CN104624637A - 一种利用耐镉真菌降低辣椒果实中镉含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用耐镉真菌降低辣椒果实中镉含量的方法，涉及微生物生态修复技术领域。本方法是：①将重金属污染土壤上优势物种根际土壤中的耐镉真菌分离、纯化和鉴定；②将耐镉真菌接种至锯木屑中繁殖制备成微生物修复基质，然后施用于镉污染土壤中，翻耕和平整土壤后开沟起垄；③在施用了微生物修复基质的镉污染土壤上采用幼苗移栽的方式种植辣椒；④田间管理。本发明克服了筛选出的耐镉微生物对土壤环境的适应性问题；确保了微生物生长的养分供应；抑制镉向果实中的转移，降低了果实中镉的含量；微生物生长迅速，可大规模繁殖，修复效果好；成本低廉、操作简便。

Description

一种利用耐镉真菌降低辣椒果实中镉含量的方法

技术领域

本发明涉及微生物生态修复技术领域，尤其涉及一种利用耐镉真菌降低辣椒果实中镉含量的方法。

背景技术

辣椒是茄科辣椒属植物，原产于中美洲和南美洲，现在已成为一种世界性的蔬菜作物。辣椒是我国重要的经济作物，其产地几乎遍布全国。截止到2011年我国辣椒种植面积133 万hm²，占世界辣椒总产量的35%，经济总产值700亿元，居蔬菜之首位，占世界蔬菜总产值的16.67%。辣椒作为一种风味蔬菜, 不仅可以鲜食而且可加工成辣椒粉、辣椒酱等，因其独特的辣味而深受消费者欢迎。我国传统医药早就注意到辣椒的药用价值，现代医学研究也显示，辣椒及其有效成分对人体确有多方面的保健作用和相当的“药效”：辣椒酊或辣椒碱，内服可作健胃剂，有促进食欲、改善消化的作用；辣椒碱对蜡样芽孢杆菌及枯草杆菌有抑制作用；辣椒茎、叶对结核杆菌有很轻微的抑制。辣椒果实中的辣味成分——辣椒素类物质，目前在食品工业中作为添加剂和医药工业中作为镇痛剂已得到广泛应用。

重金属镉是植物非必需元素，生物迁移性很强，极易被植物吸收并累积。近年来，由于城市化的发展以及矿产开采冶炼等工业活动，工业“三废”的不合理排放和固体废弃物处理不善，导致土壤中镉含量急剧增加。在农业生产活动中，施用化肥特别是磷肥、石灰、有机废物、污泥肥及污水灌溉等造成重金属镉不断进入农业环境中，对农田、菜地等造成污染。据统计，目前我国受镉等重金属污染的耕地面积近2000万hm²，约占总耕地面积的1/5。土壤中镉的增加，严重影响农作物生产及食品安全。有关调查表明，我国大城市蔬菜重金属污染中以镉、铅为严重。蔬菜受镉污染后，不仅会严重影响其产量和品质，而且会进一步通过食物链进入人体，进而危害人体健康，如日本发生的骨痛病是由重金属镉污染引起的。

镉污染已成为当今世界影响范围最广泛、危害最大的环境问题之一。镉具有很强的生物毒性和较强的化学活性，易被植物吸收，转移到果实、种子等农作物产品中而使农产品中镉含量超标，对人体的健康造成严重威胁。同时，镉被植物大量吸收后能产生各种生理毒害反应，通过损伤细胞结构，破坏植物光合作用、呼吸作用和营养代谢等影响植物的正常代谢活动和生长发育，从而导致作物不同程度的减产，乃至死亡。

采用工程、物理和化学方法修复镉污染土壤具有一定的局限性，难以大规模处理，并且会导致土壤结构破坏、生物活性下降和土壤肥力退化。农业生态措施其周期太长，效果也不显著。作为新兴的高效生态修复技术——生物修复，以其良好的社会、生态综合效益，易被大众接受，具有广阔的应用前景。其中微生物在修复重金属污染土壤方面具有独特的作用。其主要的作用原理为：微生物本身可以吸附重金属；微生物与作物根系互作，改变根际微环境，降低植物对土壤中重金属的吸收或向地上部的转移，而降低农产品中镉的含量。

微生物修复具有下列优点：

①不破坏植物生长的土壤环境；

②不会形成二次污染或导致污染物的转移；

③费用低廉；

④操作简便，有效避免操作人员受污染物直接影响；

⑤修复时间短，对周围环境干扰少。

目前，微生物在修复重金属污染土壤中也存在下列不足之处：

①微生物对土壤的适应性较差；

②微生物与植物的兼容性较低；

③微生物存活率低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种利用耐镉真菌降低辣椒果实中镉含量的方法，可有效地抑制重金属镉向果实中转移，降低果实中镉的含量，减少重金属镉对人体的危害。

本发明的目的是这样实现的：

1、基本思路

对镉污染土壤优势植物的根际土壤中的微生物进行耐镉筛选，选取耐镉性最强的微生物进行分离纯化并鉴定，再将其接种并大量繁殖制备成微生物修复基质后添加到镉污染土壤中，然后在土壤上种植辣椒，通过合理的田间管理和真菌与辣椒根系的相互作用而使镉在根系中积累，抑制镉向果实中的转移，降低果实中镉的含量。

