CN105191715A - 利用耐镉微生物降低镉污染稻田中水稻籽粒镉含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用耐镉微生物降低镉污染稻田中水稻籽粒镉含量的方法，属于重金属污染土壤生物修复技术领域。本方法是：①耐镉微生物的筛选纯化，获得能耐300mg/L镉的两株微生物菌株；②耐镉菌株的鉴定，耐镉菌株经鉴定为棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌；③耐镉微生物培养基质的制备；④耐镉微生物培养基质在水稻田中的应用。本发明筛选到的耐镉微生物菌株，来源于镉污染矿区优势植物根际土壤，具有很好的环境适应性；棘孢曲霉和蜡样芽孢杆菌的混合菌株，其效果显著优于单独施入棘孢曲霉或蜡样芽孢杆菌，提高了修复效率；成本低廉、操作简便、效果显著。适用于镉污染相对较轻的稻田土壤的生物修复。

Description

利用耐镉微生物降低镉污染稻田中水稻籽粒镉含量的方法

技术领域

本发明属于重金属污染土壤生物修复技术领域，尤其涉及一种利用耐镉微生物降低镉污染稻田中水稻籽粒镉含量的方法。

背景技术

镉是毒性最强的重金属元素之一，植物吸收的镉可以通过食物链影响人类的健康。随着工业的发展和城市污染的加剧以及农用化学物质种类、数量的增加，土壤镉污染日益严重。水稻是我国三大粮食作物之一，当水稻植株内吸收和积累的镉含量超过一定的阈值，就会对水稻的生长发育以及稻米的产量和品质产生不利的影响，甚至影响稻米质量安全，特别是在食物链的生物放大作用下，对人和动物的生命和健康构成了严重威胁。目前，我国受镉污染的农田面积约27.86万hm²（1公顷=10000m²），其中稻田土壤将近1.33万hm²。在镉污染农田中有5～10%的面积减产严重，并且所产各类粮食均不宜食用。粮食作物的安全问题直接关系到人类的健康安全，因此，如何在不浪费这些土地的基础上，生产出安全的粮食作物已成为热点和难点。

在目前镉污染现状下，要生产安全的大米，需要从水稻品种的选择、安全有效的土壤修复方法以及配套的栽培措施入手，从而达到抑制水稻对镉的吸收，提高稻米的品质和产量，抑制镉通过稻米进入食物链。

目前，对提高镉污染土壤中稻米安全的研究主要集中在水稻品种的选择，但筛选得到的品种不能兼具高产和高品质的特征。微生物的活动能够极大地影响土壤环境中重金属的积累和转运。土壤中多数微生物可通过释放有机酸等途径溶解难溶态重金属，这些微生物在重金属的转移过程中起重要作用。然而，目前报道的专性菌株几乎全部为细菌，且都是能提高重金属在土壤中的生物有效性。在中国，大面积受重金属轻度污染的耕地面积日益增多，寻找具有很强重金属耐性，且能抑制镉在植物体内向上运输的微生物菌株，对于提高镉污染土壤中稻米安全具有重要意义。

大量研究表明，长期镉污染会导致大量的耐受性微生物菌株的产生。这些菌株对植物吸收重金属有着调控作用。因此，开展针对重金属污染地区微生物的筛选，至关重要，到长期受重金属污染的地方寻找耐性强的微生物菌株是一条捷径。

发明内容

本发明的目的就在于在现有微生物修复技术理念的基础上，提供一种利用耐镉微生物降低镉污染稻田中水稻籽粒镉含量的方法。

耐镉微生物筛选自我国湖南重金属污染区优势植物根际土壤，通过外源添加耐镉微生物来降低水稻籽粒中镉含量，具有原位修复、成本低、适用于大多数水稻品种、应用范围广等优点，具有良好的生态效益和社会效益。

