JP6346982B1

JP6346982B1 - ラウルテラ属の微生物の単離方法及び植物性廃棄物処理剤の製造方法並びに植物性廃棄物処理方法

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Publication number: JP6346982B1
Application number: JP2017163377A
Authority: JP
Inventors: 隆鶴水; 英三郎阿部; 紳行豊島
Original assignee: 隆鶴水; 紳行豊島
Priority date: 2017-08-28
Filing date: 2017-08-28
Publication date: 2018-06-20
Anticipated expiration: 2037-08-28
Also published as: JP2019037192A

Abstract

【課題】悪臭の発生を抑制しつつ短時間で植物性廃棄物を分解可能な植物性廃棄物処理剤及び植物性廃棄物処理方法並びにラウルテラ属の微生物の単離方法を提供する。【解決手段】ラウルテラ属の微生物を含有する植物性廃棄物処理剤である。また、この植物性廃棄物処理剤を植物性廃棄物に投与する投与工程と、投与後の植物性廃棄物をラウルテラ属の微生物で分解させる分解工程と、を備える植物性廃棄物処理方法である。さらに、植物性廃棄物を食料とするミミズの体内から細菌叢を取得する細菌叢取得工程と、野菜を入れた液体培地に細菌叢を接種して培養する野菜培養工程と、培養後の液体培地を平板培地上で培養して集落を形成させる集落形成工程と、前記集落から分離菌株を取得する分離菌株取得工程と、を備えるラウルテラ属の微生物の単離方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、植物性廃棄物処理剤及び植物性廃棄物処理方法並びにラウルテラ属の微生物の単離方法に関し、特に、野菜屑などの植物性廃棄物を効率的に処理可能な植物性廃棄物処理剤及び植物性廃棄物処理方法並びにラウルテラ属の微生物の単離方法に関する。

農業や飲食業の分野では、野菜屑などの植物性廃棄物が大量に発生する。例えば、専業農家では、出荷する部位以外の野菜は野菜屑として廃棄される。このような植物性廃棄物は、焼却等で処分されることがあるが、費用がかかるなどの理由により、一般には田畑や近隣の空き地などに廃棄されることが多い。多量に廃棄される野菜屑は、そのまま放置しておくと、腐敗が進んで堆肥となり、作物の育成や土壌の改良などに利用できる。しかしながら、植物性廃棄物は、腐敗が進むにつれて長期間悪臭を放ち、近隣に悪影響を及ぼす。

従来、ミミズによる有機廃棄物の堆肥化技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。この技術では、ミミズに有機廃棄物を食べさせて消化させ、その糞を堆肥として使用する。しかしながら、ミミズによる堆肥化の効率は、ミミズによる植物性廃棄物の摂食速度や摂食量、消化速度などに依存する。また、ミミズという生物を使用しているため、堆肥化効率は環境等にも影響を受ける。例えば、冬などは温度が低いためミミズの活動が低下し、堆肥化効率が低下する。

このため、ミミズにより堆肥化は、少量の植物性廃棄物であれば問題ないが、大量の植物性廃棄物の場合は植物性廃棄物の全体を処理することが困難であったり、処理に時間がかかったりするという問題がある。また、ミミズによる植物性廃棄物の処理が完了するまでの間に、悪臭が発生するなどの不都合があった。

ところで従来、通性嫌気性グラム陰性細菌で大腸菌群に分類されるラウルテラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ）属の微生物が知られている（例えば、非特許文献１参照）。ラウルテラ属の微生物は、以前はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属細菌に分類されていたが、１６ＳｒＲＮＡ及びｒｐｏＢ遺伝子塩基配列の相同性に基づいて、新属として２００１年に提案された。ラウルテラ属は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属から移行された”Ｒ．ｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ”、”Ｒ．ｔｅｒｒｉｇｅｎａ”、”Ｒ．ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ”の３種と、”Ｒ．ｅｌｅｃｔｒｉｃａ”からなる。

