CN115181572A

CN115181572A - 茶黄素及其组合物在消减土壤中抗生素抗性基因的应用

Info

Publication number: CN115181572A
Application number: CN202210870723.1A
Authority: CN
Inventors: 宋嘉劲; 方华; 张厚朴; 裘梦婷; 郑从来
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-07-22
Filing date: 2022-07-22
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2042-07-22
Also published as: CN115181572B

Abstract

本发明公开了茶黄素及其组合物在消减土壤中抗生素抗性基因的应用，根据土壤的实际情况，直接投加适当比例的茶黄素及其组合物于土壤中，调节土壤含水量，避光培养90天后可显著降低土壤中多类抗生素抗性基因的丰度，操作简单便捷，为控制土壤中的抗生素抗性基因污染提供新的、有效的途径，应用前景广阔。

Description

茶黄素及其组合物在消减土壤中抗生素抗性基因的应用

技术领域

本发明涉及环境工程技术领域，具体涉及茶黄素及其组合物在消减土壤中抗生素抗性基因的应用。

背景技术

ARGs具有“可复制或传播”的生物学特性，因此既可以通过遗传由亲代转移给子代，即垂直转移(Vertical gene transfer，VGT)，也可以通过基因水平转移(Horizontagene transfer，HGT)的方式在微生物种内和种间传播。VGT发生在同种微生物的亲代和子代之间，是自然界的正常现象，传播范围有限。而HGT可以使ARGs在种间传播，被认为是土壤中ARGs传播扩散的主要途径。

土壤是环境中ARGs的重要储存库，而人类活动带入的外源ARGs 是土壤中ARGs的主要来源，例如在畜牧业中常使用抗生素作为饲料添加而被广泛用于促进动物生长和治疗疾病，但抗生素进入动物体内后不能被完全吸收，会随粪便排出体外，造成畜禽粪便中往往含有抗生素及ARGs。为提高作物产量，畜禽粪便作为有机肥被大量施用到农业土壤中，导致抗生素在土壤中持续残留，直接造成土壤中ARGs 的多样性增加和丰度升高。此外，污水处理厂的污泥和出水中含有数百种不同类型的ARGs，这些ARGs随着污泥施用和污水灌溉等措施进入农业土壤。多项研究已对全球多地耕地土壤中ARGs总体格局进行研究，均发现ARGs检出率高，类别多样化，且丰度较高，特别是磺胺类抗性基因(sul1等)、四环素类抗性基因(tetM、tetW等)等 ARGs的污染情况严重，且已证实ARGs污染的热点地区主要是人类活动活跃的农业种植区域。

现有技术对ARGs这类污染的控制策略不多，例如对于施用到土壤中的粪肥或污泥主要进行好氧堆肥或者厌氧消化处理，以期从源头上减少ARGs，但对于已经进入土壤乃至积累多代的ARGs，需要通过添加土壤改良剂来进行消减。目前发现的土壤改良剂种类较少，CN110804453A公开了一种利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因的削减方法及应用，使用木醋原液及特定精馏组分能够降低总ARGs绝对丰度。

茶色素是由茶叶中以儿茶素为主的多酚类化合物氧化衍生而来的一类水溶性色素混合物，包括茶黄素、茶红素和茶褐素三类。其中，茶黄素(Theaflavins，TFs)是红茶的核心功能成分，在茶中被称为“软黄金”，包括茶黄素TF₁、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯。目前，茶黄素的研究主要聚焦在抗氧化作用，其能否直接用于抗生素抗性基因的污染的控制，能否削减土壤中ARGs的污染并保证正面效果，是现有技术中所未涉及的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种茶黄素及其组合物在消减土壤中抗生素抗性基因的应用，以解决背景技术中提到的问题。

本发明提供了茶黄素及其组合物在消减土壤中抗生素抗性基因的应用。

优选地，所述茶黄素为茶黄素TF₁、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯中的任意一种；

所述茶黄素的组合物由茶黄素TF₁、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯中的任意两种及以上组成。

