CN113943756A - 一种阻控土壤抗生素抗性基因污染的方法 - Google Patents

一种阻控土壤抗生素抗性基因污染的方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开一种阻控土壤抗生素抗性基因污染的方法，将农用酵素作为阻抗剂直接施加在待处理污染土壤中或在施加肥料后施加于待处理土壤中或与肥料混匀后施加在待处理土壤中；所述农用酵素为由食品废物发酵而得的液体发酵物；所述待处理污染土壤为以放线菌为宿主菌的抗生素抗性基因污染的土壤。本申请依靠农用酵素对于放线菌等微生物生存的抑制，即通过对宿主微生物的选择，从而减少土壤中抗生素抗性基因的增殖和扩散，是一种高效广谱、绿色环保且价格低廉的农业环境修复技术。

Description

一种阻控土壤抗生素抗性基因污染的方法
技术领域
本发明属于环境抗性基因污染治理领域，具体涉及一种通过改变土壤微生物缓解有机肥施用引起的土壤抗性基因污染的方法
背景技术
抗生素抗性基因丰度增加能够降低抗生素药物疗效，是细菌产生抗生素耐药性的根源，是一个日趋严重的全球性公共卫生问题。农田土壤作为抗生素抗性基因的重要源与汇，有关其研究已引起了广泛的关注。由于有机肥中存在富含抗生素抗性基因的宿主微生物，且持久存在抗生素、重金属等选择压力，其使用对于农田土壤中抗生素抗性基因丰度的增加具有重要贡献。有数据显示，与1970-1979年相比，2008年的土壤中抗生素抗性基因水平提高了2至15倍。值得注意的是，土壤中抗生素抗性基因还可以通过食物链传递等途径进入人体，对全球微生物耐药带来巨大影响。因此，亟需对农田土壤中抗生素抗性基因污染进行阻控。
目前对农田土壤中抗生素抗性基因污染的阻控，主要包括源头阻控和原位修复两种。源头阻控主要通过降低动物粪便等天然有机肥中的抗生素抗性基因对土壤抗生素抗性基因的输入。中国发明申请号：CN201710414410.4，201810314161.6，201910208598.6分别是生物炭加入来降低鸡粪堆肥中的四环素类抗生素抗性基因丰度的方法，外加蚯蚓进行堆肥发酵降低畜禽粪便中抗生素抗性基因的方法和使用黑曲霉孢子的发酵产物快速去除畜禽粪便中抗性基因的方法。原位修复法主要通过一些外源材料的添加阻控抗生素抗性基因在土壤中的传播和扩散，申请号为CN201910272896.1提供一种生物质炭阻控蚓粪中复合抗性污染物的扩散传播方法，将生物质炭与蚓粪混匀静置后，去除农田土壤的抗生素、抗性致病菌和抗性基因；申请号CN202110270919.2提供了一种生物质炭超富集植物联合修复抗生素重金属污染土壤并阻控抗生素抗性基因传播的方法，依靠超富集植物对土壤重金属和抗生素吸收、富集及降解和生物质炭对抗生素抗性基因吸附、消减的协同阻控作用阻控抗生素抗性基因向植物体内迁移富集。
这几种方法都指出了去除土壤环境中重金属、抗生素、抗性基因等复合污染物的方法，但是普遍缺少对于复合污染土壤中微生物群落的调控，已有研究表明，细菌群落组成是土壤中抗生素抗性基因含量的主要决定因素，但现有专利并未涉及使用抗生素抗性基因阻控剂选择抗生素抗性基因的宿主微生物来阻控抗生素抗性基因的扩散传播。因此，开发一种调控土壤微生物阻控抗生素抗性基因丰度的方法，具有十分重要的现实意义。
发明内容
本申请提供一种农用酵素作为阻抗剂在缓解或防治土壤抗生素抗性基因污染中的应用和一种阻控土壤抗生素抗性基因污染的方法，依靠农用酵素对于放线菌等微生物生存的抑制，即通过对宿主微生物的选择，从而减少土壤中抗生素抗性基因的增殖和扩散，是一种高效广谱、绿色环保且价格低廉的农业环境修复技术。
本申请提供一种农用酵素作为阻抗剂在缓解或防治土壤抗生素抗性基因污染中的应用，所述农用酵素为由食品废物发酵而得的液体发酵物。