特開平３−１８３６７９号公報

M. Drancourtほか、「Phylogenetic analyses of Klebsiella species delineate Klebsiella and Raoultella gen. nov., with description of Raoultela ornithinolytica comb. nov., Raoultella terrigena comb. nov., and Raoultella planticola comb. nov. and Raoultella planticola comb.nov.」、「International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology」、2001年、vol. 51、p. 925-93

しかしながら、ラウルテラ属の微生物を植物性廃棄物の処理に用いることはこれまで知られていなかった。

本発明は、悪臭の発生を抑制しつつ短時間で植物性廃棄物を分解可能な植物性廃棄物処理剤及び植物性廃棄物処理方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は、上記の植物性廃棄物処理剤に好適に使用されるラウルテラ属の微生物の単離方法を提供することにある。

本発明者らは、ミミズの体内から微生物を取得して研究したところ、これがラウルテラ属の微生物であることを見出した。さらに、本発明者らは、このラウルテラ属の微生物を植物性廃棄物の分解に用いることで、悪臭の発生を抑制しつつ短時間で植物性廃棄物を分解可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ラウルテラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ）属の微生物を含有することを特徴とする植物性廃棄物処理剤である。

この場合において、前記ラウルテラ属の微生物が、配列番号１に記載された塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有する微生物であることが好ましい。

さらにこの場合において、前記ラウルテラ属の微生物が、ラウルテラオルニチノリティカ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ）、ラウルテラプランティコラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、及びこれらの新株並びに新種から選択されることが好ましい。

また、前記ラウルテラ属の微生物と、パーライト、シラス、シラスバルーン、バーミキュライト、軽石及び植物炭化物からなる群より選ばれた少なくとも１種の多孔質担体と、を含むことが好適である。

また、本発明は、上記の植物性廃棄物処理剤を植物性廃棄物に投与する投与工程と、前記投与した後の植物性廃棄物を前記ラウルテラ属の微生物で分解させる分解工程と、を備えることを特徴とする植物性廃棄物処理方法である。

さらに、本発明は、ラウルテラ属の微生物を単離する方法であって、植物性廃棄物を食料とするミミズの体内から細菌叢を取得する細菌叢取得工程と、野菜を入れた液体培地に前記細菌叢を接種して培養する野菜培養工程と、前記培養した後の前記液体培地を平板培地上で培養して集落を形成させる集落形成工程と、前記集落から分離菌株を取得する分離菌株取得工程と、を備えることを特徴とするラウルテラ属の微生物の単離方法である。

また、植物性廃棄物の処理に使用されるラウルテラ属の微生物の単離方法であって、前記細菌叢取得工程における前記ミミズは、植物性廃棄物処理剤による処理対象となる植物性廃棄物に生息するミミズであることが好適である。

本発明によれば、悪臭の発生を抑制しつつ短時間で植物性廃棄物を分解可能な植物性廃棄物処理剤及び植物性廃棄物処理方法を提供することが可能となる。また、本発明によれば、上記の植物性廃棄物処理剤に好適に使用されるラウルテラ属の微生物の単離方法を提供することが可能になる。

実施例においてラウルテラ属の微生物を平板培地で培養した状態を示す写真である。実施例において野菜の葉の分解試験を行った結果である。実施例においてラウルテラ属の微生物を染色した状態を示す写真である。実施例において野菜の葉の分解試験を行った結果である。実施例において野菜屑の分解試験を行った結果である。実施例において野菜屑の分解試験を行った結果である。

１．植物性廃棄物処理剤
以下、本発明の植物性廃棄物処理剤（以下、単に「植物性廃棄物処理剤」ということがある）について説明する。植物性廃棄物処理剤は、ラウルテラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ）属の微生物を含有している。

ラウルテラ属の微生物は、酸性側の分解菌で、植物性廃棄物の量にもよるが２〜３週間程度で分解する。この際に、腐敗ではなく分解によって植物性廃棄物が処理されるため、臭気がほとんど発生しない。より詳細には、ラウルテラ属の微生物は、体外に分解酵素を分泌することで、ｐＨ５．５〜６程度の酸性条件下で野菜屑等の植物性廃棄物のうち繊維質以外のものを分解する。ラウルテラ属の微生物による植物性廃棄物の分解では、嫌気性腐敗のようにアンモニア、インドール、スカトール等の発生がほとんどない。さらに、分解が終了した残渣は、乾燥して保存でき、最適の肥料として使用できる。

