CN106754577A - 一种复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种复合菌剂及其制备方法和应用,属有机废弃物处理技术领域。该复合菌剂的制备方法包括:活化第一类降解菌和第二类降解菌,配制多个牛肉膏蛋白胨固体培养基,将活化后的降解菌按所含菌种的类别分别接种于不同的牛肉膏蛋白胨固体培养基中培养,挑取处于对数期或稳定期的第一类降解菌和第二类降解菌分别进行稀释,得到第一菌悬液和第二菌悬液,混合两种菌悬液,得到复合菌剂。其中,第一类降解菌包括芽孢杆菌和链球菌,第二类降解菌包括假单胞菌、嗜酸菌和不动杆菌。该制备方法简单、易操作且耗时短。经此方法得到的复合菌剂用于处理有机废弃物,对有机废弃物中所含的土霉素、四环素、金霉素和强力霉素等具有高效稳定的降解能力。

Description

一种复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及有机废弃物处理技术领域,且特别涉及一种复合菌剂及其制备方法和 应用。
背景技术
[0002] 微生物发酵法是一种常用的低投入、高效益的有机废弃物无害化处理方法。目前, 大部分有机废弃物多数是自然堆积发酵,时间长,堆肥温度低,对有害微生物、寄生虫卵的 杀灭和除臭效果不理想,并且长期的堆肥导致厌氧发酵增多,反硝化细菌大量增殖,大量的 氮元素损失。因此,在有机废弃物堆积过程中添加有效微生物,不仅可以加速有机碳的分 解,减少氮素损失,减少堆积过程中氨气、硫化氢的挥发,缩短发酵时间;而且还可使堆肥温 度升高,杀死部分病原微生物和寄生虫,使有机废弃物充分腐熟,生产出优质的绿色有机肥 料。
[0003] 现阶段,已有部分用于处理有机废弃物的微生物菌剂,但是这些微生物菌剂中部 分菌剂所含的菌种来源有限,价格昂贵,不适宜普遍使用;部分菌剂所含的菌种繁杂,制备 过程和条件难以控制。且大多数现有的微生物菌剂仅对有机废弃物中所含的土霉素、四环 素、金霉素和强力霉素中的一种或两种物质同时具有降解能力,暂还未见能同时对土霉素、 四环素、金霉素和强力霉素均具有较好降解效果的微生物菌剂。
发明内容
[0004] 本发明的第一目的在于提供一种复合菌剂的制备方法,该制备方法简单、易操作 且耗时短。
[0005] 本发明的第二目的在于提供一种由上述制备方法制备而得的复合菌剂,该复合菌 剂对地土霉素、四环素、金霉素和强力霉素同时具有较好地降解能力。
[0006] 本发明的第三目的在于提供一种上述复合菌剂的应用,即将其用于处理有机废气 物,对有机废弃物中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的降解效果显著。
[0007] 本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的:
[0008] 本发明提出一种复合菌剂的制备方法,包括以下步骤:活化第一类降解菌和第二 类降解菌,其中,第一类降解菌包括芽孢杆菌和链球菌,第二类降解菌包括假单胞菌、嗜酸 菌和不动杆菌。
[0009] 配制与芽孢杆菌、链球菌、假单胞菌、嗜酸菌和不动杆菌分别对应的牛肉膏蛋白胨 固体培养基,将活化后的第一类降解菌和第二类降解菌分别接种于对应的牛肉膏蛋白胨固 体培养基中培养,分别挑取处于对数期或稳定期的第一类降解菌和第二类降解菌进行稀 释,得到第一菌悬液和第二菌悬液,混合第一菌悬液和第二菌悬液,得到复合菌剂。
[0010] 本发明还提出一种复合菌剂,其由上述复合菌剂的制备方法制备而得。该复合菌 剂可应用于有机废弃物处理领域。
