CN114522975A - 蚯蚓前肠和/或中肠内容物在修复β-内酰胺类抗生素和/或耐药基因污染的土壤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了蚯蚓前肠和/或中肠内容物在修复β‑内酰胺类抗生素和/或耐药基因污染的土壤中的应用，属于土壤修复技术领域。本发明能够同步高效削减有机菜田土壤中积累的β‑内酰胺类抗生素与高风险耐药基因的丰度，且不需要复杂的工艺流程和高成本的材料，操作简单成本低；使用蚯蚓前中肠段的肠道拮抗菌群消减土壤中的抗生素与耐药基因，不仅去除效率较高，且无二次污染，还维护了有机粪肥土壤中细菌群落的多样性和稳定性，同时避免了土著菌群带来的影响。

Description

蚯蚓前肠和/或中肠内容物在修复β-内酰胺类抗生素和/或耐 药基因污染的土壤中的应用

技术领域

本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及蚯蚓前肠和/或中肠内容物在修复β-内酰胺类抗生素和/或耐药基因污染的土壤中的应用。

背景技术

抗生素能够有效地防治畜禽的常见疾病，进而促进畜禽的健康生长。但是由于畜禽养殖业抗生素的长期滥用，不仅导致畜禽粪污中抗生素的残留，还致使畜禽粪污中大量耐药菌与耐药基因的出现。畜禽粪污作为有机肥施用于土壤会不可避免地增加畜禽养殖源抗生素与耐药基因进入农田环境的风险。畜禽粪源抗生素与耐药基因进入农田不仅会导致其在土壤环境的直接积累，还可能会传播至作物的可食用部分，污染食物链，最终威胁人类健康和生命安全。

现有研究发现，在施用不同粪肥土壤中，不同程度地积累了与人体健康密切相关的β-内酰胺类抗生素与高风险β-内酰胺类耐药基因(含多种多重抗性基因)，从蔬菜中能够分离得到来自于动物粪便的耐药病原菌耐药基因。环境中抗生素耐药基因一旦沿食物链传播，将会对人类健康带来严重威胁。

现有技术一般采用化学方法或者化学和物理结合的方法削减阻控畜禽粪污源抗生素与耐药基因。例如，公开号为CN104671618A的中国专利申请公开了一种去除污水中抗生素抗性基因的混凝方法。该方法通过向格栅出水和二级出水中投加聚合氯化铝和聚合硫酸铁对污水中抗生素抗性基因进行去除。公开号为CN104694653A的中国专利申请公开了基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法。该方法通过采用紫外和氯化消毒联合技术去除污水中抗生素抗性基因。

但是，现有技术采用化学材料削减畜禽粪污源抗生素与阻控畜禽源耐药基因容易造成二次污染，存在潜在的环境风险。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供蚯蚓前肠和/或中肠内容物在修复β-内酰胺类抗生素和/或耐药基因污染的土壤中的应用，本发明的利用蚯蚓的肠道前肠和/或中肠段内容物不仅能够去除土壤中积累的β-内酰胺类抗生素，还能够有效削减相应的β-内酰胺类耐药基因，是一种绿色环保型的手段。

本发明提供了蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物在修复β-内酰胺类抗生素和耐药基因污染的土壤中的应用；

所述蚯蚓包括畜禽粪污养殖的蚯蚓；

所述畜禽粪污含有β-内酰胺类抗生素；所述畜禽粪污中β-内酰胺类抗生素的质量浓度≥50mg/kg；

所述蚯蚓在畜禽粪污中的养殖时间≥15d。

优选的，所述耐药基因包括bla_ampC、bla_OXA-1、bla_TEM-1和bla_NDM中的一种或几种。

优选的，所述蚯蚓具有生殖环带。

优选的，所述畜禽粪污中β-内酰胺类抗生素的质量浓度为50～150 mg/kg。

优选的，所述蚯蚓包括赤子爱胜蚓。

优选的，所述土壤包括畜禽有机粪肥施用土壤。

优选的，所述应用包括以下步骤：将所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物和待修复土壤混合，进行修复。

