CN114099492B - 天然药物在制备抗菌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种天然药物在制备抗菌药物中的应用。本发明发现多种天然药物能够用于抗菌药物的制备；芒果苷对鲍曼不动杆菌的生长有很好的抑制作用；咖啡酸甲酯对鲍曼不动杆菌有很好的抑制作用；本发明还发现，去氢骆驼蓬碱能作为美罗培南的增效剂增强其对肺炎克雷伯杆菌的抗菌作用；去氢骆驼蓬碱单用或者美罗培南单用均不能抑制肺炎克雷伯杆菌的生长，但是128μg/mL去氢骆驼蓬碱与4μg/mL者美罗培南联用时可显著抑制肺炎克雷伯杆菌的生长，可将其生长率降至5％以下。

Description

天然药物在制备抗菌药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种天然药物在制备抗菌药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
细菌耐药性又称抗药性，系指细菌对于抗菌药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的抗菌作用就明显下降。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。在众多耐药菌中，多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)是指对5类抗菌药中的3类及以上药物耐药，为多重耐药菌株，包括头孢菌素类(如头孢他啶或头孢吡肟)、碳青霉烯类(如亚胺培南)、β-内酰胺酶抑制剂(如头孢哌酮/舒巴坦)、氟喹诺酮类(如环丙沙星)和氨基糖苷类(如阿米卡星)。发明人发现现有技术中一些多重耐药鲍曼不动杆菌的抗菌制剂需要在至少25μg/mL浓度以上才能对多重耐药鲍曼不动杆菌产生抑制效果，而且随抗菌制剂浓度升高，抑制效果相差不大。
另外，肺炎克雷伯杆菌是一个重要的革兰氏阴性条件致病菌，可引起各种感染性疾病，近年来发现肺炎克雷伯杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药型快速升高。因此，迫切需要探索能够克服肺炎克雷伯杆菌的手段和药物。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供天然药物在制备抗菌药物中的应用，本发明发现天然药物芒果苷和咖啡酸甲酯都能够作为抗菌药物抑制鲍曼不动杆菌的生长，天然药物去氢骆驼蓬碱能够作为抗生素美罗培南的增敏剂实现抑制肺炎克雷伯杆菌的功能，为解决细菌耐药性提供了有效的解决方法。
本发明的第一方面，提供一种：天然药物在制备抗菌药物中的应用；
优选地，所述天然药物包括：芒果苷、咖啡酸甲酯、去氢骆驼蓬碱；
具体地，本发明提供一种芒果苷在制备抗鲍曼不动杆菌药物中的应用；优选地，所述鲍曼不动杆菌为多重耐药鲍曼不动杆菌；
本发明研究首次发现，芒果苷对鲍曼不动杆菌有良好的体外抑菌活性，芒果苷在浓度为64μg/mL时，可抑制80％以上实验菌株的生长；芒果苷在浓度为128μg/mL时，可完全抑制实验菌株的生长；但是芒果苷对大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌都没有抑制作用。
本发明还提供一种咖啡酸甲酯在制备抗鲍曼不动杆菌药物中的应用；优选地，所述鲍曼不动杆菌为多重耐药鲍曼不动杆菌；
本发明研究发现，咖啡酸甲酯对鲍曼不动杆菌菌株也有很好的体外抑制作用，咖啡酸甲酯在浓度32μg/mL以上均可显著抑制实验菌株的生长，在浓度为128μg/mL时对实验菌株的抑菌率均达到99％以上。
本发明还提供一种去氢骆驼蓬碱作为抗生素增敏剂的应用；优选地，所述抗生素为美罗培南；
进一步的，提供一种去氢骆驼蓬碱联合美罗培南在制备抗肺炎克雷伯杆菌药物中的应用；
本发明研究发现，去氢骆驼蓬碱能作为美罗培南的增效剂能够增强其对肺炎克雷伯杆菌的抗菌作用，对肺炎克雷伯杆菌KP37有显著的抑制作用；去氢骆驼蓬碱单用或者美罗培南单用均不能抑制肺炎克雷伯杆菌KP37的生长；128μg/mL去氢骆驼蓬碱与4μg/mL者美罗培南联用时可显著抑制KP37的生长，可将其生长率降至5％以下，即128μg/mL去氢骆驼蓬碱与4μg/mL者美罗培南联用对KP37有显著的抑制作用。
本发明的第二方面，一种抗菌药物，所述抗菌药物包含芒果苷，咖啡酸甲酯，或去氢骆驼蓬碱和美罗培南的组合物。