[0011] 本发明还提出一种上述复合菌剂的应用,可应用于降解有机废弃物中所含的土霉 素、四环素、金霉素和强力霉素。
[0012] 本发明较佳实施例中复合菌剂的制备方法的有益效果是:通过将第一类降解菌和 第二类降解菌混合,丰富了复合菌剂所包含的有效菌种;第一类降解菌中含有的芽孢杆菌 和链球菌对四环素降解效果较佳,第二类降解菌中含有的假单胞菌、嗜酸菌和不动杆菌对 土霉素、金霉素和强力霉素的降解效果较佳。选择处于对数期或稳定期的第一类降解菌和 第二类降解菌进行稀释,可将菌剂中的活菌数维持在适宜的范围,并有效避免了菌悬液中 由于菌种浓度过高或过低影响降解效果。故上述复合菌剂对地土霉素、四环素、金霉素和强 力霉素同时具有较好地降解能力。此外,本实施例中的复合菌剂制备方法简单、易操作且耗 时短。将其应用于处理有机废弃物中的土霉素、四环素、金霉素和强力霉素效果显著。
具体实施方式
[0013] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建 议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产 品。
[00M]下面对本发明实施例的复合菌剂及其制备方法和应用进行具体说明。
[0015] 有机废气物通常指在生产、生活和其它活动中产生的丧失原有利用价值或虽未丧 失利用价值但被抛弃或者放弃的固态、液态或者气态的有机类物品和物质。目前,有机废弃 物的数量正日益增多,医用抗生素、农用抗生素和工业抗生素可通过废水和废渣等有机废 弃物排放至环境中。抗生素可诱导菌体内产生耐药基因,又由于耐药基因极易传播,并易产 生高度耐药的多重耐药菌,若耐药基因从非致病菌突变为致病菌,则会对人类造成严重影 响。本发明实施例的复合菌剂主要用于对有机废弃物中的四环素类,如土霉素、四环素、金 霉素和强力霉素进行降解。
[0016] 本发明实施例提供的复合菌剂主要包括第一类降解菌和第二类降解菌。作为较佳 地,上述第一类降解菌例如可以包括芽孢杆菌和链球菌,第二类降解菌例如可以包括假单 胞菌、嗜酸菌和不动杆菌。
[0017] 其中,芽孢杆菌为能形成芽孢的杆菌或球菌,包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭 菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。该类细菌对外界有害因子抵抗力强、分布广。芽 孢杆菌中的芽孢具有厚实且含水量较低的多层结构,且芽孢中还具有含量较高的吡啶二羧 酸,因此使其对热、干燥、辐射和化学消毒剂等具有较强的抗性。本实施例中将芽孢杆菌作 为第一类降解菌的组成成分之一,可形成强度极为优良的天然材料聚麸胺酸,作为土壤的 保护膜,可防止肥分及水分流失。其次,芽孢杆菌具有代谢快和繁殖快的特点,在增殖的同 时,释放出具有高活性的分解酵素,从而将难分解的大分子物质分解成可利用的小分子物 质。再次,芽孢杆菌还可以分解产生恶臭气体的有机物质、有机硫化物和有机氮等,尤其对 四环素类抗生素具有较佳地降解效果。
[0018] 链球菌作为一类常见的细菌,广泛存在于自然界和人及动物的粪便或者健康人鼻 咽部。该类细菌能发酵简单的糖类,对青霉素、红霉素、氯霉素和四环素等较敏感。链球菌通 过细菌核糖体与四环素类抗生素结合,可避免抗生素的扩散和传播,并起到一定的降解作 用。
[0019] 承上,上述包括芽孢杆菌和链球菌的第一类降解菌对四环素类抗生素,尤其是四 环素具有较好地降解作用。较佳地,第一类降解菌中的芽孢杆菌和链球菌的重量比例如可 以为1:2-5,在此重量比下将两种菌混合,可使第一类降解菌对四环素的降解效果达到最 佳,并避免了菌种的浪费。
