CN106834159B - 一株hs233菌株及其在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株HS233菌株及其在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用，所述HS233菌株于2016年10月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为GDMCC No：60098。HS233菌株在生长和代谢过程中除了能将镉富集与细胞内之外，该菌株还能分泌小分子物质至胞外与有效镉结合，降低有效镉的含量，从而两方面实现降低溶液中镉含量的目的。因此，HS233菌株可以用于制备耐镉和/或降低镉重金属的菌剂，用于受镉污染的水资源和耕地土壤中。

Description

一株HS233菌株及其在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用

技术领域

本发明涉及重金属污染生物防治技术领域，具体地，涉及一株HS233菌株及其在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用。

背景技术

镉（Cadmium，Cd）是人体非必需元素，广泛存在于自然环境中，且常以化合物状态存在并不能降解，是环境中生物毒性最强的重金属元素之一。其对土壤的污染来源也有多种来源，如工业金属冶炼，生活污水，肥料的使用等。在动植物中却有很强的积累性；在人体中，即使低浓度镉也会对人体造成伤害，如与含巯基的蛋白质结合，抑制酶活性，引发疾病。水稻等多种粮食作物对重金属有较强的富集作用，是吸收镉能力最强的谷类作物。其主要的吸收途径是通过食物、水和空气而进入并在体内蓄积下来，如上世纪发生在日本富山县通川流域的“骨痛病”，就是由于当地居民长期食用含镉超标大米所致，以及还有湖南衡阳的镉大米事件等。现如今主要的粮食作物耕地正处于镉污染状态，因此减少耕地中的镉含量以及降低有效镉含量至关重要。

Kosakonia sacchari是一类固氮菌，对宿主植物无害，反而可以促进宿主植物的生长。其既可以生活于根际土壤中，又可以定殖于植物内部。在根际土壤中可以提高土壤中土壤酶的活性，并且高产吲哚乙酸、铁载体，溶磷，还具有产生长素能力。1994年发现Enterobacter sacchari，后改名为Kosakonia sacchari以来，其研究都是围绕在系统发育学中的地位，而实际应用并没有受到关注，因此对此菌株开发利用具有潜在的实际应用价值。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供了一株Kosakonia sacchari HS233菌株。所述菌株具有快速繁殖、生长势良好、具有分泌促生长物质生长素的能力，并且具有固氮能力的Kosakonia sacchari。

本发明的另一目的在于提供Kosakonia sacchari HS233菌株在耐镉生长和/或降低溶液中有效镉含量的中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一株Kosakonia sacchariHS233菌株，所述菌株于2016年10月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为GDMCC No：60098，分类命名为Kosakoniasacchari，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

所述Kosakonia sacchariHS233菌株具有如下形态和生理、生化特性：

a、菌体形态特性：Kosakonia sacchariHS233菌株呈棒杆状。

b、菌落形态特性：在LB琼脂平板上生长速度较快，菌落圆形，呈现米白色，中间凸起（37℃，生长24小时），菌落直径8～12毫米。pH生长范围较广，可耐pH值4～10，最适生长温度是37℃及最佳生长pH值7。

c、生理生化特性：兼性好氧，能以乳酸钠，盐酸胍，柠檬酸钠，蔗糖，山梨醇，腐胺，蜜二糖, D-阿拉伯糖，棉籽糖，D-葡糖，明胶，果胶，糊精，α-D-乳糖，D-甘露糖，D-甘露醇，N-乙酰羟脯氨酸， D-半乳糖醛酸盐，甲基丙酮酸，麦芽糖，D-果糖，L-丙氨酸， L-半乳糖酸内脂，三羟基丁酸，甲基葡萄糖苷，D-半乳糖，肌醇，葡萄糖酸钠，纤维素二塘，水杨苷，3-甲基葡萄糖，甘油，L-天冬氨酸，D-葡萄糖醛酸盐，柠檬酸钠，龙胆二糖，N-乙酰葡萄糖胺，D-岩藻糖，6-磷酸-葡糖，L-谷氨酸，N-乙酰甘露糖胺， L-岩藻糖， 6-磷酸-果糖，粘酸，松二糖，N-乙酰半乳糖胺，L-苹果酸，乙酸钠，肌苷， L-丝氨酸，D-葡二酸，溴代丁二酸，L-鼠李糖,羟基苯乙酸为碳源的培养基上生长。菌株耐NaCl的浓度达4.0%；对5μg/mL卡拉霉素、庆大霉素、四环素，50μg/mL新霉素100μg/mL链霉素，300μg/mL氨苄青霉素、红霉素均具有耐受性；而对氯霉素耐受性差、低浓度（5μg/mL）就能抑制其生长。

进一步地，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

所述Kosakonia sacchari HS233菌株能够在液体培养基中快速大量繁殖，将溶液中大部分的镉富集与细胞内，并且可以释放小分子物质至细胞外与溶液中的有效镉结合，解除隔的有效性和毒害作用，从而降低了溶液中的镉含量以及溶液中有效镉的含量。因此，本发明要求保护Kosakonia sacchari HS233菌株在耐镉生长和/或降低溶液中有效镉含量的中的应用。