本发明的第三方面，一种药物制剂，所述药物制剂包括上述抗菌药物和药学上可接受的载体或辅料组成。
本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
本发明发现多种天然药物能够用于抗菌药物的制备；芒果苷对鲍曼不动杆菌的生长有很好的抑制作用，芒果苷在浓度为64μg/mL时，可抑制80％以上实验菌株的生长；芒果苷在浓度为128μg/mL时，可完全抑制实验菌株的生长；
本发明还发现，咖啡酸甲酯对鲍曼不动杆菌有很好的抑制作用；咖啡酸甲酯在浓度32μg/mL以上均可显著抑制实验菌株的生长，浓度为128μg/mL时对实验菌株的抑菌率均达到99％以上；
本发明还发现，去氢骆驼蓬碱能作为美罗培南的增效剂能够增强其对肺炎克雷伯杆菌的抗菌作用；去氢骆驼蓬碱单用或者美罗培南单用均不能抑制肺炎克雷伯杆菌的生长，但是128μg/mL去氢骆驼蓬碱与4μg/mL者美罗培南联用时可显著抑制肺炎克雷伯杆菌的生长，可将其生长率降至5％以下。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中不同浓度的芒果苷对不同菌株生长率的影响；
其中，图A为对鲍曼不动杆菌AB11菌株生长率的影响；
图B为对大肠杆菌E1菌株生长率的影响；
图C为对肺炎克雷伯杆菌KP50菌株生长率的影响；
图D为对金黄色葡萄球菌M11菌株生长率的影响；
图2为实施例1中不同浓度的扁桃苷对不同菌株生长率的影响；
其中，图A为对鲍曼不动杆菌AB11菌株生长率的影响；
图B为对大肠杆菌E1菌株生长率的影响；
图C为对肺炎克雷伯杆菌KP50菌株生长率的影响；
图D为对金黄色葡萄球菌M11菌株生长率的影响。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
在本发明的一种或多种实施方式中，提供一种：天然药物在制备抗菌药物中的应用；
优选地，所述天然药物包括：芒果苷、咖啡酸甲酯、去氢骆驼蓬碱；
具体地，本发明提供一种芒果苷在制备抗鲍曼不动杆菌药物中的应用；优选地，所述鲍曼不动杆菌为多重耐药鲍曼不动杆菌；
优选地，所述芒果苷体外抑制鲍曼不动杆菌的有效浓度为≥64μg/mL，或≥128μg/mL。
本发明还提供一种咖啡酸甲酯在制备抗鲍曼不动杆菌药物中的应用；优选地，所述鲍曼不动杆菌为多重耐药鲍曼不动杆菌；
优选地，所述咖啡酸甲酯体外抑制鲍曼不动杆菌的有效浓度为≥32μg/mL，或≥128μg/mL。
芒果苷(英文名称：mangiferin；CAS号：4773-96-0；分子式：C19H18O11；分子量：422.35)是一种来源于高等植物和芒果果实的不同部位生物活性成分，具有强效抗氧化活性和多因子药理作用，包括抗糖尿病、抗肿瘤、调节脂肪代谢、心脏保护、抗高尿酸血症、神经保护、抗氧化、抗炎、解热、镇痛、抗菌、抗病毒和免疫调节作用；咖啡酸甲酯是从植物中提取后经氧化而成的酯类衍生物，研究表明其具有多种药理作用。但是现有技术中并未发现芒果苷或咖啡酸甲酯具有抗鲍曼不动杆菌的作用。
本发明研究首次发现，芒果苷对鲍曼不动杆菌有良好的体外抑菌活性，芒果苷在浓度为64μg/mL时，可抑制80％以上实验菌株的生长；芒果苷在浓度为128μg/mL时，可完全抑制实验菌株的生长；但是芒果苷对大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌都没有抑制作用。
本发明还发现，咖啡酸甲酯对鲍曼不动杆菌菌株也有很好的体外抑制作用，咖啡酸甲酯在浓度32μg/mL以上均可显著抑制实验菌株的生长，在浓度为128μg/mL时对实验菌株的抑菌率均达到99％以上。
本发明还提供一种去氢骆驼蓬碱作为抗生素增敏剂的应用；优选地，所述抗生素为美罗培南；
进一步的，提供一种去氢骆驼蓬碱联合美罗培南在制备抗肺炎克雷伯杆菌药物中的应用；
优选地，所述去氢骆驼蓬碱与美罗培南联合应用体外抑制肺炎克雷伯杆菌时浓度配比为32：1；
优选地，所述去氢骆驼蓬碱与美罗培南联合应用体外抑制肺炎克雷伯杆菌时，去氢骆驼蓬碱的最低有效浓度为128μg/mL，美罗培南的最低有效浓度为4μg/mL；
去氢骆驼蓬碱是从多年生草本植物骆驼蓬中提取出来的一种β-咔波啉类生物碱，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用；但是现有技术中并未公开去氢骆驼蓬碱能够作为抗生素的增敏剂实现对肺炎克雷伯杆菌的生长抑制。