优选的，所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物和待修复土壤的质量比为 1：(1000～6000)。

优选的，所述修复的温度为10～37℃；所述修复的时间≥15d。

优选的，所述修复的温度为18～27℃。

本发明提供了蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物在修复β-内酰胺类抗生素和耐药基因污染的土壤中的应用；所述蚯蚓包括含有β-内酰胺类抗生素的畜禽粪污养殖的蚯蚓；所述蚯蚓在畜禽粪污中的养殖时间≥15d。

蚯蚓是土壤环境中生物量较大的生物，提取的蚯蚓肠道内容物在土壤环境中适应性强，能很快适应环境正常增殖，并能够参与土壤中多种生物化学反应，对土壤生态环境有直接影响。本发明选取含有β-内酰胺类抗生素的畜禽粪污的蚯蚓养殖环境中且粪污处理的时间≥15d的蚯蚓，能够保证蚯蚓在含β-内酰胺类抗生素的畜禽粪污复杂环境中完成驯化，使其肠道环境稳定且形成具有一定β-内酰胺类抗生素降解能力与高风险β-内酰胺类耐药基因及耐药菌削减能力的微生物菌群，这部分微生物菌群主要集中在蚯蚓的肠道前肠和 /或中肠段，因而本发明采用蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物去除土壤中的β- 内酰胺类抗生素与耐药基因，尤其是高风险β-内酰胺类耐药基因。本发明的处理不仅能够增加土壤中的微生物量，提高土壤中抗生素降解菌与耐药菌拮抗菌群的比例，还能够加速高风险耐药基因及耐药菌的降解去除。

本发明中蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物能够促进土壤环境中抗生素降解菌与耐药基因及耐药菌拮抗菌群的生成，促进土壤抗生素与高风险耐药基因的去除，维护土著菌群原本的生态结构，消除耐药菌的选择压力，降低土壤耐药基因的二次传播风险。并且，相比于化学材料的土壤修复，蚯蚓前中肠道内容物中的高效靶向微生物的修复，不会造成二次污染，不存在潜在的环境风险，是一种绿色环保型的抗生素与耐药基因同步降解去除手段。此外，本发明的方法简单易行，具有一次投放持续受益的作用，且对耐药性病原微生物也有一定拮抗去除作用，其整体生态效益高，还可以提高作物品质，实现农业可持续发展。