优选地，所述抗生素抗性基因包括二氨基嘧啶类、糖肽类、MLSB 类、磷霉素类、氟喹诺酮类、四环素类、氨基香豆素类。

优选地，茶黄素及其组合物在消减土壤中抗生素抗性基因的方法为：

将茶黄素及其组合物添加到土壤中，搅拌均匀，调节土壤含水量为50-60％，置于25℃、70％湿度的恒温培养箱中培养。

优选地，所述茶黄素及其组合物的添加量为5-50g/kg土壤干重。

优选地，所述培养的条件为避光培养。

优选地，所述培养的时间为90天。

优选地，所述土壤的类型选自壤土、砂土或粘土。

抗性基因丰度指基因组中各类抗生素抗性基因的拷贝数量，丰度越高，即该基因的数量越多。丰度分为绝对丰度和相对丰度，其中相对丰度用于描述单个基因数占总基因数的百分比。

本发明所测数据是通过基因丰度筛选代表性的抗生素抗性基因种类得出的，其中，二氨基嘧啶类抗生素抗性基因包括dfrA和dfrG；糖肽类抗生素抗性基因包括vanRO和vanSO；MLSB类抗生素抗性基因包括ermG、ermY、vatB、lnuG和vgaE；磷霉素类抗生素抗性基因包括fosX；氟喹诺酮类抗生素抗性基因包括mfpA；四环素类抗生素抗性基因包括tet(L)、tetA(48)、tetB(48)、tet(33)、tet(G)、otr(A)、 otrC；氨基香豆素类抗生素抗性基因包括novA基因。

本发明所带来的综合效果包括：本发明使用茶黄素及其组合物消减土壤中抗生素抗性基因，方法简单，使用方式及用量可根据实际情况进行自由调整，施用简单，节约时间，减少工作量。有效时间较长，本法在施用结束后可以对土壤中抗生素抗性基因的形成、转移及扩散形成中长期的抑制作用。

附图说明

图1为茶黄素的组合物(添加比例为25％：25％：25％：25％)对土壤中各类型抗生素抗性基因的影响结果图。

图2为茶黄素的组合物(添加比例为50％:20％:20％:10％)对土壤中各类型抗生素抗性基因的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细说明，应当指出的是，下面的具体实施方式是对本专利的较佳实施方式做了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利技术范围内作出各种变化，如下组分除特别注明外，均按照重量份计算。

本试验所用土壤分别采自新疆阿克苏、浙江金华、黑龙江大兴安岭，以五点取样法采集0-20cm的表层农业土壤，运回实验室后风干处理，去除杂草、石块、枯叶等杂质，过2mm筛备用。土壤理化性质由浙江省农科院测定，3种土壤理化性质如表S1所示。

表S1土壤理化性质

本发明中使用的甲醇、乙醇和丙酮均属于色谱级试剂，可以通过市场购买得到，纯度均大于等于99.9％。

本发明中使用的茶黄素TF₁、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′ -没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯纯度大于等于98％。

需要说明的是宏基因组测序会统计土壤中所含有的众多种类的抗生素抗性基因，本实施例所测数据是通过基因丰度筛选代表性的抗生素抗性基因种类得出的，其中，二氨基嘧啶类抗生素抗性基因包括 dfrA和dfrG；糖肽类抗生素抗性基因包括vanRO和vanSO；MLSB类抗生素抗性基因包括ermG、ermY、vatB、lnuG和vgaE；磷霉素类抗生素抗性基因包括fosX；氟喹诺酮类抗生素抗性基因包括mfpA；四环素类抗生素抗性基因包括tet(L)、tetA(48)、tetB(48)、tet(33)、 tet(G)、otr(A)、otrC；氨基香豆素类抗生素抗性基因包括novA基因。

实施例1

本发明通过在实验室内模拟试验来验证和评价茶黄素TF₁在控制土壤中抗生素基因污染的应用效果，具体操作步骤如下：

S1、土壤预处理：

在上述三种不同类型土壤中加入30g/kg土壤干重的鸡粪肥混合均匀，以模拟一种常见的土壤改良方式，其可能向土壤中带入多种 ARGs。调节土壤含水量为最大持水量的60％，置于人工气候箱，在25℃、 60％湿度条件下培养7天，以保证土壤中混入多种抗生素抗性基因。

S2、微宇宙试验：

分别称取100.0g(干重)上述不同理化性质土壤于白瓷盘中，将茶黄素均匀撒至土壤中并不断搅拌，使土壤中茶黄素TF₁含量达到 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g/kg土壤干重，然后喷洒适量无菌水，调节土壤含水量至最大持水量的60％，将土壤转移至小花盆中，盆口覆盖锡箔纸，扎5个1mm孔，将小花盆置于恒温培养箱中，每隔三天调节土壤含水量，于25℃、70％湿度条件下黑暗培养90天后取土样提取DNA。设置不添加茶黄素TF₁的空白对照，每组重复三次。

