技术方案：
一种热噬淀粉芽孢杆菌的培养方法，所述热噬淀粉芽孢杆菌的培养方法包括：
将所述热噬淀粉芽孢杆菌接种在培养基中，在65～75℃下培养24～36h。
本申请中，培养所述热噬淀粉芽孢杆菌使用的培养基组分简单，也无需复杂的培养环境，为菌株的实际应用提供了便利。
在一些具体的实施方案中，所述热噬淀粉芽孢杆菌的培养的温度为65～70℃或70～75℃等。
在一个具体的实施方案中，所述热噬淀粉芽孢杆菌的培养的温度为65℃、70℃或75℃等。
在一些具体的实施方案中，所述热噬淀粉芽孢杆菌的培养的时间为24～30h或30～36h等。
在一个具体的实施方案中，所述热噬淀粉芽孢杆菌的培养的时间为24h、30h或36h等。
优选地，所述培养基的pH值为5.5～8.5。
在一些具体的实施方案中，所述培养基的pH值为5.5～7.5或7.5～8.5等。
在一个具体的实施方案中，所述培养基的pH值为5.5、7.5或8.5等。
优选地，所述培养基的盐离子浓度为8％～12％。
在一些具体的实施方案中，所述培养基的盐离子浓度为8％～10％或10％～12％等。
在一个具体的实施方案中，所述培养基的盐离子浓度为8％、10％或12％等。
优选地，所述培养基包括氮源和碳源。
优选地，所述氮源在培养基中的重量百分比为0.1％～2％。
在一些具体的实施方案中，所述氮源在培养基中的重量百分比为0.1％～0.8％、0.1％～1％、0.8％～1％、0.8％～2％或1％～2％等。
在一个具体的实施方案中，所述氮源在培养基中的重量百分比为0.1％、0.8％、1％或2％等。
优选地，所述碳源在培养基中的重量百分比为2％～8％。
在一些具体的实施方案中，所述碳源在培养基中的重量百分比为2％～4.5％、2％～6％、4.5％～6％、4.5％～8％或6％～8％等。
在一个具体的实施方案中，所述碳源在培养基中的重量百分比为2％、4.5％、6％或8％等。
优选地，所述培养基还包括无机盐。
优选地，所述无机盐在培养基中的重量百分比为0.01％～0.1％。
在一些具体的实施方案中，所述无机盐在培养基中的重量百分比为0.01％～0.05％或0.05％～0.1％等。
在一个具体的实施方案中，所述无机盐在培养基中的重量百分比为0.01％、0.05％或0.1％等。
优选地，所述氮源包括有机氮源和无机氮源。
优选地，所述有机氮源包括牛肉膏、蛋白胨和玉米浆中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述无机氮源包括硫酸铵、硫化铵和硝酸铵中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述无机氮源和有机氮源的氮元素含量的比例为1:(0.2～2)。
在一些具体的实施方案中，所述无机氮源和有机氮源的氮元素含量的比例为1:(0.2～0.5)、1:(0.2～1)、1:(0.5～1)、1:(0.5～2)或1:(1～2)等。
在一个具体的实施方案中，所述无机氮源和有机氮源的氮元素含量的比例为1:0.2、1:0.5、1:1或1:2等。
优选地，所述碳源包括葡萄糖、淀粉和麦芽糖中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述无机盐包括氯化钠。
第三方面，本申请提供一种发酵液，采用如下技术方案：
一种发酵液，所述发酵液利用第一方面所述的热噬淀粉芽孢杆菌发酵得到。
第四方面，本申请提供一种菌悬液，采用如下技术方案：
一种菌悬液，所述菌悬液利用第一方面所述的热噬淀粉芽孢杆菌制备得到。
第五方面，本申请提供第一方面所述的热噬淀粉芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液或第四方面所述的菌悬液在制备粪便腐熟菌剂中的应用。
第六方面，本申请提供一种粪便腐熟菌剂，采用如下技术方案：
一种粪便腐熟菌剂，所述粪便腐熟菌剂包括第一方面所述的热噬淀粉芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液或第四方面所述的菌悬液。
