KR100855338B1

KR100855338B1 - 어분폐액을 이용한 액체비료의 제조방법

Info

Publication number: KR100855338B1
Application number: KR1020060104677A
Authority: KR
Inventors: 김중균; 장준환; 이건
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2006-10-26
Filing date: 2006-10-26
Publication date: 2008-09-04
Also published as: KR20080037470A

Abstract

본 발명은 어분폐액을 이용하여 액체비료를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 어분폐액을 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 아그리, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 써큐란, 바실러스 안트라시스 및 바실러스 푸시포미스로 구성된 어분폐액 분해 세균으로 분해시키는 것을 특징으로 하는 어분폐액을 이용한 액체비료의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 액체비료에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 처리에 어려움이 있는 생선폐기물 및 어분공장의 폐수를 액체비료로 효과적으로 재활용할 수 있어, 환경보호효과가 있으며, 양질의 액체비료를 경제적으로 농가에 보급할 수 있는 효과가 있다.

Description

어분폐액을 이용한 액체비료의 제조방법{Preparation Method For Liquid-fertilizer Using Fish-meal Wastewater}

본 발명은 어분폐액을 이용하여 액체비료를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 어분폐액을 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 아그리, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 써큐란, 바실러스 안트라시스 및 바실러스 푸시포미스로 구성된 어분폐액 분해 세균으로 분해시키는 것을 특징으로 하는 어분폐액을 이용한 액체비료의 제조방법에 관한 것이다.

식량안보를 필두로 부족한 식량을 자급자족해야 하는 우리나라의 사정상, 농업정책에 따른 증산 위주, 다수확 재배기술을 보급하는데 총력을 기울이다 보니 화학비료와 농약의 사용이 늘어날 수밖에 없었다. 그러나 최근 각종 환경오염에 대한 문제가 이슈화되기 시작하면서 농산물의 오염, 먹거리에 대한 안전성 문제가 자주 거론되고 수입농산물에 대응하여 우수한 농산물, 안전한 농산물 생산의 필요성이 강력하게 대두되고 있다. 화학비료 및 농약 남용에 따른 부작용, 집중축산에 의한 환경오염, 그리고 강우에 의한 토양침식 등에 의한 친환경농업의 필요성이 인식되어 친환경농업에 관한 규정 확립 후 농가 보급에 심혈을 기울이고 있다.

농작물은 성장해가면서 점점 더 많은 영양분을 필요로 한다. 농작물의 성장에는 밑거름이 주로 이용되지만 최근 시판되는 종자와 종묘들은 정밀한 웃거름(추비) 관리를 해줘야 하는 경우가 많다. 고품질 농사에서도 생육 중·후기에 주는 웃거름은 매우 중요한 관리 기술로 자리 잡았다. 각종 농업용 살포자재, 관수자재도 밑거름 위주의 관리방식에서 웃거름 쪽으로 변화 발달하고 있는 추세이다. 이러한 시비방법의 변화는 유기농업에도 그대로 적용된다. 유기농업에서 밑거름은 퇴비로 해결되지만 웃거름은 쉽지 않다. 국내에서 판매되는 많은 웃거름용 비료가 대부분 화학비료이므로 이를 사용할 수 없는 유기생산 인증 농가는 생육관리가 안될 때 발효 액비를 사용한다. 완전 분해비료인 화학비료와는 달리 대부분의 유기질비료는 고분자 화합물로 토양 분해 및 작물 흡수가 쉽지 않다. 따라서 이를 발효시켜 액비로 만들면 흡수가 잘 될 뿐 아니라, 그 안에 미생물들이 번식해 토양을 개량하고 각종 효소를 만들어 농산물에 기능성을 더해준다.

현재 우리나라에서 가장 널리 사용하고 있는 발효액비는 돼지분뇨 액비이다. 그러나, 유기생산 인증을 받은 농가는 일반사료를 먹이는 공장식 축산농가에서 나오는 축분액비 사용이 금지되기 때문에 문제가 되고 있다. 이 밖에 웃거름용으로 농가가 직접 제조해 흔하게 사용하는 액비로 대표적인 것이 생육을 촉진시키는 질소성분을 포함하고 있는 깻묵액비이다. 또한, 생선혈분, 골분, 육류, 우유 등을 이용한 동물성 액비도 보편화되어 있고, 작물 재배 중에 정리한 싹과 솎아 내거나 비바람에 떨어진 과일, 산야초 등의 작물의 잔재물을 이용한 액비 제조도 널리 보급되어 있다.