S3、提取土壤DNA并进行宏基因组测序：

取0.5g土壤样品，采用FastDNA^TM Spin Kit for Soil试剂盒提取土壤总DNA，使用Illumina NovaSeq测序仪中采用PE 150测序策略对构建文库进行宏基因组测序。

其中，文库构建使用的引物序列为：

5’-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO：1)

5’-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’(SEQ ID NO：2)

S4、测序数据分析及ARGs控制效果评价：

对于测序下机的宏基因组原始序列数据，使用fastp软件进行质控。随后采用BLASTX将序列比对到抗生素抗性基因数据库(The Comprehensive AntibioticResistance Database,CARD)，比对参数E-value设置为1e-5，max_target_seqs设置为1。采用自定义 python脚本去除比对结果中相似度低于80％和联配长度小于25个氨基酸的序列，过滤后得到ARGs相似序列集合。最后，采用自定义 python脚本计算ARGs相对丰度，并对ARGs的耐药类别进行分类，统计茶黄素处理对土壤中各类型ARGs污染的控制效果。

ARGs相对丰度(ppm)计算公式如下：

其中：N_{ARGs相似序列}为符合比对筛选参数的ARGs相似序列数目；N_序列总数为测序数据总数；n为归类到特定抗生素类型的ARGs总数。

茶黄素TF₁对不同土壤中抗生素抗性基因丰度的影响如表1所示。

表1实施例1测得的不同浓度茶黄素TF₁对不同土壤中抗生素抗性基因相对丰度的影响(单位：×100ppm)

从表1可以看出，0天时通过预实验混入的抗生素抗性基因相对丰度约为2.54×100ppm，添加茶黄素TF₁90天后，不同类型土壤中的抗生素抗性基因相对丰度均呈现出了不同程度的降低，对于土壤中抗生素抗性基因的污染起到了良好的修复效果。根据表1实验数据，综合考虑消减效率以及材料成本，茶黄素TF₁的添加量为10-50g/kg土壤干重时抗性基因的污染修复综合效率最高。

实施例2

与实施例1不同的是，将茶黄素TF₁替换为茶黄素-3-没食子酸酯。

茶黄素-3-没食子酸酯对不同土壤中抗生素抗性基因丰度的影响如表2所示。

表2实施例2测得的不同浓度茶黄素-3-没食子酸酯对不同土壤中抗生素抗性基因相对丰度的影响(单位：×100ppm)

从表1可以看出，添加茶黄素-3-没食子酸酯90天后，不同类型土壤中的抗生素抗性基因相对丰度均呈现出了不同程度的降低，对于土壤中抗生素抗性基因的污染起到了良好的修复效果。根据表2实验数据，综合考虑消减效率以及材料成本，茶黄素-3-没食子酸酯的添加量为20-40g/kg土壤干重时抗性基因的污染修复综合效率最高。

实施例3

与实施例1不同的是，将茶黄素TF₁替换为茶黄素-3′-没食子酸酯。

茶黄素-3′-没食子酸酯对不同土壤中抗生素抗性基因丰度的影响如表3所示。

表3实施例3测得的不同浓度茶黄素-3′-没食子酸酯对不同土壤中抗生素抗性基因相对丰度的影响(单位：×100ppm)

从表3可以看出，添加茶黄素-3′-没食子酸酯90天后，不同类型土壤中的抗生素抗性基因相对丰度均呈现出了不同程度的降低，对于土壤中抗生素抗性基因的污染起到了良好的修复效果。根据表3实验数据，综合考虑消减效率以及材料成本，茶黄素-3′-没食子酸酯的添加量为20-50g/kg土壤干重时抗性基因的污染修复综合效率最高。

实施例4

与实施例1不同的是，将茶黄素TF₁替换为茶黄素双没食子酸酯。

茶黄素双没食子酸酯对不同土壤中抗生素抗性基因丰度的影响如表4所示。

表4实施例4测得的不同浓度茶黄素双没食子酸酯对不同土壤中抗生素抗性基因相对丰度的影响(单位：×100ppm)

从表4可以看出，添加茶黄素双没食子酸酯90天后，不同类型土壤中的抗生素抗性基因相对丰度均呈现出了不同程度的降低，对于土壤中抗生素抗性基因的污染起到了良好的修复效果。根据表4实验数据，综合考虑消减效率以及材料成本，茶黄素双没食子酸酯的添加量为10-60g/kg土壤干重时抗性基因的污染修复综合效率最高。