附图说明

图1为赤子爱胜蚓肠道内容物对牛粪肥施用土壤中头孢氨苄的消减图；

图2为赤子爱胜蚓肠道内容物对牛粪肥施用土壤中bla基因的去除情况；

图3为赤子爱胜蚓肠道内容物对猪粪肥施用土壤中头孢氨苄的消减图；

图4为赤子爱胜蚓肠道内容物对猪粪肥施用土壤中bla基因的去除情况；

图5为赤子爱胜蚓肠道内容物对鸡粪肥施用土壤中头孢氨苄的消减图；

图6为赤子爱胜蚓肠道内容物对鸡粪肥施用土壤中bla基因的去除情况。

具体实施方式

本发明提供了蚯蚓前肠和/或中肠内容物在修复β-内酰胺类抗生素和/或耐药基因污染的土壤中的应用；

所述蚯蚓包括畜禽粪污养殖的蚯蚓；

所述畜禽粪污含有β-内酰胺类抗生素；所述畜禽粪污中β-内酰胺类抗生素的质量浓度≥50mg/kg；

所述蚯蚓在畜禽粪污中的养殖时间≥15d。

在本发明中，所述修复β-内酰胺类抗生素和/或耐药基因污染的土壤优选的包括以下方面中的一种或几种：

1)去除土壤中β-内酰胺类抗生素；

2)降低土壤中β-内酰胺类耐药基因丰度；

3)降低土壤中耐药菌丰度。

本发明选取含有β-内酰胺类抗生素的畜禽粪污的蚯蚓养殖环境中且粪污处理的时间≥15d的蚯蚓，能够保证蚯蚓在含β-内酰胺类抗生素的畜禽粪污复杂环境中完成驯化，使其肠道环境稳定且形成具有一定β-内酰胺类抗生素降解菌与高风险β-内酰胺类耐药基因及耐药菌削减能力的微生物菌群。这部分微生物菌群主要集中在蚯蚓的肠道前肠和/或中肠段，因而本发明采用蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物同步去除土壤中的β-内酰胺类抗生素与耐药基因，尤其是高风险β-内酰胺类耐药基因。

在本发明中，在β-内酰胺类抗生素的刺激下，蚯蚓肠道会进化出不同药物的降解菌(耐药菌的间接拮抗菌群)，其能降解粪肥土壤中残留的β-内酰胺类抗生素，使细菌失去β-内酰胺类抗生素药物的选择压力，那么在无β-内酰胺类抗生素药物选择压力土壤环境中，适应度代价较高的抗生素耐药菌的生存竞争力要低于适应度代价低的敏感菌，进而敏感菌逐渐取代耐药菌，从而达到去除土壤中抗生素与耐药基因的目的。此外，拮抗菌群的出现也降低了质粒与整合子的水平，又进一步减弱了本底土壤耐药基因转移的潜在传播风险。

在本发明中，所述蚯蚓在畜禽粪污中的养殖时间优选的≥15d。

在本发明中，所述蚯蚓优选的具有生殖环带，带有生殖环带的蚯蚓为成熟蚯蚓。

在本发明中，所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物优选的采用以下方法提取得到：

清洗蚯蚓体表粪污，对清洗后的蚯蚓进行麻醉或处死后，去除蚯蚓后肠肠段，挤出蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物。

在本发明中，所述清洗采用的试剂优选为生理盐水，质量浓度优选为0.9％。

在本发明中，对清洗后的蚯蚓进行麻醉的方式优选的包括将清洗后的蚯蚓放置于无水乙醇中进行麻醉，至蚯蚓不再扭动时取出。

在所述麻醉后，本发明优选的还包括将蚯蚓放置于无菌水平进行快速清洗，再用无菌吸收纸将其体表水分吸取干净。

在本发明中，所述去除蚯蚓后肠段优选的包括用无菌解剖剪刀在蚯蚓中肠与后肠分界处剪开，去除掉后肠；所述蚯蚓中肠与后肠分界处为蚯蚓的第 45体节处，所述后肠包括直肠和肛门。

在本发明中，所述挤出蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物优选的包括利用圆嘴镊子来回挤压腹部提取蚯蚓前中肠段肠道内容物。在本发明具体实施过程中，利用无菌尖嘴镊子按住蚯蚓头部一侧，腹部朝上，选择圆润宽嘴无菌镊子且使用不会破坏蚯蚓体表的力度均匀反复挤压蚯蚓腹部，将前肠与中肠内容物从前肠向中肠推动，并从中肠段挤出，收集目的肠段内容于无菌EP 管中，置于冰上保鲜待用。本发明的方法不仅提取效率高，而且体液污染少。

在本发明中，所述从蚯蚓麻醉或处死至目的肠段内容物取出，用时≤2.5 min。

在本发明中，所述耐药基因优选的包括bla_ampC、bla_OXA-1、bla_TEM-1和 bla_NDM中的一种或几种。

在本发明中，所述养殖环境优选为养殖床。

在本发明中，所述畜禽粪污中β-内酰胺类抗生素的质量浓度优选为 50～150mg/kg，更优选为100mg/kg，这一质量浓度范围既能达到驯化蚯蚓的目的，又能避免对蚯蚓产生毒性，保证拮抗菌群的多样性。