우리나라에서 발생되는 수산폐기물의 양은 회를 즐기는 인구의 꾸준한 증가로 인하여 매년 증가할 것으로 예상된다. 어분 생산을 통해 수산폐기물이 감소되고 재활용되고 있다. 우리나라 어분 제조 공정에서는 주로 생선 머리, 뼈 등의 폐기물을 이용하여 수산폐기물의 자숙, 압착, 분쇄 후 스팀 농축, 건조, 냉각 공정 등의 물리적 방법에 의해 제조되고 있다. 이때 스팀농축 공정을 거치면 어유와 높은 함량의 유기물질을 함유하는 액체증기가 발생하는데, 어유를 분리하고 나면 나머지 어분폐액 액체는 폐수처리 된다. 어분폐액의 직접적 배출은 환경오염의 심각한 문제로 일반적으로 해양투기 되고 있으며, 악취는 민원제기가 끊임없이 제기되고, 매년 환경기준의 강화로 인하여 어분제조 공장은 폐쇄해야 할 처지에 있다. 우리나라는 OECD 가입 회원국으로서 폐기물 해양투기를 규제하는 런던협약이 채택한 '96 의정서'를 의무적으로 따라야 할 입장이어서, 이것이 발효될 경우 바다에 버릴 수 있는 폐기물 종류가 대폭 축소되면서 폐기물로 인한 대란이 벌어질 가능성을 배제할 수 없다.

이에, 본 발명자들은 처리에 어려움이 있는 어분폐액을 재활용하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 7종의 혼합미생물을 이용하여 어분폐액을 분해한 분해산물이 액체비료로써 탁월한 효과를 가진다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 어분폐액을 효과적으로 분해하는 혼합미생물을 이용한 액체비료의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 액체비료를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 아그리, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 써큐란, 바실러스 안트라시스 및 바실러스 푸시포미스로 구성된 혼합미생물을 전배양하는 단계; 및 (b) 상기 전배양된 혼합미생물을 어분폐수에 접종하고, 배양하여 상기 혼합미생물에 의해 어분폐수의 유기물이 무기질로 분해된 액체비료를 수득하는 단계를 포함하는 어분폐수로부터 액비를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 혼합미생물은 JB1, JB2, JB3, JB4, JB5, JB6 및 JB7로 구성된 KACC 0000인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 어분폐수는 원료어분폐수를 2~50배 희석한 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 전배양한 다음에 희석된 원료폐수에서 혼합미생물을 2~6일간 순화시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (b) 단계의 배양은 40~60℃에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 생분해된 어분폐수를 함유하는 액체비료를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 어분제조에 사용하고 폐기되는 어분폐액를 효율적으로 분해할 수 있는 혼합미생물을 시판되는 양질의 부식토 및 부산 외곽의 시비된 식물 주변에서 수집된 퇴비와 침출수에서 분리하고, 상기 혼합미생물이 효율적으로 어분폐액를 분해한다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 방법으로 제조된 액체비료가 식물의 발아 및 뿌리생장을 효율적으로 촉진시킨다는 것을 확인하였다.

상기 혼합미생물은 2006년 10월 19일자로 농업생물공학연구원의 한국농업미생물 자원센터에 기탁번호 KACC 91274P로 기탁하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 액비제조용 미생물의 분리

시판되는 양질의 부식토 및 부산 외곽의 시비된 식물 주변에서 수집된 퇴비와 침출수에서 호기성 분해 세균을 분리하였다.

