CN112175840B - 一种黑粉菌及其在正常和胁迫环境下促进植物生长的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物学技术领域，具体涉及一种黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311及其促进植物生长和提高植物对多种胁迫耐受性的应用。所述黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18150。所述菌株能够促进植物地上和地下部生长、增强植物对盐、干旱和多种金属离子胁迫的耐受性。其中，所述菌株能够通过促进植物幼苗叶绿素含量、提高体内抗氧化酶活性和减少镉离子积累等途径减轻镉离子胁迫对植物的伤害作用。所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311可用于制备促进植物生长制剂和土壤改良剂，具有广阔的应用前景。

Description

一种黑粉菌及其在正常和胁迫环境下促进植物生长的应用
技术领域
本发明涉及微生物学技术领域，具体涉及一种黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311及其促进植物生长和提高植物对盐、干旱胁迫和多种金属离子胁迫耐受性的应用。
背景技术
高盐和干旱胁迫是植物生长面临的巨大挑战，直接影响植物的生长发育，降低粮食作物产量。现代农业的发展和化肥的大量使用使土壤盐碱化成为制约全球农业发展的重要因素，导致严重的社会、经济与环境问题。据统计，全球盐碱化土地面积约为9.6亿公顷，我国大约有1.0亿公顷。土壤盐碱化使土壤板结与肥力下降，不利于植物吸收养分，阻碍农作物生长和产量。此外，干旱也是影响世界和我国农业生产是巨大威胁之一。目前，全球干旱半干旱地区面积约占世界陆地面积55％。而我国是干旱半干旱地区面积较大的国家，占全国土地面积的52.5％以及全国耕地面积的38％左右，每年由干旱造成的粮食减产高达50～75亿公斤。因此，增强植物对盐和干旱的耐受性、开发胁迫条件下维持粮食产量的方法，对于保证我国和世界粮食安全意义重大。
随着全球经济快速发展和人口快速增加，工业废弃物和农药的大量使用导致土壤重金属离子(如镉、铜、铬、锌、钴等)和金属离子铝污染的现象日趋严重，已危害粮食安全和人类健康。在我国，超过2000万公顷耕地受到重金属离子污染影响。土壤重金属对植物的胁迫具有普遍、隐蔽、表聚、不可逆和长期性等特点，增加了土壤重金属离子污染防治的难度。此外，重金属在植物根、茎、叶及籽粒中大量累积，不仅严重地影响植物生长和发育，而且会通过食物链危及人类健康。例如，作为植物生长发育非必需的金属元素，镉离子在土壤中的积累不仅抑制植物生长、导致粮食减产，而且能通过水稻、小麦等植物逐渐在人体富集，导致痛骨病等严重疾病发生。镉胁迫下，镉离子能够代替叶绿素a和b中的Mg2+或进入原卟啉原，阻碍氨基酮戊酸盐合成，造成植物叶绿素合成受阻，使植物表现出缺绿症状。此外，镉胁迫会诱导植物细胞产生大量活性氧(ROS)，产生氧化胁迫而抑制植物生长。通常情况下，植物体内由抗氧化酶和非酶抗氧化剂(如还原型谷胱甘肽)组成的抗氧化系统可以清除镉胁迫产生的多余ROS，保护植物免受不良环境的影响。抗氧化系统的活力越高，植物对逆境的耐受性越强。综上，盐、干旱和金属离子胁迫是现阶段危害世界农业发展以及全球粮食产量和品质提高的主要因素，解决这些问题对于保障世界粮食安全具有重要意义。
发明专利“一株HS233菌株及其在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用”(CN201611045455.0)公开了一株HS233菌株及其在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用。所述HS233菌株能够分泌小分子物质至胞外与镉离子结合，降低有效镉含量；同时还可以在生长和代谢过程中协助植物将镉排出至细胞外，从而实现降低溶液和植物体内有效镉含量的目的。所述菌株HS233是通过分泌物质降低环境中镉的有效性来阻止植物吸收镉离子，因此所述菌株和植物之间不存在直接的互作关系，因此无法缓解已吸收镉离子对植物的危害。此外，该菌无明显的促生效应，对盐、干旱和其他金属离子胁迫的缓解作用也尚不清楚。
“一种降低种植在镉污染土壤中的蔬菜体内镉含量的方法”(CN201510590310.8)公开了一种细菌降低蔬菜镉含量的方法。所述方法将巴西固氮螺菌喷施在蔬菜根际土壤，能够降低蔬菜中镉含量。但巴西固氮螺菌在正常环境下不具有促进蔬菜生长的功能，且尚未发现该菌对植物耐受盐、干旱和其它金属离子等多种胁迫能力的影响。
本发明意外的发现了一种黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311，所述菌株能够在不接触植物的情况下，明显促进植物在正常环境和不良环境下的生长；能够缓解盐、干旱和多种金属离子胁迫对植物造成的伤害。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311，所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311于2019年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18150。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，存活状态是存活，电话010-64807355，传真：010-64807288。