在本发明中，所述蚯蚓优选的包括赤子爱胜蚓，赤子爱胜蚓处理畜禽粪污效率较高。在本发明中，每条所述赤子爱胜蚓的体重优选为0.3～0.5g。

在本发明中，所述土壤优选包括畜禽有机粪肥施用土壤，更优选为有机菜田土壤。

在本发明中，所述应用优选的包括以下步骤：将所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物和待修复土壤混合，进行修复；或者，将所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物施用于耕层土壤，对耕层土壤进行翻耕后修复。

在本发明中，当将所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物和待修复土壤混合，进行修复时，所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物和待修复土壤的质量比为1：(1000～6000)，更优选为1：(2000～3000)，最优选为1：1000、 1：2000或者1：3000。

在本发明中，当将所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物施用于耕层土壤，对耕层土壤进行翻耕后修复时，所述耕层土壤的深度优选为0～20cm，这是由于抗生素耐药基因主要是集中在有机肥施用大田的耕层土壤；所述翻耕的目的是将蚯蚓肠内容物和耕层土壤进行混匀，达到修复目的。在本发明中，所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物在施用前优选的还包括对所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物进行稀释，所述稀释采用的试剂优选为无菌水、 0.9％无菌生理盐水或者无菌磷酸盐缓冲液；所述稀释的比例优选为(1:50) ～(1:100)；所述施用的方式优选为喷施。

在本发明中，所述修复的温度优选为10～37℃，更优选为18～27℃，最优选为20～24℃；所述修复的时间优选的≥15d，更优选为15～60d。

在本发明中，所述待修复土壤的含水率优选为18％～22％，更优选为 20％。

在本发明中，所述待修复土壤优选的100目筛的筛下组分。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1赤子爱胜蚓前中肠道内容物同步高效降低牛粪有机肥施用土壤中β-内酰胺类抗生素与耐药基因基因的方法

选取带有明显生殖环带、活力较强的赤子爱胜蚓，每条体重在0.5±0.1g 左右，清洗体表后，备用。称取相应重量的阿莫西林药物标准品，溶解于无菌水中，添加至无β-内酰胺类药物的自然发酵好牛粪中，得到终浓度100 mg/kg的阿莫西林污染处理后混合均匀的牛粪。将预先准备好的300条赤子爱胜蚓，添加至60kg的100mg/kg的阿莫西林污染制备好的牛粪中，室温下暗光下培养20天进行驯化。驯化完成后取出蚯蚓，清洗体表后，放置于无水乙醇中进行麻醉，待蚯蚓不再扭动时立即取出，放置于无菌水平进行快速清洗，再用无菌吸收纸将其体表水分吸取干净，置于一次性无菌平皿中，然后用无菌解剖剪刀在蚯蚓中肠与后肠分界即第45体节处快速剪开，去除掉后肠(直肠与肛门)；再利用无菌尖嘴镊子按住蚯蚓头部一侧，腹部朝上，选择圆润宽嘴无菌镊子且使用不会破坏蚯蚓体表的力度均匀反复挤压蚯蚓腹部，将前肠与中肠内容物从前肠向中肠推动，并从中肠段挤出，收集目的肠段内容于无菌EP管中，快速置于冰上保鲜待用。将预先准备好的PBS磷酸盐缓冲液1ml加入至装有蚯蚓前中肠内容物的EP管中，然后在实验室常用的涡旋仪上涡旋10s-15s，每次蚯蚓从麻醉到肠道内容物获取完毕，时间控制在3min内。