상기 부식토와 퇴비 각각 5g과 침출수 0.5ml을 각각 5ml의 멸균된 0.2% NaCl 용액에 첨가하고, 교반하였다. 각 혼합용액 1ml을 0.8% 영양배지(Nutrient broth, pH 6.8), 효모-말토스 배지(yeast extract 3g/L, malt extract 3g/L, 펩톤 5g/L, 글루코오스 10g/L 및 암피실린 0.05g/L, pH6.2) 및 베넷 배지(Bennet's medium, yeast extract 1g/L, beef extract 1g/L, 글루코오스 10g/L, pH 7.2)이 담긴 튜브에 첨가하였다. 상기 샘플이 첨가된 배양배지들을 각각 45℃와 55℃에서 180rpm에서 진탕배양한 후, 각각 동일한 배지에 1.5% 아가를 첨가한 고체배지에 도말하였다. 배양된 미생물들은 순수한 콜로니로 분리될때까지 계속하여 새로운 고체배지에 도말하여 순수한 균주를 분리하였다. 분리된 순수 균주는 4℃에 보관하면서 2주에 한번씩 계대배양하였다.

상기 분리된 순수 균주에서 유용한 미생물을 스크리닝하기 위하여, 다음의 세 가지 아가 배지에 상기 순수 균주를 도말하였다.

① 단백질 분해 미생물의 선별을 위한 1% 스킴밀크 아가배지

② 지방분해 미생물의 선별을 위한 3.215% 스피릿 블루 아가배지(beef extract 5g/L, soluble starch 20g/L, 트립토오스 10g/L, NaCl 5g/L, 아가 15g/L, pH 7.4)

③ 탄수화물 분해 미생물의 선별을 위한 셀룰로오스 아가배지(셀룰로오스 분말 10g/L, yeast extract 1g/L, NaCl 0.1g/L, (NH₄)₂SO₄ 2.5g/L, K₂HPO₄ 0.25g/L, MgSO₄7H₂O 0.125g/L, FeSO₄7H₂O 0.0025g/L, MnSO₄4H₂O 0.025g/L, 아가 15g/L, pH 7.2)

그 결과, 상기 세 가지 배지 중 적어도 하나의 배지에서 양성환을 형성하는 46개의 순수균주를 확인하였다.

실시예 2: 어분폐액 분해 미생물의 선별

직각도말 방법(Alippi, A. and Reynaldi, F., J. Invertev. Pathol., 91: 141, 2006)을 사용하여 실시예 1에서 분리한 46개의 순수균주 중에서 서로에 대한 길항미생물을 스크리닝하였다.

먼저, 46개의 균주 중 무작위로 선택된 몇 개의 균주를 고체 영양 아가배지에 도말하였다. 도말된 각 균주의 고체배양접시의 표면을 4개의 구획으로 나누고, 각 구획에 4개의 다른 균주를 원래 도말된 균주의 도말선과 직각으로 도말하였다. 각각의 배지는 45℃와 55℃에서 3일동안 배양하였으며, 각 배지에서의 균주의 성장이 저해되는 지를 확인하였다.

그 결과, 분리된 46종의 균주에 대하여 길항물질을 생산하지 않는 7개의 균주를 확인하고, 상기 7개 균주를 JB1~JB7으로 명명하였다.

실시예 3: 미생물의 생장에 미치는 염의 영향

상기 7개 균주의 성장에 염이 미치는 영향을 확인하였다. 상기 7개 균주를 1%, 2% 및 3.5% 농도의 NaCl을 추가로 함유하는 실시예 1에서 사용한 3가지 고체 배지에 도말하였다. 도말된 배지는 동일한 조건에서 배양하여 세균의 성장에 염이 미치는 영향을 콜로니를 둘러싼 클리어 존(clear zone)의 색깔 및 크기의 변화로 측정하였다.

그 결과, 1% 및 2% 농도의 NaCl을 첨가한 배지에서는 세균 콜로니 주위의 클리어존의 색깔이나 크기에 변화가 없었으며, 3.5% 농도의 NaCl을 첨가한 배지에서 자란 세균 콜로니의 경우, 클리어존의 색깔 및 크기가 뚜렷한 차이를 나타내었다.

어분 생산에서 사용되는 원료의 염농도는 다양하며, 따라서 어분폐액의 염농도도 매우 다양하나, 본 발명에서 사용되는 어분폐액의 염 농도는 1% 미만의 것을 사용하였다. 그러므로, 어분폐액의 염농도는 상기 7개 분리 균주의 성장에 영향을 미치지 않는다.

