CN101125776B - 一种诱导植物产生系统抗病性的有机无机复混肥及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种诱导植物产生系统抗病性的有机无机复混肥及应用，属生物技术领域。该复混肥成分质量比为：有机质含量23～30％，全N 6.5～8.8％，P3.6～6.64％和K7～8％，其他52.9～53.56％；制备步骤：200～300℃加热烘干褐煤；按褐煤∶蚕粪∶废渣5～30∶1～5∶1的质量比，立即将青霉素生产的固-液混合废弃残渣和蚕粪倒入预烘干的褐煤中搅拌均匀并保持85℃以上至少20分钟；按硝铵磷肥∶硫酸钾∶磷酸一铵∶钙镁磷肥∶有机预混料20～26∶14～16∶5～10∶ 2～4∶44～59的质量比混合各物料，挤压造粒，即得粒径2-10mm的有机无机复混肥。该肥作为诱导植物产生系统抗病性，提供作物生长的营养需求的应用。本发明具有效果佳、施用方便等优点，特别适宜各种无公害农业生产需要。
Description
技术领域：
本发明涉及一种诱导植物产生系统抗病性的有机无机复混肥及应用，属生物技术领域。
背景技术：
随着科学技术的进步，各国农业科学家普遍认为，肥料要向高效、复合的方向发展，即应寻求一种新型肥料，不仅将氮、磷、钾及微量元素配合使用，而且要将化肥和有机肥结合起来，发挥整体优势，以建立良性农田生态循环体系和作物营养综合体系，充分利用土壤潜力，达到使作物增产增收最佳效果。目前，世界各国都在借助高科技手段，寻求新的肥源，其中有机无机肥料是研究的重点。国内外纷纷开展针对目标作物的生长习性的有机无机复混肥，这样在提供全面、均衡营养的同时，增加土壤有机质含量，提供土壤微生物正常生长所需的环境，提高土壤营养成分的利用率。
长期以来，植物病害的防治主要依赖于抗病品种和化学农药。但由于现代社会对环境保护的日益重视，限制或减少化学农药在农业上的使用已是大势所趋；植物的遗传抗病性状常常与其它农艺性状常常难以有机结合，选育既抗病又高产、优质作物品种的难度越来越大，例如至今也未能培育出抗黄萎病的棉花品种，而且现推广的转基因抗虫棉品种在获得高效抗虫性后，抗病性不仅没有增强，反而大都有所降低。因此，研究探索植物保护的新技术、新途径一直是世界范围内农业科技工作者的重要努力方向。植物诱导抗病性也称系统抗病性，是指经诱导物处理后，植物体本身产生的对多种有害病原菌抗性，而非专一抗性的现象，植物体内未直接接触诱导物的部位也被诱导表达PRs蛋白(病程相关蛋白，Pathogenesis relatedproteins)是其最重要的生理指标。植物诱导抗病性具有抗病谱广、持续时间长和利用安全方便等特点，被认为是植物病害防治的一种新途径、新技术，目前已成为国际上重要的农业研究领域。
为使植物诱导抗病性应用于农业生产，近20多年来国际上研究筛选有效的抗病诱导物，特别是能商业化生产的化学药剂，迄今已发现2，6-二氯异烟酸(INA)、苯并噻唑类制剂(BTH)和氨基丁酸(BABA)等化合物可诱导作物产生对黄萎病、枯萎病及叶斑病的抗性，其中苯并噻唑类制剂(BTH)已开始商业化生产；但因该诱导物为化学制剂，对多数农作物有药害，因此开发效果一般。而开发活的微生物作为诱导物虽可避免这个问题，但实际应用效果常常受到环境条件的影响，而且诱导物的制备工序复杂，成本较高，开发难度也很大。目前，研究开发无污染、施用安全的生物制剂是该领域的热点，我们曾利用青霉素发酵的工业废弃物开发了一种诱导植物表达病程相关蛋白的有机肥(专利授权号：zl200510010824.8)，它同时具备良好肥效，又可诱导植物产生系统抗病性的有机肥，将这种可以诱导植物表达病程相关蛋白的工业废弃物添加到复混肥中，作为有机质中的主要成分之一，开发明确诱导植物表达病程相关蛋白基因表达，从而诱导植物产生系统抗病性的有机、无机复混肥，不但具有良好的开发前景，还有积极的环保意义。