β-内酰胺类抗生素与耐药基因污染土壤，采集自天津武清某牛粪有机肥施用的蔬菜种植基地，土壤理化性质：pH值7.1，有机质含量47.3g/kg，全氮3.1g/kg，铵态氮48.5mg/kg，硝态氮0.8g/kg，全磷1.2g/kg，有效磷39.3 mg/kg。污染土壤中β-内酰胺类抗生素头孢氨苄(Cephalexin monohydrate， CPL)的浓度为4.93±0.33μg/kg；β-内酰胺类耐药基因bla_OXA-1、bla_TEM-1和 bla_ampC的浓度范围分别为(1.9±0.8)×10⁵拷贝数/g(干土重)、(6.3±1.0) ×10⁴拷贝数/g(干土重)和(8.2±1.8)×10⁶拷贝数/g(干土重)。选取有机叶菜类田块，依据中华人民共和国农业行业标准(TY/T 1121)采用五点交叉取样法(方形田块)，使用专业不锈钢土壤采样器进行菜地耕层土壤样品 (表层土0-20cm)的采集。土壤采集后挑拣出菜根、菜叶和草根树叶等杂质，再进行粉碎过100目的微孔筛，得到颗粒均匀的土壤100kg。

然后按照蚯蚓前中肠内容物与土壤分别为1:1000、1:3000和1:6000的质量比，进行蚯蚓前中肠肠道内容物的添加，混合均匀后，维持土壤的含水率在25±1％，于常温环境下(25℃±2℃)，修复1个月后，不同蚯蚓肠道内容物/土壤投加比例下(1:1000、1:3000和1:6000)，土壤中β-内酰胺类头孢氨苄的残留浓度分别降低至0.47±0.20μg/kg、1.25±0.15μg/kg和 1.96±0.16μg/kg；相比于未添加肠道内容物的处理组(平均自然降解率为38.7％)，而添加肠道内容物的处理组中头孢氨苄的平均去除率提高至 60.2％-90.5％。土壤中β-内酰胺类耐药基因bla_OXA-1浓度分别是(7.1±2.9)×10³拷贝数/g(干土重)、(1.0±0.5)×10³拷贝数/g(干土重)和(8.7±2.6)×10⁴拷贝数/g(干土重)；bla_TEM-1浓度分别是(4.0±1.3)×10³拷贝数/g(干土重)、(3.2±0.8)×10³拷贝数/g(干土重)和(3.3±1.4)×10⁴拷贝数/g(干土重)； bla_ampC浓度分别是(5.1±1.2)×10⁵拷贝数/g(干土重)、(5.8±1.3)×10³拷贝数/g(干土重)和(2.8±1.5)×10⁶拷贝数/g(干土重)；以上说明当投加比为1:6000时，土壤中bla基因削减效率最低，而投加比为1:3000时，其对bla 基因的去除效率与投加比为1:1000的处理组无显著差异，在综合考虑成本因素与去除效率基础上，建议采用肠道内容物/土壤投加比例为1:3000的处理，平均去除率在94.2％±1.1％范围内。与未添加蚯蚓前肠、中肠道内容物的对照组相比，同步平行培养30天后，土壤中bla基因残留水平是(4.5±1.6)×10⁴拷贝数/g(干土重)-(3.8±1.8)×10⁶拷贝数/g(干土重)，平均去除率仅为 42.8±11.2％；此外还发现，在添加了蚯蚓肠道内容物的处理下，30天后，土壤环境微生物生态多样性Shannon-Weaver指数指数由原来的2.6±0.2显著提高至3.9±0.4(p<0.05)。说明蚯蚓前、中肠道内容物修复土壤后，土壤土著菌群生态多样性和稳定性得到了显著的改善，进一步证明该技术是一种绿色环境友好且可有效控制bla耐药基因污染的修复方法。