本发明的目的是这样实现的：

1、基本思路

利用稀释涂平板和划线分离法，对采自中国重金属之乡——湖南的四个长期污染矿区优势植物根际土壤中的耐镉微生物进行筛选，选取耐镉能力最强的两株微生物进行分离纯化，并依据形态特征、生理生化特性及16SrRNA序列分析，鉴定为棘孢曲霉真菌（Aspergillusaculeatus）和蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）；将获得的耐镉菌株添加到修复基质中并施加到土壤中，以达到降低镉污染稻田中水稻籽粒中镉含量的效果。

2、具体方案

本方法包括下列步骤：

①耐镉微生物的筛选纯化，获得能耐300mg/L镉的两株微生物菌株

A、样地的选择；

B、耐镉微生物的筛选纯化；

C、筛选培养基的配方；

②耐镉菌株的鉴定，耐镉菌株经鉴定为棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌

A、DNA的提取与PCR扩增；

B、PCR产物测序与BLAST鉴定

筛选出的耐镉能力最强的细菌和真菌分别为蜡样芽孢杆菌和棘孢曲霉真菌；

③耐镉微生物培养基质的制备

A、棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌最适温度和pH的确定；

B、菌悬液的制备：

C、微生物培养基质的制备：

④耐镉微生物培养基质在水稻田中的应用

A、整地；

B、播种；

C、田间管理

a、苗期管理；

b、分蘖期管理；

c、拔节期管理；

d、抽穗期管理。

3、工作机理：

对野外重金属污染较严重的地区进行耐镉微生物的筛选鉴定，得到耐镉的微生物，制成微生物培养基质，外源添加微生物培养基质到稻田土中；微生物一方面通过降低土壤中的有效态镉含量和pH，来降低镉在稻田土中镉对水稻的毒害作用；另一方面通过降低镉在水稻体内的转移系数，从而降低污染稻田中水稻籽粒镉的含量，最终达到降低水稻籽粒中镉含量的目的。