参考文献：
1.Huges，D.W.and Galau，A.G(1988)，Preparation of RNA from cotton leaves andpollen.Plant Mol.Bio.Rep.6：253-257
2.Melissa K.Hill，Lyon Karin J.，Lyon Bruce R.(1999)Identification of disease response genesexpressed in Gossypium hirsutum upon infection with the wilt pathogen Verticillium dahliae.PlantMolecular Biology，40：289-296
3.Sambrook J，Russell DW(2001)Molecular cloning：a laboratory manual.3rd edn..Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork
发明内容：
本发明的目的在于通过对可诱导植物系统表达PRs蛋白的灭活青霉素生产残渣的研究，开发一种诱导植物产生系统抗病性的有机无机复混肥及应用。
本发明的有机无机复混肥成分的质量百分比为：有机质含量23～30％，全N6.5～8.8％，P3.6～6.64％和K7～8％，其他52.9～53.56％；该有机无机复混肥有机活性诱导剂由下列步骤制成；
(1)褐煤预处理，将商品褐煤加热至200～300℃烘干。
(2)有机预混料制备：预处理褐煤后，按照干燥褐煤：蚕粪∶废渣5～30∶1～5∶1的质量比，立即将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣和蚕粪倒入预烘干的褐煤中搅拌均匀混合成固体粒料；利用预处理褐煤的热量保持混合物85℃以上至少20分钟，以灭活青霉素的固-液废渣中的青霉菌和残留青霉素。
(3)有机无机复混肥的料制备：按硝铵磷肥∶硫酸钾∶磷酸一铵∶钙镁磷肥∶有机预混料20～26∶14～16∶5～10∶2～4∶44～59的质量比充分混合各物料，用常规的设备挤压造粒，粒径2-10mm，即得到诱导植物产生系统抗病性的有机无机复混肥，
(4)将制备的样品按常规标准检测，成分的质量百分比为：有机质含量23～30％，全N 6.5～8.8％，P3.6～5.39％和K7～8％，其他52.9～53.56％。
本发明的有机无机复混肥以基肥、追肥的形式施用，不但具有有机无机复混肥的各种优点，同时还可诱导植物表达病程相关蛋白从而产生系统抗病性。
本发明具有效果佳、有广泛应用领域等优点，特别适应于无公害种植的需要及大量农药才能控制病害的作物。
本发明是这样实现的：
一、有机活性诱导剂的制备
(1)褐煤预处理，将商品褐煤加热至200～300℃烘干；
(2)有机预混料制备：预处理褐煤后，按照干燥褐煤∶蚕粪∶废渣5～30∶1～5∶1的质量比，立即将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣和蚕粪倒入预烘干的褐煤中搅拌均匀混合成固体粒料；利用预处理褐煤的热量保持混合物85℃以上至少20分钟，以灭活青霉素的固-液废渣中的青霉菌和残留青霉素；
(3)按硝铵磷肥∶硫酸钾∶磷酸一铵∶钙镁磷肥∶有机预混料20～26∶14～16∶5～10∶ 2～4∶44～59的质量比充分混合各物料，用常规的设备挤压造粒，粒径2-10mm，即得到诱导植物产生系统抗病性的有机无机复混肥。有机无机复混肥成分的质量百分比为：有机质含量23～30％，全N 6.5～8.8％，P3.6～6.64％和K7～8％，其他52.9～53.56％。