2、本方法包括下列步骤：

①将重金属污染土壤上优势物种根际土壤中的耐镉真菌分离、纯化和鉴定；

②将耐镉真菌接种至锯木屑中繁殖制备成微生物修复基质，然后施用于镉污染土壤中，翻耕和平整土壤后开沟起垄；

③在施用了微生物修复基质的镉污染土壤上采用幼苗移栽的方式种植辣椒；

④通过少量多次灌水、适时防治病虫害杂草以及适时中耕松土和补充微生物修复基质的田间管理，抑制重金属镉向果实中转移，降低果实中镉的含量。

本发明具有下列优点和积极效果：

①利用镉污染地区优势植物的根际土壤作为耐镉微生物筛选的来源，克服了筛选出的耐镉微生物对土壤环境的适应性问题；

②将耐镉真菌接种到锯木屑中繁殖制备成修复基质后施用，确保了微生物生长的养分供应，既可以提高微生物的繁殖率和存活率，还有效利用了废弃物；

③通过真菌与植物根系的相互作用而使镉在根系中积累，抑制镉向果实中的转移，降低了果实中镉的含量；

④微生物生长迅速，可大规模繁殖，修复效果好；

⑤成本低廉、操作简便。

附图说明

图1是耐镉真菌对辣椒植株节高和单株果重影响的坐标图；

图2是耐镉真菌对辣椒挂果数和分枝级数影响的坐标图；

图3是耐镉真菌对辣椒根、叶、茎和果实中镉含量影响的坐标图（盆栽试验）；

图4是耐镉真菌对辣椒株高和单株果重影响的坐标图；

图5是耐镉真菌对辣椒根、叶、茎和果实中镉含量影响的坐标图（大田自然环境栽培试验）。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明：

一、方法

1、耐镉真菌的分离纯化

选取5g中国株洲重金属污染区优势植物根际土壤置于三角瓶中，无菌条件下，加入适量玻璃珠和90ml无菌水，在旋转式摇床150rpm、30℃振荡30min，以使微生物从土壤中充分洗脱，然后静置20min，吸取上清液用无菌水稀释100倍，即为土壤菌悬液；取1ml上清液均匀涂布到镉浓度为50mg/L的固体平板上（牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏琼脂培养基或高氏一号培养基），待菌落长成后，利用平板划线分离法接种到镉浓度为100、150和200mg/L的三种固体培养基中，30℃培养；将耐镉能力最强的菌落选出，对其单菌落连续4次采用平板划线分离法进行纯化；

2、将耐镉真菌进行种属鉴定

将耐镉能力最强的菌株接种至装有30ml液体培养基（马丁氏琼脂培养基）的离心管中（50ml）振荡培养一天，8000rpm离心10min，倒掉上清液并加入无菌水重复离心2次后取出沉淀，在无菌条件下利用真菌DNA提取试剂盒抽提基因组DNA，提取产物利用PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶产物切割回收并纯化后利用真菌ITS序列测序，测序结果提交至Gene Bank并利用BLAST进行序列比对，利用序列相似性确定耐镉真菌为棘孢曲霉；

3、耐镉真菌繁殖及微生物修复基质的制备

采用浇灌法，按10g液态培养基培养的棘孢曲霉菌落兑1kg经过高温高压灭菌且含水量约为50%锯木屑的比例，将耐镉真菌-棘孢曲霉菌落接种到锯木屑中培养，调节pH值至6.0，在28℃培养两天使真菌大量繁殖，制备成镉污染土壤微生物修复基质，将用于添加至镉污染土壤中。

二、实施例

1、实施例一：盆栽试验

1）将菜园表层土晾干并粉碎，过2mm筛后于高温高压下灭菌30min，按2.5mg/kg土壤干重添加镉含量并置于密闭的环境平衡2个月，获得镉污染土壤；

2）将获得的经镉平衡后的土壤按每千克添加100g经过大量繁殖棘孢曲霉的锯木屑微生物修复基质和10g复合肥，混匀后装至高18cm，上口径15cm和下口径12cm的塑料盆中，以添加未接种棘孢曲霉的锯木屑为对照；

3）将苗床中苗高约为20cm左右的辣椒幼苗移栽至塑料盆中；种植的辣椒放置于玻璃温室进行培养；辣椒移栽后每天适量浇水，保持土壤湿润即可；初花期每盆补充150g经过大量繁殖棘孢曲霉的微生物修复基质与表层土混合；移栽后45天左右开始挂果，每株挂果2个后，分别测定株高、分枝数和分枝级数，取根、茎、叶和果实烘干测定镉含量，同时取5g土壤进行真菌分离培养；