所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311在促进植物生长中的应用，包括地上生长和地下生长。
所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311在促进植物叶片中叶绿素合成中的应用。
所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311在提高植物抗氧化中的应用。
所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311在提高植物对胁迫环境耐受性中的应用。
优选的，所述的胁迫环境为盐胁迫、干旱胁迫和多种金属离子胁迫。
优选的，所述的金属离子包括镉、铬、钴、锌、铜和铝。
所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311在促进盐、干旱和多种金属离子胁迫下幼苗生长中的应用。
本发明还提供了一种含有黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311的植物促生剂。
所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311在制备促进植物生长制剂中的应用，所述的促进植物生长制剂为微生物菌剂或微生物肥料。
本发明另提供了一种含有所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311的土壤改良剂。
本发明的有益效果是：本发明所请求保护的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311能够促进正常和多种胁迫条件下植物地上和地下部分生长，缓解重金属镉离子对植株造成的伤害。所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311可用于制备促进植物生长制剂和土壤改良剂，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311的系统发育分析。
图2黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共生对拟南芥(A)、烟草(B)、娃娃菜(C)、胡萝卜(D)、水稻(E)和玉米(F)幼苗生长的影响。(G)为不同植物幼苗鲜重变化的量化图。数据为平均值±SE，三次生物学重复(n＝3)。*表示与对照相比，差异达统计显著水平(p<0.05)。
图3盐和干旱胁迫下黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养对拟南芥生长的促进效应。不同小写字母表示差异达统计显著水平(p<0.05)。
图4不同重金属离子和铝离子胁迫下黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共生对拟南芥幼苗生长的影响。不同小写字母表示差异达统计显著水平(p<0.05)。
图5黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共生对镉胁迫下拟南芥幼苗地上部叶绿素a(A)、叶绿素b(B)、总叶绿素(C)和类胡萝卜素含量(D)的影响。不同小写字母表示差异达统计显著水平(p<0.05)。
图6黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311对镉胁迫下拟南芥幼苗抗氧化酶活性的影响。(A)超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)；(B)抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbateperoxidase,APX)；(C)过氧化物酶(Peroxidase,POD)；(D)过氧化氢酶(Catalase,CAT)。不同小写字母表示差异达统计显著水平(p<0.05)。
图7黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311对镉胁迫下拟南芥非酶抗氧化系统及相关酶活的影响。(A)还原型抗坏血酸含量(reduced ascorbic acid)；(B)单脱氢抗坏血酸还原酶(Monodehydroascorbate reductase,MDAR)；(C)脱氢抗坏血酸还原酶(Dehydroascorbatereductase,DHAR)；(D)谷胱甘肽含量(Glutathione,GSH)；(E)谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR)；(F)谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPX)。不同小写字母表示差异达统计显著水平(p<0.05)。
图8黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311对镉胁迫下拟南芥地上(shoot)和根(root)中镉离子含量的影响。不同小写字母表示差异达统计显著水平(p<0.05)。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明所请求保护的技术方案进行说明，但本发明所请求保护的范围并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一、菌株的分离与鉴定