实施例2赤子爱胜蚓前中肠道内容物同步高效降低猪粪肥土壤中β-内酰胺类抗生素与耐药基因的方法

选取带有明显生殖环带、活力较强的赤子爱胜蚓，每条体重在0.5±0.1g 左右，清洗体表后，备用。称取相应重量的阿莫西林药物标准品，溶解于无菌水中，添加至无β-内酰胺类药物的发酵好猪粪中，得到终浓度100mg/kg 的阿莫西林污染处理后混合均匀的猪粪。将预先准备好的300条赤子爱胜蚓，添加至60kg的100mg/kg的阿莫西林污染制备好的猪粪中，室温下暗光下培养20天进行驯化。驯化完成后取出蚯蚓，清洗体表后，放置于无水乙醇中进行麻醉，待蚯蚓不再扭动时立即取出，放置于无菌水平进行快速清洗，再用无菌吸收纸将其体表水分吸取干净，置于一次性无菌平皿中，然后用无菌解剖剪刀在蚯蚓中肠与后肠分界即第45体节处快速剪开，去除掉后肠(直肠与肛门)；再利用无菌尖嘴镊子按住蚯蚓头部一侧，腹部朝上，选择圆润宽嘴无菌镊子且使用不会破坏蚯蚓体表的力度均匀反复挤压蚯蚓腹部，将前肠与中肠内容物从前肠向中肠推动，并从中肠段挤出，收集目的肠段内容于无菌EP管中，快速置于冰上保鲜待用。将预先准备好的PBS磷酸盐缓冲液1ml加入至装有蚯蚓前中肠内容物的EP管中，然后在实验室常用的涡旋仪上涡旋10～15s，每次蚯蚓从麻醉到肠道内容物获取完毕，时间控制在3min 内。

β-内酰胺类抗生素与耐药基因污染土壤，采集自天津宁河区某猪粪有机肥施用的蔬菜大棚，土壤理化性质：pH值6.8，有机质含量14.5g/kg，全氮 0.4g/kg，硝态氮3.93mg/kg，铵态氮3.04mg/kg，全磷0.8g/kg，有效磷32.3 g/kg。污染土壤中β-内酰胺类抗生素头孢氨苄(CPL)的浓度为5.86±0.46 μg/kg；β-内酰胺类耐药基因bla_OXA-1、bla_TEM-1和bla_ampC的浓度范围分别为 (2.3±0.3)×10⁵拷贝数/g(干土重)、(7.9±1.2)×10⁵贝数/g(干土重)和(1.1±0.7)×10⁷拷贝数/g(干土重)。选取有机叶菜类田块，依据中华人民共和国农业行业标准(TY/T 1121)采用五点交叉取样法(方形田块)，使用专业不锈钢土壤采样器进行菜地耕层土壤样品(表层土0-20cm)的采集。土壤采集后挑拣出菜根、菜叶和草根树叶等杂质，再进行粉碎过100目的微孔筛，得到颗粒均匀的土壤120kg。

然后按照蚯蚓前中肠内容物与土壤分别为1:1000、1:3000和1:6000的质量比，进行蚯蚓前中肠肠道内容物的添加，混合均匀后，维持土壤的含水率在25±1％，于常温环境下(25℃±2℃)，修复1个月后，不同蚯蚓肠道内容物/土壤投加比例下(1:1000、1:3000和1:6000)，土壤中β-内酰胺类头孢氨苄的残留浓度分别降低至0.82±0.35μg/kg、1.26±0.16μg/kg和1.91±0.71 μg/kg；相比于未添加肠道内容物的处理组(平均自然降解率为31.1％)，而添加肠道内容物的处理组中头孢氨苄的平均去除率提高至67.4％-86.0％。土壤中β-内酰胺类耐药基因bla_OXA-1浓度分别是(3.8±0.4)×10³拷贝数/g(干土重)、(1.0±0.7)×10⁴拷贝数/g(干土重)和(4.1±1.6)×10⁴拷贝数/g(干土重)；bla_TEM-1浓度分别是(5.2±1.2)×10⁴拷贝数/g(干土重)、(4.2±0.9) ×10⁴拷贝数/g(干土重)和(2.4±1.5)×10⁵拷贝数/g(干土重)；bla_ampC浓度分别是5.8±1.6)×10⁵拷贝数/g(干土重)、(4.3±1.2)×10⁵拷贝数/g(干土重)和(6.4±1.3)×10⁶拷贝数/g(干土重)；上述结果说明，当投加比为1:6000时，土壤中bla基因削减效率最低，而投加比为1:3000时，其对bla 基因的去除效率与投加比为1:1000的处理组无显著差异，在综合考虑成本因素与去除效率基础上，建议采用肠道内容物/土壤投加比例为1:3000的处理，平均去除率为95.4±0.7％范围内。与未添加蚯蚓前肠、中肠道内容物的对照组相比，同步平行培养30天后，土壤中bla基因残留水平是(9.4±2.7)×10⁴拷贝数/g(干土重)-(8.5±3.2)×10⁶拷贝数/g(干土重)，平均去除率仅为 37.0±19.4％；此外还发现，在添加了蚯蚓肠道内容物的处理下，30天后，土壤环境微生物生态多样性Shannon-Weaver指数由原来的2.1±0.5显著提高至 3.5±0.3(p<0.05)。说明蚯蚓前、中肠道内容物修复土壤后，土壤土著菌群生态多样性和稳定性得到了显著的改善，进一步证明该技术是一种绿色环境友好且可有效控制bla耐药基因污染的修复方法。