本発明におけるラウルテラ属の微生物としては、“ラウルテラオルニチノリティカ”（“Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ”（Ｒ．ｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ））、“ラウルテラテリゲナ”（“Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｔｅｒｒｉｇｅｎａ”（Ｒ．ｔｅｒｒｉｇｅｎａ））、“ラウルテラプランティコラ”（“Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ”（Ｒ．ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ））、“ラウルテラエレクトリカ”（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｅｌｅｃｔｒｉｃａ（Ｒ．ｅｌｅｃｔｒｉｃａ））、及びこれらの新株、並びにラウルテラ属の微生物の新種からなる群より選択される微生物であることが好ましい。ここで、ラウルテラ属の微生物としては、後述するミミズから取得されるものが好ましい。以下、ミミズから取得されるラウルテラ属の微生物を“ラウルテラアースワーム”（“Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｅａｒｔｈｗｏｒｍ”）という。

植物性廃棄物処理剤に含まれるラウルテラ属の微生物としては、これらのうち１種類のみでもよく、２種類以上を混合したものであってもよい。また、ラウルテラ属の微生物としては、植物性廃棄物の分解能力があるものであれば、野生株であっても変異株であってもよい。

本発明におけるラウルテラ属の微生物としては、配列番号１に記載された塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列を含んでいる微生物が好ましい。具体的には、“ラウルテラオルニチノリティカ”、“ラウルテラプランティコラ”、及びこれらの新株並びに新種から選択される微生物であることが好ましい。

ラウルテラ属の微生物の細胞は、幅が約０．３〜１．０、長さが約０．６〜６．０μｍのまっすぐな桿状で、運動性はない。ラウルテラ属の微生物は、炭水化物の豊富な培地上では、通常盛り上がった光沢のある、ねばねばした集落（コロニー）を形成するため、集落の形状で他の微生物との判別が可能である。

ラウルテラ属の微生物は、至適生育温度が３７℃で、呼吸と発酵の両方の代謝を行い、肉汁エキス培地で１０℃でも生育できるほか、オキシダーゼ陰性、カタラーゼ陽性、グルコースから酸（ときとしてガス発生を伴う）を生成する。また、ラウルテラ属の微生物は、唯一炭素源としてクエン酸塩やグルコースをエネルギー源として資化することができる。
ラウルテラ属の微生物は、抵抗性減弱による易感染性宿主などでは日和見感染が見られることもあるが、重篤な病原性については報告がないことから、植物性廃棄物処理剤として安全に使用することができる。

“ラウルテラオルニチノリティカ”と“ラウルテラプランティコラ”のいずれの菌種もインドール産生能陽性である。また、両菌種とも、土壌、植物、水域環境から検出されるが、後述するミミズの体内から取得することもできる。

植物性廃棄物処理剤は、上記のラウルテラ属の微生物を培地等で培養したものをそのまま使用することができる。

植物性廃棄物処理剤は、上記のラウルテラ属の微生物と、必要に応じて多孔質担体とを含んでいてもよい。多孔質担体は、ラウルテラ属の微生物を固定化する役割を有し、取り扱い性に優れたものとなる。多孔質担体としては、パーライト、シラス、シラスバルーン、バーミキュライト、軽石及び植物炭化物からなる群より選ばれた少なくとも１種を挙げることができる。これらはいずれも天然素材であるため、屋外の植物性廃棄物に施用したあとも環境に悪影響を及ぼすことがないため好ましい。

多孔質担体は、１ｇあたり含有菌数１０万個以上となるように調整することが好ましい。また、多孔質担体にラウルテラ属の微生物を担持させた植物性廃棄物処理剤は、通常は湿度２０〜４０％、好ましくは３０％に調整して保管する。

