CN109045018A - 茶黄素-双没食子酸酯在制备MBLs抑制剂中的医用用途 - Google Patents

茶黄素-双没食子酸酯在制备MBLs抑制剂中的医用用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及茶黄素‑双没食子酸酯在制备MBLs抑制剂中的医用用途，并通过头孢硝噻吩水解试验、分级抑菌浓度试验及时间‑杀菌试验验证茶黄素‑双没食子酸酯能够抑制B类β‑内酰胺酶的活性并恢复多种β‑内酰胺类抗生素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌BAA1717的抗菌活性。进一步通过建立小鼠金葡菌肺炎感染模型证明茶黄素‑双没食子酸酯联用β‑内酰胺类抗生素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌BAA1717造成的感染具有良好的治疗效果。由于传统抗生素的滥用和乱用，细菌耐药性已成为感染疾病临床治疗中的重大难题。因此，茶黄素‑双没食子酸酯作为B类β‑内酰胺酶抑制剂与抗生素有较好的联用前景，可增加面对耐药菌感染时的药物选择,对开发抗产B类β‑内酰胺酶金葡菌感染新药有着重要意义。

Description

茶黄素-双没食子酸酯在制备MBLs抑制剂中的医用用途
技术领域
本发明公开了茶黄素-双没食子酸酯的一种新的用途，进一步讲涉及茶黄素-双没食子酸酯在制备B类β-内酰胺酶（metallo-β-lactamases，简称：MBLs）抑制剂中的医用用途，属于医学制药技术领域。
背景技术
细菌耐药性是当今细菌感染疾病治疗的主要难题之一，其中β-内酰胺酶是β-内酰胺类抗生素的重要耐药因素，可根据氨基酸序列同源性分为A、B、C、D四种。目前，已有多种β-内酰胺酶抑制剂应用于临床治疗中，但均只可靶向A、C、D三种β-内酰胺酶，尚未有任何一种B类β-内酰胺酶抑制剂应用于临床治疗中。而B类β-内酰胺酶（简称：MBLs）广泛存在于多种革兰氏阳性和阴性致病菌中，为感染性疾病的治疗带来了巨大的困难。因此，开发针对B类β-内酰胺酶的抑制剂具有十分重要的意义。
本发明涉及的茶黄素-双没食子酸酯是茶黄素的重要活性成分之一，常见于红茶提取物中，已被证实具有抗肿瘤、清除自由基、抗炎、抗突变等多种生物学活性，是具有很大应用潜力的天然化合物。截至目前国内外未见茶黄素-双没食子酸酯在制备B类β-内酰胺酶抑制剂中的相关报道。
发明内容
本发明提供了一种在茶黄素-双没食子酸酯制备MBLs抑制剂中的医用用途，公开了茶黄素-双没食子酸酯能够抑制B类β-内酰胺酶的活性，恢复多种β-内酰胺类抗生素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌BAA1717的杀菌活性。
本发明所述的茶黄素-双没食子酸酯，其分子式：C43H32O20，分子量：868.70。
本发明所述的茶黄素-双没食子酸酯在制备B类β-内酰胺酶抑制剂中的用途。
本发明所述的茶黄素-双没食子酸酯作为B类β-内酰胺酶（MBLs）抑制剂为药学上可接受的任何载体。
本发明所述的茶黄素-双没食子酸酯作为B类β-内酰胺酶抑制剂用于制备治疗感染性疾病药物中的用途。
本发明所述的茶黄素-双没食子酸酯作为B类β-内酰胺酶抑制剂用于制备治疗细菌引起的感染性疾病药物中的用途。
本发明所述的茶黄素-双没食子酸酯作为B类β-内酰胺酶抑制剂用于制备治疗金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病药物中的用途。
本发明通过头孢硝噻吩水解试验、分级抑菌浓度试验及时间-杀菌试验验证茶黄素-双没食子酸酯能够抑制B类β-内酰胺酶的活性并恢复多种β-内酰胺类抗生素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌BAA1717的抗菌活性。进一步通过建立小鼠金葡菌肺炎感染模型证明茶黄素-双没食子酸酯联用β-内酰胺类抗生素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌BAA1717造成的感染具有良好的治疗效果。
本发明的积极效果在于：
提供了茶黄素-双没食子酸酯在制备B类β-内酰胺酶抑制剂中的新医用用途，公开了茶黄素-双没食子酸酯能够抑制B类β-内酰胺酶的活性，恢复多种β-内酰胺类抗生素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌BAA1717的抗菌活性。体内实验中，茶黄素-双没食子酸酯联用头孢噻吩对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌BAA1717引起的肺炎感染具有良好的治疗效果，具有广泛的医用用途。
附图说明
图1为本发明茶黄素-双没食子酸酯对六种选用B类β-内酰胺酶的抑制效果图；
图2为本发明时间-杀菌曲线；
图3 为本发明茶黄素-双没食子酸酯与头孢噻吩联用对小鼠金葡菌肺炎死亡率的影响。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
试验例1
头孢硝噻吩水解实验