可选的，所述抗生素抗性基因包括β-内酰胺类、莫匹罗星类、氟喹诺酮类、大环内酯类、多重耐药类、四环素类、糖肽类和肽类抗性基因中的至少一种。
本申请还提供一种农用酵素作为阻抗剂在抑制土壤放线菌中的应用，所述农用酵素为由食品废物发酵而得的液体发酵物。
可选的，所述液体发酵物的制备方法如下：
将食品废物、红糖、水和发酵粉按配比混合，密封后发酵，所得发酵产物进行过滤；所得滤液即为所述液体发酵物；
所述配比为：1～2份红糖，10～20份水，3～6份食品废物，1-2份发酵粉；
所述发酵包括：前期好氧发酵和后期厌氧发酵，前期好氧发酵期间每隔3-5天开盖放气并搅拌一次；发酵总时长为45-80天，其中前期好氧发酵的发酵时间为10-15天，后期厌氧发酵的发酵时间为35-65天；整个发酵过程中发酵温度为20℃～40℃。
所述发酵粉含有乳酸菌菌群；所得液体发酵物的pH为3.5～5；液体发酵物物的优势菌群为乳酸杆菌，占测序总量的90％以上。
可选的，所述食品废物为蔬果类废物。例如包括丢弃菜叶、果皮、豌豆壳等。
可选的，过滤时所用滤网孔径不大于10目，使残渣与液体发酵物分离。
本申请还提供一种阻控土壤中以放线菌为宿主菌的抗生素抗性基因污染的方法，包括：
将农用酵素作为阻抗剂直接施加在待处理污染土壤中或在施加肥料后施加于待处理土壤中或与肥料混匀后施加在待处理土壤中；所述农用酵素为由食品废物发酵而得的液体发酵物；所述待处理污染土壤为以放线菌为宿主菌的抗生素抗性基因污染的土壤。
可选的，所述抗生素抗性基因包括β-内酰胺类、莫匹罗星类、氟喹诺酮类、大环内酯类、多重耐药类、四环素类、糖肽类和肽类抗性基因中的至少一种。
可选的，所述阻抗剂的浓度为稀释10～20倍的液体发酵物原液；所述液体发酵物原液的制备方法如下：
将食品废物、红糖、水和发酵粉按配比混合，密封后发酵，所得发酵产物过滤后所得滤液即为所述液体发酵物原液；
所述配比为：1～2份红糖，10～20份水，3～6份食品废物，1-2份发酵粉；
所述发酵包括：前期好氧发酵和后期厌氧发酵，前期好氧发酵期间每隔3-5天开盖放气并搅拌一次；发酵总时长为45-80天，其中前期好氧发酵的发酵时间为10-15天，后期厌氧发酵的发酵时间为35-65天；整个发酵过程中发酵温度为20℃～40℃；所得液体发酵原液的pH为3.5～5。
可选的，所述液体发酵物的施加量为每平方米土壤10～20ml或每株植物根部10～20ml，每间隔3～6个月施用一次。
可选的，所述肥料为猪粪有机肥。
可选的，所述待处理土壤中种植农作物，例如番茄等。
可选的，所述阻抗剂在种植开始后的10～15天第一次施加。
本申请发现农用酵素可以有效抑制猪粪有机肥施用引起的土壤中放线菌门的增加，通过对宿主微生物的选择，从而减少土壤中抗生素抗性基因的增殖和扩散。本申请发现依靠显著性降低以放线菌为首的抗生素抗性细菌来阻控农业土壤中抗生素抗性基因的富集，是一种高效、广谱、绿色环保且价格低廉的土壤环境修复技术，具有广阔的应用前景。
比于现有技术，本申请至少具有如下有益效果之一：
(1)食品废物来源广泛，且价格低廉，是一种良好的原料；
(2)上述抗生素抗性基因阻控剂可通过厌氧发酵将生物质废弃物转化为富含有效活菌、矿质养分、有机酸和植物激素等生物活性物质的液体堆肥物，实现了生物质废弃物的绿色处理，并显著改善土壤的质量；
(3)农用酵素能显著减低土壤中抗生素抗性基因的宿主微生物，从而减少土壤中抗生素抗性基因的增值和扩散；
(4)农用酵素制备简单，易于储存和运输，易于操作，生物质炭是绿色、环境友好型的一类材料。
本申请的方法对于我国农田土壤作物产量的提高与阻控抗性细菌和抗性基因污染的扩散传播风险具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗性基因在土壤中的丰度变化图。
图2为实施例3中糖肽类和大环内酯类抗性基因在土壤中的丰度变化图。