２．ラウルテラ属の微生物の単離方法
ラウルテラ属の微生物は、土壌から単離することができるが、土壌中に生息するミミズの体内から無菌的に単離することも可能である。

ミミズは、野菜その他の屑等の植物性廃棄物中に進入して徘徊し、植物性廃棄物を撹拌しながら食する。ミミズが植物性廃棄物を食すときに、土中の微生物や植物の成分などを腸内に取り込み、植物性廃棄物を分解して糞として排出する。ミミズの体内では、複数種の微生物が細菌の集合体（細菌叢）を形成しており、その細菌の作用により植物性廃棄物の分解が行われる。また、ミミズは、植物性廃棄物中を徘徊して食する際に、多量の代謝物酵素を体外に分泌すると言われている。

次に、ラウルテラ属の微生物をミミズから単離する方法について説明する。ミミズは、植物性廃棄物を食料とするものを使用することができ、特に、植物性廃棄物処理剤による処理対象となる植物性廃棄物中に生息し、これを食料としているミミズが好ましい。処理対象を食料としているミミズの体内に生息する微生物は、その植物性廃棄物の分解に適した特性を有しているためである。

次に、採取したミミズは、アクリノール液Ｐ殺菌消毒剤で表面を充分に洗浄して殺菌し、頭部、上部、下部及び尻部を無菌的にメスで切断し、それぞれの消化器系の細菌叢を培地で培養する。ミミズの消化器系には、複数種の細菌が集合して細菌叢を形成しており、この中に含まれているラウルテラ属の微生物（細菌）を培養によって単離する（細菌叢取得工程）。特に、ミミズの下部及び尻部には、ラウルテラ属の微生物が多く含まれており、後述する方法によってほぼ１００％の確率でラウルテラ属の微生物を単離することができる。

また、ミミズの排泄物からもラウルテラ属の微生物を単離することができ、例えば排泄物を２ｍｍφ×４ｍｍの俵型に切断したものを培養すると、ラウルテラ属の微生物を単離することができる。なお、ミミズの生息していた土壌からも微生物を直接採取することができるが、土壌中には種々の微生物が含まれているため、ラウルテラ属の微生物が優勢なミミズの体内から採取する場合と比較して、採取効率が悪い。

細菌叢の培養のための培地は、ラウルテラ属の微生物が生育するものであれば特に制限はないが、ポテトベース培地又はＴＴＣ培地を挙げることができる。ポテトベース培地は、じゃがいもをミキサーで破砕処理してろ過し、得られた上澄みを、こはく酸などでｐＨ５．５〜６．０に調整し、添加物を添加した培養液を液体培地として使用することができる。添加物としては、グルコース、Ｌ−グルタミン酸、５’−リボヌクレオチド、カサミノ酸などを挙げることができる。

また、ＴＴＣ培地は、トリフェニールテトラゾウリウムクロライド（ＴＴＣ）を含む培地である。なお、ＴＴＣ培地では、上記のじゃがいもの上澄みに変えて、ポリペプトンを使用した培養液を液体培地として使用することができる。さらに、これらの培養液に寒天を添加し、平板培地として使用することができる。以下、培地の好ましい処方について例示する。下記の培地の寒天を除いたものが液体培地、寒天を加えてプレートに固化したものが平板培地である。

＜ポテトベース培地：液体又は平板培地（ｐＨ５．５〜６．０）＞
じゃがいも（原料）：１００〜１５０ｇ
Ｌ−グルタミン酸−５リボヌクレオチド：１ｇ
グルコース：１０ｇ
寒天（平板培地のみ）：１５〜１８ｇ

＜ＴＴＣ培地：液体又は平板培地（ｐＨ５．５〜６．０）＞
Ｈ１ポリペプトン：１０ｇ
カサミノ酸又はＬ−グルタミン酸−５リボヌクレオチド：１ｇ
グルコース：５ｇ
寒天（平板培地のみ）：１５〜１８ｇ
トリフェニールテトラゾウリウムクロライド（ＴＴＣ）１％溶液（凍結保存可能）：０．５ｍｌ／１００ｍｌ