二、诱导抗病性试验
1、病原菌的接种试验
1)样品水提液的制备：
取该有机无机复混肥200g，加蒸馏水至10L，浸泡24小时，过滤得到2％浓度的水提液，或稀释到所需浓度。
2)对甜瓜枯萎病四个生理小种的抗病性实验：
甜瓜(Cucumis melo L.cv.En-Dor)、按常规栽培管理，每种处理选长势一致的健康苗200株，用1％的有机无机复混肥水提液灌根，分别按标准方法接种甜瓜枯萎病病原菌四个生理小种的孢子，以植株1/3以上部分出现枯萎症状作为指标，统计病株率，可知该样品对有关作物病害的防治效果。
试验结果：1％的该有机无机复混肥对于甜瓜枯萎病的四个生理小种均表现显著的防治作用，发病病株率可降低45％，说明该有机无机复混肥所诱导的对甜瓜枯萎病不同生理小种的抗性没有选择性，符合诱导植物产生系统抗病性的一般规律。
3)对烟草黑胫病的诱导抗性实验：
烟草品种“红花大金元”(Nicotiana tabacum cv.HongDa)，漂浮育成苗，移栽入装有园土得花盆中，于25℃的条件下培养，选长势一致的健康苗200株，用0.5-2％的有机无机复混肥水提液灌根，以普通烟草专用肥作为对照，按标准方法接种疫霉菌(寄生疫霉烟草变种98Pn009)的孢子，以植株1/3以上部分出现黑胫病症状作为指标，统计病株率，可知该样品对烟草黑胫病害的防治效果。
实验结果：发病株率比各自空白对照显著降低30％-50％，说明本发明的有机无机复混可以显著诱导烟草提高对黑胫病的抗性。
2、病程相关蛋白基因表达检测
1)样品水提液的制备：
取该有机无机复混肥200g，加蒸馏水至10L，浸泡24小时，过滤得到2％浓度的水提液，或稀释到所需浓度。
2)烟苗的培养和诱导：
取烟草品种“红花大金元”(Nicotiana tabacum cv.HongDa)漂浮育成苗，移栽入装有园土得花盆中，于25℃的条件下培养，选长势一致的健康苗，用0.5％的有机无机复混肥水提液灌根，以普通烟草专用肥作为对照。于灌根后6、8、12、24、48h、72h取下叶片，置液氮中冷冻固定，然后于-80℃下保存备测。
3)总RNA的提取：
根据Hughes和Galau(1988)的方法和Melissa(1999)的改进方法，分别提取各处理组的子叶总RNA。利用260/280光吸收值和琼脂糖电泳的方法确保各样品浓度和质量一致；
4)PR蛋白基因表达的检测：
每个样品取10μg RNA经过甲醛变性胶电泳后，转膜至Hybond-N+膜上，亚甲兰染色，根据28S rRNA的量，确保膜上每个样品RNA的浓度和质量得一致性。将8种不同PRs蛋白基因片段(见表1)以内切酶切下后，利用随机引物法将片段标记32p dCTP，作为探针，用于Northern杂交分析。Northern杂交根据标准方法进行(Sambrook et al.，2001)，杂交完成后压X-光片(Kodark)-80℃曝光5-6天。根据X-光片上的曝光强度可以直观的观察到不同处理时间各种PR蛋白基因的相对表达量。
表1、用于标记探针的质粒
5)试验结果
对烟草根部不同时间的水提液处理，利用Northern杂交的方法，在远离根部的叶片中检测出PR-1b、PR-3、PR-5、酸性几丁质酶等4种PR蛋白基因出现持续性的诱导表达。
已知PRs蛋白的易位累积，均不是通过转移从感染部位或诱导物处理部位移动到其它部分的，因此在未直接处理物的叶片检出部分PR蛋白的大量表达，说明本发明制作的有机无机复混肥能够诱导烟草产生系统抗病性(systemic acquiredresistance)，而不仅仅是局部抗性(local resistance)。
具体实施方式：
以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：