一种耐镉和/或降低有效镉含量的菌剂，含有如上所述的Kosakonia sacchariHS233菌株及辅料。

优选地，所述菌剂中Kosakonia sacchari HS233菌株的细胞密度OD₆₀₀为1。

一种耐镉和/或降低有效镉含量的方法，将如上所述Kosakonia sacchari HS233菌株制成OD₆₀₀为1的种子液，然后将种子液接种于镉污染的样品中，30～37℃培养3～36h。

优选地，所述种子液接种于镉污染的样品中后，Kosakonia sacchari HS233菌株在镉污染的样品中的最终细胞浓度OD₆₀₀为0.025。

优选地，种子液接种于镉污染的样品中后在37℃培养24h，处理镉的效果最好。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：

本发明提供了一株Kosakonia sacchariHS233菌株，该菌株在含镉环境下的繁殖过程中能将大量镉富集与胞内，并且可分泌大量可与镉相互结合的小分子物质，将胞外的有效镉螯合成为无效镉，从而降低胞外有效镉含量，达到解除有效镉的毒害。其可以制备成为微生物肥料或者环境净化工程菌，应用于农业生产和环境改良等方面。

附图说明

图1为菌株HS233接种到不同浓度含镉液体培养基中，不同时间处理后各处理的镉浓度；其中镉浓度分别为100、200、400μM。L代表离心处理后得上清液，G代表过滤处理后得滤液。

图2为菌株HS233的菌落图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

一、菌株的分离和纯化：发明人通过分离纯化广西梧县野生稻中的内生菌获得Kosakonia sacchariHS233，具体分离纯化步骤如下：将从广西梧县采取回来的野生稻用自来水冲洗干净，再用将从广西采取回来的野生稻用蒸馏水洗净，剪下长度3～5cm根、茎、叶分别置于已灭菌的3个培养皿中，用70%乙醇浸泡5min，再用0.1%的次氯酸钠浸泡10min，无菌水洗涤10次，每次10min，并将最后一次洗涤液涂布于固体培养基，以检测体外消毒是否彻底。将表面消毒完全的根、茎、叶用灼烧过的剪刀剪碎，用灭过菌的碾砵碾碎，再用磷酸缓冲液悬浮。取20μL上清液于1mL无菌水中稀释，再取20μL稀释至1mL，后取20μL涂布于灭菌的LB固体平板培养基中，将平板于37℃培养箱中培养。观察菌体的生长情况，用接种环挑取长势较好并不同形态特征的菌苔，用平板划线法进行反复传代培养，直至菌落的颜色、形状、大小、质地和透明度一样。最后通过简单染色（石碳酸复红染色）和显微镜镜检（油镜），进一步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。纯化后的菌株于15%的甘油中-20℃和-80℃保存。

二、菌株的筛选：

1、对步骤一所分离、纯化到的菌株划线于固体LB培养基平板，24h后将纯化的内生菌接种到8mL含400 μmol mL^-1镉的LB液体培养基中，37℃ 120rpm 培养24h，观察菌体生长情况，挑选出生长良好的菌体进行初筛。

2、将步骤1得到具有耐镉生长的菌株，接种到100mL含0、100、200、400 μmol.mL^-1镉的LB液体培养基中，37℃ 120rpm培养0、3、6、9、12、24和36h，期间各采样一次进行样品处理。

于0、3、6、9、12、24和36h采取的菌液样品进行处理：13000 rpm离心，获得上清液；一部分上清液用0.22 μm的过滤器进行过滤得滤液，样品处理后利用原子吸收分光光度计测定处理液中的镉含量。在测定不同处理液中的镉含量后，数据如图1，图1结果表明HS233具有将培养基中的镉富集与菌体细胞内，并且同样会分泌胞外蛋白将有效镉螯合成为无效镉，从而降低溶液中的镉含量。

而且，在不同浓度镉处理下，菌株HS233在处理不同时间后，溶液中的镉含量呈现下降趋势，并且过滤后滤液中的镉含量明显少于离心上清液中。且在36h后，100μM过滤滤液中的镉含量由原来的11.25mg/L降至0.0156 mg/L；200μM（22.5mg/L）镉浓度下，离心液上清液中的镉含量降至7.0980 mg/L，过滤滤液中的镉含量降至1.5201mg/L；400μM（45mg/L）镉浓度下，离心液上清液中的镉含量降至14.6668 mg/L，过滤滤液中的镉含量降至3.6841mg/L。表明菌株HS233具有耐镉生长特性，具有将胞外的镉富集于胞内的能力，并且分泌胞外物质与胞外的有效镉结合，使之成为无效镉，从而缓解镉的毒害作用。

因此，采用上述方法成功筛选获得一株能对镉具有强耐受性且降低溶液中可溶性镉含量和更低的有效镉含量的菌株，命名为HS233。将分离纯化后的菌株HS233在LB平板上培养1～2 d后，收集平板上的菌体。保存于15%灭菌甘油(-20 ℃和-80℃)。