平板培地は、上記の寒天を加えた培地を加熱溶解し、例えば１２０℃で１５分滅菌してプレートに分注することで製造することができる。ＴＴＣ培地の場合、滅菌後の培地に、ＴＴＣを添加する。ＴＴＣの濃度は任意であるが、１％溶液を０．５ｍｌ／１００ｍｌ（培地体積）程度となるように加えることが好ましい。なお、培地にＴＴＣを加えない場合は、増菌用培地を用いてもよい。

次に、野菜を入れた液体培地に細菌叢を接種して培養する（野菜培養工程）。培養に使用する野菜は特に制限はないが、ねぎなどを使用することができる。上記の培地を使用したラウルテラ属の微生物の培養条件としては、通常、培養温度は室温（２５〜３０℃）、培養時間は２〜６日程度である。

次に、液体培地で得られた培養液を平板培地に接種する。液体培地は、適宜希釈して平板培地に集落が形成されるように調整する。平板培地で培養すると、集落が形成される（集落形成工程）。培養条件としては、通常、培養温度は２５〜３０℃、培養時間は２４〜４８時間程度である。

ラウルテラ属の微生物は、盛った光沢のある強いねばねばした集落を形成する。この集落の形状により、ラウルテラ属の微生物の集落をある程度判断できる。また、ラウルテラ属の微生物は、平板培地上で集落を形成するが、培地の表面と内部全体に菌糸のようなものが発育して培地を覆った状態（以下、「菌糸状容態」ということがある）となる。培地と菌糸状容態は、ホルムアルデヒドでは固定化できず、染色液（メチレンブルー）を使用すると染色できる。このような性状からも、ラウルテラ属の微生物を特定することができる。

ラウルテラ属の微生物は、平板培地の単一集落から取得することで、単クローンのものを取得することができる（分離菌株取得工程）。得られた微生物は、凍結保存液にて凍結保存することができる。凍結保存液は、ラウルテラ属の微生物が死滅しない任意の保存液を使用することができる。好ましい保存液の組成は以下のとおりである。
＜凍結保存液＞
グリセリン：１０％
ペプトン：３％
水：残部

３．植物性廃棄物処理方法
上記のラウルテラ属の微生物は、植物性廃棄物処理剤として植物性廃棄物の処理に有効である。以下、植物性廃棄物処理方法について説明する。まず、植物性廃棄物処理剤を植物性廃棄物に投与する（投与工程）。植物性廃棄物処理剤は、植物性廃棄物に散布などの方法で投与することができる。投与後は適宜撹拌などを行ってもよい。

次に、植物性廃棄物処理剤のラウルテラ属の微生物によって植物性廃棄物を分解させる（分解工程）。分解は、投与後の植物性廃棄物を室温で数日保管することで行うことができる。植物性廃棄物の量は内容にもよるが、植物性廃棄物処理剤を投与した植物性廃棄物は、投与後１５〜２０日くらいで褐色になり、分解される。この工程で、嫌気性腐敗のようにアンモニア、インドール又はスカトール等の悪臭の発生はほとんどない。

本発明によれば、ラウルテラ属の微生物を含む植物性廃棄物処理剤を植物性廃棄物に散布などによって施用することで、植物性廃棄物を分解させることができる。このため、従来のミミズによる堆肥化技術のように、ミミズによる摂食量や消化速度などに堆肥化の速度が依存せず、悪臭の発生を抑制しつつ短時間で植物性廃棄物を分解することが可能となった。また、ミミズのような微生物よりも高等な生物を使用していないため、温度や光といった環境条件による影響を受けにくく、植物性廃棄物の処理を安定的に行うことができる。例えば、本発明であれば、冬場であっても植物性廃棄物の処理を効率的に行うことができる。