PDA培养基配置：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15～20克；蒸馏水1000毫升，自然pH。
菌株的分离方法：菌株分离自拟南芥根际环境，在PDA培养基上经划线分离得到单菌落。
分离所得的菌株鉴定基于该菌ITS基因序列。菌株ITS基因扩增采用真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。PCR产物经回收、测序后，所得序列在NCBI数据库中BLAST比对并构建系统发育树，如图1所示，确定分离所得菌株属于黑粉菌属(Ustilago sp.)，命名为黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311。
将黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311于2019年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18150，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，存活状态是存活，电话010-64807355，传真：010-64807288。
实施例二、黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311对植物生长的影响
1. 1/2MS培养基配方：
(1)大量元素母液配置(20×)：准确称取33g NH4NO3、38g KNO3、8.8g CaCl2·2H2O、7.4g MgSO4·7H2O和3.4g KH2PO4。将上述药品分别溶于去离子水，后定容至1000ml。
(2)微量元素母液配置(200×)：准确称取KI 0.166g、H3BO3 1.24g、MnSO4·4H2O4.46g、ZnSO4·7H2O 1.72g、Na2MoO4·2H2O 0.05g、CuSO4·5H2O 0.005g和CoCl2·6H2O0.005g，将上述药品分别溶于去离子水，定容至1000ml。
(3)铁盐母液配置(200×)：准确称取FeSO4·7H2O 5.56g、Na2EDTA·2H2O 7.46g分别溶解，并定容至1000ml。
1/2MS培养基配置方法：取大量元素母液10ml、微量元素1ml和铁盐1ml，定容至400ml。后加入蔗糖12g，用NaOH调溶液pH至5.8。再加入1％琼脂后，121℃高温灭菌。
2.黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311的共培养处理
向制备好的1/2MS培养基一侧接入直径为4mm的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311菌块，将萌发好的拟南芥、烟草、娃娃菜、胡萝卜、水稻和玉米无菌苗移植至培养基无菌一侧。置于植物人工气候室培养。
在植物人工气候室中，玉米幼苗培养8天；拟南芥、娃娃菜和胡萝卜培养15天；水稻幼苗培养20天；烟草幼苗培养30天后，测定植物生长量。
3.结果分析
实验结果表明，黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养明显促进了所有受试植物的生长，如图2所示。与对照相比，黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养下拟南芥、烟草、娃娃菜、胡萝卜、水稻和玉米的地上鲜重分别为对照的2.9、2.1、1.7、1.3、3.0和1.7倍。拟南芥、烟草、娃娃菜、水稻和玉米地下鲜重分别为对照的7.3、2.3、2.8、1.0和1.5倍。上述结果说明黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311能够显著促进多种植物生长，因此，这种促生效应在植物中存在普遍性。
实施例三、盐胁迫和干旱胁迫下黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311对拟南芥生长的缓解作用
1.盐胁迫培养基和干旱胁迫培养基制备
1/2MS培养基的制备同实施例二。
实验所用培养基为1/2MS培养基；盐胁迫培养基采用1/2MS培养基中添加75mMNaCl模拟；干旱胁迫培养基采用1/2MS培养基中添加100mM甘露醇(Mannitol)模拟；高温灭菌后，备用。
2.黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311的共培养处理
对照组：向1/2MS培养基、盐胁迫培养基和干旱胁迫培养基中分别移植萌发好的拟南芥无菌苗，置于植物人工气候室中，培养15天，测量拟南芥的地上和地下鲜重。
实验组：向1/2MS培养基、盐胁迫培养基和干旱胁迫培养基中接入直径为4mm的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311菌块，将萌发好的拟南芥无菌苗移植至培养基无菌一侧，置于植物人工气候室培养，培养15天，测量拟南芥的地上和地下鲜重。
拟南芥地上和地下鲜重均采用每10株幼苗的平均鲜重表示。数据为平均值±SE，三次生物学重复(n＝3)。
3.结果分析