本申请中，使用上述粪便腐熟菌剂对粪便进行腐熟处理，制得的有机肥料的盐离子浓度适宜，病原菌以及虫卵的数量明显减少，营养丰富，可以提高土壤中的有机质含量并降低碱解氮、有效磷和速效钾含量，改良土壤的性质，提高种子萌发指数，促进农作物的萌发与生长，具有重要的应用意义。
优选地，所述粪便腐熟菌剂中所述热噬淀粉芽孢杆菌的有效活菌数不低于0.1亿/g。
在一些具体的实施方案中，所述粪便腐熟菌剂中所述热噬淀粉芽孢杆菌的有效活菌数为0.1～0.2亿/g、0.1～0.3亿/g、0.1～0.4亿/g、0.1～0.5亿/g、0.2～0.3亿/g、0.2～0.4亿/g、0.2～0.5亿/g、0.3～0.4亿/g、0.3～0.5亿/g或0.4～0.5亿/g等。
在一个具体的实施方案中，所述粪便腐熟菌剂中所述热噬淀粉芽孢杆菌的有效活菌数为0.1亿/g、0.2亿/g、0.3亿/g、0.4亿/g或0.5亿/g等。
本申请中，相比于现有的腐熟菌剂，本申请中的腐熟菌剂中添加的菌体的数量更少，但腐熟的速度及效果与常规腐熟菌剂相当，甚至更优，提高了热噬淀粉芽孢杆菌利用率的同时，降低了生产的成本。
第七方面，本申请提供第一方面所述的热噬淀粉芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液、第四方面所述的菌悬液或第六方面所述的粪便腐熟菌剂在制备有机肥中的应用。
第八方面，本申请提供一种有机肥，采用如下技术方案：
一种有机肥，所述有机肥包括第一方面所述的热噬淀粉芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液、第四方面所述的菌悬液或第六方面所述的粪便腐熟菌剂。
第九方面，本申请提供第一方面所述的热噬淀粉芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液、第四方面所述的菌悬液或第六方面所述的粪便腐熟菌剂在粪便腐熟中的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请通过梯度升温筛选得到一株热噬淀粉芽孢杆菌，其可在65～75℃的高温环境下对粪便进行腐熟，有利于加速腐熟的速度、提高腐熟的程度并杀死粪便中的有害菌和虫卵，制成肥料后，保证农作物的生长环境中含有更多的营养物质并减轻病原菌以及病虫害的威胁；上述热噬淀粉芽孢杆菌容易培养，培养基成分简单，为相关产品的大规模生产创造了条件。
2.使用上述热噬淀粉芽孢杆菌制备得到的粪便腐熟菌剂可以提高粪便的腐熟速度并提高腐熟的程度，菌剂中的热噬淀粉芽孢杆菌的添加量低于现有技术，但可以达到相近甚至更优的腐熟效果，细菌的利用率高，生产成本低。
3.利用上述粪便腐熟菌剂制备得到的有机肥符合NY/T525-2021的标准，可以改良土壤的有机质含量、盐离子浓度等理化性质，为农作物的萌发与生长提供了更好的环境；腐熟化程度高，毒害作用小，种子发芽指数符合国家标准。
附图说明
图1为实施例2中嗜热菌株的划线培养结果图片。
图2为实施例2中嗜热菌株的系统发育树的构建结果图片。
图3为实施例3提供的一种培养条件下热噬淀粉芽孢杆菌的生长曲线图片。
图4为实施例4提供的另一种培养条件下热噬淀粉芽孢杆菌的生长曲线图片。
具体实施方式
本申请提供一种热噬淀粉芽孢杆菌，所述热噬淀粉芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24739，保藏日期为2022年4月21日。
上述热噬淀粉芽孢杆菌通过梯度升温筛选得到，可在65～75℃下对粪便进行腐熟处理，具有重要的应用价值。
本申请还提供了上述热噬淀粉芽孢杆菌的培养方法，具体包括：
将所述热噬淀粉芽孢杆菌接种在培养基中，在65～75℃下培养24～36h。
具体地，所述培养基的pH值为5.5～8.5，盐离子浓度为8％～12％。
具体地，以重量百分比计，所述培养基包括氮源0.1％～2％、碳源2％～8％和无机盐0.01％～0.1％，余量为去离子水。
具体地，所述氮源包括有机氮源和无机氮源，
所述有机氮源包括牛肉膏、蛋白胨和玉米浆中的任意一种或至少两种的组合，