4）试验结果分析：

从土壤中分离培养的优势菌落仍为棘孢曲霉；与镉胁迫下添加不含棘孢曲霉的修复基质的植株相比，添加含棘孢曲霉的微生物修复基质促进了辣椒的生长，表现为植株节高和单株果重增加（见图1）；分枝级数和挂果数增多(见图2)；添加2.5mg/kg的镉于土壤中，根、茎、叶和果实中的镉含量显著升高，与未添加耐镉真菌棘孢曲霉的处理相比，添加含棘孢曲霉修复基质处理，重金属镉含量显著下降，且在根系中大量积累，而转移到果实中镉的含量比未添加真菌的辣椒果实低62%（件图3），表明施用耐镉真菌棘孢曲霉后，真菌与辣椒根系相互作用，促进镉在根中的积累，但抑制了镉向地上部的转移，尤其是向果实中的转移，降低了果实中镉的含量。

2、实施例二：大田自然环境栽培试验

1）镉污染土壤修复基质的施用

将接种并大量繁殖棘孢曲霉的微生物修复基质按每平方米土壤1.2kg的量添加至镉污染土壤表层，同时施复合肥15～20kg/亩，然后旋耕表层0～30cm的耕作层使土壤与修复基质及复合肥混匀，以未接种棘孢曲霉的锯木屑添加至土壤为对照；

2）镉污染土壤上栽植辣椒幼苗

将旋耕并混匀微生物修复基质的土壤开沟起垄，垄高28cm，沟宽40cm，按株行距为40cm×60cm的规格将辣椒幼苗移栽至添加了微生物修复基质并开沟起垄的土壤中；

3）田间管理

移栽后采用少量多次的灌溉方式，既保持了土壤湿润有利辣椒幼苗的成活，也有利于微生物的繁殖的活性的维持；生长中期（约移栽后45天左右）按每亩20kg的量施用磷酸二氢钾作为追肥；适时防治病虫害和杂草；初花期结合中耕松土，按每平方米0.5kg的量补充微生物修复基质；移栽后50天左右开始开花结果，花凋谢后22天左右采收果实，采收后称鲜重以计算总产量，在挂果2个时采集根、茎、叶和果实烘干测定镉含量，同时采集表层土壤进行真菌分离培养。

4）试验结果分析

研究结果显示，土壤中微生丰富，但添加了微生物修复基质的土壤中主要为棘孢曲霉，表明添加的真菌在自然环境下的土壤适应性仍较好，繁殖力强；添加了微生物修复基质的小区辣椒植株生长较旺，果实总产量比未添加的高10～15%左右（见图4）；添加微生物修复基质的辣椒根系中镉含量比未添加修复基质的含量高20～30%，但地上部，尤其是果实中的镉含量比未添加真菌的低46%（见图5），表明添加了含棘孢曲霉的微生物修复基质不仅促进了辣椒的生长，提高了产量，而且促进了镉在辣椒根系的积累，降低了辣椒果实中镉的含量，减少重金属镉对人体的危害。 

Claims (3)

1.一种利用耐镉真菌降低辣椒果实中镉含量的方法，其特征在于：

①将重金属污染土壤上优势物种根际土壤中的耐镉真菌分离、纯化和鉴定；

②将耐镉真菌接种至锯木屑中繁殖制备成微生物修复基质，然后施用于镉污染土壤中，翻耕和平整土壤后开沟起垄；

③在施用了微生物修复基质的镉污染土壤上采用幼苗移栽的方式种植辣椒；

④通过少量多次灌水、适时防治病虫害杂草以及适时中耕松土和补充微生物修复基质的田间管理，抑制重金属镉向果实中转移，降低果实中镉的含量。

2.按权利要求1所述的一种利用耐镉真菌降低辣椒果实中镉含量的方法，其特征在于所述的步骤②中的耐镉真菌繁殖及微生物修复基质的制备：

采用浇灌法，按10g液态培养基培养的棘孢曲霉菌落兑1kg经过高温高压灭菌且含水量约为50%锯木屑的比例，将耐镉真菌-棘孢曲霉菌落接种到锯木屑中培养，调节pH值至6.0，在28℃培养两天使真菌大量繁殖，制备成镉污染土壤微生物修复基质，将用于添加至镉污染土壤中。

3.按权利要求1所述的一种利用耐镉真菌降低辣椒果实中镉含量的方法，其特征在于大田自然环境栽培试验：

①镉污染土壤修复基质的施用

将接种并大量繁殖棘孢曲霉的微生物修复基质按每平方米土壤1.2kg的量添加至镉污染土壤表层，同时施复合肥15～20kg/亩，然后旋耕表层0～30cm的耕作层使土壤与修复基质及复合肥混匀，以未接种棘孢曲霉的锯木屑添加至土壤为对照；

②镉污染土壤上栽植辣椒幼苗

将旋耕并混匀微生物修复基质的土壤开沟起垄，垄高28cm，沟宽40cm，按株行距为40cm×60cm的规格将辣椒幼苗移栽至添加了微生物修复基质并开沟起垄的土壤中；

③田间管理

移栽后采用少量多次的灌溉方式；生长中期按每亩20kg的量施用磷酸二氢钾作为追肥；适时防治病虫害和杂草；初花期结合中耕松土，按每平方米0.5kg的量补充微生物修复基质。