CN114350369A

CN114350369A - 一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法

Info

Publication number: CN114350369A
Application number: CN202210072724.1A
Authority: CN
Inventors: 罗玲; 赵鑫; 李欣怡; 袁龙; 冯治涵; 杨璇; 朱思漫; 邓欧平; 何燕; 兰婷
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2022-01-21
Filing date: 2022-01-21
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本发明公开了一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，该方法包含：将猪粪装入陶瓷锅中，盖上盖子以限制氧气供应，然后在500℃马弗炉中加热2h，获得猪粪炭，研磨，过筛；将待改良土壤与所述猪粪炭混合后恒温处理，所述猪粪炭通过抑制移动遗传因子向土壤传播和改变细菌群落结构以阻碍抗生素抗性基因的传播，减少了抗生素抗性基因宿主Actinobacteria和Firmicutes，维持Chloroflexi的含量，使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。本发明的方法能够有效使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。

Description

一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法

技术领域

本发明涉及一种去除ARGs的方法，具体涉及一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法。

背景技术

近年来，抗生素的大量使用和滥用导致抗生素抗性基因(ARGs，能使细菌对四环素、磺胺和氯霉素等抗生素产生抗性的基因)的广泛传播，导致由于感染抗生素耐药细菌而死亡的人数逐年提高，抗生素抗性已成为危害公众健康的重大挑战。具有抗性的遗传元件具有通过食物链转移到人类相关的微生物组织的可能，这将对医用抗生素的药效和人体健康构成严重威胁。

大量的抗生素被用于畜禽养殖产业，然而由于动物无法完全吸收被其新陈代谢排出，30％～90％的抗生素通过排泄物进入环境，导致畜禽粪便成为ARGs的主要储存库。畜禽粪便常作为有机肥参与土壤改良，而其中蕴含的ARGs便有可能进入土壤和地下水环境，并通过食物链威胁人体健康。

发明内容

本发明的目的是提供一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，解决了猪粪用于土壤改良容易导致抗生素抗性基因传播的问题，能够有效使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。

为了达到上述目的，本发明提供了一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，该方法包含：将猪粪装入陶瓷锅中，盖上盖子以限制氧气供应，然后在500℃马弗炉中加热2h，获得猪粪炭，研磨，过筛；将待改良土壤与所述猪粪炭混合后恒温处理，所述猪粪炭通过抑制移动遗传因子向土壤传播和改变细菌群落结构以阻碍抗生素抗性基因的传播，减少了抗生素抗性基因宿主Actinobacteria和Firmicutes，维持Chloroflexi的含量，使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。

优选地，研磨后过100目筛。

优选地，所述待改良土壤与猪粪的质量比为98：2～5。

优选地，所述恒温的温度为20℃。

优选地，所述恒温处理25～30天。

本发明的去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，解决了猪粪用于土壤改良容易导致抗生素抗性基因传播的问题，具有以下优点：

本发明的方法采用猪粪炭处理土壤，猪粪炭通过抑制移动遗传因子向土壤传播和改变细菌群落结构以阻碍抗生素抗性基因的传播，减少了抗生素抗性基因宿主Actinobacteria和Firmicutes，维持Chloroflexi的含量，使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。

本发明的方法处理获得的猪粪炭的得率为40％左右，防止了更多的营养流失，能够确保猪粪炭的肥力，而且能够使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。

附图说明

图1为不同处理的对ARGs去除结果；A为ARGs的绝对丰度；B为ARGs相对丰度以及数目。

图2为不同处理的MGEs的影响；A为MGEs的绝对丰度；B为MGEs的相对丰度。

图3为不同处理对细菌的影响；A为主要细菌门的相对丰度；B为前10种属的相对丰度。

图4为细菌群落结构的改变结果；A为不同样品理化特性与细菌群落间冗余分析；B为不同样品的细菌生物量。

图5为不同影响因素对于ARGs的影响；A为偏最小二乘路径模型；B为不同影响因素对于ARGs的标准化影响程度。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，采用了猪粪/猪粪生物炭与土壤共培养的技术，该方法包含：

将猪粪装入陶瓷锅中，盖上盖子以限制氧气供应，然后在500℃马弗炉中加热2h，获得生物炭，即猪粪炭，研磨后过100目筛(0.15mm)。

取农田土壤(可采集自温江区某农田)，农田土壤与猪粪的质量比为98：2或95：5，将农田土壤与猪粪炭在20℃恒温培养28天，2％猪粪或5％猪粪制备的猪粪炭与农田土壤处理分别作为B2和B5处理。