所述无机氮源包括硫酸铵、硫化铵和硝酸铵中的任意一种或至少两种的组合，
所述无机氮源和有机氮源的氮元素含量的比例为1:(0.2～2)。
具体地，所述碳源包括葡萄糖、淀粉和麦芽糖中的任意一种或至少两种的组合。
具体地，所述无机盐包括氯化钠。
本申请还提供了一种发酵液，所述发酵液利用第一方面所述的热噬淀粉芽孢杆菌发酵得到。
本申请还提供了一种菌悬液，所述菌悬液利用第一方面所述的热噬淀粉芽孢杆菌制备得到。
本申请还提供了一种粪便腐熟菌剂，所述粪便腐熟菌剂包括上述热噬淀粉芽孢杆菌、发酵液或菌悬液。
其中，所述粪便腐熟菌剂中所述热噬淀粉芽孢杆菌的有效活菌数不低于0.1亿/g。
本申请还提供了一种有机肥，所述有机肥包括上述热噬淀粉芽孢杆菌、发酵液、菌悬液或粪便腐熟菌剂。
以下结合实施例1～7、对比例1～4以及附图1～4对本申请的技术方案作进一步说明。
实施例
实施例1
本实施例提供了嗜热菌株的分离方法。该嗜热菌株是从鸡粪堆肥中分离获得的，步骤如下：
将鸡粪与锯末进行混合，调节碳氮比为25:1、水分为60％，混合后的物料堆体成圆锥形，高度不小于1.2m。堆肥开始后，进行温度检测，待堆体温度达到65℃时，从堆肥中心取样，混匀备用。
在90mL液体培养基(以重量百分比计，含葡萄糖6％、牛肉膏0.7％、硫酸铵0.3％和氯化钠0.05％，余量为去离子水)中加入上述混合样品10g，在温度为60℃的环境下振荡培养48h，作为第一培养菌液。
利用移液枪，吸取5mL第一培养菌液，加入到95mL的新鲜液体培养基中，在温度为65℃的环境下振荡培养48h，作为第二培养菌液。
利用移液枪，吸取5mL第二培养菌液，加入到95mL的新鲜液体培养基中，在温度为70℃的环境下振荡培养48h，作为第三培养菌液。
将第三培养菌液梯度稀释后，涂布在固体培养基(以重量百分比计，含葡萄糖6％、牛肉膏0.7％、硫酸铵0.3％、氯化钠0.05％和琼脂粉1.5％，余量为去离子水)表面，将培养平板在温度为70℃的环境下培养24h，对不同形态的单菌落进行分离，进一步纯化，得到嗜热菌株。
将获得的嗜热菌株的培养菌液与50％的甘油溶液按照体积比为1:1混合后，于-80℃下保存。
实施例2
本实施例提供了上述嗜热菌株的鉴定过程。
对实施例1分离得到的嗜热菌株分别进行形态学鉴定、分子生物学鉴定和系统发育鉴定。
形态学鉴定
将嗜热菌株在固体培养基(以重量百分比计，含葡萄糖6％、牛肉膏0.5％、硫酸铵0.5％、氯化钠0.1％和琼脂粉1.5％，余量为去离子水)表面进行划线，在70℃的环境下培养24h，对其形态进行观察。
图1为嗜热菌株的划线培养结果图片。形态学观察结果如表1所示。
表1 嗜热菌株的形态学观察结果
分子生物学鉴定
将保存的菌株接种在液体培养基(以重量百分比计，含葡萄糖6％、牛肉膏0.5％、硫酸铵0.5％和氯化钠0.1％，余量为去离子水)中，70℃的环境下培养24h。
吸取培养后的菌液于离心管中，送交北京擎科生物科技有限公司进行菌株16SrRNA的测序及鉴定。
经测序分析，16S rRNA的基因序列如SEQ ID No.1所示。
系统发育鉴定
根据16S rRNA的测序结果，通过NCBI的BLAST功能进行同源性分析，选取同源性较高的序列，使用MEGA5软件进行多序列比对，构建发育树。结果如图2所示。
图2为嗜热菌株的系统发育树的构建结果图片，可以看出，上述嗜热菌株与热噬淀粉芽孢杆菌的亲缘关系最近，相似度达到99.99％。
综合上述形态学鉴定、分子生物学鉴定和系统发育鉴定的结果，确认该菌株为淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)，将其命名为热噬淀粉芽孢杆菌Bacillusthermoamylovorans J2-5。
将上述热噬淀粉芽孢杆菌Bacillus thermoamylovorans J2-5于2022年4月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.24739。
实施例3
本实施例提供了上述热噬淀粉芽孢杆菌的培养方法。