以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これらは本発明の目的を限定するものではない。

＜ミミズの飼育と細菌叢の取得＞
土面に穴を作り野菜やその他の屑を山盛りに入れ、ミミズを乗せて遮光した。この状態で１４日ミミズを飼育したのち、ミミズを採取した。次に、採取したミミズの表面をアクリノール液Ｐ殺菌消毒剤使用の方法で充分に滅菌し、頭部、上部、下部及び尻部を無菌的にメスで切断し、各部位内容物は、滅菌白金耳で取得し、平板培地で培養した。

＜ポテトベース培地の調製＞
よく水洗いしたじゃがいも１００ｇを細切し、少量の水を加えてミキサーで処理し、ネットでろ過しよく絞り静置してデンプンを沈降させた。その上澄みを取得し、５質量％のこはく酸でｐＨ６．０に補正し、グルコース１０ｇ、Ｌ−グルタミン酸１ｇ、５’−リボヌクレオチド１ｇを添加して培養液とした。さらに、この培養液に寒天１５ｇを加え、ｐＨ５．５とした。得られた培地を１２０℃で１５分滅菌し、プレートに分注し、冷却固化して平板培地を作成した。

＜ＴＴＣ培地の調製＞
Ｈ１ポリペプトン１０ｇ、カサミノ酸１ｇ（Ｄｉｆｃｏ社）、グルコース５ｇ、水１０００ｇを混合し、ｐＨ５．５とした培養液を得た。液体培地の場合は、この培養液を１２０℃で１５分滅菌した。平板培地の場合は、この培養液に寒天１５ｇを加え、得られた培地を１２０℃で１５分滅菌した。トリフェニールテトラゾウリウムクロライド（ＴＴＣ）は、別途フィルター除菌した１％ＴＴＣ溶液を用意しておき、平板培地・液体培地とも、滅菌後の培養液に、１００ｍｌあたり０．５ｍｌとなるように加えた。平板培地の場合、ＴＴＣ添加後の培地をプレートに分注し、冷却固化した。

上記で取得した細菌叢を、ＴＴＣ培地（平板培地）表面に白金耳を使用してこすりつけて接種し、培養温度２５℃、培養時間２４時間で培養した。その結果、性状の異なる５種の集落の形成が確認できた。このうち、ラウルテラ属の微生物は、盛りあがった光沢のある強いねばねばした集落を形成する（図１）。この集落を白金耳ですくいあげると、多量の培地が付着してくる。

＜分離株の野菜分解試験＞
ＴＴＣ液体培地２ｍｌの滅菌試験管に、３種の野菜の葉（キャベツ、レタス２種類）をオキシドールでよく洗浄したのち水洗いしたものを入れ、分離菌株を液層に接種した。各菌株接種し室温４日間で野菜の分解が確認された（図２）。図中、１は対照（コントロール）、２、３、４、５はそれぞれミミズの頭部、中部、下部、尻部から抽出した細菌叢を使用した試験結果である。それぞれを平板培地に培養して各集落を確認したところ、いずれのサンプルからもラウルテラ属の微生物の集落が形成された。

＜単一集落の培養＞
ラウルテラ属の微生物の集落の１つを白金耳で取得してＴＴＣ培地（液体）で３０度、２日間培養した。同様に他の集落も培養し、３種類のサンプル（３／４ＴＴＣ１、３／４ＴＴＣ２、３／４ＴＴＣ３）を取得した。

ラウルテラ属の微生物の凍結保存液は、以下の処方のものを使用した。
＜菌株の凍結保存液＞
グリセリン：１０％（１０ｇ）
ペプトン：３％（３ｇ）
水：９０ｍｌ
上記凍結保存液内にて本菌の保存を行った。

＜分離菌の染色と諸性状＞
分離集落及び培養液をスライドガラスに塗株し、乾燥したのち火焔固定し染色液（メチレンブルー）を滴下、乾燥し水洗いするとねばねばした菌株のためか定着せずに流出した。１枚のスライドガラス２か所に菌株を塗株し、乾燥したものを、一方は水洗いしたがやはり流出したので、一方は染色そのままで観察した（図３）。この図において、（ａ）は実施例においてラウルテラ属の微生物を染色した状態を示す写真、（ｂ）は（ａ）の一部の拡大写真である。その結果、菌株がメチレンブルーで染色され、桿状細胞が確認された。なお、培養液をそのままスライドガラスに塗株して染色しても同様の染色像が観察された。