表1-4结果表明，茶黄素TF₁、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3 ′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯均能够消减土壤中抗生素抗性基因的丰度，且不受土壤类型的影响。

实施例5

在综合考虑材料成本与消减效率后，以30g/kg土壤(干重)为总量，以壤质砂土为测试土壤类型，配制茶黄素组合物。

S1、同实施例1；

S2、微宇宙试验：

配制茶黄素组合物：将茶黄素TF₁、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯按25％:25％:25％:25％配制。

分别称取100.0g(干重)上述不同理化性质土壤于白瓷盘中，将3g上述茶黄素组合物均匀撒至土壤中并不断搅拌，然后喷洒适量无菌水，调节土壤含水量至最大持水量的60％，将土壤转移至小花盆中，盆口覆盖锡箔纸，扎5个1mm孔，将小花盆置于恒温培养箱中，于25℃、70％湿度条件下黑暗培养90天后取土样提取DNA。设置不添加茶黄素组合物的空白对照，每组重复三次。

S3、同实施例1。

茶黄素组合物对壤质砂土中不同抗生素抗性基因丰度的影响如图1所示。

从图1可以看出，二氨基嘧啶类抗生素抗性基因丰度下降95.11％，糖肽类抗生素抗性基因丰度下降86.82％，MLSB类抗生素抗性基因丰度下降81.52％，磷霉素类抗生素抗性基因丰度下降79.27％，氟喹诺酮类抗生素抗性基因丰度下降79.03％，四环素类抗生素抗性基因丰度下降71.57％，氨基香豆素类抗生素抗性基因丰度下降60.53％，即添加上述茶黄素组合物后90天，上述抗生素抗性基因的丰度下降均在60％以上。

实施例6

与实施例5不同的是，茶黄素组合物按照茶黄素TF₁：茶黄素-3- 没食子酸酯：茶黄素-3′-没食子酸酯：茶黄素双没食子酸酯＝50％:20％:20％:10％配制。

茶黄素组合物对壤质砂土中不同抗生素抗性基因丰度的影响如图2所示。

从图2可以看出，二氨基嘧啶类抗生素抗性基因丰度下降98.62％，糖肽类抗生素抗性基因丰度下降88.18％，氟喹诺酮类抗生素抗性基因丰度下降82.54％，磷霉素类抗生素抗性基因丰度下降79.27％，MLSB 类抗生素抗性基因丰度下降76.70％，四环素类抗生素抗性基因丰度下降74.57％，氨基香豆素类抗生素抗性基因丰度下降67.25％，即添加上述茶黄素组合物后90天，上述抗生素抗性基因的丰度下降均在 67％以上。

实施例7

与实施例5不同的是，茶黄素组合物按照茶黄素TF₁：茶黄素-3- 没食子酸酯：茶黄素-3′-没食子酸酯＝50％:30％:20％配制。

90天后，上述不同抗生素抗性基因的丰度下降均在60％以上。

实施例8

与实施例5不同的是，茶黄素组合物按照茶黄素TF₁：茶黄素-3- 没食子酸酯：茶黄素-3′-没食子酸酯＝10％:50％:40％配制。

90天后，上述不同抗生素抗性基因的丰度下降均在54％以上。

实施例9

与实施例5不同的是，茶黄素组合物按照茶黄素-3-没食子酸酯：茶黄素-3′-没食子酸酯＝50％:50％配制。

90天后，上述不同抗生素抗性基因的丰度下降均在50％以上。

实施例10

与实施例5不同的是，调节土壤含水量至土壤最大含水量的50％。

90天后，上述不同抗生素抗性基因的丰度下降均在50％以上。

具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.茶黄素及其组合物在消减土壤中抗生素抗性基因的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述茶黄素为茶黄素TF₁、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯中的任意一种；

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗生素抗性基因包括二氨基嘧啶类、糖肽类、MLSB类、磷霉素类、氟喹诺酮类、四环素类、氨基香豆素类。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，茶黄素及其组合物在消减土壤中抗生素抗性基因的方法为：

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述茶黄素及其组合物的添加量为5-50g/kg土壤干重。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述培养的条件为避光培养。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述培养的时间为90天。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述土壤的类型选自壤土、砂土或粘土。