图3为实施例4中在多重耐药类、肽类和四环素类抗性基因在土壤中丰度变化图。
图4为实施例5中土壤中放线菌门的丰度变化图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
本申请发现农用酵素可以有效抑制猪粪有机肥施用引起的土壤中放线菌的增加，通过对宿主微生物的选择，从而减少土壤中抗生素抗性基因的增殖和扩散。农用酵素的制备方法包括：
(1)收集3～6重量份食品废物、搅碎，得到食品混合物；食品废物优选蔬果类废物，例如包括丢弃菜叶、果皮、豌豆壳等。
(2)在发酵桶中加入水10-20重量份、红糖1-2重量份充分搅拌，使红糖完全溶解，得到红糖溶液；
(3)将步骤(1)中食品废物倒入发酵桶中，添加1-2重量份发酵粉搅拌至充分混合，得到浆液，然后密封，制作标签贴至桶上，并将其置于通风、阴凉处，避免阳光照射，进行发酵；
(4)在发酵第10天-15天内，每隔3-5天开盖放气并搅拌一次，确保食品废物完全侵泡在液体中，避免其发霉腐败；在发酵第10-15天后，不再开盖；整个发酵过程中温度在20℃～40℃。
(5)在发酵约45-80天后，打开发酵桶，液体呈深黄色至黄褐色，有酸酸的酯香与酒香味；
(6)用滤网过滤酵素残渣，所得滤液即农用酵素，pH在3.5～5之间；所用滤网孔径不大于10目，使残渣与农用酵素分离。
将上述农用酵素用水稀释10～20倍后直接施加在抗生素抗性基因污染土壤中或与肥料混匀后施加在抗生素抗性基因污染土壤中或在施加肥料后1-2天施加在抗生素抗性基因污染土壤中。
阻抗剂的添加量为每平方米土壤10～20ml或每株植物根部10～20ml，每间隔3～6个月施用一次。
以下以具体的实施例进行说明：
实施例1农用酵素的制备
原料配比见表1：
表1原料配方(重量份)
编号 食品废物 水 红糖 发酵粉
1# 5 15 1.5 1.5
2# 6 20 2 2
3# 3 10 1 1
按照表1配方，操作步骤如下：
(1)收集配方量的食品废物(包括丢弃菜叶、果皮、豌豆壳等)、搅碎，得到食品混合物；
(2)在发酵桶中加入配方量的水和红糖充分搅拌，使红糖完全溶解，得到红糖溶液；
(3)将步骤(1)中食品废物倒入发酵桶中，添加配方量的发酵粉搅拌至充分混合，得到浆液，然后密封，制作标签贴至桶上，并将其置于通风、阴凉处，避免阳光照射，进行发酵；
(4)在发酵第15天内，每隔4天开盖放气并搅拌一次，确保食品废物完全侵泡在液体中，避免其发霉腐败；在发酵第15天后，不再开盖；整个发酵过程中，发酵罐内的温度在20℃～40℃。
(5)在发酵约60天后，打开发酵桶，液体呈深黄色至黄褐色，有酸酸的酯香与酒香味；
(6)用10目滤网过滤酵素残渣，所得滤液作为农用酵素。
实施例2农用酵素阻控土壤中β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗性基因的实验实验地点：浙江省海宁杨度科研基地实验田。
原本土壤中β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗性基因丰度分别为84.69±19.17和106.78±26.78ppm，随后种植农作物番茄，采用常规的水肥管理，施加肥料为浙江杭州萧山某有机肥料有限公司的猪粪有机肥，实施例1中的1#农用酵素用水稀释10倍得稀释10倍酵素，种植开始后每株番茄根部土壤施加15ml所得稀释10倍酵素。待番茄成熟后，取番茄根部2-10cm处土壤进行检测分析。以单独施加猪粪有机肥作为对照。
本实施例中，种植土壤于4月底开始，分别于5月初和7月中旬各施加一次稀释后的农用酵素，最后于10月初取土。