本发明具有下列优点和积极效果：

①筛选到的耐镉微生物菌株，来源于镉污染矿区优势植物根际土壤，具有很好的环境适应性；

②棘孢曲霉和蜡样芽孢杆菌的混合菌株，其效果显著优于单独施入棘孢曲霉或蜡样芽孢杆菌，提高了修复效率；

③微生物培养基质不仅确保了微生物生长的养分供应，增加了微生物的成活率和可操作性，且能改善土壤环境；

④耐镉微生物筛选自污染地优势植物根际土，且和水稻具有很好的适应性；

⑤筛选出的耐镉微生物不需要专门的寄主，可以大规模纯培养；

⑥耐镉微生物修复基质不仅能改善镉污染对水稻的毒害作用，还能抑制镉在水稻体内的向上运输，从而达到降低水稻籽粒中镉含量的目标；

⑦成本低廉、操作简便、效果显著。

适用于镉污染相对较轻（稻田土壤中镉含量低于30mg/kg）的稻田土壤的生物修复。

附图说明

图1是本方法的步骤图；

图2.1是镉胁迫下有外源添加耐镉微生物后的水稻生长状况图片，

图2.2是镉胁迫下无外源添加耐镉微生物后的水稻生长状况图片；

图3.1是镉胁迫下外源添加耐镉微生物对水稻地上部生物量的影响图片，

图3.2是镉胁迫下外源添加耐镉微生物对水稻地下部生物量的影响图片；

图4.1是镉胁迫下外源添加耐镉微生物对水稻籽粒中镉浓度影响的图片，

图4.2是镉胁迫下外源添加耐镉微生物对水稻种皮中镉浓度影响的图片，

图4.3是镉胁迫下外源添加耐镉微生物对水稻根中镉浓度影响的图片，

图4.4是镉胁迫下外源添加耐镉微生物对水稻叶中镉浓度影响的图片，

图4.5是镉胁迫下外源添加耐镉微生物对水稻茎中镉浓度影响的图片，

图4.6是镉胁迫下外源添加耐镉微生物对水稻根际土壤镉浓度影响的图片；

图5.1是耐镉微生物对水稻根际土壤pH影响的图片；

图5.2是耐镉微生物对水稻根际土壤有效态镉浓度影响的图片。

图2.1～图5.2中：

左边柱子是指对照（即不加镉和微生物）；

中间柱子是指加镉；

右边柱子是指加镉和微生物。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明：

一、方法

①耐镉微生物的筛选纯化，获得能耐300mg/L镉的两株微生物菌株

A、样地的选择

根据湖南矿区和化工厂分布情况，确定四个污染土壤采集点（分别为：湖南浏阳废弃化工厂，113°21’N，28°01’E；株洲清水塘化工区，113°04’N，27°52’E；湘潭滴水村化工厂，112°57’N，27°52’E；岳阳桃林铅锌矿区，113°26’N，29°18’E；），每个采集点等距离设置8个重复采样点，用不锈钢工具采集表层0～20cm优势植物根际土；去除所有动植物残体后，将8个采样点的土壤混合均匀、并于荫凉处过2mm塑料筛，装入自封袋中，放入干冰中运至实验室；

B、耐镉微生物的筛选纯化

将上述4份保存于-20℃冰箱中的样品，分别取10g在无菌条件下加入装有适量玻璃珠的250mL三角瓶中，加入90mL无菌水，在旋转式摇床上250r/min震荡30min；震荡结束后静置30min；吸取上清液并用无菌水稀释100倍，取1mL稀释后的上清液涂布到加有50mg/L镉的培养基上，待菌落长出后，用平板划线分离法将菌落接种到更高镉浓度的培养基上进行培养，镉的浓度依次为100、150、200、300mg/L；最终挑选出在镉浓度为300mg/L的培养基上仍能生长的两株菌株用于鉴定，并将单菌落在培养基上划线转接5次以达到对菌株进行纯化的目的，培养温度为30℃；

C、筛选培养基的配方：

筛选耐镉微生物所需的培养基为添加不同浓度CdSO₄的固体培养基：

马丁氏（Martin）琼脂培养基（用于培养真菌）：MgSO₄·7H₂O0.5g，KH₂PO₄1g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，琼脂18g，定容到1L后加入1%的孟加拉红溶液3.3mL；

牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）：NaCl5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂18g，定容到1L，调整pH为7.0～7.2。

②耐镉菌株的鉴定，耐镉菌株经鉴定为棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌

A、DNA的提取与PCR扩增：

以筛选纯化得到的两株耐镉菌株为模板，提取总DNA，采用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）扩增ITS区；将PCR产物加入15g/L的琼脂糖凝胶中电泳，ITS序列的长度一般为500～700bp；电泳后，将扩增所得的片段切下，用凝胶回收试剂盒回收扩增产物；

PCR反应体系为：10×ExTaqbuffer2.0μL，2.5mMdNTPMix1.6μL，5pPrimer10.8μL，5pPrimer20.8μL，Template0.5μL，5uExTaq0.2μL，ddH2O14.1μL；

PCR反应条件为：95°C预变性5min，95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，24个循环，最后72°C延长10min使其完全反应；

B、PCR产物测序与BLAST鉴定：

将回收后的产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序；测序结束后，将ITS序列用BLAST程序与GenBank中的ITS序列进行同源性比对；经鉴定，筛选出的耐镉能力最强的细菌和真菌分别为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）和棘孢曲霉真菌（Aspergillusaculeatus）。

③耐镉微生物培养基质的制备

A、棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌最适温度和pH的确定：

分别将1mL两种菌株的菌悬液接种到新配制并灭菌的200mL液体培养基中，按照不同温度（10、15、20、25、30、35、40℃）和pH值（4、5、6、7、8、9）条件下震荡培养36h，通过测定吸光度值，确定该菌株生长温度；

蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）在15～40℃生长良好，pH4～9均能生长，最佳pH为6～7；棘孢曲霉真菌（Aspergillusaculeatus）在10～35℃生长良好，pH4～7均能生长，最佳pH为6；

B、菌悬液的制备：

取上述筛选得到的耐镉真菌和细菌，分别接入对应的灭菌液体培养中，蜡样芽孢杆菌35℃200r/min，棘孢曲霉真菌30℃200r/min培养36h后，8000r/min离心10min，收集菌液，用无菌水洗涤后稀释至OD₆₀₀=1.0（菌浓度为10⁸CFU/mL），制成菌悬液备用。

C、微生物培养基质的制备：

培养基质为沙子和锯木屑（v/v=3：1），将上述两种菌株的菌悬液接种到培养基质中（每1kg培养基质中分别接种20mL蜡样芽孢杆菌菌悬液和20mL棘孢曲霉真菌菌悬液），调节pH至6，30℃培养4天，制成微生物培养基质。

④耐镉微生物培养基质在水稻田中的应用

A、整地

去除土壤表层的大石块、树枝等杂物，撒施底肥（每亩施用30kg高效复合肥和30kg碳铵）和微生物培养基质（每亩施用2000kg）于土壤表层，翻耕土壤（10～20cm）并耙平；每隔3m左右开一条畦沟，以便于施肥、打农药等田间管理，并做到横沟、竖沟和围沟相通（沟宽0.2m、深0.2～0.3m），使田中流水、排水畅通，田面不积水；充分灌溉后，晾晒3～4天后播种；播种前3～5天，每亩用60%的丁草胺乳剂150g，兑水30～40kg喷雾，以达到防止杂草的目的；

B、播种

采用人工直播的方法进行播种：首先将选好的种子用0.3%硫酸铜液浸种48h后，用清水冲洗干净，再用清水浸种2～3天；将浸种后的种子均匀播种（播种量为常规稻3～4kg/每亩，杂交稻2kg/每亩），均匀覆土3～5mm；

C、田间管理

a、苗期管理

水稻出苗后，对于缺苗严重的地段，要进行补苗，及时移密补疏；苗期管理要做到田面不积水，保持湿润，确保水稻扎根立苗；在稻苗2叶1心后浅水勤灌；稻苗3叶1心期,每亩撒施尿素5kg、钾肥10kg，追肥促进早分蘖，以达到计划苗数；除此之外，稻象甲和灰飞虱是水稻苗期的重要虫害，可以用快杀乳油（每亩用28%快杀乳油20～30mL）和锐劲特胶悬剂+抑虱净乳油（每亩用5%锐劲特胶悬剂30mL+30%抑虱净乳油10mL）分别防止稻象甲和灰飞虱；

b、分蘖期管理

分蘖期要做到浅水勤浇、适当晒田：当有效分蘖期结束以后，要灌深水抑制分蘖发生；分蘖后期，每亩追施尿素15～25kg，可增加有效穗，促进穗粒形成；分蘖期需要注意防治白叶枯病、稻蓟马等病虫害，用20%叶青双可湿性粉剂10g/亩对水喷雾；

c、拔节期管理

如拔节期发现水稻植株叶黄缺肥，追施尿素5～10kg/亩；拔节期是纹枯病的多发期，可用50%多菌灵粉剂10g/亩，配合20%粉锈宁乳油40mL/亩进行防治；

d、抽穗期管理

抽穗期，应适时进行追肥，幼穗分化期，要保持水层深度达到4～7cm；灌浆期，采取干干湿湿，以湿为主的灌水办法；

水稻播种采用人工直播的方法，省工、省力；三沟相通的整地措施，既能使稻田中流水、排水流畅，还进一步保证了施入土壤中微生物的活性；同时微生物培养基质的添加减轻了镉污染对水稻的毒害作用，降低了镉在水稻籽粒中的积累量。