实施例2

菌株的鉴定及保藏：实施例1分离得到的一株Kosakonia sacchari具有如下形态和生理、生化特性：

a、菌体形态特性：Kosakonia sacchari细胞呈棒杆状。

b、菌落形态特性：在LB琼脂平板上生长速度较快，菌落圆形，呈现米白色，中间凸起（37℃，生长24小时），菌落直径8～12毫米（如图1）。pH生长范围较广，可耐pH值4～10，最适生长温度是37℃及最佳生长pH值7。

c、生理生化特性：兼性好氧，能以乳酸钠，盐酸胍，柠檬酸钠，蔗糖，山梨醇，腐胺，蜜二糖, D-阿拉伯糖，棉籽糖，D-葡糖，明胶，果胶，糊精，α-D-乳糖，D-甘露糖，D-甘露醇，N-乙酰羟脯氨酸， D-半乳糖醛酸盐，甲基丙酮酸，麦芽糖，D-果糖，L-丙氨酸， L-半乳糖酸内脂，三羟基丁酸，甲基葡萄糖苷，D-半乳糖，肌醇，葡萄糖酸钠，纤维素二塘，水杨苷，3-甲基葡萄糖，甘油，L-天冬氨酸，D-葡萄糖醛酸盐，柠檬酸钠，龙胆二糖，N-乙酰葡萄糖胺，D-岩藻糖，6-磷酸-葡糖，L-谷氨酸，N-乙酰甘露糖胺， L-岩藻糖， 6-磷酸-果糖，粘酸，松二糖，N-乙酰半乳糖胺，L-苹果酸，乙酸钠，肌苷， L-丝氨酸，D-葡二酸，溴代丁二酸，L-鼠李糖,羟基苯乙酸为碳源的培养基上生长。菌株耐NaCl的浓度达4.0%；对5μg/mL卡拉霉素、庆大霉素、四环素，50μg/mL新霉素100μg/mL链霉素，300μg/mL氨苄青霉素、红霉素均具有耐受性；而对氯霉素耐受性差、低浓度（5μg/mL）就能抑制其生长。

所述Kosakonia sacchari HS233菌株的分子分类地位的确定：采用细菌16S rDNA基因通用引物进行扩增，将PCR产物直接进行测序，获得菌株的16S rDNA序列（如SEQ IDNO：1所示），将16S rDNA序列输入GenBank进行Blast比对，初步确定本发明的HS233菌株在分类学中的属、种的位置。结果发现本发明的HS233，与Kosakonia sacchari模式菌株SP1相似性为99.67%，结合上述形态学特征、生理生化特性、16S rDNA系统发育分析及文献查阅，本发明的HS233应归属于Kosakonia sacchari。

本发明所述的Kosakonia sacchari HS233已于2016年10月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为GDMCC No：60098，分类命名为Kosakonia sacchari，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一株HS233菌株及其在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1497

<212> DNA

<213> 16SrDNA

<400> 1

agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacatatg caagtcgaac 60

ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac gagtggcgga cgggtgagta atgtctggga 120

aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc taataccgca taatgtcgca 180

agaccaaaga gggggacctt cgggcctctt gccatcagat gtgcccagat gggattagct 240

agtaggtggg gtaacggctc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca 300

gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360

cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt 420

aaagtacttt cagcggggag gaaggggata aggttaataa ccttattcat tgacgttacc 480

cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc 540

gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca cgcaggcggt ctgtcaagtc ggatgtgaaa 600

tccccgggct caacctggga actgcatccg aaactggcag gcttgagtct cgtagaggga 660

ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa 720

ggcggcctcc tggacgaaga ctgacgctca ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780

agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgtctatttg gaggttgtgc ccttgaggcg 840

tggcttccgg agctaacgcg ttaaatagac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa 900

ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa 960

cgcgaagaac cttacctggt cttgacatcc acagaacttg ccagagatgg tttggtgcct 1020

tcgggaactg tgagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg 1080

ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc ctttgttgcc agcggttagg ccgggaactc 1140

aaaggagact gccagtgata aactggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc 1200

cttacgacca gggctacaca cgtgctacaa tggcgcatac aaagagaagc gacctcgcga 1260

gagcaagcgg acctcataaa gtgcgtcgta gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca 1320

tgaagtcgga atcgctagta atcgtggatc agaatgccac ggtgaatacg ttcccgggcc 1380

ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc 1440

ttcgggaggg cgcttaccac tttgtgattc atgactgggg tgaagtcgta acaggta 1497

Claims (7)

1.一株Kosakonia sacchari HS233菌株，其特征在于，所述菌株于2016年10月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：60098。

2.权利要求1所述的Kosakonia sacchari HS233菌株在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用。

3.一种耐镉和/或降低有效镉含量的菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的HS233菌株和辅料。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，菌剂中HS233菌株的细胞密度OD₆₀₀为1。

5.一种耐镉和/或降低有效镉含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的HS233菌株制成OD₆₀₀为1的种子液，然后将种子液接种于镉污染的样品中，30～37℃培养3～36h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子液接种于镉污染的样品中后，HS233菌株在镉污染的样品中的最终细胞浓度OD₆₀₀为0.025。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，37℃培养24h。