实验结果如图3所示，在盐胁迫下，与黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养的拟南芥地上部分鲜重是对照组的3.4倍；在干旱胁迫下，与黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养的拟南芥地上部分鲜重是对照组的3.7倍。这些结果说明黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311能够明显减缓盐和干旱对拟南芥生长的抑制作用，增强植物对盐和干旱胁迫的耐受能力。
实施例四、金属离子胁迫下黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311对拟南芥生长的缓解作用
1.培养基的配置
1/2MS培养基：基础培养基；
镉胁迫培养基：1/2MS培养基中加入25μM氯化镉；
铬胁迫培养基：1/2MS培养基中加入300μM高铬酸钾；
钴胁迫培养基：1/2MS培养基中加入10μM氯化钴；
锌胁迫培养基：1/2MS培养基中加入250μM硫酸锌；
铜胁迫培养基：1/2MS培养基中加入5μM硫酸铜；
铝胁迫培养基：1/2MS培养基中加入60μM氯化铝。
上述培养基经高温灭菌后，倒平板备用。
2.黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311的共培养处理
对照组：向1/2MS培养基、镉胁迫培养基、铬胁迫培养基、钴胁迫培养基、锌胁迫培养基、铜胁迫培养基、铝胁迫培养基中分别移植萌发好的拟南芥无菌苗，置于植物人工气候室中，培养15天，测量拟南芥的地上和地下鲜重。
实验组：向1/2MS培养基、镉胁迫培养基、铬胁迫培养基、钴胁迫培养基、锌胁迫培养基、铜胁迫培养基、铝胁迫培养基中接入直径为4mm的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311菌块，将萌发好的拟南芥无菌苗移植至培养基无菌一侧，置于植物人工气候室培养，培养15天，测量拟南芥的地上和地下鲜重。
3.结果分析
图4显示了不同重金属离子胁迫下拟南芥幼苗表型的变化。从图中可以看出，在镉胁迫下，与黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养的拟南芥地上部分鲜重是对照组的3.2倍；在铬胁迫下，与黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养的拟南芥地上部分鲜重是对照组的6.8倍；在钴胁迫下，与黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养的拟南芥地上部分鲜重是对照组的3.2倍；在锌胁迫下，与黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养的拟南芥地上部分鲜重是对照组的1.6倍；在铜胁迫下，与黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养的拟南芥地上部分鲜重是对照组的1.3倍；在铝胁迫下，与黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养的拟南芥地上部分鲜重是对照组的5.7倍。同时，与黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养的拟南芥的根部生长显著优于对照组。综上所述，黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311能够增强拟南芥对多种重金属胁迫和铝离子胁迫的耐受能力，促进拟南芥在胁迫条件下的生长。
实施例五、镉胁迫下黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311对拟南芥幼苗叶绿素含量的影响
1.拟南芥幼苗叶绿素含量的测定
叶绿素的提取和测定根据Turlerinde等(1998)方法，略做改动。取实施例四镉胁迫下培养的拟南芥幼苗的叶片0.3g，利用95％乙醇研磨成浆，后定容至6ml。4℃，10000g离心10min，取上清，用分光光度计分别测定OD649、OD665和OD470。
2.结果分析
实验结果如图5所示，正常情况下，黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养的拟南芥幼苗叶片叶绿素a含量相较于对照组提高1.6倍，获得显著提高。在镉胁迫下拟南芥幼苗叶片叶绿素a含量相较于未添加镉离子的对照组降低76.7％，而与黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养的拟南芥幼苗叶片叶绿素a含量是镉胁迫对照组的5.1倍。叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量的变化趋势与叶绿素a一致，均获得了显著提高。综上，黑粉菌(Ustilagosp.)HFJ311不仅可以促进正常情况下拟南芥叶片叶绿素和类胡萝卜素的合成，而且可以提高镉离子胁迫下叶片的叶绿素和类胡萝卜素含量。黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311可以增强植物光合作用，促进植物在正常和镉离子胁迫下的生长，提高对镉胁迫的耐受性。
实施例六、镉胁迫下黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311对拟南芥抗氧化系统活性的影响
1.抗氧化酶活性的测定方法