[0020] 进一步地,为提高复合菌剂对四环素类抗生素中其余种类物质的降解程度,本实 施例复合菌剂的第二类降解菌例如可包括重量比为1:4-8:0.5-3的假单胞菌、嗜酸菌和不 动杆菌。
[0021] 其中,假单胞菌属于无核细菌,其对四环素类抗生素的作用机理如下:一种是通过 假单胞菌产生抗生素灭活酶或抗生素修饰酶,如内酰胺酶对四环素抗生素起到一定的水 解作用;另一种是通过改变四环素抗生素的作用靶点,使假单胞菌与四环素类抗生素结合, 从而改变四环素类抗生素的结构,使其失去原有的活性。
[0022] 由于本实施例中所用到的微生物菌种最适生长pH为5-9,为了扩大本复合菌剂的 适用范围,在第二类降解菌中优选加入了嗜酸菌,如氧化亚铁硫杆菌、氧化钩端螺旋菌和铁 氧化细菌等。嗜酸菌作为一类有益菌群,可平衡人类消化系统的功能,促进免疫系统,并增 强抵抗力。该类细菌在极低的PH环境下,甚至在pH低于0的环境中均可生长。该类细菌与四 环素类抗生素作用时,可通过其细胞结构,将抗生素降解后排出体外。除此以外,嗜酸菌还 可氧化有机废弃物中的Fe2+为Fe3+,并且还能去除有机废弃物中的部分重金属,如Cu、Zn、Ni 和Cd等。
[0023] 不动杆菌主要分别在水体和土壤中,极易在潮湿环境中生存。此类细菌粘附力极 强,能有效降解有机废弃物中的四环素类抗生素物质。作为可选地,本实施例中的不动杆菌 例如可以选自醋酸钙不动杆菌、鲁菲不动杆菌、鲍曼不动杆菌、溶血不动杆菌、琼氏不动杆 菌和约翰不动杆菌中的至少一种。
[0024] 承上,上述包括假单胞菌、嗜酸菌和不动杆菌的第二降解菌对四环素类抗生素,尤 其是土霉素、金霉素和强力霉素具有较好地降解作用。并且,以上述重量比将假单胞菌、嗜 酸菌和不动杆菌混合,可使第二类降解菌对土霉素、金霉素和强力霉素的综合降解效果达 到最佳,同时也避免了菌种的浪费。
[0025] 制备时,先活化上述第一类降解菌和第二类降解菌,活化可以是在25-37 °C的条件 下活化16-32h,具体活化时间可通过观察微生物的生长情况确定,必要时可进行多次活化。 较佳地,活化温度为30°C,在此活化温度下,第一类降解菌和第二类降解菌中所含的菌种均 能较好生长。
[0026] 配制多个牛肉膏蛋白胨固体培养基,以分别与芽孢杆菌、链球菌、假单胞菌、嗜酸 菌和不动杆菌对应。此培养基例如可按以下配方配制:牛肉膏2_4g、蛋白胨8_12g、氯化钠4-6g、琼脂15-20g,水lOOO-llOOmL。按上述配比将培养基各配方混合,调节培养基的pH至中性 或微碱性(如pH为7.5-8),以利于细菌生长繁殖。高温灭菌后,将液体牛肉膏蛋白胨培养基 倒入至培养皿中,冷却即得牛肉膏蛋白胨固体培养基。该类培养基又称普通培养基,其所含 的牛肉膏可为微生物提供碳源和能源,蛋白胨可提供氮源,氯化钠则可提供无机盐。
[0027] 将活化后的第一类降解菌和第二类降解菌按不同的菌种类别分别接种于与其对 应的牛肉膏蛋白胨固体培养基中培养。也即将芽孢杆菌、链球菌、假单胞菌、嗜酸菌和不动 杆菌分别接种于5个不同的牛肉膏蛋白胨固体培养基中培养。作为优选地,接种时,可按照 重量比为1.5-5:1.5-5:100将第一类降解菌和第二类降解菌分别接种于牛肉膏蛋白胨固体 培养基中,也即将芽孢杆菌、链球菌、假单胞菌、嗜酸菌和不动杆菌均按重量比1.5-5:100分 别接种于5个牛肉膏蛋白胨固体培养基中。更优地,上述各菌种的接种重量比均还可以是1: 50。然后将接种后的培养基置于30-40 °C的条件下培养至少5天。较佳地,培养时间可以为7 天,此培养条件下,培养基中的第一类降解菌和第二类降解菌所产生的菌落数量和长势均 较好。