二、实施例

1、实施例一：适应性试验

培养基质为锯木屑和沙子（v/v=3：1，pH=6.5）；将培养基质分为两份，一份按5%接种量接种上述筛选得到的两株菌株悬浮液（1：1比例混合），另一份不接种。两份基质分别种植育秧好的水稻苗，另外在取一份接种耐镉微生物的基质闲置；以国际水稻研究所营养液配方进行施肥，并分别于处理7天、21天、40天和60天取水稻根际土和闲置土壤，进行微生物的筛选，同时观察水稻长势。

试验结果分析：试验结果表明，在整个处理期间，接种菌株和不接种菌株基质中的水稻长势一致，生长周期一致；对接种微生物土壤中的耐镉微生物进行筛选发现，基质中棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌均为优势菌落，且数量相当；种植水稻和闲置土壤中，这两种菌株的数量并没有显著的变化；说明棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌可以很好的共生，且这两种菌株和水稻之间也存在良好的适应性。

2、实施例二：盆栽试验

选用籼稻‘9311’为材料，催芽后将其移至无污染稻田土育秧30天，采用国际水稻研究所营养液配方进行施肥；育秧期间，准备培养基质，具体方法为：将锯木屑和沙子（v/v=3：1，pH=6.5），拌匀后放入灭菌锅中（127°C）高温灭菌1h，用1.5mMCdSO₄溶液浇灌至土壤镉浓度达到20mg/kg，平衡一周后接种棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌（1：1），以单独的镉处理、镉加棘孢曲霉真菌处理和镉加蜡样芽孢杆菌处理为对照；将准备好的基质分装至塑料桶中（高40cm，直径25cm），育秧好的水稻苗用自来水冲洗干净，灭菌超纯水冲洗三遍后，种植于上述塑料桶中，每桶三株；实验设5组处理，分别为对照、镉处理、镉+棘孢曲霉处理、镉+蜡样芽孢杆菌处理、镉+棘孢曲霉+蜡样芽孢杆菌处理，每个处理5个重复。在温室可控条件下培养，水稻结实成熟后，处理结束；处理期间，每隔一个月对基质中微生物数量进行测定；处理结束后，测定水稻各器官镉浓度。

试验结果分析：在整个处理期间，基质中棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌均为优势菌落，数量显著多于其他微生物；镉胁迫下，外源添加混合菌株的效果显著优于单独添加棘孢曲霉和蜡样芽孢杆菌；外源添加混合菌株能够减轻镉对水稻生长的毒害作用(图2.1-图2.2，图3.1-图3.2)，能够降低水稻对镉的转运能力，降低水稻根际土壤pH和有效态镉浓度(图5.1-图5.2)。

3、实施例三：小区试验

试验时间：2014年4月～8月，试验地点：武汉

取湖南株洲清水塘化工区镉污染土壤置于水泥池(长×宽×高＝6m×6m×0.5m)，按225kg/公顷施入高效复合肥；表层覆1～2cm微生物培养基质，并充分混入0～25cm的表层土壤，呈十字状开两条畦沟，以不添加菌株的基质为对照；将育秧好的籼稻‘9311’种植于小区，每个小区种植80株，每个处理设置3个小区；依据实际生长进行田间管理，定期浇水、除草、并追肥，一直到水稻结实成熟后，处理结束。测定水稻各器官镉浓度。

试验结果分析：添加微生物培养基质小区内的水稻长势明显优于对照，分蘖数更多；不同器官镉浓度的测定结果也显示，添加微生物培养基质后，水稻各器官镉浓度均低于对照(图4.1-图4.6)，尤其是籽粒中镉浓度，与对照相比达到了显著水平(图4.1)；以上结果均表明外源添加微生物培养基质提高了水稻的耐镉能力，降低了镉在水稻籽粒的积累量。

Claims (5)