＜平板培地の集落及び菌糸状容態の染色＞
発育した集落及び菌糸状容態を染色するために、ホルムアルデヒドを注入して固定化を行ったが固定できなかった。そこで、平板培地に染色液を注入して培地全体を染色し、のち水洗いして染色液を除き乾燥すると、全面に菌糸状容態が発育していることが確認された。

＜ＴＴＣ培養液のフィルターろ過＞
ＴＴＣ培養液の３つのサンプル（３／４ＴＴＣ１、３／４ＴＴＣ２、３／４ＴＴＣ３）に対して、０．４５μｍのミニザルトフィルター（ＭｉｎｉｓａｒｔＦｉｌｔｅｒ）を使用し、それぞれ２回ろ過したが、いずれも集落が形成された。これは、一般に、細菌は、０．４５μｍフィルターを通過しないのが常識であるが、この細菌は様々な状態の菌糸状容態となることから、フィルターを通過できたと考えられる。また、平板培地内部についてカットして取り出して染色像を確認したところ、菌糸状容態が培地内部にも発育増殖していることがわかった。

＜微生物種の特定＞
ＴＴＣ培養液の３つのサンプル（３／４ＴＴＣ１、３／４ＴＴＣ２、３／４ＴＴＣ３）について微生物種の特定を行った。それぞれのサンプルよりＰｒｅｐＭａｎ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅａｇｅｎｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応用ＤＮＡテンプレートとした。ＦＡＳＴＭｉｃｒｏＳｅｑＲ５００１６ＳｒＤＮＡＰＣＲＫｉｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により、１６ＳｒＤＮＡの５’末端領域５００ｂｐをＰＣＲ反応で増幅させた。得られたＰＣＲ反応産物は、ＦａｓｔＧｅｎｅ（登録商標）Ｇｅｌ／ＰＣＲＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（日本ジェネティックス社製）を用いて精製したのち、ＮａｎｏＤｒｏｐＮＤ−１０００Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて濃度を測定した。

ＰＣＲ反応産物を、Ｂｉｇ−ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ反応用テンプレートとして用い、ＭｉｃｒｏＳｅｑ５００１６ＳｒＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりシークエンス反応を行った。得られた反応溶液はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｘｔｅｒｎｉｎａｔｏｒ（登録商標）ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて精製し、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて塩基配列の解読を行った。得られた塩基配列は３つの検体で同じであった（配列番号１）は、三井農林株式会社のデータベース（ＭＭＩＤＤＢ）及びＭｉｃｒｏＳＥＱ（登録商標）データベースを用いた相同性比較により同定を行った。

＜近縁菌種との１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の相同値比較＞
得られた塩基配列（配列番号１）を用いて、データベース（ＭＭＩＤＤＢ）及びＭｉｃｒｏＳＥＱ（登録商標）データベースを用いた相同性検索を行い、表１の結果が得られた。

上記の結果から、配列番号１は、Ｒａｏｕｉｔｅｌｌａｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ（ＭｉｃｒｏＳＥＱ（登録商標）、ＭＮＫ４２２：Ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎｄａｔａを採用）Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ（ＡＦｌ２９４４３、ＭＮＫ４２３：Ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎｄａｔａを採用）と最も高い相同値を示した。このため、３つの検体のいずれも、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ又はＲ．ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ、又はこれらの新株、若しくはラウルテラ属の微生物の新種（“ラウルテラアースワーム”）であると同定した。

＜ラウルテラ属の微生物の分解能＞
３種の葉（キャベツ、レタス２種類）５０ｇに試験群にＴＴＣ培養液（３／４ＴＴＣ１）１ｍｌを入れ、よく混合した。この状態で４日保管したところ、葉がある程度分解したことが確認された（図４）。分解物のにおいを確認したところ、臭気はほとんどなかった。これは、ラウルテラ属の微生物が発育して葉の分解を行う一方で、本微生物が圧倒的に発育しており腐敗性の細菌などよりも優位となっているためと推測される。