土壤中β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗性基因丰度如图1所示，对比施加猪粪有机肥非处理组中土壤高达175.52±3.69、228.39±25.65(ppm)的β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗性基因，施加猪粪有机肥和酵素处理组的β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗性基因丰度会降低到121.74±18.62、159.79±19.52(ppm)。
实施例3农用酵素阻控土壤中糖肽类和大环内酯类抗性基因的实验
实验地点：浙江省海宁杨度科研基地实验田。
原本土壤中多糖类和大环内酯类抗性基因丰度分别为334.36±54.16和439.17±74.08ppm，随后种植农作物番茄，采用常规的水肥管理，施加肥料为浙江杭州萧山某有机肥料有限公司的猪粪有机肥，实施例1中的1#农用酵素用水稀释10倍得稀释10倍酵素，种植开始后每株番茄根部土壤施加15ml所得稀释10倍酵素。待番茄成熟后，取番茄根部2-10cm处土壤进行检测分析。以单独施加猪粪有机肥作为对照。
本实施例中，种植土壤于4月底开始，分别于5月初和7月中旬各施加一次稀释后的农用酵素，最后于10月初取土。
土壤中糖肽类和大环内酯类抗性基因丰度如图2所示，对比施加猪粪有机肥非处理组中土壤高达175.52±3.69和228.39±25.65(ppm)的β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗性基因，施加猪粪有机肥和酵素处理组的β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗性基因丰度会降低到121.74±18.62和159.79±19.52(ppm)。
实施例4农用酵素阻控土壤中多重耐药类、肽类和四环素类抗性基因的实验
实验地点：浙江省海宁杨度科研基地实验田。
原本土壤中多重耐药类、肽类和四环素类抗性基因分别为1,708.35±214.61、239.26±42.37和445.52±87.55ppm，随后种植农作物番茄，采用常规的水肥管理，施加肥料为浙江杭州萧山某有机肥料有限公司的猪粪有机肥，实施例1中的1#农用酵素用水稀释10倍得稀释10倍酵素，种植开始后每株番茄根部土壤施加15ml所得稀释10倍酵素。待番茄成熟后，取番茄根部2-10cm处土壤进行检测分析。以单独施加猪粪有机肥作为对照。
本实施例中，种植土壤于4月底开始，分别于5月初和7月中旬各施加一次稀释后的农用酵素，最后于10月初取土。
土壤中多重耐药类、肽类和四环素类抗性基因丰度如图3所示，对比施加猪粪有机肥非处理组中土壤高达2,819.72±81.11、431.01±24.13和813.43±48.63(ppm)的β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗性基因，施加猪粪有机肥和酵素处理组的多重耐药类、肽类和四环素类抗性基因丰度会降低到2,260.02±191.35、330.44±29.22和599.41±59.11(ppm)。
实施例5农用酵素阻控土壤中放线菌门丰度的实验
实验地点：浙江省海宁杨度科研基地实验田。
原本土壤中放线菌门丰度为43,311.62±17,084.91ppm，随后种植农作物番茄，采用常规的水肥管理，施加肥料为浙江杭州萧山某有机肥料有限公司的猪粪有机肥，实施例1中的1#农用酵素用水稀释10倍得稀释10倍酵素，种植开始后每株番茄根部土壤施加15ml所得稀释10倍酵素。带番茄成熟后，取番茄根部2-10cm处土壤进行检测分析。以单独施加猪粪有机肥作为对照。
本实施例中，种植土壤于4月底开始，分别于5月初和7月中旬各施加一次稀释后的农用酵素，最后于10月初取土。