将商品褐煤加热至300℃烘干，按照干燥褐煤∶蚕粪∶废渣5∶1∶1的质量比，立即将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣和蚕粪倒入预烘干的褐煤中搅拌均匀混合成固体粒料；利用预处理褐煤的热量，保持混合物85℃以上30分钟，灭活青霉素的固-液废渣中的青霉菌和残留青霉素。按硝铵磷肥∶硫酸钾∶磷酸一铵∶钙镁磷肥∶有机预混料20∶14∶5∶2∶59的质量比充分混合各物料，用常规的设备挤压造粒，即得到粒径2mm的诱导植物产生系统抗病性的有机无机复混肥，成分的质量百分比为：有机质含量30％，全N 6.5％，P3.6％和K7％，其他52.9％。
以每亩65公斤的用量，将该有机无机复混肥作为基肥施入土中，按常规植入马铃薯将该有机无机复混肥作为基肥，后期追施农户自己制备的农家肥，常规栽培、管理马铃薯，结果表明：马铃薯晚疫病病株率比对照下降26％。
实施例二：
基本同实施例一。不同之处为：燥褐煤∶蚕粪∶废渣的质量比为30∶1∶1的；褐煤加热温度为250℃，保持混合物85℃以上20分钟；硝铵磷肥∶硫酸钾∶磷酸一铵∶钙镁磷肥∶有机预混料比例为23∶15∶7∶3∶52；褐煤加热温度为300℃，保持混合物85℃以上30分；粒经2mm；有机无机复混肥的质量百分比为：有机质含量27％，全N 7.6％，P4.8％和K7.5％，其他53.1％。
以每亩65公斤的用量，将该有机无机复混肥作为基肥施入土中，按常规植入马铃薯，后期再将该有机无机复混肥作为追肥，以每亩20公斤用量施入，常规栽培、管理马铃薯，结果表明：马铃薯晚疫病病株率比对照下降34％。
实施例三：
基本同实施例一。不同之处为：燥褐煤∶蚕粪∶废渣的质量比为15∶3∶1的；褐煤加热温度为200℃，保持混合物85℃以上25分；硝铵磷肥∶硫酸钾∶磷酸一铵∶钙镁磷肥∶有机预混料比例为26∶16∶10∶4∶44；褐煤加热温度为300℃，保持混合物85℃以上30分；粒径2mm：有机无机复混肥的质量百分比为：有机质含量23％，全N8.8％，P6.64％和K8％，其他53.56％。
以每亩50公斤的用量(1000株/亩)，将该有机无机复混肥作为基肥施入土中，条施、环施均可，以每亩50公斤施用常规烟草专用复合肥作为对照，按常规移栽漂浮育成烟草苗(品种：红花大金元)，浇灌定根水，常规栽培、管理，结果表明：黑胫病病株率比对照下降31％。
Claims (2)
1.一种诱导植物产生系统抗病性的有机无机复混肥，其特征在于该有机无机复混肥成分的质量百分比为：有机质含量23～30％，全N 6.5～8.8％，P3.6～6.64％和K7～8％，其他52.9～53.56％；该有机无机复混肥由下列步骤制成；
(1)褐煤预处理，将商品褐煤加热至200～300℃烘干；
(2)有机预混料制备：预处理褐煤后，按照干燥褐煤∶蚕粪∶废渣5～30∶1～5∶1的质量比，立即将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣和蚕粪倒入预烘干的褐煤中搅拌均匀混合成固体粒料；利用预处理褐煤的热量保持混合物85℃以上至少20分钟，以灭活青霉素的固-液废渣中的青霉菌和残留青霉素；
(3)有机无机复混肥的料制备：按硝铵磷肥∶硫酸钾∶磷酸一铵∶钙镁磷肥∶有机预混料20～26∶14～16∶5～10∶2～4∶44～59的质量比充分混合各物料，用常规的设备挤压造粒，即得到粒径2-10mm诱导植物产生系统抗病性的有机无机复混肥。
2.权利要求1所述的有机无机复混肥，以基肥、追肥的形式施用，作为诱导植物产生系统抗病性，同时提供作物生长的营养需求的应用。
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