对实施例2中的热噬淀粉芽孢杆菌进行培养，培养基配方如下：
以重量百分比计，使用的液体培养基配方为葡萄糖6％、牛肉膏0.5％、硫酸铵0.5％和氯化钠0.1％，余量为去离子水。培养基的pH值为7.5，盐离子浓度为8％。
将保存的菌液按照体积比为1:1000接种于上述液体培养基中，在65℃下进行培养，并于培养的6、12、18、24和30h吸取菌液，使用紫外分光光度计测量在OD600处的吸光值，并根据吸光值绘制生长曲线。
图3为本实施例提供的培养条件下热噬淀粉芽孢杆菌的生长曲线图片。由图3可以看出，使用上述培养基在对应的培养条件下进行培养，随着培养时间的延长，菌液的OD600数值呈持续性增长，表明上述培养条件可用于热噬淀粉芽孢杆菌的连续培养中。
实施例4
本实施例提供了上述热噬淀粉芽孢杆菌的培养方法。
对实施例2中的热噬淀粉芽孢杆菌进行培养，培养基配方如下：
以重量百分比计，使用的液体培养基配方为葡萄糖4.5％、牛肉膏0.53％、硫酸铵0.27％和氯化钠0.05％，余量为去离子水。培养基的pH值为8.5，盐离子浓度为10％。
将保存的菌液按照体积比为1:1000接种于上述液体培养基中，在70℃下进行培养，并于培养的6、12、18、24和30h吸取菌液，使用紫外分光光度计测量在OD600处的吸光值，并根据吸光值绘制生长曲线。
图4为本实施例提供的培养条件下热噬淀粉芽孢杆菌的生长曲线图片。由图4可以看出，在上述培养条件下，在0～12h为迟缓期，细菌数目的增长并不明显；在12～18h时，细菌进入对数增长期，细胞数量呈几何级数增长，菌体数量迅速增加；在18～24h内，细菌的增长进入稳定期，菌液的OD值无明显增加，而在24h后，细菌整体进入衰亡期，细胞数量逐渐下降。因此，若采用本实施例中的条件进行热噬淀粉芽孢杆菌的培养，需要根据具体的实验目的确定培养的时间。
实施例5
本实施例提供一种复合菌剂，复合菌剂由微生物粉剂20斤、玉米芯粉(由北京世纪阿姆斯生物工程有限公司提供)30斤和沸石粉(由北京世纪阿姆斯生物工程有限公司提供)50斤组成。
上述微生物粉剂中包括枯草芽孢杆菌和热噬淀粉芽孢杆菌，热噬淀粉芽孢杆菌为实施例2中的热噬淀粉芽孢杆菌Bacillus thermoamylovorans J2-5微生物粉剂中枯草芽孢杆菌的数量为6.25亿/g，热噬淀粉芽孢杆菌的数量为6.25/g亿。复合菌剂中枯草芽孢杆菌和热噬淀粉芽孢杆菌的有效活菌数均为1.25亿/g，复合菌剂的总有效活菌数为2.5亿/g。
将微生物粉剂、玉米芯粉和沸石粉充分混合，制成上述复合菌剂。
其中，上述微生物粉剂的制备方法如下：利用实施例3所述的培养方法培养热噬淀粉芽孢杆菌，在37℃下培养枯草芽孢杆菌，获得枯草芽孢杆菌发酵液和热噬淀粉芽孢杆菌发酵液，并将上述两种发酵液制备成粉末，混合，即可获得微生物粉剂。
对比例1
本对比例提供一种复合菌剂，与实施例5的区别仅在于，本对比例中，利用保藏编号为CGMCC No.6153(该菌株的培养温度为45～55℃)的热噬淀粉芽孢杆菌替代微生物粉剂中的热噬淀粉芽孢杆菌，其余组分、添加量及制备方法均与实施例5相同。
对比例2
本对比例提供一种复合菌剂，与实施例5的区别仅在于，本对比例中，利用保藏编号为CGMCC No.19551(该菌株的培养温度为50～60℃)的热噬淀粉芽孢杆菌替代微生物粉剂中的热噬淀粉芽孢杆菌，其余组分、添加量及制备方法均与实施例5相同。
对比例3
本对比例提供一种市售复合菌剂，上述复合菌剂中的微生物种类为枯草芽孢杆菌和黑曲霉，上述复合菌剂中的总有效活菌数为5亿/g。
对比例4
本对比例提供一种市售复合菌剂，上述复合菌剂中的微生物种类为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，上述复合菌剂中的总有效活菌数为10亿/g。
实施例6
本实施例使用实施例5、对比例1～4中的复合菌剂对鸡粪进行腐熟处理，步骤如下：
将复合菌剂与鸡粪按照重量比为1:1000混合，其中鸡粪的水分在60％，混合均匀后进行高温堆肥，粪堆高度在0.7m以上，环境温度在20℃以上。