取实施例五获得的拟南芥材料0.2g，在2mL预冷的50mM磷酸缓冲液(pH 7.8，含l％聚乙烯吡咯烷酮)中充分研磨。匀浆在15000g、4℃下离心30min。上清液用于超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性的测定。
SOD活性按照Prochazkova et al.(2001)的方法测定。酶活反应液为50mM磷酸缓冲液(pH 7.8)，13mM蛋氨酸，75mM氮蓝四唑和0.1mM EDTA。在3ml反应液中加入50μl酶提取液。加入2mM核黄素后，将其置于光下启动反应，30min后将其放于暗处终止反应。反应完成后利用分光光度计测定反应液在560nm处吸光值。
APX活性参照Nakano和Asada(1981)的方法测定。在4ml比色皿中加入1.5ml磷酸缓冲液(100mM,pH 7.8)、0.75ml EDTANa2(0.4mM)、0.75ml抗坏血酸(1.2mM)和50μl酶提取液。加入20μl H2O2后，立即在分光光度计中测定290nm处吸光值的变化速率。
CAT活性测定参考Aebi(1984)的方法，并略做改动。酶反应液为50mM磷酸缓冲液(pH 7.8)。向反应液中加入100μl酶提取液和15mM H2O2，立即于紫外分光光度计中于240nm处检测H2O2的降解速率。
POD活性参照
Figure BDA0002732857400000071
et al.(1995)的方法测定。酶反应液为50mM磷酸缓冲液(pH7.8)和20mM愈创木酚。向反应液中加入10μl酶液和10μl H2O2原液后，立即于分光光度计中测定470nm下OD值。
2.拟南芥幼苗体内谷胱甘肽含量的测定
谷胱甘肽能和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应产生2-硝基-5-硫基苯甲酸和(GSSG)。2-硝基-5-硫基苯甲酸是黄色产物，在波长为412nm时具有最大吸收，因此用分光光度计可测谷胱甘肽含量。其具体方法为：取实施例五获得的拟南芥幼苗0.2g于预冷的研钵中，加入2ml预冷的7％磺基水杨酸研磨成浆。后4℃、10000g离心10min，上清即为粗酶液。
测定方法：取2只比色皿，其中一只依次加入400μL试剂一(110mM Na2HPO4、40mMNaH2PO4、15mM EDTA、0.3mM DTNB和0.04％BSA)、320μL试剂二(1mM EDTA、50mM imidazdesolution、0.02％BSA和5％Na2HPO4)、1.5U谷胱甘肽还原酶、80μl NaDPHNa4溶液和80μl提取液作为空白对照。另一只比色皿中加入400μl试剂一、320μl试剂二、1.5U谷胱甘肽还原酶(GR)、80μl NaDPHNa4溶液和80μl粗酶液。迅速混匀，于412nm记录反应起始3min内吸光值变化。
3.拟南芥幼苗体内抗坏血酸含量的测定方法
取实施例五获得的拟南芥幼苗0.2g，加入1ml 2.5M预冷的高氯酸充分研磨。匀浆于2℃、10000g离心10min。取500μl上清液，加20μl甲基橙溶液，用饱和Na2CO3溶液调pH至6.0。再用1M NaH2PO4定容到800μl。向粗提液中加入0.3M二硫苏糖醇，于25℃水浴30min，即为粗酶液。后加入1ml 1M NaH2PO4溶液、1U抗坏血酸氧化酶和100μl粗酶液，紫外分光光度计测定OD265，每15s读一次，共测定2min。
4.拟南芥幼苗体内谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶酶活的测定
取实施例五获得的拟南芥幼苗0.3g，液氮研磨。加入2ml预冷的提取缓冲液(50mMPBS(pH 7.0)、0.1mM EDTA、1mM苯甲基磺酰氟、1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％Triton x-100)充分匀浆，后4℃、12000g离心15min，上清液即为粗酶液。
谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定：向3ml反应液(0.26mM Tris-HCl(pH 7.5)、3μMEDTA和2mM GSSG)中加入200μl粗酶液，用4mM NADPH启动反应，在340nm处测定OD值的变化。消光系数为6.22l/mmol·cm。
GR活性＝ΔA340×X×Y/(K·b·m)
其中，X为反应时酶提取液稀释倍数；Y为提取液总体积与反应时所取酶液的体积比；K为消光系数；b为比色皿宽度；m为所取材料质量。
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性测定：向3ml反应液(含50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)、1mM EDTA、1mM Sodium azide、2.5U GR和1.6mM H2O2)中加入50μL粗酶液。用2mM NADPHNa4启动反应，连续测定340nm处吸光值。
5.拟南芥幼苗体内单脱氢抗坏血酸还原酶和双脱氢抗坏血酸还原酶活性测定
取实施例五获得的拟南芥幼苗0.2g，加入2ml提取液(50mM PBS(pH 7.0)、0.1mMEDTA、1mM PMSF、1％PVP、0.1％Triton x-100和1mM Asc)充分研磨。匀浆4℃、12000g离心15min，上清液即为测定单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)和双脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性的酶提取液。