1.一种利用耐镉微生物降低镉污染稻田中水稻籽粒镉含量的方法，其特征在于包括下列步骤：

①耐镉微生物的筛选纯化，获得能耐300mg/L镉的两株微生物菌株

A、样地的选择；

B、耐镉微生物的筛选纯化；

C、筛选培养基的配方；

②耐镉菌株的鉴定，耐镉菌株经鉴定为棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌

A、DNA的提取与PCR扩增；

B、PCR产物测序与BLAST鉴定

筛选出的耐镉能力最强的细菌和真菌分别为蜡样芽孢杆菌和棘孢曲霉真菌；

③耐镉微生物培养基质的制备

A、棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌最适温度和pH的确定；

B、菌悬液的制备：

C、微生物培养基质的制备：

④耐镉微生物培养基质在水稻田中的应用

A、整地；

B、播种；

C、田间管理：a、苗期管理；b、分蘖期管理；c、拔节期管理；d、抽穗期管理。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤①：

A、样地的选择

根据湖南矿区和化工厂分布情况，确定4个污染土壤采集区，分别为湖南浏阳废弃化工厂、株洲清水塘化工区、湘潭滴水村化工厂和岳阳桃林铅锌矿区；

每个采集区等距离设置8个采样点，用不锈钢工具采集表层0～20cm优势植物根际土，去除所有动植物残体后，将每个污染土壤采集区的8个采样点的土壤混合均匀；每个采集区得到一份混合污染土壤，并于荫凉处过2mm塑料筛，装入自封袋中，放入干冰中运至实验室；

B、耐镉微生物的筛选纯化

将上述4份保存于-20℃冰箱中的样品，分别取10g在无菌条件下加入装有适量玻璃珠的250mL三角瓶中，加入90mL无菌水，在旋转式摇床上250r/min震荡30min；震荡结束后静置30min；吸取上清液并用无菌水稀释100倍，取1mL稀释后的上清液涂布到加有50mg/L镉的培养基上，待菌落长出后，用平板划线分离法将菌落接种到更高镉浓度的培养基上进行培养，镉的浓度依次为100、150、200、300mg/L；最终挑选出在镉浓度为300mg/L的培养基上仍能生长的两株菌株用于鉴定，并将单菌落在培养基上划线转接5次以达到对菌株进行纯化的目的，培养温度为30℃；

C、筛选培养基的配方：

筛选耐镉微生物所需的培养基为添加不同浓度CdSO₄的固体培养基：

马丁氏琼脂培养基，用于培养真菌：MgSO₄·7H₂O0.5g，KH₂PO₄1g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，琼脂18g，定容到1L后加入1%的孟加拉红溶液3.3mL；

牛肉膏蛋白胨培养基，用于培养细菌：NaCl5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂18g，定容到1L，调整pH为7.0～7.2。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤②：

A、DNA的提取与PCR扩增：

以筛选纯化得到的两株耐镉菌株为模板，提取总DNA，采用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC扩增ITS区；将PCR产物加入15g/L的琼脂糖凝胶中电泳，ITS序列的长度一般为500～700bp；电泳后，将扩增所得的片段切下，用凝胶回收试剂盒回收扩增产物；

PCR反应体系为：10×ExTaqbuffer2.0μL，2.5mMdNTPMix1.6μL，5pPrimer10.8μL，5pPrimer20.8μL，Template0.5μL，5uExTaq0.2μL，ddH2O14.1μL；

PCR反应条件为：95°C预变性5min，95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，24个循环，最后72°C延长10min使其完全反应；

B、PCR产物测序与BLAST鉴定：

将回收后的产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序；测序结束后，将ITS序列用BLAST程序与GenBank中的ITS序列进行同源性比对；经鉴定，筛选出的耐镉能力最强的细菌和真菌分别为蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus和棘孢曲霉真菌Aspergillusaculeatus。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤③：