堆温升至50℃后开始翻倒，每2天翻堆1次，持续30天。
陈化后，上述鸡粪完成腐熟。
对鸡粪在腐熟过程中的温度进行检测，统计使用上述各组菌剂进行腐熟处理的鸡粪达到50℃所需的时间、温度高于50℃的持续时间以及所能达到的最高温度，结果如表2所示。
表2 各组复合菌剂用于鸡粪腐熟的统计结果
| 组别 | 达到50℃时间(d) | ≥50℃持续时间(d) | 最高温度(℃) |
| 实施例5 | 2 | 12 | 70.2 |
| 对比例1 | 2 | 9 | 61.3 |
| 对比例2 | 2 | 10 | 68.7 |
| 对比例3 | 2 | 9 | 63.9 |
| 对比例4 | 2 | 10 | 67.2 |
由表2可知，使用上述5组复合菌剂对鸡粪进行腐熟处理，堆温升至50℃所需的时间相同，均为2天，证明上述复合菌剂的初始升温速度相近。但高温持续时间与所能达到的最高温度不同。
将实施例5的结果与对比例3～4进行比较，可以看出，使用实施例5中的复合菌剂腐熟后鸡粪的高温持续时间长于对比例3和4，达到的最高温度也高于对比例3和4。堆温温度高于50℃的持续时间长有利于加速腐熟的进程，堆温温度高则有利于杀灭粪便中的病原菌和虫卵。上述结果说明采用本申请中的热噬淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌制成的复合菌剂的腐熟效果优于市售产品(对比例3和4)。另外，更为重要的是，实施例5中的总有效活菌数为2.5亿/g，而对比例3和4的总有效活菌数依次为5亿/g和10亿/g，明显高于实施例5中的微生物添加量，表明采用本申请中的热噬淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌制成的复合菌剂可以在有效活菌数低于现有技术的前提下，加速腐熟的速度并提高腐熟的程度，从而提高原料的利用率，降低生产成本，对于实际的农业生产具有重要的意义。
将实施例5的结果与对比例1～2进行比较，可以看出，在采用相同的复合菌剂配方以及保证相同的总有效活菌数的前提下，采用本申请中的热噬淀粉芽孢杆菌可以延长高温腐熟的时间并提高堆温的最高温度，表明本申请中的热噬淀粉芽孢杆菌对于粪便的腐熟效果优于其他的嗜热热噬淀粉芽孢杆菌(对比例2)，更优于采用常规培养温度的热噬淀粉芽孢杆菌(对比例1)，对于粪便的腐熟处理具有重要的意义。
对鸡粪在腐熟过程中的盐离子浓度变化进行检测，在堆肥后的第1、3、6、9、12、15、18、21、24、27和30天，取10g新鲜样品放入锥形瓶中，并加入10mL蒸馏水，混合搅拌0.5h。提取上清液，使用电导率仪进行测定，结果如表3所示。
表3 各组鸡粪腐熟过程中的盐离子浓度变化结果
土壤溶液的盐离子浓度与其中的溶质浓度直接相关，通常认为，肥料的盐离子浓度在3mS/cm以下有利于农作物的生长，若盐离子浓度过高，则会因土壤溶液的浓度高于农作物根部细胞的细胞液的浓度而使农作物无法吸收土壤中的水分和无机盐，甚至使根部的水分倒流到土壤中而发生“烧苗”现象。
由表3可以看出，使用不同组别的复合菌剂处理后的鸡粪的盐离子浓度均呈现先升高后降低的趋势，这与粪便腐熟过程中的盐离子浓度变化的趋势相符。
将实施例5与对比例3～4进行比较，可以看出，腐熟30天后，3组处理后的粪便的盐离子浓度均低于3mS/cm，浓度适宜，不会对农作物的生长产生不利影响，但使用实施例5中的复合菌剂腐熟后的粪便在处理后第24天，盐离子浓度即低于3mS/cm，而对比例3是在处理后第30天，盐离子浓度才低于3mS/cm，对比例4是在处理后第27天，盐离子浓度才低于3mS/cm，这也表明了采用实施例5中的复合菌剂可以对粪便进行更加快速的腐熟处理。并且，考虑到对比例3和4中添加的有效活菌数远高于实施例5，进一步说明了实施例5的复合菌剂的腐熟效率更高，具有更高的应用价值。