MDAR活性测定参照Hossain方法：在2ml离心管中加入900μl 2mM Asc、2U抗坏血酸氧化酶和30μl酶提取液，用NADPH启动反应。快速混匀后加入比色皿中，在340nm处测定OD值的变化速率。MDAR酶活计算方法同GR。
DHAR的活性测定参照Arrigoni方法：在2ml离心管中加入700μl PBS(pH 7.0)、700μl 20mM GSH、100μl 2mM双脱氢抗坏血酸和100μl酶提取液，快速混匀后加入比色皿中，于265nm处测定OD值的变化。DHAR酶活计算方法同GR。
6.结果分析
实验结果如图6所示，与对照组相比，CdCl2处理下拟南芥幼苗SOD、APX、CAT和POD酶活性分别增加16.1％、80.6％、19.2％、63.8％。当在含CdCl2的培养基中接种黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311发现，黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养显著提高拟南芥幼苗SOD、APX、CAT和POD酶活性；这些酶的活性较镉胁迫相比分别提高156.1％、339.4％、37.6％和134.9％(图6)。此外，黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养能够通过增强GR和GPX等酶的活性，显著提高镉胁迫下拟南芥幼苗体内抗坏血酸(Asc)和还原型谷胱甘肽(GSH)的含量(图7)。上述结果说明，镉离子胁迫下，黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311能够提高植物抗氧化胁迫能力。
实施例七、镉胁迫下黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311对拟南芥吸收镉离子的影响
1.植物体内镉离子含量的检测方法
将实施例五获得的拟南芥幼苗置65℃烘干至恒重，称取干重0.05g。用浓硝酸将其研磨、定容到10ml，沸水浴硝化3-4h，静置过夜。溶液用漏斗进行过滤，使用原子吸收光谱仪测定滤液中镉离子含量。
2.结果分析
实验结果如图8所示，在镉离子胁迫下，拟南芥地上和根部的镉离子含量较对照明显增多。当接种黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311后，该菌能够显著降低镉离子胁迫下拟南芥幼苗中的镉离子含量；与镉离子胁迫相比，黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311共培养组拟南芥地上和根部镉离子含量分别减少45.0％和75.6％。综上，黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311还可以通过抑制拟南芥对镉离子的吸收，减缓镉离子对植物的伤害。
综上所述，本发明提供了一种黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311，所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311能够促进植物的生长、促进植物叶片叶绿素的合成；缓解金属离子、干旱和高盐对于植物生长的胁迫，提高植物的抗氧化胁迫能力；抑制植物对镉离子的吸收，减缓镉离子对植物的伤害。所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311可被制成土壤改良剂和植物促生剂，具有广泛的应用前景。

Claims (7)

1.一种黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311，所述的菌株于2019年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18150。
2.如权利要求1所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311在正常环境下促进植物生长中的应用，所述植物为拟南芥，烟草，娃娃菜，胡萝卜，水稻和玉米。
3.如权利要求1所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311在镉离子胁迫环境下促进拟南芥叶片叶绿素合成中的应用。
4.如权利要求1所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311在镉离子胁迫环境下提高拟南芥抗氧化中的应用。
5.如权利要求1所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311在提高拟南芥对胁迫环境耐受性中的应用，所述的胁迫环境为盐胁迫、干旱胁迫或金属离子胁迫。
6.一种植物促生剂，其特征在于，所述的促生剂含有权利要求1所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311。
7.如权利要求1所述的黑粉菌(Ustilago sp.)HFJ311在制备正常及胁迫环境下促进植物生长的制剂中的应用，其特征在于，所述的促进植物生长制剂为微生物菌剂或微生物肥料，所述胁迫环境为盐胁迫、干旱胁迫或金属离子胁迫，所述植物为拟南芥，烟草，娃娃菜，胡萝卜，水稻和玉米。
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