실시예 4. 어분폐액 분해 미생물의 동정

실시예 2에서 확인한 JB1~JB7 균주를 그람염색(Gram staining), 콜로니 형태 및 현미경 검사를 통하여 일차적으로 동정하였다.

상기 7종의 균주는 모두 영양 상태에서 높은 운동성을 가지고, 0.5~0.7μm의 넓이와 3~5μm의 길이를 가지는 그람 양성의 간균이었다. 그 중 JB3 균주는 액체 배양 시에 길이가 2배로 신장되었다. 7종의 균주에서 세균은 대부분 쌍으로 관찰되었으며, 이분법에 의하여 증식한다는 것을 알 수 있었다. JB1 및 JB 6 균주는 장시간 배양했을 때, 지름 약 10mm의 커다란 콜로니를 형성하였으며, 나머지 종들은 작은 콜로니를 형성하였다. 아가-스텝 배양 결과, 7종의 균주는 모두 통성 호기성을 나타내었다.

2차 동정은 16S-rDNA 서열을 분석하여 수행하였다. 각 균주의 염색체 DNA는 AccuPrep 염색체 DNA 추출 킷트(바이오니아, 한국)를 사용하여 분리하였으며, 분리된 DNA를 주형으로 하여 하기의 프라이머를 이용하여 PCR을 사용하여 수행하였으며, 그 결과, 각각의 균주에서 약 1500 bp 크기 단편의 16S-rRNA 유전자가 증폭되었다 (도 1).

27F 프라이머:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (서열번호 1)

1492R 프라이머: (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (서열번호 2)

증폭된 PCR 단편은 전기영동하여 아가로오즈 겔 상에서 AccuPrep SV 겔 및 PCR Clean-up 시스템(Promega, USA)을 이용하여 분리하고, pGEM T-easy 벡터(Invitrogen, USA)에 삽입하여, E.coli DH5α에 형질전환시켰다.

상기 형질전환체를 배양하여, AccuPrep 플라스미드 추출킷트(바이오니아, 한국)를 사용하여, 플라스미드를 분리하고, M13 프라이머(서열번호 3 및 서열번호 4)를 이용하여 3' 말단과 5'말단의 서열을 결정하였다.

M13 프라이머: 5' gtaaaacgacggccagt 3' (서열번호 3)

M13 프라이머: 5' atttcacacaggaaacagctatgac 3' (서열번호 4)

서열이 결정된 상기 7종 균주의 16S rDNA 서열을 서열번호 5~서열번호 11에 나타내었다.

상기 결정된 부분 서열을 GenBank의 Advanced BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 상동성 검색을 수행하였다(Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389, 1997). BioEdit Sequence Alignment Editor(ver. 5.0.9, Hall, T., Nucleic Acids Symposium Series, 41: 95, 1999)를 이용하여 알리그먼트를 확인하였고, PHYLIP(ver. 3.5c)의 DNAdist 프로그램을 이용하여 거리 측정 전에 갭(gap)을가지는 모든 위치를 제거하였다.

그 결과, JB 1은 바실러스 서브틸리스로 동정되었고, JB2는 바실러스 리케니포미스로 동정되었으며, JB 3은 바실러스 아그리로 동정되었고, JB4는 바실러스 코아굴란스로 동정되었으며, JB5는 바실러스 써큐란으로 동정되었고, JB6은 바실러스 안트라시스로 동정되었으며, JB7은 바실러스 푸시포미스로 동정되었다(표 1).

미생물	16S-rDNA크기	GenBankAccession No.	균주명	상동성	서열번호
JB1	1447 bp	DQ219358	Bacillus subtilis	100%	5
JB2	1518 bp	AY468373	Bacillus licheniformis	98%	6
JB3	1498 bp	AY319301	Brevibacillus agri	99%	7
JB4	1514 bp	AF466695	Bacillus coagulans	98%	8
JB5	1449 bp	Y13064	Bacillus circulans	99%	9
JB6	1513 bp	AY138279	Bacillus anthracis	99%	10
JB7	1449 bp	AY548950	Bacillus fusiformis	99%	11

상기 7종 균주를 혼합한 혼합균주는 2006년 10월 19일자로 농업생물공학연구원의 한국농업미생물 자원센터에 기탁번호 KACC 91274P로 기탁하였다.