表1为本发明实施例1采用的不同量的猪粪获得的生物炭的得率

对比例

将2％猪粪(M2)或5％猪粪(M5)与农田土壤以不同比例(dw/dw)进行培养，以20℃恒温培养28天。

将农田土壤以20℃恒温培养28天，作为空白处理(CK)。

将农田土壤，作为TS处理。

将猪粪以20℃恒温培养28天，作为M处理。

实验例1高通量测序

1、高通量测序测定

在28天培养结束后，采集不同深度的三个子样品混合为一个样品。样品DNA通过Power

DNA IsolationKit(购自MOBIO，USA)提取。

不同处理组的微生物群落结构采用高通量测序测定，具体如下：

首先，利用细菌16S V4-V5区引物515F和909R进行PCR扩增。纯化和定量PCR产物后，使用

DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和qPCR定量，文库合格后，使用Illumina测序平台进行上机测序。

引物515F的核苷酸序列如下：

5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'；

引物909R的核苷酸序列如下：

5'-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3'。

ARGs和MGEs的丰度通过高通量qPCR和Wafergen SmartChip Real-time PCR系统(Wafergen,Fremont,CA)测定。所有DNA样品均稀释至20ngμL^-1并重复测定三次，共296个引物组可以靶向285个ARG、16S rRNA基因、8个转座酶、1类整合子基因(intl1)和临床相关的1类整合子基因(cintl1)，能较完整地检测出环境中主要的ARGs，部分引物见表2。

基因芯片平台上共有5184个纳米孔为PCR提供了反应位点，每孔使用100nl PCR反应混合物，该混合物包含1×LightCycler 480SYBR Green IMaster、1mg mL^-1牛血清白蛋白、无核酸酶PCR级水、500nM引物和20ng mL^-1DNA样本。PCR条件为：95℃酶激活10min，扩增40个循环：95℃变性30s，60℃退火30s。

使用Smartchip qPCR软件(Wafergen,Fremont,CA)分析qPCR结果，检测限设置为31，如果所有三个技术重复都显示阳性结果，则扩增仅被视为阳性。ARGs和MGEs的相对丰度(目标基因拷贝数/16S rRNA基因拷贝数)根据Zhu等(Continental-scale pollutionofestuaries with antibiotic resistance genes,Nat Microbiol.2(2017)16270)的研究计算。

表2为部分目标引物

2、结果

(1)ARGs去除率

施用粪便等有机肥导致该土壤受到了一定的ARGs污染，结果显示(参见图1)，农田土壤中ARGs的绝对丰度和相对丰度分别为1.15×10⁸copies g^-1和0.08copies 16s rRNA^-1。此外，在所用猪粪中也检测到了较高的ARG含量。

土壤与2％和5％的猪粪共同培养28天后，ARGs的丰度显著提高(P<0.01)。与空白相比，ARGs的绝对丰度分别提升了1个和3个数量级，其相对丰度分别扩大了9倍和46倍，呈现出随猪粪施加量增多，ARGs污染逐渐加剧的趋势。由上可知，若不能有效管控猪粪等粪便的施用，将提高土壤中ARGs的污染，甚至有可能通过农作物危害人类饮食健康。

但是，同等质量猪粪烧成的生物炭与土壤培养后，检测到ARGs含量与CK并无显著差异，B2、B5与M2、M5相比，相对丰度降低了56.71％和94.63％，甚至较TS显著降低(P<0.01)。氨基糖苷类、多药类和四环素类是M、M5、M2中主要的ARGs类型，以上三种抗生素在畜禽养殖业大量使用，其对应的抗性基因在粪便改良土壤中占主导，如下表3为本发明实施例1和对比例处理后ARGs去除率。

表3本发明实施例1和对比例处理后ARGs去除率

如表2所示，猪粪转化为生物炭后，不同种类ARGs的丰度均降低95％以上。与M2和M5相比，B2和B5的ARGs数目分别从112种和136种降至42种和45种(参见图1)，表明本发明实施例1的猪粪炭能够有效去除ARGs，不仅降低了ARGs的丰度，也显著减少了ARGs的多样性(P<0.01)。

(2)MGEs的传播

MGEs(移动遗传因子，能使基因在细胞间水平移动的DNA分子，包括整合子和转座子等)作为ARGs在细菌间水平传播的载体，是决定ARGs传播效率的重要因素，部分ARGs即使脱离宿主细菌，也能够依靠MGEs以DNA分子形式存在。粪便作为一种细菌多样且群落结构复杂的有机肥，具有强烈的水平基因转移能力，粪肥的施用有可能通过向土壤中引入MGEs来增强ARGs的传播。

由Pearson相关性分析(参见表4)可知，除万古霉素类抗性基因外，不同类型的ARGs均与MGEs极显著相关(P<0.01)，表明MGEs在土壤ARGs的迁移过程中扮演了重要角色。