本发明研究发现，去氢骆驼蓬碱能作为美罗培南的增效剂增强其对肺炎克雷伯杆菌的抗菌作用，对肺炎克雷伯杆菌KP37有显著的抑制作用；去氢骆驼蓬碱单用或者美罗培南单用均不能抑制肺炎克雷伯杆菌KP37的生长；128μg/mL去氢骆驼蓬碱与4μg/mL者美罗培南联用时可显著抑制KP37的生长，可将其生长率降至5％以下，即128μg/mL去氢骆驼蓬碱与4μg/mL者美罗培南联用对KP37有显著的抑制作用。
在本发明的一种或多种实施方式中，提供一种抗菌药物，所述抗菌药物包含芒果苷，咖啡酸甲酯，或去氢骆驼蓬碱和美罗培南的组合物。
在本发明的一种或多种实施方式中，提供一种药物制剂，所述药物制剂包括上述抗菌药物和药学上可接受的载体或辅料组成。
所述药学上可接受的载体或辅料选自稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、助流剂、粘合剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、离子交换剂、矫味剂或抗氧化剂中的一种或多种。
在一种或多种实施方式中，所述药物制剂的剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂或混悬剂；注射剂、透皮制剂、或喷剂。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1
芒果苷抗多重耐药鲍曼不动杆菌的静态作用测定
1.材料
1.1实验菌株
本实验过程中菌株(鲍曼不动杆菌AB11、大肠杆菌E1、肺炎克雷伯杆菌KP50、金黄色葡萄球菌M11)均是从医院的检验科获得，已经被鉴定为多重耐药菌株，并测定了其对临床常用抗生素的敏感性(如表1)。试验用菌株都储存在-80℃冰箱内，使用前在MHA固体培养基上进行传代培养，最少传代培养两次。
表1试验菌株对临床常用抗生素的敏感性测定结果
Figure BDA0003452292600000041
/>
Figure BDA0003452292600000051
1.2药物与主要试剂
芒果苷，大连美仑生物技术有限公司(辽宁大连)；扁桃苷，大连美仑生物技术有限公司(辽宁大连)；钙调MH肉汤培养基(CAMHB肉汤)，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司(山东青岛)；MHA琼脂培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司(山东青岛)；生理盐水，上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海)；
2.方法
2.1菌液制备
-20℃下保存的鲍曼不动杆菌室温下解冻，接种到MHA琼脂培养基上，35℃培养18-20h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养18-20h，以保证菌株处于对数生长期。选取若干菌落，生理盐水配制成菌悬液，调整样品管与0.5麦士比浊管浊度一致，此时菌液浓度约为1.5×108CFU/mL，再用CAMHB肉汤进行稀释，使得菌液最后的工作浓度为5×105CFU/mL，最终以活菌计数进行浓度验证。
2.2药物母液配制
根据美国临床和实验室标准协会(CLSI M100-S30)的规定和试剂商的说明，选择合适的药物溶剂。芒果苷和扁桃苷分别溶解于二甲基亚砜，配成浓度为40960μg/mL的溶液，保存于-20℃的冰箱中以备使用。每次使用之前放于4℃冰箱中使药物自然融化解冻。
2.3芒果苷抗鲍曼不动杆菌的作用测定
根据CLSIM100-S30方案的微量肉汤稀释法，以CAMHB肉汤稀释药液使其成为2倍工作浓度，筛选芒果苷应用的浓度范围为0-512μg/mL。按浓度从低到高的顺序吸取芒果苷100μL，加入96孔平板的，每孔再加入100μL的菌液(5×105CFU/mL)，其中阳性生长对照孔只含菌液不含药物，空白对照孔只含CAMHB肉汤。根据CLSIM100-S30方案的要求，将加药的96孔平板置35℃恒温培养箱中培养18h，观察结果并记录细菌生长率。
3.结果
表2芒果苷抗多重耐药鲍曼不动杆菌AB11生长率的影响
Figure BDA0003452292600000061
由表2和图1A可以看出，芒果苷在浓度为64μg/mL时，可抑制80％以上实验菌株AB11的生长；芒果苷在浓度为128μg/mL时，可完全抑制实验菌株AB11的生长。从图1B-D可以看出，芒果苷对大肠杆菌E1、肺炎克雷伯杆菌KP50、金黄色葡萄球菌M11三种菌株没有抑制作用。从图2A-D可以看出，扁桃苷对本实施例的四种菌株均没有抑制作用。