실시예 5. 7종 혼합 미생물의 생분해 활성 측정

상기 7종의 균주를 이용하여 어분폐액을 호기적으로 생분해하여 액비로의 재활용 가능성 확인하였다.

이후의 실시예에서 사용한 7종 균주 혼합물은 실시예 4에서 동정된 7종의 균주를 동량으로 혼합한 것으로, 7종 균주를 각각 배양하여 대수 증식기가 끝났을 때 원심분리로 세균을 수확한 후, 동량씩 혼합하여 사용하였다.

본 실시예에서 사용한 원료 어분폐액은 부산의 어분 공장에서 수확한 것이다.

먼저, 100ml 시린지를 반응기로 사용하여, 어분폐액의 생분해에 미치는 산소의 영향 및 어분폐액의 희석배수를 확인하였다(Cho, KS et al., J. Microbiol. Biotech., 16:414, 2006). 타이곤(Tygon) 튜빙을 시린지 바늘에 높고, 말단을 폐쇄하였다. 상기 7종 균주 혼합물 0.2g(wet weight)을 40ml의 원료 어분폐액이 담겨있는 시린지에 접종하였다.

원료 어분폐액의 희석비가 균주의 생분해능에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 2배, 4배 및 8배 희석한 어분폐액을 사용하였으며, 희석하지 않은 원료 어분폐액을 대조군으로 사용하였다. 어분폐액의 빠른 생분해를 위하여, 접종하는 세균은 0.2μm 필터로 여과한 원료 어분폐액에서 2일 동안 순화시켰다. 다음으로, 호기적 조건에서 접종된 세균을 배양할 희석 어분폐액에서 2일 동안 순화시켰다.

상기 방법으로 준비된 시린지를 45℃, 180rpm에서 진탕배양하였다. 배양 중에 혼합 균주에서 생산되는 가스는 타이곤 튜빙을 통하여 채집하여 가스크로마토그래피로 분석하였다. 또한, 배양액은 시린지로부터 채집하여, 이온크로마토그래피로 양이온과 음이온의 농도를 분석하였다. 85% 순도의 멸균된 산소를 시린지를 통하여 공급하였다.

상기와 같이, 4일간 순화시킴으로써 생분해의 lag 타임이 감소하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. CODcr 및 TN은 산소를 공급하지 않은 조건과 비교하였을 때, 산소를 공급한 조건에서, 7종의 균주에 의하여 분해되어 더 많이 감소되었다. CODcr/TN의 비는 상기 두 조건에 서 모두 감소하였다. 산소공급 조건에서 이산화탄소 가스의 생성은 질소가스의 증가와 함께 증가하였으나, 산소를 공급하지 않은 조건에서는 시린지 반응기 내에 단지 작은 공기방울만 발생하였다. 이 결과로, 7종의 균주는 호기적 조건에서 유기 물질이 더 많이 분해한다는 것을 알 수 있었다.

어분폐액의 희석배수에 따른 어분폐액 분해 결과를 살펴보면, 원료어분폐액와 2배 희석한 어분폐액를 사용한 경우에는 배양이 72시간동안 지속되었으나, 4배 희석한 어분폐액 및 8배 희석한 어분폐액를 사용하였을 때는 시린지 용기가 발생한 가스에 의해 충진되어 55시간 밖에 배양을 지속시키지 못하였다 (도 3). 그러므로, 시린지 용기내의 7종 균주 혼합물의 산소 소비율은 기질로 사용되는 어분폐액가 희석될 수록 증가한다는 것을 알 수 있었다. 즉, 많이 희석된 어분폐액 일수록 CODcr 및 TN의 제거비율도 빨라져 생분해가 빠르게 진행된다는 것을 알 수 있었다. 생분해동안 발생하는 이산화탄소 가스와 질소가스의 생성율은 8배 희석된 어분폐액에서 각각 46.4 mg/L/h 및 64.1 mg/L/h로 가장 높았다. 미생물의 개체 수 역시 8배 희석된 어분폐액에서 5.4×10⁶ CFU/ml이 최대 세균수였으며, 희석배수가 클수록 증가하였다.