实施例3赤子爱胜蚓前中肠道内容物同步高效降低鸡粪肥土壤中β-内酰胺类抗生素与耐药基因的方法

选取带有明显生殖环带、活力较强的赤子爱胜蚓，每条体重在0.5±0.1g 左右，清洗体表后，备用。称取相应重量的阿莫西林药物标准品，溶解于无菌水中，添加至无β-内酰胺类药物的以发酵好的鸡粪与牛粪混合物料中(10％的鸡粪)，得到终浓度100mg/kg的阿莫西林污染处理后混合均匀的鸡粪牛粪混合物。将预先准备好的300条赤子爱胜蚓，添加至60kg的100mg/kg 的阿莫西林污染制备好的含鸡粪物料中，室温下暗光下培养20天进行驯化。驯化完成后取出蚯蚓，清洗体表后，放置于无水乙醇中进行麻醉，待蚯蚓不再扭动时立即取出，放置于无菌水平进行快速清洗，再用无菌吸收纸将其体表水分吸取干净，置于一次性无菌平皿中，然后用无菌解剖剪刀在蚯蚓中肠与后肠分界即第45体节处快速剪开，去除掉后肠(直肠与肛门)；再利用无菌尖嘴镊子按住蚯蚓头部一侧，腹部朝上，选择圆润宽嘴无菌镊子且使用不会破坏蚯蚓体表的力度均匀反复挤压蚯蚓腹部，将前肠与中肠内容物从前肠向中肠推动，并从中肠段挤出，收集目的肠段内容于无菌EP管中，快速置于冰上保鲜待用。将预先准备好的PBS磷酸盐缓冲液1ml加入至装有蚯蚓前中肠内容物的EP管中，然后在实验室常用的涡旋仪上涡旋10s-15s，每天蚯蚓从麻醉到肠道内容物获取完毕，时间控制在3min内。

β-内酰胺类抗生素与耐药基因污染土壤，采集自天津津南区某鸡粪有机肥施用的蔬菜地，土壤理化性质：pH值7.6，有机质含量22.7g/kg，全氮3.9 g/kg，硝态氮6.8mg/kg，铵态氮21.6mg/kg，全磷1.1g/kg，有效磷66.9mg/kg。污染土壤中β-内酰胺类抗生素头孢氨苄(CPL)的浓度为9.62±1.02μg/kg；β-内酰胺类耐药基因bla_OXA-1、bla_TEM-1和bla_ampC的浓度范围分别为(8.3±0.8) ×10⁷拷贝数/g(干土重)、(2.3±1.0)×10⁷拷贝数/g(干土重)和(4.8±1.6) ×10⁸拷贝数/g(干土重)。选取有机叶菜类田块，依据中华人民共和国农业行业标准(TY/T 1121)采用五点交叉取样法(方形田块)，使用专业不锈钢土壤采样器进行菜地耕层土壤样品(表层土0-20cm)的采集。土壤采集后挑拣出菜根、菜叶和草根树叶等杂质，再进行粉碎过100目的微孔筛，得到颗粒均匀的土壤120kg。