将实施例5与对比例1～2进行比较，可以看出，对比例1在处理后第30天盐离子浓度低于3mS/cm，对比例2在处理后第27天盐离子浓度低于3mS/cm，证明实施例5中的复合菌剂的腐熟效率更高，证明在采用相同的菌剂配方以及相同活菌数添加量的基础上，本申请中的热噬淀粉芽孢杆菌对粪便的腐熟效率优于其他的嗜热热噬淀粉芽孢杆菌(对比例2)和常规培养温度的热噬淀粉芽孢杆菌(对比例1)，利用其制成的粪便腐熟菌剂的腐熟效率更高，腐熟后制得的有机肥更有利于农作物的生长。
实施例7
本实施例对实施例6中5种腐熟后的鸡粪的腐熟程度及性质进行检测，具体包括种子发芽指数测定、蛔虫卵死亡率测定和粪大肠菌群数测定。
种子发芽指数测定
取10g新鲜的、腐熟天数依次为1、3、6、9、12、15、18、21、24、27和30天的鸡粪样品放入锥形瓶中，按固液比为1:10加入蒸馏水，混合搅拌1h，静置0.5h。
将双层滤纸放入培养平板中，然后将静置上清液均匀加入到平板的滤纸上，上清液渗透双层滤纸为宜，最后加入准备好的小油菜种子10粒。在环境温度为25℃的条件下，避光培养48h。统计发芽种子的粒数，并由游标卡尺逐一测量主根长度，用无菌水作为对照，重复3次。计算公式如下：
种子发芽指数(GI)＝(样品处理组种子发芽率×种子根长)/(水样对照组种子发芽率×种子根长)×100％。
结果如表4所示。
表4 各组腐熟后鸡粪的种子发芽指数测定结果
由表4可以看出，随着腐熟时间的延长，使用上述不同组别的菌剂腐熟后的鸡粪的种子发芽指数均呈现不断增长的趋势。根据NY/T525-2021中的规定，种子发芽指数大于70％即可认为堆肥对种子无毒性。使用实施例5制备的复合菌剂腐熟处理18天的鸡粪的种子发芽指数即达到了71.3％；腐熟30天后，鸡粪的种子发芽指数可达80.6％，说明粪便的腐熟程度很高，对农作物生长无毒性。
将实施例5与对比例3～4进行比较，可以看出，使用对比例3和4中的复合菌剂均是在腐熟后第21天粪便的种子发芽指数才超过了70％，且腐熟30天后的粪便的种子发芽指数也低于实施例5，未达到80％，证明对比例3和4中的复合菌剂对粪便的腐熟速度及程度均低于实施例5，由此可知将实施例5中的热噬淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌混合制成的复合菌剂，可以在有效活菌数低于市售产品的前提下产生更优的腐熟效果，毒害作用小、腐熟速度快，在农业生产中具有实际应用的价值。
将实施例5与对比例1～2进行比较，使用对比例1中的复合菌剂腐熟处理21天后的粪便的种子发芽指数超过70％，证明对比例1中的腐熟后粪便的腐熟速度低于实施例5；使用对比例2中的复合菌剂腐熟处理18天后的鸡粪的种子发芽指数超过70％，但使用其腐熟处理18～30天的鸡粪的种子发芽指数均低于实施例5，表明其对于粪便的腐熟速度略慢于实施例5。因此，在采用相同的复合菌剂配方、添加相同有效活菌数的前提下，本申请中的热噬淀粉芽孢杆菌相比于其他的嗜热热噬淀粉芽孢杆菌(对比例2)和常规培养温度的热噬淀粉芽孢杆菌(对比例1)，具有更快的腐熟速度，对于缩短粪便的腐熟时间、提高粪便腐熟处理的速度具有重要的意义。
蛔虫卵死亡率测定
参照NY525-2012中的标准方法进行测定。
粪大肠菌群数测定
参照NY525-2012中的标准方法进行测定。
蛔虫卵死亡率和粪大肠菌群数测定的结果如表5所示。
表5 各组腐熟后鸡粪的蛔虫卵死亡率和粪大肠菌群数测定结果
| 组别 | 粪大肠菌群数(个/g) | 蛔虫卵死亡率(％) |
| 实施例5 | 55 | 86 |
| 对比例1 | 84 | 76 |
| 对比例2 | 78 | 77 |
| 对比例3 | 85 | 75 |
| 对比例4 | 80 | 79 |
由表5可知，使用实施例5组的复合菌剂腐熟后的粪便的粪大肠菌群数更低，蛔虫卵死亡率更高，因而制成相应的有机肥后，可以降低病原菌或虫卵对农作物生长的不利影响，并减少病原体的传播。结合表2中的数据，可知堆肥中高温持续的时间越长，堆温的最高温度越高，对于粪便中病原菌和虫卵的灭杀效果越好。
将实施例5与对比例3～4进行比较，可以看出，实施例5组处理后粪便的粪大肠菌群数显著低于对比例3和4，蛔虫卵死亡率显著高于对比例3和4，说明采用实施例5中热噬淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌形成的复合菌剂可以在有效活菌数更低的前提下达到更好的病原菌、虫卵灭杀效果，这对于保证有机肥产品的安全性具有重要的意义。