A、棘孢曲霉真菌和蜡样芽孢杆菌最适温度和pH的确定：

分别将1mL两种菌株的菌悬液接种到新配制并灭菌的200mL液体培养基中，按照不同温度：10、15、20、25、30、35、40℃和pH值：4、5、6、7、8、9条件下震荡培养36h，通过测定吸光度值，确定该菌株生长温度；

蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus在15～40℃生长良好，pH4～9均能生长，最佳pH为6～7；棘孢曲霉真菌Aspergillusaculeatus在10～35℃生长良好，pH4～7均能生长，最佳pH为6；

B、菌悬液的制备：

取上述筛选得到的耐镉真菌和细菌，分别接入对应的灭菌液体培养中，蜡样芽孢杆菌35℃200r/min，棘孢曲霉真菌30℃200r/min培养36h后，8000r/min离心10min，收集菌液，用无菌水洗涤后稀释至OD₆₀₀=1.0，菌浓度为10⁸CFU/mL，制成菌悬液备用；

C、微生物培养基质的制备：

培养基质为沙子和锯木屑，v/v=3：1，将上述两种菌株的菌悬液接种到培养基质中，每1kg培养基质中分别接种20mL蜡样芽孢杆菌菌悬液和20mL棘孢曲霉真菌菌悬液，调节pH至6，30℃培养4天，制成微生物培养基质。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤④：

④耐镉微生物培养基质在水稻田中的应用

A、整地

去除土壤表层的大石块、树枝等杂物，撒施底肥，每亩施用30kg高效复合肥和30kg碳铵和微生物培养基质，每亩施用2000kg于土壤表层，翻耕土壤10～20cm并耙平；每隔3m左右开一条畦沟，以便于施肥、打农药等田间管理，并做到横沟、竖沟和围沟相通，沟宽0.2m、深0.2～0.3m，使田中流水、排水畅通，田面不积水；充分灌溉后，晾晒3～4天后播种；播种前3～5天，每亩用60%的丁草胺乳剂150g，兑水30～40kg喷雾，以达到防止杂草的目的；

B、播种

采用人工直播的方法进行播种：首先将选好的种子用0.3%硫酸铜液浸种48h后，用清水冲洗干净，再用清水浸种2～3天；将浸种后的种子均匀播种，播种量为常规稻3～4kg/每亩，杂交稻2kg/每亩，均匀覆土3～5mm；

C、田间管理

a、苗期管理

水稻出苗后，对于缺苗严重的地段，要进行补苗，及时移密补疏；苗期管理要做到田面不积水，保持湿润，确保水稻扎根立苗；在稻苗2叶1心后浅水勤灌；稻苗3叶1心期,每亩撒施尿素5kg、钾肥10kg，追肥促进早分蘖，以达到计划苗数；除此之外，稻象甲和灰飞虱是水稻苗期的重要虫害，可以用快杀乳油，每亩用28%快杀乳油20～30mL，和锐劲特胶悬剂+抑虱净乳油，每亩用5%锐劲特胶悬剂30mL+30%抑虱净乳油10mL，分别防止稻象甲和灰飞虱；

b、分蘖期管理

分蘖期要做到浅水勤浇、适当晒田：当有效分蘖期结束以后，要灌深水抑制分蘖发生；分蘖后期，每亩追施尿素15～25kg，可增加有效穗，促进穗粒形成；分蘖期需要注意防治白叶枯病、稻蓟马等病虫害，用20%叶青双可湿性粉剂10g/亩对水喷雾；

c、拔节期管理

如拔节期发现水稻植株叶黄缺肥，追施尿素5～10kg/亩；拔节期是纹枯病的多发期，可用50%多菌灵粉剂10g/亩，配合20%粉锈宁乳油40mL/亩进行防治；

d、抽穗期管理

抽穗期，应适时进行追肥，幼穗分化期，要保持水层深度达到4～7cm；灌浆期，采取干干湿湿，以湿为主的灌水办法。