＜植物性廃棄物処理剤の製造＞
多孔質担体として無菌パーライトを使用し、これにＴＴＣ培養液（３／４ＴＴＣ１）を混合し、植物性廃棄物処理剤を得た。生菌数１ｇあたり含有菌数１０万以上となるようにＴＴＣ培養液の濃度を調整した。混合後は、湿度３０％となるように調整して保存した。

＜植物性廃棄物処理剤の使用＞
野菜屑を厚さ１５〜２０ｃｍくらいに広げ、その上に植物性廃棄物処理剤を散布した。この上に野菜屑を広げて再度植物性廃棄物処理剤を散布した。これを交互に繰り返して野菜屑を積み重ね、最後に植物性廃棄物処理剤と少量の水とを散布し、シートで覆った。

この状態で２週間ほど保管した。その結果を図５，図６に示す。図５（ａ）は処理前の野菜屑の写真、同図（ｂ）は処理後１週間経過した野菜屑の状態を示した写真、図６（ｃ）は処理後２週間経過した野菜屑の状態を示した写真、同図（ｄ）はこれを乾燥した状態を示した写真である。

これらの図から、植物性廃棄物処理剤によって野菜屑が２週間程度で効率的に分解されたことがわかる。その際にはほとんど臭気が発生しなかった。さらに、野菜屑を乾燥したもの（図６（ｄ））は乾燥して保存でき、肥料として最適である。

植物性廃棄物処理剤で２週間処理した後の野菜屑に含まれる分解物の成分を食品分析センターに依頼して分析したところ、以下のとおりであった（数値は％）。
総合多糖体２３
チッソ５
リン４
カリ５

この結果から、ラウルテラ属の微生物による分解物には、アンモニア、インドール、スカトールといった悪臭成分は含まれていない。このように、酸性側の分解菌であるラウルテラ属の微生物を使用することで、腐敗菌の増殖を抑制して悪臭の発生を防ぎつつ、植物性廃棄物を効率的に分解できることがわかった。

Claims

ラウルテラ属の微生物を単離する方法であって、
植物性廃棄物を食料とするミミズの体内から細菌叢を取得する細菌叢取得工程と、
野菜を入れた液体培地に前記細菌叢を接種して培養する野菜培養工程と、
前記培養した後の前記液体培地を平板培地上で培養して集落を形成させる集落形成工程と、
前記集落から分離菌株を取得する分離菌株取得工程と、を備えることを特徴とするラウルテラ属の微生物の単離方法。
前記細菌叢取得工程における前記ミミズは、植物性廃棄物処理剤による処理対象となる植物性廃棄物に生息するミミズであることを特徴とする請求項１に記載のラウルテラ属の微生物の単離方法。
ラウルテラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ）属の微生物を含有する植物性廃棄物処理剤の製造方法であって、請求項１又は２に記載のラウルテラ属の微生物の単離方法を含むことを特徴とする植物性廃棄物処理剤の製造方法。
前記ラウルテラ属の微生物が、配列番号１に記載された塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有する微生物であることを特徴とする請求項３に記載の植物性廃棄物処理剤の製造方法。
前記ラウルテラ属の微生物が、ラウルテラオルニチノリティカ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ）、ラウルテラプランティコラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）から選択されることを特徴とする請求項４に記載の植物性廃棄物処理剤の製造方法。
前記ラウルテラ属の微生物と、パーライト、シラス、シラスバルーン、バーミキュライト、軽石及び植物炭化物からなる群より選ばれた少なくとも１種の多孔質担体と、を混合することを特徴とする請求項３に記載の植物性廃棄物処理剤の製造方法。
請求項１又は２に記載のラウルテラ属の微生物の単離方法で単離したラウルテラ属の微生物を植物性廃棄物に投与する投与工程と、
前記投与した後の植物性廃棄物を前記ラウルテラ属の微生物で分解させる分解工程と、を備えることを特徴とする植物性廃棄物処理方法。