[0028] 因微生物的生长周期一般分为四个阶段,即迟缓期、对数期、稳定器和衰亡期。其 中处于对数期的细菌生长速度最快、代谢旺盛、酶系活跃、活菌数和总菌数大致接近,各细 胞的化学组成形态和理化性质也基本一致。处于稳定期的细菌活菌数相对稳定,总细菌数 达到最高水平,细胞代谢产物积累达到最高峰,芽孢杆菌的芽孢在此时期开始形成。因此, 本实施例中优选挑取处于对数期或稳定期的第一类降解菌和第二类降解菌分别进行稀释, 得到第一菌悬液和第二菌悬液。更佳地,挑取处于稳定期的芽孢杆菌进行稀释,以保证该类 菌种芽孢得以形成。
[0029] 为了避免稀释后的第一菌悬液和第二菌悬液中菌种浓度过低,对四环素类物质的 降低效果不佳,本实施例中例如可将第一类降解菌和第二类降解菌分别稀释成浊度〇D_为 0.7-0.9的第一菌悬液以及浊度OD6qq为0.75-0.85的第二菌悬液。此浊度范围内的第一菌悬 液和第二菌悬液所含菌种的数量适中,有效避免了菌悬液中由于菌种浓度过高或过低影响 降解效果。混合上述第一菌悬液和第二菌悬液,即得到本实施例的复合菌剂。
[0030] 值得说明的是,为了丰富复合菌剂中的菌种所需的营养元素,提高复合菌剂中菌 种的活菌量,本实施例中还可在复合菌剂中加入无机盐,例如硫酸镁和硫酸锌等。无机盐的 添加量例如按照复合菌剂重量的0.1-0.5 %进行添加。
[0031] 为了保证该复合菌剂对四环素类物质具有较好的降解效果,本发明实施例中所制 备出的复合菌剂的活菌含量优选为大于等于1.5X106cfu/mL。此外,经验证,本发明实施例 中所制备出的复合菌剂在室温(20-40Γ)保存3个月后每毫升复合菌剂中活菌总数不少于 1.0X106cfu/g,说明本发明实施例所提供的制备方法简单并高效可行。
[0032] 因本实施例的复合菌剂主要可用于降解有机废弃物中的四环素、土霉素、金霉素 和强力霉素,在实际应用中,例如可将该复合菌剂用于有机废弃物中的堆肥。具体地,可在 堆肥初期,将复合菌剂按堆肥重量的2-5%添加于堆肥中进行发酵降解,且该堆肥既可以是 好氧性堆肥,也可以是兼性厌氧性堆肥。
[0033] 值得说明的是,本实施例中第一类降解菌、第二类降解菌和有机盐的种类和含量, 以及复合菌剂制备过程所涉及到的制备数据等均不仅限于上述范围,制备者可根据实际需 要对上述内容进行相关调整。
[0034] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0035] 实施例1
[0036] 于25°C的条件下活化第一类降解菌和第二类降解菌32h,其中第一类降解菌含有 重量比为1:2的芽孢杆菌和链球菌,第二类降解菌含有重量比为1:4:0.5的假单胞菌、嗜酸 菌和不动杆菌。
[0037] 将2g牛肉膏、8g蛋白胨、4g氯化钠和15g琼脂加入至IOOOmL水中,调节混合溶液的 pH至中性,得到液体牛肉膏蛋白胨培养基。经高温灭菌后,将上述液体牛肉膏蛋白胨培养基 倒入培养皿中,冷却得到牛肉膏蛋白胨固体培养基。
[0038] 将芽孢杆菌、链球菌、假单胞菌、嗜酸菌和不动杆菌分别按重量比为1.5:100接种 于5个不同的牛肉膏蛋白胨固体培养基中,然后置于30°C的条件下培养5天。挑取处于对数 期的芽孢杆菌和链球菌稀释为浊度OD6qq为0.7的第一菌悬液,挑取处于对数期的假单胞菌、 嗜酸菌和不动杆菌稀释为浊度OD6OO为0.75的第二菌悬液,混合上述第一菌悬液和第二菌悬 液得到复合菌剂。按复合菌剂重量的0.1%向复合菌剂中加入硫酸镁,该复合菌剂的活菌含 量为1.5\106(^11/!11匕将其在20°(:的条件下保存3个月后每毫升复合菌剂中活菌数为1.0乂 106cfu/g〇