实施例2
咖啡酸甲酯抗多重耐药鲍曼不动杆菌的作用
实验菌株
收集临床分离得到的鲍曼不动杆菌(AB2，AB11，AB12)，菌株均被正确鉴定且测定了其对临床常用抗生素的敏感性。
菌悬液配制
从已经分纯并过夜培养的MHA平板上挑取3～5个菌落，接种于无菌0.9％氯化钠溶液中。菌液用麦氏比浊管调浊度至0.5麦氏浊度(约为1×108CFU/mL)，再用钙调MH肉汤培养基稀释100倍(约为1×106CFU/mL)。
咖啡酸甲酯溶液配制
根据美国临床实验室标准化协会标准的要求配制咖啡酸甲酯原液浓度为40960μg/mL。
微量肉汤稀释法
将咖啡酸甲酯用钙调MH肉汤培养基进行倍比稀释，制成3个稀释浓度(32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL)。向无菌的96孔平板设定孔中加入100μL的各浓度咖啡酸甲酯溶液，再向各孔加入100μL稀释后的菌液，同时做阴性对照和培养基对照。37℃培养16～18h，观察结果并记录各咖啡酸甲酯溶液对应的抑菌率。
实验结果
实验菌株的药敏结果
所用实验菌株对以下抗生素均耐药：阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南、头孢唑啉、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、磺胺甲基异惡唑/甲氧苄氨嘧啶、氯霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、四环素。由此可见，实验菌株均为多重耐药鲍曼不动杆菌。
不同浓度咖啡酸甲酯对多重耐药鲍曼不动杆菌的抑菌率
表3咖啡酸甲酯对多重耐药鲍曼不动杆菌的抑菌率
Figure BDA0003452292600000071
表注：表中生长率(％)表示为三次实验平均值±标准差。每个咖啡酸甲酯浓度的统计学对照组均为无药组(咖啡酸甲酯浓度为0μg/mL)。统计分析使用单因素ANOVA分析中的Dunnett法，p<0.05视为有统计学差异。
由表3可以看出，与未加咖啡酸甲酯的对照组相比，咖啡酸甲酯在浓度32μg/mL以上均可显著抑制实验菌株的生长(p<0.05)。与未加咖啡酸甲酯的对照组相比，咖啡酸甲酯在浓度为128μg/mL时对AB2、AB11、AB12的抑菌率均达到99％以上(p<0.05)。
实施例3
去氢骆驼蓬碱增强美罗培南对肺炎克雷伯杆菌的抗菌作用测定
实验菌株：肺炎克雷伯杆菌
本实验过程中菌株均是从医院的检验科获得并鉴定，试验用菌株储存在-80℃冰箱内，使用前在MHA固体培养基上进行传代培养，最少传代培养两次。
药物与主要试剂
去氢骆驼蓬碱，大连美仑生物技术有限公司(辽宁大连)；美罗培南，大连美仑生物技术有限公司(辽宁大连)；钙调MH肉汤培养基(CAMHB肉汤)，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司(山东青岛)；MHA琼脂培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司(山东青岛)；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)，大连美仑生物技术有限公司(辽宁大连)。
方法
培养基及药物储存液的配制
CAMHB肉汤培养基的制备：称取CAMHB粉末8.80g，放入500mL的玻璃瓶内，加入蒸馏水，搅动使其溶解，于121℃高压灭菌30min，冷却后，放于4℃冰箱中保存以备使用。
MHA琼脂培养基的制备：称取MHA粉末16.80g，放入500mL的锥形瓶内，加入蒸馏水，搅动使其溶解，于121℃高压灭菌30min，冷却后，放于4℃冰箱中保存以备使用。
药物储存液的制备：根据美国临床和实验室标准协会(CLSI M100-S30)的规定和试剂商的说明，选择合适的药物溶剂。去氢骆驼蓬碱溶解于二甲基亚砜，配成浓度为20480μg/mL的溶液；美罗培南溶解于无菌蒸馏水，配成浓度为5120μg/mL的溶液的溶液。所有药物储存液保存于-20℃的冰箱中以备使用。每次使用之前放于4℃冰箱中使药物自然融化解冻。
抗菌作用的测定
菌液的制备