将实施例5与对比例1～2进行比较，可以看出，在复合菌剂的配方以及有效活菌添加量相同的前提下，本申请中的热噬淀粉芽孢杆菌对于粪便中的病原菌以及虫卵的杀灭效果更好，明显优于现有的嗜热热噬淀粉芽孢杆菌(对比例2)和常规培养温度的热噬淀粉芽孢杆菌(对比例1)，为复合菌剂的制备提供了新的原料。
综合上述结果，可以看出，本申请中的热噬淀粉芽孢杆菌可以提高粪便的腐熟效率，高效杀死粪便中的病原菌和有害虫卵，腐熟处理30天后的粪便的种子发芽指数可达80％以上，优于现有技术中的常温热噬淀粉芽孢杆菌以及嗜热热噬淀粉芽孢杆菌。与现有的市售菌剂相比，可以在减少有效活菌数的前提下达到相近甚至更优的技术效果，降低了生产及使用成本，对于粪便处理以及农作物培养均具有重要的意义。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 北京世纪阿姆斯生物工程有限公司
<120> 一种热噬淀粉芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1415
<212> DNA
<213> 热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)
<400> 1
gtcgagcgaa caataagaag cttgcttttt gttggttagc ggcggacggg tgagtaacac 60
gtgggtaacc tgcctgtaag accgggataa ctccgggaaa ccggtgctaa taccggatag 120
attatctttc cgcctggaga gataaggaaa gatggctttt gccatcactt acagatgggc 180
ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga 240
cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300
gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagngaag 360
aaggtcttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtatcgga ggaaatgccg 420
gtaccttgac ggtacctgac gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggtcctt 540
taagtctgat gtgaaatctt gcggctcaac cgcaagcggt cattggaaac tgggggactt 600
gagtgcagaa gaggaaagcg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 660
gaacaccagt ggcgaaggcg gctttctggt ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg 720
gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 780
tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 840
cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900
ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatctcct gaccgccctg 960
gagacagggt cttcccttcg gggacaggat gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1020