土壤中放线菌门丰度如图4所示，对比施加猪粪有机肥非处理组中土壤高达84,122.42±11,109.54的放线菌门，施加猪粪有机肥和酵素处理组的放线菌门丰度会降低到46,799.37±6,033.22(ppm)，几乎接近本地土水平。
综上可知，酵素可以有效的降低猪粪有机肥施用带来的放线菌的增加，已有研究表明放线菌可以产生大约三分之二的已知抗生素，是动物有机肥携带和传播不同抗生素抗性基因的主要类群，故此，酵素可以通过对宿主微生物的选择，从而减少土壤中抗生素抗性基因的增殖和扩散。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.农用酵素作为阻抗剂在缓解或防治土壤抗生素抗性基因污染中的应用，所述农用酵素为由食品废物发酵而得的液体发酵物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗生素抗性基因为β-内酰胺类、莫匹罗星类、氟喹诺酮类、大环内酯类、多重耐药类、四环素类、糖肽类和肽类抗性基因中的至少一种。
3.农用酵素作为阻抗剂在抑制土壤放线菌中的应用，所述农用酵素为由食品废物发酵而得的液体发酵物。
4.根据权利要求1～3任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述液体发酵物的制备方法如下：
将食品废物、红糖、水和发酵粉按配比混合，密封后发酵，所得发酵产物进行过滤处理，所得滤液即为所述液体发酵物；
所述配比以重量份计为：1～2份红糖，10～20份水，3～6份食品废物，1-2份发酵粉；
所述发酵包括：前期好氧发酵和后期厌氧发酵，前期好氧发酵期间每隔3-5天开盖放气并搅拌一次；发酵总时长为45-80天，其中前期好氧发酵的发酵时间为10-15天，后期厌氧发酵的发酵时间为35-65天；整个发酵过程中发酵温度为20℃～40℃；所得液体发酵物的pH为3.5～5。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述食品废物为蔬果类废物。
6.一种阻控土壤中以放线菌为宿主菌的抗生素抗性基因污染的方法，其特征在于，包括：
将阻抗剂直接施加在待处理污染土壤中或在施加肥料后施加于待处理土壤中或与肥料混匀后施加在待处理土壤中；所述阻抗剂为由食品废物发酵而得的液体发酵物；所述待处理污染土壤为以放线菌为宿主菌的抗生素抗性基因污染的土壤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因包括β-内酰胺类、莫匹罗星类、氟喹诺酮类、大环内酯类、多重耐药类、四环素类、糖肽类和肽类抗性基因中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述阻抗剂的浓度为稀释10～20倍的液体发酵物原液；所述液体发酵物原液的制备方法如下：
将食品废物、红糖、水和发酵粉按配比混合，密封后发酵，所得发酵产物过滤后所得滤液即为所述液体发酵物原液；
所述配比为：1～2份红糖，10～20份水，3～6份食品废物，1-2份发酵粉；
所述发酵包括：前期好氧发酵和后期厌氧发酵，前期好氧发酵期间每隔3-5天开盖放气并搅拌一次；发酵总时长为45-80天，其中前期好氧发酵的发酵时间为10-15天，后期厌氧发酵的发酵时间为35-65天；整个发酵过程中发酵温度为20℃～40℃；所得液体发酵原液的pH为3.5～5。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述液体发酵物的施加量为每平方米土壤10～20ml或每株植物根部10～20ml，每间隔3～6个月施用一次。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述肥料为猪粪有机肥。
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