结果显示(参见图2)，猪粪中MGEs的绝对丰度和相对丰度分别为2.54×10¹¹copiesg^-1和0.08copies 16s rRNA^-1，显著高于其他处理(P<0.01)。不同处理间MGEs的变化趋势与ARGs相似，猪粪的施用增加了土壤中MGEs的丰度，显著促进土壤中基因的水平转移(P<0.01)。与CK相比，M2和M5使MGEs的绝对丰度分别提升了3个和4个数量级，也使其相对丰度扩大了17.5倍和63.4倍。然而，实施例1中将猪粪转为猪粪炭后，MGEs的丰度较CK和TS相比无显著差异，表明通过本发明实施例1处理获的猪粪炭可以通过抑制MGEs向土壤传播来降低ARGs丰度。

表4为MGEs与ARGs丰度间的相关性分析

注：**在0.01级别(双尾)，相关性显著。

(3)细菌群落结构的改变

高通量测序结果(参见图3)显示，猪粪(M)中的主要细菌门类是Proteobacteria、Actinobacteria和Chloroflexi，而Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes是土壤(TS、CK)中的主要菌门。粪便改良土壤样品(M2、M5)中的Chloroflexi低于生物炭改良土壤(B2、B5)，而加入生物炭后，该菌门的丰度无明显变化。

然而，Chloroflexi与ARGs呈负相关关系，生物炭对于土壤中Chloroflexi的维持表明ARGs污染并未恶化。随着粪便比重的增大，Actinobacteria和Firmicutes逐渐增加。Actinobacteria是抗生素的主要生产者，通常携带着多种ARGs，在所有样品中总丰度排名第八的Streptomyces(Actinobacteria)能分泌具有生物活性的抗生素以便与接触的其他微生物竞争。作为Firmicutes增长的首要贡献者，Bacillus是畜禽粪便和污泥中常见的宿主病原体。Actinobacteria和Firmicutes从猪粪向土壤的转移可能是粪便改良土壤中ARGs升高的主要原因。将猪粪转化为生物炭后，以上ARGs的潜在菌门和菌属均有所减少，甚至低于土壤本身，表明本发明实施例1的猪粪生物炭对于细菌群落结构的改变阻碍了ARGs的传播。

参见图4的A，冗余分析显示，B2、B5和TS、CK聚集在同一象限，且与M2、M5和M明显分开，样品间的聚类情况表明，与猪粪不同，猪粪生物炭的投入未显著改变农田土壤的细菌群落结构。同时，猪粪转化为生物炭后，土壤生物量显著降低(参见图4的B，P>0.05)，这降低了ARGs通过垂直传递扩增的风险。

此外，Actinobacteria、Firmicutes与TC、TN和TP等细菌营养来源正相关。由表5可知，猪粪转化为生物炭后，由于热解过程中C、N元素的损失，TC和TN的含量均有所下降，但也灭活了大量如Actinobacteria和Firmicutes等细菌，这有利于控制ARGs的流入。但是，猪粪生物炭中TC、TN和TP的含量仍高于农田土壤，表明本发明实施例1的猪粪生物炭的加入仍能有效提升土壤肥力。

表5为农田土壤、猪粪和猪粪生物炭的理化性质

(4)综合影响分析

图5的A为偏最小二乘路径模型，用于揭示不同影响因素对于ARGs的解释度，其中实线代表显著影响(P<0.05)，虚线为不显著；路径系数代表某变量对所指变量的直接影响程度；R²代表谋变量被解释的程度，趋近于1表明解释程度高；该模型的拟合度(GOF)为0.759，趋近于1，表明拟合效果好；B为不同影响因素对于ARGs的标准化影响程度。

由偏最小二乘路径模型(PLSPM，图5)可知，MGEs是直接影响ARGs最显著的因素(路径系数为1.201)，其次是理化性质(路径系数为-0.157)，它主要通过显著影响细菌群落结构来间接驱动ARGs的变化。将猪粪转化为生物炭投入到土壤后，MGEs的含量显著降低，这直接降低了ARGs在细胞间的水平基因转移效率，同时，TC和TN等细菌营养来源的降低改变了细菌的群落结构，导致Actinobacteria和Firmicutes等ARGs宿主的减少。猪粪生物炭在增强土壤肥力的同时，也能有效抑制ARGs向土壤中传播。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims

1.一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，其特征在于，该方法包含：

将猪粪装入陶瓷锅中，盖上盖子以限制氧气供应，然后在500℃马弗炉中加热2h，获得猪粪炭，研磨，过筛；

将待改良土壤与所述猪粪炭混合后恒温处理，所述猪粪炭通过抑制移动遗传因子向土壤传播和改变细菌群落结构以阻碍抗生素抗性基因的传播，减少了抗生素抗性基因宿主Actinobacteria和Firmicutes，维持Chloroflexi的含量，使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。

2.根据权利要求1所述的去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，其特征在于，研磨后过100目筛。

3.根据权利要求1所述的去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，其特征在于，所述待改良土壤与猪粪的质量比为98：2～5。

4.根据权利要求1所述的去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，其特征在于，所述恒温的温度为20℃。

5.根据权利要求1所述的去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，其特征在于，所述恒温处理25～30天。