유기물질의 무기질화 또한 8배 희석된 어분폐액을 기질로 사용하였을 때, 가장 최선의 결과를 나타내었다.

실시예 6. 바이오리액터를 사용한 어분페액의 생분해

본 실시예에서는 7종 균주 혼합물이 어분폐액을 호기적으로 생분해시키는 것을 5L 바이오리액터(코바이오텍, 한국)를 사용하여 확인하였다.

배양은 회분식(batch type)으로 호기적 조건에서 수행하였으며, 어분폐액의 희석배수는 실시예 5의 결과에 의해 8배 및 32배로 희석된 어분폐액을 사용하였다. 사용된 어분폐액의 특징을 표 2에 나타내었다.

희석된 어분폐액의 특징

성분	8배 희석액(mg/L)	32배 희석액(mg/L)
CODcr	17,846±2,413	4,634±459
TN	1,740±15	421±8
BOD5	6,240±120	2,749±856
NH₄ ⁺-N	478±25	59±40
NO₃ ^--N	0	0
NO₂ ^--N	0	0

사용할 7종 균주 혼합물을 실시예 5와 동일한 방법으로 희석 어분폐액에 순화시켰다. 순화된 7종 균주 혼합물(20g wet cell)를 4L의 멸균된 희석 어분폐액이 충진된 바이오리액터에 접종하고, 45℃, 200rpm 조건에서 생분해를 수행하였다.

생분해 반응동안 용존산소 농도 및 pH의 변화는 리얼타임으로 측정하였으며, 다른 파라메터들은 샘플링 후 분석하였으며, 양이온(NH₄ ⁺ 및 Na⁺) 농도와 음이온(NO₂ ^- 및 NO₃ ^-) 농도는 각각 Metrosep C2-150(150×4.0mm) 및 Metrosep Supp 5-150(50×4.0mm) 칼럼을 이용하여 이온크로마토그래피(Metrohm 792 Basic IC, 스위스)로 측정하였다. Na⁺및 pH는 거의 변화가 없었으며, NO₂ ^--N 및 NO₃ ^--N은 축적되지 않았다 (도 4).

CODcr(화학적 산소 요구량-dichromate) 및 TN(전체 질소) 농도는 수질분석기(Humas Co., Ltd. 한국)를 사용하여 분석하였으며, CODcr의 평균제거율은 74.1%이었고, TN의 평균 제거율은 71.3%이었으며, CODcr/TN 비는 10.3에서 9.2로 소폭으로 감소하였다. 상기 제거율은 실시예 5의 시린지 용기에서 8배 희석한 어분폐수를 생분해 하였을때보다 월등히 높은 결과이고, 이는 바이오리액터가 시린지반응기에 비하여 산소 공급이 원활하기 때문으로 생각된다.

BOD5(5일간 생물학적 산소 요구량)은 OxiDirect BOP-System(Lovibond, 독일)을 이용하여 분석하였다. 질소 및 이산화탄소 가스의 발생량은 각각 molecular sieve 13X(스텐레스스틸, 메쉬 80/100, 6ft×1/8 in) 및 carboxen 1,000(스텐레스스틸, 메쉬 60/80, 6ft×1/8 in) 칼럼을 사용하여 GC/TCD(Perkin Elmer Instrument, USA) 분석을 통하여 측정하였다. 상기 가스 분석 시에는 동일하게 하기 조건을 적용하였다. 캐리어가스는 헬륨을 30ml/min 유속으로 사용하였으며, 인젝터와 디텍터의 온도는 각각 100℃와 200℃로 셋팅하였다. 질소가스 검출을 위한 오븐의 온도는 40℃로 하였으며, 이산화탄소가스 검출을 위한 오븐 온도는 30℃/min의 상승속도로 40℃에서 170℃로 증가시켰다.