[0039] 实施例2
[0040] 于37°C的条件下活化第一类降解菌和第二类降解菌16h,其中第一类降解菌含有 重量比为1:5的芽孢杆菌和链球菌,第二类降解菌含有重量比为1:8: 3的假单胞菌、嗜酸菌 和不动杆菌。
[0041] 将4g牛肉膏、12g蛋白胨、6g氯化钠和20g琼脂加入至IlOOmL水中,调节混合溶液的 pH至7.5,得到液体牛肉膏蛋白胨培养基。经高温灭菌后,将上述液体牛肉膏蛋白胨培养基 倒入培养皿中,冷却得到牛肉膏蛋白胨固体培养基。
[0042] 将芽孢杆菌、链球菌、假单胞菌、嗜酸菌和不动杆菌分别按重量比为1:20接种于5 个不同的牛肉膏蛋白胨固体培养基中,然后置于40°C的条件下培养7天。挑取处于稳定期的 芽孢杆菌和链球菌稀释为浊度OD6qq为0.9的第一菌悬液,挑取处于稳定期的假单胞菌、嗜酸 菌和不动杆菌稀释为浊度OD6qq为0.85的第二菌悬液,混合上述第一菌悬液和第二菌悬液得 到复合菌剂。按复合菌剂重量的0.5 %向复合菌剂中加入硫酸锌,该复合菌剂的活菌含量为 2 X 106cfu/mL。将其在40°C的条件下保存3个月后每毫升复合菌剂中活菌数为1.5 X IO6Cfu/ g°
[0043] 实施例3
[0044] 于30°C的条件下活化第一类降解菌和第二类降解菌24h,其中第一类降解菌含有 重量比为1:3.5的芽孢杆菌和链球菌,第二类降解菌含有重量比为1:6:1.7的假单胞菌、嗜 酸菌和不动杆菌。
[0045] 将3g牛肉膏、IOg蛋白胨、6g氯化钠和17g琼脂加入至1050mL水中,调节混合溶液的 pH至8,得到液体牛肉膏蛋白胨培养基。经高温灭菌后,将上述液体牛肉膏蛋白胨培养基倒 入培养皿中,冷却得到牛肉膏蛋白胨固体培养基。
[0046] 将芽孢杆菌、链球菌、假单胞菌、嗜酸菌和不动杆菌分别按重量比为1:50接种于5 个不同的牛肉膏蛋白胨固体培养基中,然后置于35°C的条件下培养6天。挑取处于稳定期的 芽孢杆菌和链球菌稀释为浊度OD6qq为0.8的第一菌悬液,挑取处于对数期的假单胞菌、嗜酸 菌和不动杆菌稀释为浊度OD6qq为0.8的第二菌悬液,混合上述第一菌悬液和第二菌悬液得 到复合菌剂。按复合菌剂重量的0.3%向复合菌剂中加入硫酸镁和硫酸锌的混合物,该复合 菌剂的活菌含量为1.5X107cfu/mL。将其在30°C的条件下保存3个月后每毫升复合菌剂中 活菌数为2X106cfu/g。
[0047] 实验例
[0048] 重复实施上述实施例1-3,制得足够多的复合菌剂,并以按上述各实施例所得的复 合菌剂分别作为试验组1-3,在堆肥初期,将试验组1-3中的复合菌剂分别添加于3组具有相 同条件的堆肥中,发酵10天。测试发酵10天后试验组1-3的复合菌剂对堆肥中土霉素、四环 素、金霉素和强力霉素的降解效果,上述降解效果以降解后的堆肥中土霉素、四环素、金霉 素和强力霉素的残留率(%)表示,其结果如表1所示:
[0049] 表1 土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的残留率
Figure CN106754577AD00081