从-80℃的冰箱里取出保存的菌株，放在37℃恒温箱里使其自然溶化，用取菌环挑取适量的菌液接种到MHA固体培养基上，在37℃恒温培养箱中培养24h。然后挑取生长较好的单菌落再次接种于MHA固体培养基上，进行传代培养，在37℃下培养24h。至少传代培养三次，方可用于实验研究。从MHA固体培养基上，用取菌环挑取适量生长较好的菌落，溶解于装有无菌的PBS溶液的无菌试管中，于涡旋混合器上振荡混合均匀，然后将其与中国细菌浊度标准管进行对比，调整实验菌液浓度至0.5麦氏单位(1.5×108CFU/mL)，再用无菌CAMHB肉汤进行稀释，使得菌液最后的工作浓度为106CFU/mL。
药液的稀释
每个药物的稀释方法相同，采用二倍微量稀释的方法。取10支无菌玻璃试管置于试管架上，编号为1-10，取适量无菌CAMHB肉汤培养基于无菌小烧杯中。取适量药物储存液和CAMHB培养基于试管中，充分摇匀，使管内的浓度为96孔板中工作浓度的2或4倍。
抗菌作用测定
实验分为3组，具体如下：
去氢骆驼蓬碱单用组：100μL菌悬液+100μL 256μg/mL去氢骆驼蓬碱溶液；
美罗培南单用组：100μL菌悬液+100μL 8μg/mL美罗培南溶液；
药物联用组：10μL菌悬液+50μL 512μg/mL的去氢骆驼蓬碱溶液+50μL 16μg/mL的美罗培南溶液。
试验设生长对照组(200μL菌悬液)作为对照。加完药液和菌液后，将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养18h，观察实验结果，每个实验重复三次。
结果
去氢骆驼蓬碱增强美罗培南对肺炎克雷伯杆菌KP37生长率的抑制作用
表4去氢骆驼蓬碱和美罗培南联用对菌株生长率的影响
Figure BDA0003452292600000081
表注：表中生长率(％)表示为三次实验中生长率的平均值±标准差。每个实验组的统计学对照组均为无药组(生长对照组)。统计分析使用单因素ANOVA分析中的Dunnett法，p<0.001视为有统计学差异。
由表4可以看出，与未加药物的生长对照组相比，去氢骆驼蓬碱单用或者美罗培南单用均不能抑制肺炎克雷伯杆菌KP37的生长(p＞0.001)；与未加药物的生长对照组相比，128μg/mL去氢骆驼蓬碱与4μg/mL者美罗培南联用时可显著抑制KP37的生长，可将其生长率降至5％以下，即128μg/mL去氢骆驼蓬碱与4μg/mL者美罗培南联用对KP37有显著的抑制作用(p<0.001)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.天然药物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述应用为去氢骆驼蓬碱联合美罗培南在制备抗肺炎克雷伯杆菌药物中的应用。
2.如权利要求1所述天然药物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述去氢骆驼蓬碱与美罗培南联合应用时浓度配比为32：1。
3.如权利要求1所述天然药物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述去氢骆驼蓬碱与美罗培南联合应用体外抑制肺炎克雷伯杆菌时，去氢骆驼蓬碱的最低有效浓度为128μg/mL，美罗培南的最低有效浓度为4μg/mL。
4.一种抗菌药物，其特征在于，所述抗菌药物以去氢骆驼蓬碱和美罗培南的组合物作为活性成分。
5.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括权利要求4所述的抗菌药物和药学上可接受的载体或辅料组成。
6.如权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，所述药学上可接受的载体或辅料选自稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、助流剂、粘合剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、离子交换剂、矫味剂或抗氧化剂中的一种或多种。
7.如权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的给药剂型为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、注射剂、透皮制剂或喷剂。
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