然后按照蚯蚓前中肠内容物与土壤分别为1:1000、1:3000和1:6000的质量比，进行蚯蚓前中肠肠道内容物的添加，混合均匀后，维持土壤的含水率在25±1％，于常温环境下(25℃±2℃)，修复1个月后，不同蚯蚓肠道内容物/土壤投加比例下(1:1000、1:3000和1:6000)，土壤中β-内酰胺类头孢氨苄的残留浓度分别降低至1.06±0.59μg/kg、1.84±0.34μg/kg和2.65±0.95 μg/kg；相比于未添加肠道内容物的处理组(平均自然降解率为28.3％)，而添加肠道内容物的处理组中头孢氨苄的平均去除率提高至62.5％-89.0％。土壤中β-内酰胺类耐药基因bla_OXA-1浓度分别是(6.3±0.9)×10⁵拷贝数/g(干土重)、(8.9±1.1)×10⁵拷贝数/g(干土重)和(2.3±1.3)×10⁷拷贝数/g(干土重)；bla_TEM-1浓度分别是(5.4±0.9)×10⁵拷贝数/g(干土重)、(7.4±1.1) ×10⁵拷贝数/g(干土重)和(6.3±2.6)×10⁶拷贝数/g(干土重)；bla_ampC浓度分别是(7.2±1.6)×10⁶拷贝数/g(干土重)、(4.2±0.9)×10⁶拷贝数/g(干土重)和(2.1±1.2)×10⁸拷贝数/g(干土重)；说明当投加比为1:6000时，土壤中bla基因削减效率最低，而投加比为1:3000时，其对bla基因的去除效率与投加比为1:1000的处理组无显著差异，在综合考虑成本因素与去除效率基础上，建议采用肠道内容物/土壤投加比例为1:3000的处理，平均去除率在98.1±1.5％范围内。与未添加蚯蚓前肠、中肠道内容物的对照组相比，同步平行培养30天后，土壤中bla基因残留水平是(8.3±0.8)×10⁶拷贝数/g (干土重)-(2.7±1.2)×10⁸拷贝数/g(干土重)，平均去除率仅为43.2±16.3％；此外还发现，在添加了蚯蚓肠道内容物的处理下，30天后，土壤环境微生物生态多样性Shannon-Weaver指数由原来的3.0±0.2显著提高至3.8±0.5(p <0.05)。说明蚯蚓前、中肠道内容物修复土壤后，土壤土著菌群生态多样性和稳定性得到了显著的改善，进一步证明该技术是一种绿色环境友好且可有效控制bla耐药基因污染的修复方法。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.蚯蚓前肠和/或中肠内容物在修复β-内酰胺类抗生素和/或耐药基因污染的土壤中的应用；

所述蚯蚓包括畜禽粪污养殖的蚯蚓；

所述畜禽粪污含有β-内酰胺类抗生素，所述畜禽粪污中β-内酰胺类抗生素的质量浓度≥50mg/kg；

所述蚯蚓在畜禽粪污中的养殖时间≥15d。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述耐药基因包括bla_ampC、bla_OXA-1、bla_TEM-1和bla_NDM中的一种或几种。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述蚯蚓具有生殖环带。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述畜禽粪污中β-内酰胺类抗生素的质量浓度为50～150mg/kg。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蚯蚓包括赤子爱胜蚓。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述土壤包括畜禽有机粪肥施用土壤。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：将所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物和待修复土壤混合，进行修复。

8.根据权利要求1或7所述的应用，其特征在于，所述蚯蚓的肠道前肠和中肠段内容物和待修复土壤的质量比为1：(1000～6000)。

9.根据权利要求1或7所述的应用，其特征在于，所述修复的温度为10～37℃；所述修复的时间≥15d。

10.根据权利要求1或7所述的应用，其特征在于，所述修复的温度为18～27℃。

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