试验中表达纯化来自于金黄色葡萄球菌BAA1717、BAA1707、BAA1720和大肠杆菌EDL933和NDM-1野生株的六种不同基因型的B类β-内酰胺酶，
将上述实验中纯化的六种蛋白分别置于冰盒中备用。将PBS缓冲液加至96孔板中，分别于每孔中加入5μg纯化后的B类β-内酰胺酶，以及不同浓度的TFDG药物，同时设立只加药物不加蛋白的对照组，用于去除药物底色。充分混匀后，于每孔中加入50 μM头孢硝噻吩，放置于室温下进行孵育。随后，使用酶标仪测定492nm下的光密度，并记录数值，参见图1所示。
结论：本发明茶黄素-双没食子酸酯能够剂量依赖性地抑制B类β-内酰胺酶的活性。
试验例2
分级抑菌浓度试验
本实验以BAA1717为实验菌株，采用美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）微量棋盘稀释法测定TFDG与多种β-内酰胺类抗生素的分级抑菌浓度指数（Fractional inhibitoryconcentration index, FICI）。实验中，接种BAA1717菌株于TSB培养基中，于恒温振荡器中200 rpm转速振荡过夜。次日调整菌液浓度为5×105 CFUs/ml，根据棋盘法实验步骤，于每孔中添加不同浓度的两种药物，于37℃恒温生化培养箱中孵育24 h，以眼观无细菌生长为最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）。FICI的计算方法为：
FICI = MIC（A药联合使用浓度）/ MIC（A药单独使用浓度）+ MIC（B药联合使用浓度）/MIC（B药单独使用浓度）；
当FICI≤0.5时被定义为协同作用，FICI﹥2时被定义为拮抗作用，当数值处于0.5与2之间时为相加或无关效果；
结果见表1：
注：青霉素类：A. 青霉素 B. 氨苄青霉素；一代头孢菌素：C. 头孢噻吩 D. 头孢唑林E. 头孢拉定；二代头孢菌素：F.头孢呋辛 G. 头孢克洛；三代头孢菌素；H.头孢哌酮 I.头孢他啶 J.头孢曲松。
结论：本发明茶黄素-双没食子酸酯对实验中所使用β-内酰胺类抗生素均有十分明显的协同效果，可显著降低抗生素的最小抑菌浓度，且所有实验组FICI≤0.5，表现出了较广谱的协同特性。
试验例3
时间-杀菌试验
时间-杀菌实验通过将特定浓度的药物与菌体进行孵育，于不同时间点将菌液涂于TSB固体培养基上进行菌落计数，判断药物对细菌生长的影响。本实验以BAA1717为实验菌株，以头孢噻吩为实验药物与TFDG联合使用，与头孢噻吩和TFDG单独使用效果进行比较。同时设立舒巴坦实验组为对照药物组，比较头孢噻吩与TFDG和舒巴坦分别联用的效果。
从固体培养基中挑取BAA1717菌株，接种至TSB培养基中，于37℃恒温振荡器中200rpm震荡过夜。次日，将菌液浓度调整至1×108 CFUs/ml，分别于各孔中加入不同浓度的药物进行孵育，并于0 h、1 h、2 h、4 h及6 h取200 μl菌液涂布于TSB固体培养基上，放置于37℃恒温生化培养箱中孵育过夜。于次日对固体培养基上的单菌落进行计数，并记录数据，绘制时间-杀菌曲线（图2）。
结论：舒巴坦与头孢噻吩药物组以及TFDG与头孢噻吩药物组均体现了良好的协同效果。尤其1 h后，TFDG体现了比舒巴坦更有效的协同作用，可大幅影响菌体的生长速度。
试验例4
小鼠金黄色葡萄球菌肺炎模型治疗学研究
小鼠金黄色葡萄球菌肺炎模型建立
将40只BALB/c小鼠分为4组，分别为阳性对照组、头孢噻吩治疗组、TFDG治疗组以及TFDG与头孢噻吩联用治疗组。在组织病理学研究、肺脏菌落计数以及肺脏湿/干重比实验中，24只小鼠同样按上述描述分为4组。使用乙醚麻醉小鼠并由单手保定，将制备好的金葡菌菌悬液滴入鼻孔内，仰卧平躺放置小鼠直至恢复活动能力。保护率实验的四个实验组中，每只小鼠金葡菌菌悬液的滴鼻剂量为25 μl （3.3×108 CFUs）。组织病理学研究、肺脏菌落计数以及肺脏湿/干重比实验的四组小鼠，每只滴鼻剂量为18 μl （2.4×108 CFUs）。
保护率试验
小鼠经滴鼻感染2 h后进行给药。头孢噻吩治疗组每只小鼠皮下注射0.325 mg；TFDG治疗组每只皮下注射1 mg；联合用药组每只小鼠同时皮下注射头孢噻吩0.325 mg和TFDG 1mg；阳性对照组每只小鼠皮下注射与TFDG等体积的DMSO。每12 h给药一次，结果见图3。
结论：TFDG与头孢噻吩联用组显著的降低了金葡感染小鼠的死亡率。

Claims (6)

1.茶黄素-双没食子酸酯在制备B类β-内酰胺酶抑制剂中的用途。
2.茶黄素-双没食子酸酯作为B类β-内酰胺酶抑制剂为药学上可接受的任何载体。
3.茶黄素-双没食子酸酯作为B类β-内酰胺酶抑制剂用于制备治疗感染性疾病药物中的用途。
4.茶黄素-双没食子酸酯作为B类β-内酰胺酶抑制剂用于制备治疗细菌引起的感染性疾病药物中的用途。
5.茶黄素-双没食子酸酯作为B类β-内酰胺酶抑制剂用于制备治疗金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病药物中的用途。
6.权利要求1~5所述的茶黄素-双没食子酸酯，其分子式：C43H32O20，分子量：868.70。
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