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttggttct agttgccagc 1080
attcagttgg gcactctaga gcgactgccg gcgacaagtc ggaggaaggt ggggatgacg 1140
tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaaag 1200
ggcagcgaag cggcgacgca tnagcgaatc ccagaaaacc attctcagtt cggattgcag 1260
gctgcaactc gcctgcatga agccggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg 1380
aagtcggtga ggtaaccgna aggagccagc cgccg 1415
Claims (10)
1.一种热噬淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述热噬淀粉芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 24739，保藏日期为2022年4月21日。
2.一种权利要求1所述的热噬淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述热噬淀粉芽孢杆菌的培养方法包括：
将所述热噬淀粉芽孢杆菌接种在培养基中，在65~75℃下培养24~36 h。
3.一种发酵液，其特征在于，所述发酵液利用权利要求1所述的热噬淀粉芽孢杆菌发酵得到。
4.一种菌悬液，其特征在于，所述菌悬液利用权利要求1所述的热噬淀粉芽孢杆菌制备得到。
5.权利要求1所述的热噬淀粉芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液或权利要求4所述的菌悬液在制备粪便腐熟菌剂中的应用。
6.一种粪便腐熟菌剂，其特征在于，所述粪便腐熟菌剂包括权利要求1所述的热噬淀粉芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液或权利要求4所述的菌悬液。
7.根据权利要求6所述的粪便腐熟菌剂，其特征在于，所述粪便腐熟菌剂中所述热噬淀粉芽孢杆菌的有效活菌数不低于0.1亿/g。
8.权利要求1所述的热噬淀粉芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液、权利要求4所述的菌悬液或权利要求6~7任一项所述的粪便腐熟菌剂在制备有机肥中的应用。
9.一种有机肥，其特征在于，所述有机肥包括权利要求1所述的热噬淀粉芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液、权利要求4所述的菌悬液或权利要求6~7任一项所述的粪便腐熟菌剂。
10.权利要求1所述的热噬淀粉芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液、权利要求4所述的菌悬液或权利要求6~7任一项所述的粪便腐熟菌剂在粪便腐熟中的应用。
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Citations (1)
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| CN109402015A (zh) * | 2018-11-20 | 2019-03-01 | 江南大学 | 一株热噬淀粉芽孢杆菌及其应用 |
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2022
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