샘플 내의 생세균 수는 적당한 배수로 희석한 후 영양 아가배지에서 형성되는 콜로니 수를 계측하여 CFU/ml로 나타내었으며, DSW(dry-sludge weight)는 채취한 샘플을 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 105℃에서 12시간동안 건조한 후 중량을 측정하였다. 세포수는 2.9×10⁸CFU/ml 수로 증가하였으며, DSW는 생분해 반응전 14,500mg/L에서 7,010mg/L로 감소하였다. 이는 고체슬러지의 일부도 생분해되었다는 것을 의미한다.

실시예 7. 분해된 어분폐액을 이용한 식물 발아율 측정

어분폐액은 바이오리액터에서의 산소가 충분히 공급되면 유기물은 CO₂, SO₄ ^2-, NO₃ ^- 등의 안정적인 최종산물로의 완전히 전환되며, 산소공급이 불충분하면 액체비료로써 토양에 시비되었을때 식물 생장에 문제를 일으킬 수 있는 유기산을 축적하게 된다. 7종 균주 혼합물에 의하여 최종 분해된 어분폐액을 액체비료로 사용할 시에 식물에 대한 독성을 나타나는지 알아보기 위하여, 발아율 테스트를 실시하였다.

발아율 테스트에 사용할 액체비료로는 실시예 6에서 7종의 균주혼합물로 생분해된 어분폐액 샘플을 8,000rpm으로 원심분리한 상등액을 0.45μm 필터로 여과한 후 사용하였다.

먼저 멸균된 접시에 여과지를 넣고 냉이(Leptidium sativum) 씨앗을 넣은 후, 실시예 6에서 상기 액체비료를 첨가하였으며, 대조군으로는 증류수를 사용하였다. 배양접시는 25℃의 암소에서 75% 습도를 유지하면서 발아시켰으며, 72시간 후에 각 배양접시의 발아율(RSG: relative seed germination), 뿌리성장율(RRG: relative root growth) 및 발아인덱스(GI: germination index)을 하기 식으로 나타내었다. 식물독성을 측정하는데 있어서, 발아율 측정은 뿌리 성장율 측정에 비하여 덜 민감한 방법으로 알려져 있으며, RSG와 RRG를 곱한 GI 지수가 식물독성 측정에 가장 민감한 변수로 알려져 있다.

RSG(%)= 액체비료군에서 발아된 씨앗의 수/대조군에서 발아된 씨앗의 수×100

RRG(%)= 액체비료군의 평균 뿌리길이/대조군의 평균뿌리길이×100

GI(%)= RSG×RRG/100

그 결과, 액체비료의 GI 평균은 8.0%였으며, GI (%) 수치는 생분해에 사용된 어분폐액의 희석배수에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 32배 희석한 어분폐액을 생분해한 액체비료군의 경우 GI 수치는 50%이상이었으며, GI 수치 50% 는 식물 독성 물질이 없는 물질이라는 것을 나타내는 지표로 사용된다 (도 5).

실시예 8. 액체비료의 아미노산 조성 분석

액체비료에 있어서 아미노산은 중요한 성분이며, 8배 희석한 어분폐액 및 이를 생분해한 액체비료의 아미노산 조성을 분석하였다 (표 3).

생분해된 어분폐액의 아미노산 조성

	8배 희석된 어분폐액	본 발명의 액체비료	시판 액체비료
Lysine	0.43	2.04	1.54
Histidine	0.25	0.90	0.28
Arginine	0.37	0.18	0.23
Aspartic acid	0.54	1.21	0.90
Threonine	0.21	0.24	0.23
Serine	0.23	0.21	0.21
Glutamic acid	0.89	0.98	2.96
Proline	0.71	1.94	0.09
Glycine	1.25	1.38	0.31
Alanine	1.02	0.66	1.00
Valine	0.23	0.24	0.39
Cysteine	0.04	0.15	N.D.
Methionine	0.01	0.61	N.D.
Isoleucine	0.13	0.20	0.28
Leucine	0.26	0.31	0.42
Tyrosine	0.05	0.38	0.17
Phenylalanine	0.19	0.91	0.22
Total	6.81	12.54	9.23

액체비료가 생분해 전의 어분폐액보다 2배 가까운 농도의 전체 아미노산을 함유하고 있었으며, 아르기닌, 세린 및 알라닌을 제외한 모든 아미노산이 액체비료에 더 많이 함유되어 있었다. 또한, 액체비료의 아미노산 함량은 기종에 시판되어 상용되는 액체비료(안동액비; 상품명: 한거름 액비;밀투밸런스주식회사)보다도 높은 수준의 아미노산을 함유하고 있었다.