[0051] 由表1可以看出,经本试验组1-3中的复合菌剂降解后的堆肥中土霉素、四环素、金 霉素和强力霉素的残留率均未超过15%,说明本实施例中的复合菌剂对堆肥中土霉素、四 环素、金霉素和强力霉素均同时具有较好地降解能力。对比试验组1-3,可看出试验组3制备 出的复合菌剂性能较其余两组试验组的复合菌剂对堆肥中土霉素、四环素、金霉素和强力 霉素的降解效果略好,其原因在于该试验组中采用的处于稳定期的芽孢杆菌制备第一菌悬 液,提高了芽孢杆菌对四环素类物质的分解能力,其次,该复合菌剂中有机盐同时包含了硫 酸镁和硫酸锌,为细菌生长提供了镁元素和锌元素;再次,该试验组在制备菌剂的过程中第 一类降解菌和第二类降解菌的配比、菌种培养的参数等均较优,故其降解效果更佳。
[0052] 综上所述,本发明实施例的复合菌剂,该复合菌剂成本低廉,产品贮存时间长,对 地土霉素、四环素、金霉素和强力霉素同时具有较好地降解能力。该复合菌剂的制备方法简 单、易操作且耗时短。将其应用于处理有机废弃物中的土霉素、四环素、金霉素和强力霉素 效果显著。
[0053] 以上所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。本发明的实 施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施 例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1. 一种复合菌剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:活化第一类降解菌和第二类 降解菌,其中,所述第一类降解菌包括芽孢杆菌和链球菌,所述第二类降解菌包括假单胞 菌、嗜酸菌和不动杆菌; 配制与所述芽孢杆菌、所述链球菌、所述假单胞菌、所述嗜酸菌和所述不动杆菌分别对 应的牛肉膏蛋白胨固体培养基,将活化后的所述第一类降解菌和所述第二类降解菌分别接 种于对应的所述牛肉膏蛋白胨固体培养基中培养,分别挑取处于对数期或稳定期的所述第 一类降解菌和所述第二类降解菌进行稀释,得到第一菌悬液和第二菌悬液,混合所述第一 菌悬液和所述第二菌悬液,得到复合菌剂。
2. 根据权利要求1所述的复合菌剂的制备方法,其特征在于,所述芽孢杆菌和所述链球 菌的重量比为1:2-5。
3. 根据权利要求1所述的复合菌剂的制备方法,其特征在于,所述假单胞菌、所述嗜酸 菌和所述不动杆菌的重量比为1:4-8:0.5-3。
4. 根据权利要求1所述的复合菌剂的制备方法,其特征在于,将活化后的所述第一类降 解菌和所述第二类降解菌均按重量比为1.5-5:100分别接种于对应的所述牛肉膏蛋白胨固 体培养基中。
5. 根据权利要求1所述的复合菌剂的制备方法,其特征在于,培养是在30-40°C的条件 下维持至少5天。
6. 根据权利要求1所述的复合菌剂的制备方法,其特征在于,所述第一类降解菌与所述 第二类降解菌混合前,挑取处于对数期或稳定期的所述第一类降解菌,稀释成浊度〇D_为
0.7-0.9的所述第一菌悬液。
7. 根据权利要求1所述的复合菌剂的制备方法,其特征在于,所述第一类降解菌与所述 第二类降解菌混合前,挑取处于对数期或稳定期的所述第二类降解菌,稀释成浊度〇D_为
0.75-0.85的所述第二菌悬液。
8. —种复合菌剂,其特征在于,由权利要求1-7任一项所述的复合菌剂的制备方法制备 而得。
9. 权利要求8所述的复合菌剂在处理有机废弃物中的应用。
10. 根据权利要求9所述的复合菌剂在处理有机废弃物中的应用,其特征在于,所述有 机废弃物为堆肥,将所述复合菌剂按所述堆肥重量的2-5%添加于所述堆肥中进行发酵。
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