본 발명은 어분폐액을 효과적으로 분해하는 혼합미생물을 이용한 액체비료의 제조방법 및 상기 방법으로 어분폐수를 분해시켜 제조된 액체비료를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 의하면, 처리에 어려움이 있는 생선폐기물 및 어분공장의 폐수를 액체비료로 효과적으로 재활용할 수 있어, 환경보호효과가 있으며, 양질의 액체비료를 경제적으로 농가에 보급할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 7종의 분리 균주의 16S-rDNA 유전자의 단편을 PCR한 결과를 나타낸 것이다(레인 1: JB1; 레인 2:JB2; 레인 3:JB3; 레인 4:JB4; 레인 5:JB5; 레인 6:JB6; 및 레인 7:JB7).

도 2는 시린지 배양에서 원료 어분폐액의 생분해에 미치는 산소의 영향을 나타낸 그래프로, (a)는 혐기적 조건에서의 결과이고, (b)는 호기적 고건에서의 결과이다 [O₂ ( ● ); N₂( ■ ); CO₂ ( ▲ ); CODcr ( ◇ ); TN ( ▼ ); 및 세균 수 ( ◎ )].

도 3은 시린지 배양에서 어분폐액의 생분해에 미치는 원료 어분폐액의 희석배수의 영향을 나타낸 그래프이다[[O₂ ( ● ); N₂( ■ ); CO₂ ( ▲ ); CODcr ( ◇ ); TN ( ▼ ); 및 세균 수 ( ◎ )].

도 4는 8배 희석된 어분폐액(a) 및 32배 희석된 어분폐액(b)을 5L 바이오리액터에서 생분해한 결과를 나타낸 그래프이다[O₂ ( ● ); N₂( ■ ); CO₂ ( ▲ ); CODcr ( ◇ ); TN ( ▼ ); 및 세균 수 ( ◎ )].

도 5는 8배 희석된 어분폐액(a) 및 32배 희석된 어분폐액(b)을 사용한 발아시험 결과를 발아지수(GI)로 나타낸 것이다[생분해시키지 않은 원료 어분폐액(■) 및 액체비료(□)].

<110> Pukyong National University Business Incubator Center <120> Preparation Method For Liquid-fertilizer Using Fish-meal Wastewater <130> P06-B216 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atttcacaca ggaaacagct atgac 25 <210> 5 <211> 1447 <212> DNA <213> Bacillus subtilis JB1 <400> 5 ggggaagagg tgggctatct gcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60 gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120 aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt 180 cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240 caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 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Claims

다음의 단계를 포함하는 어분폐수로부터 액비를 제조하는 방법:

(a) 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 아그리, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 써큐란, 비병원성 바실러스 안트라시스 및 바실러스 푸시포미스로 구성된 혼합미생물을 전배양하는 단계; 및

(b) 상기 전배양된 혼합미생물을 어분폐수에 접종하고, 배양하여 상기 혼합미생물에 의해 어분폐수의 유기물이 무기질로 분해된 액체비료를 수득하는 단계.
제1항에 있어서, 혼합미생물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis; DQ219358), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis; AY468373), 바실러스 아그리(Brevibacillus agri; AY319301), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans; AF466695), 바실러스 써큐란(Bacillus circulans; Y130640), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis; AY138279) 및 바실러스 푸시포미스(Bacillus fusiformis; AY548950)로 구성되고, 한국농업미생물 자원센터에 기탁된 기탁번호 KACC 91274P인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 어분폐수는 원료어분폐수를 2~50배 희석한 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 전배양한 다음에 희석된 원료폐수에서 혼합미생물을 2~6일간 순화시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (b) 단계의 배양은 40~60℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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